מודל העכבר AcroSensE ושיטות הדמיה של תאים חיים המתוארים כאן מספקים גישה חדשה לחקר דינמיקת הסידן בתא התת-תאי של אקרוזום הזרע וכיצד הם מווסתים שלבי ביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואקסוציטוזה בזרע עכבר חי
במאמר זה
סיכום
תקציר
אקסוציטוזה אקרוזום (AE), שבה השלפוחית האקזוציטוטית היחידה של הזרע מתמזגת עם קרום הפלזמה, היא תהליך מורכב ותלוי סידן החיוני להפריה. עם זאת, ההבנה שלנו לגבי האופן שבו איתות סידן מווסת AE עדיין אינה שלמה. בפרט, יחסי הגומלין בין דינמיקת הסידן התוך-אקרוזומלית לבין שלבי הביניים המובילים ל-AE אינם מוגדרים היטב. במאמר זה אנו מתארים שיטה המספקת תובנות מרחביות וזמניות על דינמיקת הסידן האקרוזומלית והקשר שלה לאיחוי קרום ולאקסוציטוזה שלאחר מכן של שלפוחית האקרוזומים. השיטה משתמשת בעכבר מהונדס חדשני המבטא חיישן ממוקד אקרוזום לאקסוציטוזה (AcroSensE). החיישן משלב מחוון סידן מקודד גנטית (GCaMP) המאוחה עם mCherry. חלבון היתוך זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר תצפית בו זמנית של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואירועי איחוי ממברנה. ניטור בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ו-AE בזרע חי של AcroSensE מושג באמצעות שילוב של הדמיה בקצב פריימים גבוה ומערכת העברת חומרים ממריצים שיכולה להתמקד בזרע יחיד. פרוטוקול זה מספק גם מספר דוגמאות לשיטות בסיסיות לכימות וניתוח הנתונים הגולמיים. מכיוון שמודל AcroSensE מקודד גנטית, ניתן להעצים את חשיבותו המדעית על ידי שימוש בכלים גנטיים זמינים, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או שיטות מבוססות עריכה גנטית (CRISPR). בעזרת אסטרטגיה זו, ניתן לפתור את תפקידיהם של מסלולי איתות נוספים בקיבול הזרע ובהפריה. לסיכום, השיטה המתוארת כאן מספקת כלי נוח ויעיל לחקר דינמיקת סידן בתא תת-תאי ספציפי - אקרוזום הזרע - וכיצד דינמיקות אלה מווסתות את שלבי הביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.
מבוא
הזרע רוכש את היכולת להפרות בתהליך שנקרא קיבול1. נקודת קצה אחת של תהליך זה היא שהזרע רוכש את היכולת לעבור AE. יותר משני עשורים של נתונים תומכים בנוכחותו של מודל מורכב ורב-שלבי של AE בזרע יונקים (מסוכםב-2,3). עם זאת, חקר AE בזרע חי הוא מאתגר, והשיטות הזמינות כיום לניטור תהליך זה ברזולוציה נאותה הן מסורבלות ודורשות שלבי הכנה מרובים4, מוגבלות לזיהוי השלב הסופי של AE (למשל, באמצעות PNA5), מוגבלות למדידות של שינויים בסידן ציטוסולי (בניגוד לדינמיקה של סידן אקרוזומלי), או מוגבלים למדידות של דינמיקת סידן ציטוסולית או AE6.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו תחת ההנחיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קורנל (#2002-0095). עכברי AcroSensEבני 8-10 שבועות 2 שימשו במחקר הנוכחי. בקשות למידע על זמינותם של עכברי AcroSensE ניתן להגיש למחבר המתאים.
1. איסוף זרע ושטיפתו
- איסוף זרע קאודה אפידידימלי (פרטים נוספים על הליך זה מסופקים ב-11) מעכברי AcroSensE. אפשר 15 דקות לשחה החוצה בצלחת תרבית רקמה של 3.5 ס"מ המכילה 0.5 מ"ל של מדיום וויטן שונה (MW) ב 37 ° C. צלחת צריך להיות מכוסה כדי להפחית אידוי של MW, ויש להטות כך המדיום יש מספיק עומק כדי לכסות את אפידידימידים cauda.
הער....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 מספק המחשה פשוטה שמראה את רצף השינויים הפלואורסצנטיים הצפויים בעקבות גירוי מוצלח של זרע. הפאנל העליון של איור 2 מדגים את השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP3, כאשר האות עמום בתחילה (ריכוזי הסידן האקרוזומליים הבסיסיים נמוכים מ-GCaMP3 KD), ועם כניסתם של יוני סידן דרך נקבוביות היתוך, הפלואורסצנטיות עולה בבהירות. לבסוף, עם AE, יש אובדן אות עקב דיפוזיה ואובדן של החיישן לחלל החוץ תאי. הפאנל התחתון של איור 2 מדגים את הש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, מתוארת שיטה מבוססת מיקרוסקופיה המשתמשת במודל העכבר החדש שנוצר AcroSensE לניטור וניתוח בזמן אמת, תא בודד של יחסי הגומלין בין דינמיקת סידן אקרוזומלית ושלבי ביניים המובילים ל- AE. יחד עם גישות גנטיות זמינות, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או עריכת גנים, מודל ושיטה אלה מספקים מערכת רבת עוצמה לחקר תפקידם של רכיבים ומסלולים שונים המשתתפים במסלולי איתות זרע הקשורים לקיבול, AE והפריה.
שלבים קריטיים
חשוב בכל שלבי הטיפול בזרע להשתמש בפיפטות העברת פלסטיק גדולות או בק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לאף מחבר אין ניגודי אינטרסים לדווח עליו הקשורים לעבודה זו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01-HD093827 ו- R03-HD090304 (A.J.T).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מטרת שמן פי 100 | אולימפוס יפן | ||
| Sigma | C0926 | ||
| צלחת כיסוי 35 מ"מ, עובי 1.5 | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 מ"ל צינור עם תחתית עגולה | Falcon | 352054 | |
| בורוסיליקט זכוכית capilarries | Sutter Instrument Co. CA ארה"ב | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס יפן | אולימפוס FluoView | |
| גלוקוז | סיגמא | G7528 | |
| טיפ בוגר | TipOne, ארה"ב מדעי | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| חומצה לקטית | Sigma | G5889 | |
| מערכות דגירה של מיקרוסקופ תאים חיים | TOKAI HIT Shizuoka, יפן | דגם STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| חולץ מיקרופיפטה | Sutter Instrument Co. CA ארה"ב | דגם P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| פיפטה להעברת פלסטיק | פישרברנד | 13-711-6M | |
| פולי-D-ליזין | Sigma | P7280 | |
| חומצה פירובית | Sigma | 107360 | |
| מערכת אספקת תאים בודדים | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
מקורות
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal c....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
