מיקרוגליה נחשבים לחלק מהתאים הרבגוניים ביותר בגוף, המסוגלים להסתגלות מורפולוגית ותפקודית. ההטרוגניות והרב-תכליתיות שלהם מאפשרות שמירה על הומאוסטזיס מוחי, תוך שהם קשורים גם לפתולוגיות נוירולוגיות שונות. כאן מתוארת טכניקה לטיהור מיקרוגליה של חוט השדרה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
עמוד השדרה מגדיר חוליה ומעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ושומר על חוט השדרה. התפתחות ותפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית של יונקים מסתמכים באופן משמעותי על פעילותם של מקרופאגים מקומיים המכונים מיקרוגליה. מיקרוגליה מציגה הטרוגניות ורב-תפקודיות, ומאפשרת ביטוי גנים והתנהגות מובחנים בתוך חוט השדרה והמוח. מחקרים רבים בחנו את תפקוד תאי המיקרוגליה במוח, ומפרטים בהרחבה את שיטות הטיהור. עם זאת, טיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה בעכברים חסר תיאור מקיף. לעומת זאת, השימוש בקולגנאז מטוהר מאוד, בניגוד לתמצית לא מזוקקת, חסר דיווח ברקמות מערכת העצבים המרכזית. במחקר זה, עמוד השדרה וחוט השדרה נכרתו מעכברי C57BL/6 בני 8-10 שבועות. העיכול שלאחר מכן השתמש בקולגנאז מטוהר מאוד, וטיהור מיקרוגליה השתמש בשיפוע צפיפות. התאים עברו צביעה לצורך ציטומטריית זרימה, הערכת כדאיות וטוהר באמצעות צביעת CD11b ו-CD45. התוצאות הניבו כדאיות ממוצעת של 80% וטוהר ממוצע של 95%. לסיכום, מניפולציה של מיקרוגליה בעכבר כללה עיכול עם קולגן מטוהר מאוד, ואחריו שיפוע צפיפות. גישה זו יצרה למעשה אוכלוסיות משמעותיות של מיקרוגליה בחוט השדרה.
מבוא
המאפיין המגדיר של בעלי חוליות הוא עמוד השדרה או עמוד השדרה, שבו הנוטוכורד הוחלף ברצף של עצמות מקוטעות הנקראות חוליות, המחולקות על ידי דיסקים בין-חולייתיים. רצף זה של חומר גלוסקמי מעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ומגן על חוט השדרה1. בסוג Rodentia, עמוד השדרה נוצר בדרך כלל על ידי שבע חוליות צוואריות, שלוש עשרה חוליות בית החזה, שש חוליות מותניות ומספר משתנה של חוליות קאודליות 2,3. אורך חוט השדרה דומה לזה של עמוד השדרה, והפילום הטרמינלי הוא מבנה לא עצבי המעגן את חוט השדרה לעצה. בנוסף, סיבי עצב יוצאים דרך הפתח הבין חולייתי1.
התפתחותה ותפקודה התקין של מערכת העצבים המרכזית ביונקים תלויים באופן קריטי בפעילות המקרופאגים השוכנים במערכת העצבים, הנקראים מיקרוגליה4. למרות שתאי מיקרוגליה תוארו בתחילה כפגוציטים שוכני מוח, מחקר שנערך לאחרונה ייחס תפקודים דינמיים רבים לתאים אלה 5,6. גודלה של מיקרוגליה נע בין 7 ל -10 מיקרומטר בהומאוסטזיס; הם נחשבים בין התאים הרבגוניים ביותר בגוף ויכולים להסתגל מורפולוגית ותפקודית לסביבתם המשתנה ללא הרף7. תאים אלה מפגינים הטרוגניות גבוהה הן בשלב העוברי והן בשלב הבוגר 8,9, ואילו בשלב הבוגר הם מפגינים גם הטרוגניות תפקודית מורכבת בהתבסס על ההקשר המרחבי-זמני שלהם10. ההטרוגניות והתפקודים המרובים של תאי מיקרוגליה מאפשרים ביטוי גנים דיפרנציאליים והתנהגות בחוט השדרה ובמוח. הוכח כי ביטוי CD11b, CD45, CD86 ו- CCR9 גבוה יותר בחוט השדרה בהשוואה למוח 8,9.
קיימים פרוטוקולים מרובים לבידוד תאי מיקרוגליה במוח11,12; עם זאת, רק מעטים קיימים עבור מיקרוגליה חוט השדרה13,14. אופטימיזציה של שיטה לטיהור מיקרוגליה מחוט השדרה מאפשרת פיתוח של מחקרים מרובים המתמקדים בגילוי הפיזיולוגיה של מיקרוגליה. פרוטוקול זה נועד לתאר מיצוי פשוט וקל מאוד לשחזור של חוט השדרה של העכבר וטיהור תאי מיקרוגליה (איור 1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקר נערך בהתאם לתקן המקסיקני הרשמי NOM-062-ZOO-1999 והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. האישור למחקר התקבל מוועדות המחקר, האתיקה והבטיחות הביולוגית של בית החולים לילדים במקסיקו (HIM/2023/006) ומועדת המחקר והביואתיקה של בית החולים הכללי של מקסיקו אדוארדו ליסאגה (DI/21/501/04/62). שלושה עכברי C57BL/6 בגילאי 6 עד 8 שבועות התקבלו מבית החולים לילדים במקסיקו, שם גודלו בתנאים מבודדים במדפים מונשמים, בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
1. הכנת חומרים וריאגנטים
- PBS ללא Ca2 + ו-Mg2+ טרום חם, כמו גם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ל-37°C.
- השלימו את תמיסת HBSS עם 100 מיקרוגרם/מ"ל של Liberase ו-4 מיקרוגרם/מ"ל של DNase (HBSS-LD). ודא כי הפתרון שומר על pH פיזיולוגי של 7.4.
הערה: 1 מ"ל של פתרון עבודה לכל חוט השדרה יהיה צורך. - הכינו תמיסה איזוטונית של 90% לצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות (זמינה מסחרית, ראו טבלת חומרים) וחממו אותה מראש ל-37°C.
- הכינו את חיץ הצביעה על ידי שילוב של סרום בקר עוברי 5% מומת חום (FBS) עם PBS, ואחסנו את התערובת על קרח.
- חימום מראש של גלוקוז בינוני-גבוה של Dulbecco של Dulbecco (1g / L) (DMEM) עד 37 ° C.
- השלם את מדיום DMEM עם 10% FBS, 2 mM L-גלוטמין, 200 U / מ"ל פניצילין, 200 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין, ו 500 pg / מ"ל של אמפוטריצין B (ראה טבלה של חומרים) להכנת DMEM-S.
2. דיסקציה והכנה של חוט השדרה
- המתת חסד העכבר עם מנת יתר intraperitoneal של pentobarbital במינון של 150 מ"ג / ק"ג. לעקר את בית החזה והגב של העכבר באמצעות 70% אתנול.
הערה: ודא שהמתת החסד בוצעה בהצלחה לפני שתמשיך בנתיחת העכבר. - יש לגלח את אזור בית החזה ולהצמיד את הגפיים ללוח הדיסקציה באמצעות סרט הדבקה.
- באמצעות אזמל, בצעו חתך זהיר לאורך קו האמצע הגבי מהעורפית לאזור העצה (איור 2).
- בעזרת מיקרוסקופ כירורגי סטריאוסקופי יש לנתח בשכבות עד להגעה לעמוד השדרה המותני וזיהוי הקשת הקוסטלית האחרונה.
הערה: 13 הקשתות הקוסטליות מבוטאות בחוליות בית החזה; כאשר הם מנותחים, הם נראים עליונים על חוליה L12. - קבעו את החוליה הצווארית האחרונה ואת עצם העצה, ואז בצעו חתך כדי להפריד את עמוד השדרה (איור 2).
- באמצעות שימוש במלקחיים מנתחים, בצעו כריתת למינקטומיה גבית של החוליות כדי לחלץ את חוט השדרה (איור 3A-D).
הערה: למעט שתי החוליות הצוואריות הראשונות (אטלס וציר), כל החוליות הנעות חולקות עיצוב מורפולוגי משותף באזורים שונים (צוואר הרחם, בית החזה או מותני). כל חוליה ניידת טיפוסית כוללת גוף חוליה גלילי בקצה הקדמי שלה. לחלק האחורי של הגוף מחוברת קשת גרמית המכונה קשת חולייתית (קשת עצבית), המורכבת מתהליכים למינה ועמוד השדרה. בין מבנים אלה נמצא פתח החוליות15. - הסירו את העצבים היוצאים דרך הפורמינה (שורשים גביים וגחונים) שמרכיבים את מערכת העצבים ההיקפית ועשויים להכיל מקרופאגים שחדרו (איור 3D).
הערה: אין צורך להסיר את pia mater או את קרומי המוח מכיוון שתווך שיפוע הצפיפות מבטל ביעילות אסטרוציטים מזהמים. בנוסף, שמירה על קרומי המוח מפחיתה את זמן הטיהור ומשפרת את הכדאיות.
3. עיכול רקמות ובידוד של מיקרוגליה
- הניחו את חוט השדרה על לוח הניתוח, ובעזרת מספריים של Vannas, חתכו את חוט השדרה לחתיכות של 2 מ"מ, והניבו בממוצע 10 חלקים.
- העבירו את חלקי חוט השדרה למיקרו-צינורית שטוחה בנפח 2 מ"ל (איור 3E,F).
- הוסף 1 מ"ל של פתרון העבודה HBSS-LD (שלב 1.2). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 25 דקות, תוך ערבול נמרץ כל 5 דקות.
- מעבירים את התוכן של כל עיכול דרך מסננת של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן מוסיפים 7 מ"ל של HBSS עם 2% FBS כדי לנטרל את העיכול.
- למחוץ את הרקמה הנותרת באמצעות מזרק 1 מ"ל בוכנה. צנטריפוגה את המתלה בצינור חרוטי 50 מ"ל במשך 5 דקות ב 220 x גרם, 4 ° C.
- השליכו את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל, והשהו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל HBSS עם 2% FBS בצינור חרוטי של 15 מ"ל. שלב עם 2 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות איזוטונית 90%. צנטריפוגה למשך 25 דקות ב 160 x גרם, 18 ° C.
הערה: השתמש בהאצה איטית והימנע משימוש בבלם. - השתמש פיפטה העברה כדי לאחזר את הממשק ולהעביר אותו לצינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 220 x גרם, 4 ° C.
- השהה מחדש את התאים ב- DMEM-S (שלב 1.6) ושמור אותם מאוחסנים על קרח.
4. קביעת טוהר/כדאיות
- לכימות תאים בני קיימא באמצעות תא המוציטומטר, השתמש בכתם כחול טריפאן 0.4% (ראה טבלת חומרים).
הערה: בממוצע, עכבר יחיד מספק 4-6 מיליון תאים. - כדי לכמת תאים בני קיימא באמצעות ציטומטר זרימה, השתמש בצביעת צבע פלואורסצנטי תגובתי אמין זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- העבר מיליון תאים לתוך צינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה (FACS) של 5 מ"ל. לדלל את הצבע הפלואורסצנטי עם PBS ביחס של 1:1000 (יצירת פתרון עבודה כדאיות).
- לדגור את הדגימות עם פתרון קיימא בחושך ב 4 ° C במשך 30 דקות. שטפו את התאים עם PBS קר כקרח פעמיים. להשהות מחדש את התאים ב 400 μL של חיץ צביעה (שלב 1.4).
- חסום את התאים עם 2.4G2 anti-FcRIII/I (ראה טבלת חומרים) במאגר הצביעה הקר כקרח למשך 15 דקות ב- 4°C.
- ניסוח קוקטייל צביעת הנוגדנים על ידי הוספת נוגדנים חד-שבטיים בעלי תווית פלואורסצנטית CD45-PerCP ו-CD11b-eFluor 450 למאגר הצביעה (בדילול של 1:300) (ראה טבלת חומרים).
הערה: כאשר שתי הטכניקות זמינות, בחר את זו המתאימה ביותר לפרוטוקול הבא. - לדגור את הדגימות עם קוקטייל מכתים נוגדנים בחושך ב 4 ° C במשך 30 דקות. שטפו את התאים עם חיץ כתמים קר כקרח פעמיים. להשהות מחדש את התאים ב 400 μL של חיץ צביעה.
- רכוש 250,000 אירועים על ציטומטר זרימה, כפי שמתואר על ידי אסטרטגיית gating בשלב 6 (איור 4).
5. צביעה אימונופלואורסצנטית
- מניחים את הכיסוי המטופל מראש בבאר של צלחת בעלת 6 בארות.
הערה: כדי לטפל בכיסויים, הניחו אותם בצלחת פטרי עם תמיסת L-פוליליזין (0.01 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים במים מזוקקים ואפשרו להם להתייבש. - זרעו 200,000 תאים על הכיסוי המטופל באמצעות 500 μL של תמיסת DMEM-S. דגירה במשך 24 שעות.
- הסירו את הכיסויים וקיבעו את התאים באמצעות 3.7% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח.
- חדרו לתאים עם 0.2% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS קר. חסום את התאים עם 0.2% BSA ב- PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- יש לדלל את הנוגדנים החד-שבטיים בעלי התווית הפלואורסצנטית (בדילול של 1:300, ראו טבלת חומרים) בתמיסת החסימה ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח.
- החל אמצעי הרכבה המכיל DAPI על השקופית ולאחר מכן אטם אותה באמצעות כיסוי.
הערה: ניתן לנתח את השקופיות באופן מיידי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי, או לאחסן אותן עד 3 חודשים בטמפרטורה של -20°C.
6. אסטרטגיית Gating עבור מיקרוגליה חוט השדרה
- צור תרשים נקודה וקבע שער לבידוד תאים בני קיימא בהתבסס על צביעת כדאיות ותעלה פלואורסצנטית ריקה16. אל תכלול תאים שאינם בני קיימא.
- הפק חלקה נוספת תוך שימוש בפרמטרים של פיזור קדימה וצד כדי לסלק פסולת16.
- לפתח תרשים נקודה נוסף ולנתח את הביטוי של CD11b ו- CD45 כדי להבדיל מיקרוגליה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עיכול אנזימטי באמצעות רקמת חוט השדרה של עכבר בוצע באמצעות תערובת מועשרת מאוד בקולגנאז ותרמוליזין. הרקמה המעוכלת שנוצרה עברה מעבר דרך מסנן של 40 מיקרומטר כדי לחסל חומר לא מעוכל. התאים שנאספו הועשרו באמצעות שיפוע צפיפות פרקול, עם 90% בחלק התחתון ו-45% בחלק העליון. התאים המועשרים במיקרוגליה בתוך הממשק הוכתמו בנוגדנים CD45 ו-CD11b ועברו ניתוח ציטומטרי של זרימה (איור 1).
דיסקציה של עמוד השדרה המשתרע מאזור העורף אל העצה, כרוכה בחשיפה ודיסקציה של השרירים הפרא-חולייתיים. ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקולים רבים פותחו לחקר תאי מיקרוגליה בשל חשיבותם בהומאוסטזיס של המוח. בשיטות אלה, תאי מיקרוגליה מקורם בדרך כלל בהמיספרות מוחיות של חולדות ועכברים עובריים או יילודים17. מספר מצומצם של מחקרים התייחסו לטיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכברים בוגרים13,14. טכניקות אלה כוללות עיכול אנזימטי באמצעות collagenase ו / או פפאין יחד עם DNAse, לעתים קרובות בשילוב עם הפרדה הדרגתית באמצעות Percoll או OptiPrep. עם זאת, שימוש בעיכול חוט השדרה מבוסס פפא...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמלגה שהוענקה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (CONACYT) (702361). המחברים מודים לתוכנית הדוקטורט במדעי הכימיה הביולוגית של בית הספר הלאומי למדעים ביולוגיים של המכון הפוליטכני הלאומי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות איסוף 15 מ"ל | קורנינג, ארה"ב | 430790 | |
| 2 מ"ל מיקרו-צינורות | Axygen, ארה"ב | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, ארה"ב | 101302 | |
| צינורות איסוף 50 מ"ל | קורנינג, ארה"ב | 430829 | |
| 70% אתנול | |||
| אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (פניצילין, סטרפטומיצין, אמפוטריצין b) | Gibco, ארה"ב | 15240062 | |
| נוגדן CD11b eFluor 450 נגד עכברים | eBioscience, ארה"ב | 48-0112 | |
| נוגדן CD45 PerCP נגד עכבר | BioLegend, ארה"ב | 103130 | |
| תמיסת מלח מאוזנת (PBS) סידן- קורנינג ללא מגנזיום | , ארה"ב | 46-013-CM | |
| מסננת תאים כחולים 40 μ מ | קורנינג, ארה"ב | 352340 | |
| Costar 6 בארות ברורות לא מטופלות | קורנינג, ארה"ב | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| חימום דיגיטלי רועד Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, ארה"ב | 88870001 | |
| ניתוח מלקחיים למיקרו-כירורגיה | FT מאת DUMONT | ||
| DNase | Roche, ארה"ב | 4536282001 | |
| Dulbecco´ s נשר שונה וחריף; s גלוקוז בינוני-גבוה (DMEM) | Merck, ארה"ב | D6429 | |
| גילוח חשמלית | |||
| FACS צינור | תרמו, ארה"ב | 352058 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| ציטומטר זרימה ציטופלקס | בקמן קולטר | ||
| האנק תמיסת מלח מאוזנת | Merck, ארה"ב | H2387 | |
| L-גלוטמין | קורנינג, ארה"ב | ||
| Liberase TM | רוש, ארה"ב | 5401119001 | |
| לשכת נויבאואר Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, ארה"ב | צנטריפוגה שיפוע צפיפות 17089101 | |
| תמיסת פולי-L-ליזין | Merck, ארה"ב | P8920 | |
| אזמל מס' 25 | HERGOM, מקסיקו | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 מ"ל | Axygen, ארה"ב | 10011-680 | |
| מיקרוסקופ סטריאוסקופי | Velab, מקסיקו | HG927831 | |
| מספריים כירורגיים ישרים (10 ס"מ) | HERGOM, מקסיקו | ||
| מספריים ישרים של | HERGOM, מקסיקו | ||
| Triton X100 | Merck, ארה"ב | X100 | |
| כתם כחול טריפן 0.4% | Merck, ארה"ב | 15250-061 | |
| מערבל מערבולת | DLAB, סין | 8031102000 | |
| Zombie Aqua ערכת כדאיות ניתנת לתיקון | BioLegend, ארה"ב | 423102 | צביעת צבע פלואורסצנטי תגובתי לאמין |
מקורות
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205(2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
