מאמר שיטה

זיהוי פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד רב-גני בסרטן קיבה המבוסס על פלטפורמת ריצוף מוליכים למחצה של יון

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66058

⸱

10 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2Research and Development Department, Guangzhou Darui Biotechnology Co., Ltd, 3Key Laboratory of Antibody Engineering of Guangdong Higher Education Institutes, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 4Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, Southern Medical University

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

פרוטוקול זה מציע הליכי מעבדה הוליסטיים הנדרשים לאיתור פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בדגימות סרטן קיבה המבוססים על פלטפורמת ריצוף מוליכים למחצה של יונים. רצפי היעד, מתאמי קשירה, הגברה וטיהור ספרייה וקריטריונים לבקרת איכות מתוארים גם הם בפירוט.

תקציר

סרטן קיבה הוא גידול הטרוגני נפוץ. לרוב החולים יש סרטן קיבה מתקדם בזמן האבחנה ולעתים קרובות זקוקים לכימותרפיה. למרות 5-fluorouracil (5-FU) נמצא בשימוש נרחב לטיפול, הרגישות הטיפולית שלה סובלנות התרופה עדיין צריך להיקבע, אשר מדגיש את החשיבות של ניהול אישי. פרמקוגנטיקה יכולה להנחות את היישום הקליני של טיפול אישי. פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs), כסמן גנטי, תורמים לבחירת משטרי כימותרפיה ומינונים מתאימים. SNPs מסוימים קשורים למטבוליזם של פולאט, היעד הטיפולי של 5-FU. מתיל-אנטרה-הידרופולאט רדוקטאז (MTHFR) rs1801131 ו-rs1801133, דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR) rs1650697 ו-rs442767, מתיונין סינתאז (MTR) rs1805087, גמא-גלוטמיל הידרולאז (GGH) rs11545078 ומשפחת נשאי מומסים 19 חבר 1 (SLC19A1) RS1051298 נחקרו בסוגים שונים של סרטן ותרופות נוגדות פולאט, שיש להן פוטנציאל חיזוי ומשמעות מנחה עבור יישום של 5-FU. טכנולוגיית ריצוף המוליכים למחצה של הדור הבא של מבול היונים יכולה לזהות במהירות SNPs הקשורים לסרטן הקיבה. בכל פעם שבסיס מורחב בשרשרת דנ"א, H+ משתחרר, מה שגורם לשינויי pH מקומיים. החיישן היוני מזהה שינויי pH וממיר אותות כימיים לאותות דיגיטליים, ומשיג ריצוף על ידי סינתזה. לטכניקה זו יש דרישת דגימה נמוכה, הפעלה פשוטה, עלות נמוכה ומהירות ריצוף מהירה, המועילה להנחיית כימותרפיה אישית על ידי SNPs.

מבוא

סרטן קיבה הוא נטל כבד בתחום בריאות הציבור העולמי. על פי סטטיסטיקת הסרטן העולמית לשנת 2020, שפורסמה על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן (IARC), סרטן הקיבה הוא הסרטן החמישי המאובחן ביותר והגורם הרביעי המוביל למוות הקשור לסרטן. ברחבי העולם, שיעור ההיארעות המתוקנן לגיל במזרח אסיה הוא הגבוה ביותר בקרב גברים ונשיםכאחד 1. המופע של סרטן קיבה הוא חתרני, כלומר, חולים לעתים קרובות אין שום סימפטומים ברורים ספציפיים בשלב המוקדם. בקרב כלל חולי סרטן הקיבה, במדינות ללא בדיקות סקר שגרתיות, 80%-90% מהחולים מאובחנים בשלב מתקדם כאשר הגידול אינו ניתן לניתוח או חוזר תוך 5 שנים לאחר הניתוח2.

עבור סרטן קיבה מתקדם או גרורתי, כימותרפיה היא הטיפול העיקרי, אשר יכול לשפר את שיעור ההישרדות ואיכות החיים של החולים. עבור הטיפול הראשוני בחולים עם סרטן קיבה גרורתי, משטר פלטינה-פלואורופירימידין הוא הבחירה העיקרית למשטר כימותרפי קו ראשון3. Fluoropyrimidine כולל בעיקר 5-fluorouracil (5-FU) ונגזרות fluoropyrimidine דרך הפה, כגון capecitabine ו tegafur. המטרה העיקרית של 5-FU היא אנזימים הקשורים למטבוליזם של חומצה פולית, המעכבים את סינתזת הדנ"א ומאטים את צמיחת רקמת הגידול. תגובות שליליות לתרופות מגבילות את התועלת שלהן, עם שלשולים, רירית, דיכוי מיאלוסופרסיה, ותסמונת כף היד בין תופעות הלוואי השכיחות ביותר. דווח כי תגובה טיפולית ותגובות שליליות לתרופות קשורות קשר הדוק לגורמים במסלול המטבולי של חומצה פולית. יש לציין כי המוטציה ההומוזיגוטית של rs1801131 זוהתה כאינדיקטור לתסמונת כף היד (p = 4.1 x 10-6, OR = 9.99, 95% CI: 3.84-27.8)4. למרות fluoropyrimidines נמצאים בשימוש נרחב כימותרפיה נגד סרטן, הכימותרפיה שלהם היא מצב חירום נפוץ, גרימת כישלון טיפולי בטיפול בסרטן הקיבה. לדוגמה, שיעור התגובה הכולל הוא רק 10%-15% בקרב חולים עם סרטן מעי גס מתקדם שטופלו ב-5-FU רק5. כמו כן, fluoropyrimidines יש רעילות כי לא ניתן להתעלם. תגובות הרעילות המושרות על ידי 5-FU כוללות בעיקר שלשולים, תסמונת כף היד, סטומטיטיס, נויטרופניה, טרומבוציטופניה, רעילות עצבית ואפילו מוות6. רעילות חמורה הקשורה לטיפול מתרחשת ב-10%-30% מהחולים המטופלים בפלואורופירימידינים, ורעילות קטלנית מתרחשת ב-0.5%-1% מחולים אלה7.

מחקר איכות חיים של חולים עם סרטן קיבה מתקדם מצא כי שיעור התגובה היה פחות מ -50% עבור אלה שקיבלו כימותרפיה מבוססת 5-FU8. לכן, הבנת הגורמים הקשורים לרגישות של כימותרפיה מבוססת 5-FU חשובה במיוחד לטיפול מדויק כדי למקסם את קצב התגובה והיעילות תוך מזעור רעילות. בהתחשב בכך ש-5-FU קשור קשר הדוק למטבוליזם של פולאט, הווריאנטים הגנטיים של אנזימים במסלול המטבולי של פולאט עשויים להיות אחד הגורמים. כ-90% מהשונות ברצף האנושי מיוחסת למוטציות בסיס יחיד בדנ"א, הידועות כפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs)9. כאשר SNPs משנים את תכונות האנזים של מטבוליזם של חומצה פולית, זה עשוי להוביל להבדלים אינדיבידואליים ביעילות, רעילות ועמידות כימותרפית לפלואורואורציל בחולי סרטן קיבה.

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) משמש בעיקר להמרת 5,10-methylenetetrahydrofolate (5,10-MTHF) ל-5-methyltetrahydrofolate. 5-FdUMP, מטבוליט של 5-FU, יוצר טרינרי לא פעיל עם 5,10-MTHF וסינתאז תימידילט (TS), מעכב פעילות של TS ומוביל למחסור ב-dTMP10. הצטברות של 5,10-MTHF יכולה לשפר את השפעת העיכוב של 5-FU על TS, אשר מתואמת עם הפעילות של MTHFR. MTHFR rs1801131 ו- rs1801133 הם הפולימורפיזמים הנפוצים ביותר, הקשורים לפעילות אנזימים נמוכה יותר (ירידה של 75% עבור rs1801133 ו- 30% עבור rs181131) והצטברות של 5,10-MTHF11.

דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR) הוא האנזים העיקרי במטבוליזם של פולאט ובסינתזת DNA. DHFR מפחית דיהידרופולאט, באמצעות NADPH, לטטרה-הידרופולאט (THF) המשמש לנשיאת יחידת פחמן אחת. SNPs של DHFR עשויים להשפיע על הביטוי שלו, לשנות את הפעילות והשפע של THF, ולהשפיע עוד יותר על חילוף החומרים של פולאט ורגישות של 5-FU. מוטציה נקודתית ב- DHFR rs1650697 מתרחשת במקדם העיקרי של הגן DHFR , אשר מגביר את ביטוי DHFR12. מחקר מצא כי rs442767 קשור ליעילות ולרעילות של תרופות נוגדות חומצה פולית, כגון pemetrexed ו- methotrexate. לגבי SNP rs442767, גנוטיפ GT מסמל את התורשה של אלל G ואלל T באותו מוקד על הכרומוזומים ההומולוגיים מכל הורה. באופן דומה, הגנוטיפים GG ו-TT מציינים את התורשה של שני אללי G או שני אללי T, בהתאמה. בהשוואה לגנוטיפ GT+TT, GG קשור לירידה בהישרדות ללא אירועים ולסיכון מוגבר13. זה מצביע על כך rs442767 עשוי להוביל להשפעה פוטנציאלית מסוימת על 5-FU.

מתיונין סינתאז (MTR) מזרז את המתילציה מחדש של הומוציסטאין למתיונין, אשר ממלא תפקיד חשוב במטבוליזם של חומצה פולית. MTR rs1805087 הוא הפולימורפיזם הנפוץ ביותר של גן MTR . MTR rs1805087 מחליף גליצין בחומצה אספרטית באתר החלבון שעשוי להיות פונקציונלי, מה שעשוי להפחית את הפעילות של MTR. נבדקים עם אלל G היו בעלי רמת חומצה פולית מוגברת בפלזמה וירידה ברמת הומוציסטאיןבפלזמה 14. להיפך, מחקר הראה כי rs1805087 אין קשר מובהק סטטיסטית עם היעילות של 5-FU. אבל מחקר זה התמקד בסרטן המעי הגס וגודל המדגם היה קטן. הקשר בין rs1805087 לבין היעילות של 5-FU בחולי סרטן קיבה עדיין נחקר15.

גמא-גלוטמיל הידרולאז (GGH) הוא אנזים ליזוזומלי המווסת את ריכוזי הפולאט התוך-תאי. חומצה פטרואילגלוטמית היא שם נרדף לחומצה פולית המורכבת מפטרין, חומצה p-אמינומתילבנזואית וחומצה גלוטמית. ישנן שתי צורות של חומצה פולית באורגניזמים, מונוגלוטמט פולאט ופולאט פוליגלוטמטים. THF-פוליגלוטמט מומר אנזימטית לפולאט מונוגלוטמי על ידי GGH, ומשחרר בזה אחר זה מונו-גלוטמט (מונו-גלו) או די-גלוטמט (די-גלו)16. מחקר על ביטוי GGH בחולים עם סרטן קיבה מתקדם מקומי, הראה ביטוי GGH גבוה יכול להפחית 5,10-MTHF ו- TS, מה שאומר שרק מינון קטן של 5-FU נדרש כדי להשיג את ההשפעה מעכבת TS בחולים אלה17. GG הוא סמן ביולוגי פרוגנוסטי בחולים עם סרטן קיבה מתקדם מקומי המטופלים בכימותרפיה אדג'ובנטית לאחר הניתוח עם S-1, תרופה של 5-FU, וממלא תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס תוך תאי של חומצה פולית18. GGH rs11545078 הוא גרסה שגויה ומשנה את Thr-127 ל- Ile-127. מחקר המתמקד בספציפיות המצע של GGH מצביע על כך ש- rs11545078, בהשוואה לסוג בר, מביא ליעילות קטליטית גבוהה יותר ונמוכה יותר עבור מטוטרקסט והמבנה דומה לחומצה פולית19. יחד, חקירת הקשר בין rs11545078 לבין התוצאות הקליניות של 5-FU היא אסטרטגיה מבטיחה להבנת עמידות לתרופות.

Solute carrier family 19 member 1 (SLC19A1), המכונה גם מוביל פולאט מופחת, הוא חלבון טרנסממברנה מסייע טיפוסי המייבא פולאט מופחת שתאי יונקים חסרים את היכולת לסנתז דה נובו, המוכר כמעריך את תגובת הגידול ל- 5-FU20. עם זאת, רק מחקרים מעטים בוצעו לגבי הקשר בין 5-FU ופולימורפיזם SLC19A1 21. בחולים עם סרטן ריאות של תאים לא קטנים שקיבלו pemetrexed שהוא אנלוגי לחומצה פולית, rs1051298 על הגן SLC19A1 תרם להגדלת הסיכון לכל תגובה שלילית לתרופות ולירידה בהישרדות הכוללת22,23. SLC19A1 rs1051298, גרסה של 3'אזור לא מתורגם על מטבוליזם של חומצה פולית, עשויה לעזור להסביר חלק מההבדלים האישיים לגבי טיפול ב-5-FU. כאן המטרה היא להעריך את הקשר בין rs1051298 ותנגודת 5-FU בקרב חולים עם סרטן קיבה.

ערכה, המבוססת על ריצוף מוליכים למחצה, משמשת לזיהוי איכותי של גנים במבחנה (איור 1), אשר יכולה לזהות 7 SNPs נבחרים ב-5 גנים, מוטציות rs1801131 ו-rs1801133 של הגן MTHFR , rs1650697 ו-rs442767 מוטציות של גן DHFR , rs1805087 מוטציה של גן MTR , rs11545078 מוטציה של גן GGH ו-rs1051298 של SLC19A1 גן בדגימות רקמת גידול של חולי סרטן קיבה. ראשית, חומצת הגרעין הדגימה חולצה, ומקטע המטרה הוגבר במיוחד על ידי PCR. מתאם ריצוף אוניברסלי נוסף בשני הקצוות של מקטע הדנ"א כדי לבנות ספרייה שניתן להשתמש בה לריצוף. לאחר מכן נעשתה הגברה של ספריית הרצף על ידי PCR ליצירת תבנית רצף. התבנית החיובית הועשרה כדי לעמוד בדרישות הרצף. באמצעות מערכת ריצוף מוליכים למחצה, על ידי קיבוע גדיל הדנ"א בחור הזעיר של שבב המוליך למחצה. DNA פולימראז לוקח את הדנ"א החד-גדילי כתבנית ומסנתז את גדיל הדנ"א המשלים על פי עקרון זיווג הבסיס המשלים. בכל פעם שבסיס מורחב בשרשרת דנ"א, פרוטון משתחרר, מה שגורם לשינויים מקומיים ב-pH. חיישן יוני מזהה שינויי pH וממיר אותות כימיים לאותות דיגיטליים, כך שניתן לפרש בסיסים בזמן אמת, ולבסוף ניתן לקבל את רצף הבסיס של כל מקטע DNA. ניתוח ביואינפורמטיקה שימש כדי להתאים רצפים אלה למפת הייחוס של הגנום האנושי. כאשר גנים הקשורים לסרטן קיבה עוברים מוטציה, רצפי בסיס הדנ"א המתאימים שלהם ישתנו, כדי לקבל את מידע המוטציה של גנים קשורים.

התוצאה יכולה להציג מצב מוטציה גנטית ולספק התייחסות לרופאים לבחור סוגים ומינונים מתאימים של תרופות כימותרפיות ולחזות את עמידות התרופה לחולי סרטן קיבה. עם זאת, תוצאות הבדיקה הן להתייחסות קלינית בלבד ואינן מומלצות להיות הבסיס היחיד לטיפול פרטני בחולים. רופאים צריכים לקבל החלטה מקיפה המבוססת על מצבו של המטופל, אינדיקציות תרופתיות, תגובות טיפול ואינדיקטורים אחרים לבדיקות מעבדה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים ודגימות הרקמה של סרטן הקיבה (שלב 1), שהתקבלו מאנדוסקופיה או ניתוח של מערכת העיכול העליונה, ששימשו במחקר זה, נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה הרפואית ב -24 ביולי 2023 (NFEC-2023-298). מלבד זאת, פרוטוקול זה נועד אך ורק להמחיש זיהוי רב-גני בסרטן קיבה מבלי לעסוק בהשוואות עוקבה, ולכן הוא אינו מציב קריטריונים ספציפיים להכללת או אי הכללת חולים. המטופלים/המשתתפים נתנו את הסכמתם מדעת בכתב להשתתף במחקר זה.

1. הכנת בלוקים משובצים של סרטן קיבה

  1. הגדר את מערכת הטמעת הרקמות, הכוללת מאגר פרפין ומתקן, לצד פלטות חמות וקרות, בהתאם להנחיות ההפעלה שנקבעו.
  2. מוציאים את הרקמה המוכנה להטמעה מהמייבש ומפקידים אותה בחריץ האחסון של מרכז ההטבעה.
  3. בחרו תבניות הטבעה מתאימות בהתאם לגודל הרקמה, שפכו כמות מספקת של פרפין מומס כדי לכסות את הרקמה, ולאחר מכן מקמו את התבנית על הצלחת החמה.
  4. שלפו את הרקמה מהקלטות והניחו את רירית הקיבה בניצב לבסיס תבנית ההטבעה כדי להבטיח שמישור החתך חותך דרך כל שכבות הרקמה. מיישרים את הרקמה בתבנית.
  5. מניחים את הקלטת על החלק העליון של התבנית, ואחריה מזיגה משנית של פרפין, מילוי התבנית.
  6. מניחים את התבנית המשובצת על הצלחת הקרה, ולאחר התמצקות הפרפין, מוציאים את הבלוקים המשובצים מהתבניות.

2. מיצוי חומצת גרעין מדגימות

  1. השתמש בערכות מיצוי וטיהור של חומצות גרעין כדי לחלץ חומצות גרעין מדגימות רקמה משובצות פרפין.
  2. השתמש בכימות חומצת גרעין כדי לכמת את חומצת הגרעין המופקת. ריכוז חומצות הגרעין מומלץ להיות גבוה מ-2 ננוגרם/מיקרוליטר.
    הערה: החומרים המשמשים כאן זמינים בטבלת החומרים.

3. הכנה לספריית רצף

  1. הכנה לפני ניסוי
    1. הפעל את מנורת ה- UV בשולחן העבודה הנקי במיוחד, וחטא למשך 30 דקות. לאחר מכן, כבה את מנורת ה- UV והפעל את המאוורר כדי לאוורר למשך 10 דקות.
    2. הוציאו את חומצת הגרעין מהמקרר -20 ± 5°C, בדקו ורשמו את מזהה הדגימה, ברקוד חומצת הגרעין ומספר תג התווית הספציפי שהוקצה לדגימה. הניחו אותו על מדף צינורות הצנטריפוגה להמסה בטמפרטורת החדר (RT) לאחר האימות, וצנטריפוגו אותו למשך 10 שניות, עם 2,500 x גרם קבועים למצב המתנה.
  2. הגברה PCR של מקטע מטרה
    1. קח את תמיסת התגובה ללכידת שברים, פריימר הגברה של סרטן קיבה ופריימר הגברת היתוך מערכת המותאמת אישית לגילוי מפרקים רב-גנים של סרטן קיבה ושים אותם על קרח להמסת. נערו וערבבו אותם לאחר המסתם, צנטריפולטו אותם במשך 10 שניות והכינו מים נטולי נוקלאז. מידע מפורט על פריימר מוצג בטבלה 1.
      הערה: הערכה עדיין אינה זמינה מסחרית, צור קשר עם authotrs לפרטים נוספים.
    2. הכינו צינור תגובת PCR של 0.2 מ"ל, הוסיפו ריאגנטים לצינור בתורו לפי טבלה משלימה 1, ערבבו וערבבו במשך 5 שניות, וצנטריפוגייט באופן מיידי במשך 10 שניות, עם 2,500 x גרם קבועים, כך שלא יהיו טיפות ברורות על דופן הצינור והכיסוי. דגימות RNA ישועתקו לאחור ל-cDNA ולאחר מכן ישמשו לבניית הספרייה לאחר מכן. מוצרי cDNA יתווספו לצינורות בתורו בהתאם לטבלה משלימה 2.
    3. הניחו כל צינור תגובה על המחזור התרמי. עבור דגימות הדנ"א, הפעל את תוכנית ההגברה כמפורט בטבלה 2. עבור מוצרי cDNA, הפעל את תוכנית ההגברה כמפורט בטבלה 3.
  3. עיכול רצף פריימר
    1. הוציאו את אנזים העיכול הראשוני ושימו אותו על קרח להמסה. לאחר ההגברה, הוציאו את צינורות התגובה הנ"ל, הוסיפו 2 μL של אנזים עיכול פריימר לכל צינור, וודאו שהנפח הכולל הוא 22 μL.
    2. מערבלים ומערבבים את תמיסת התגובה בצינור ה-PCR ובצנטריפוגה באופן מיידי למשך 10 שניות, עם 2,500 x גרם קבועים.
    3. שים כל צינור תגובה על המחזור התרמי והפעל את התוכנית כמפורט בטבלה 4.
  4. קשירת מתאם
    1. שים את מתאם חיבור ריאגנטים על קרח כדי להתמוסס. הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, ולאחר מכן ערבבו כל רכיב לפי טבלה 5, וסמנו אותו כתערובת מתאם X.
      הערה: המתאם המחבר ריאגנטים כולל מתאמי P1 ומתאמים ספציפיים X, הממוספרים 1 עד 48. אלה נועדו לתייג באופן ייחודי דוגמאות שונות. בעת הוספת מתאם ספציפי, פתח רק צינור אחד בכל פעם כדי למנוע זיהום צולב של המתאם הספציפי. ניתן לאחסן את תערובת המתאם הספציפי המדולל בטמפרטורה של -20 ± 5°C למצב המתנה. בזרימות עבודה של ריצוף, דוגמאות אינן מעובדות בנפרד, אלא דוגמאות מרובות, שכל אחת מהן מתויגת במתאם ספציפי, משולבות בספריה מאוחדת, לצורך ריצוף. שיטה זו מאפשרת בידול עוקב של דגימות בהתבסס על רצפי המתאם הספציפיים שלהן.
    2. הוציאו את מוצר הפריימר המעוכל (22 מיקרוליטר) מהמחזור התרמי. מוסיפים ריאגנטים לצינור בתורו לפי טבלה 6, מערבלים ומערבבים במשך 5 שניות. צנטריפוגה במהירות נמוכה למשך 10 שניות, עם 2,500 x גרם קבועים, כך שאין נפילה ברורה על הקיר והכיסוי של הצינור.
    3. הניחו את צינור התגובה על המחזור התרמי. עבור דגימות הדנ"א, הפעל את תוכנית ההגברה כמפורט בטבלה 7. עבור מוצרי cDNA, הפעל את תוכנית ההגברה כמפורט בטבלה 8.
  5. טיהור מוצר קשירה והגברה
    1. הוציאו מראש את החרוזים המגנטיים לטיהור הדנ"א מהמקרר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס, ערבבו אותם באופן שווה וצנטריפולטו אותם באופן מיידי למשך 10 שניות, עם 2,500 x גרם קבועים. אזנו את החרוזים המגנטיים ב-RT למשך 30 דקות.
    2. הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ספיחה נמוכה והעבירו את תוצר תגובת הקשירה לצינור המתאים.
    3. הוסף 45 μL של DNA חרוזים מגנטיים מטוהרים לכל צינור, מערבל וערבב היטב, צנטריפואט מיידי במשך 10 שניות, ודגור ב RT במשך 5 דקות.
    4. הניחו את הצינור על מדף מגנטי למשך 3 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והימנעו מהוצאת החרוזים החוצה.
    5. העבירו 300 μL של אתנול 75% שהוכן לאחרונה לתוך צינור המיקרוצנטריפוגה, וסובבו בעדינות את הצינורות 4x ב-180°. לאחר הפתרון ברור, במהירות להשליך את supernatant. הימנעו מהוצאת החרוזים החוצה. חזור על הליך הכביסה פי 1 יותר.
    6. הסר את צינורות המיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל ממדף המגנטים, וצנטריפוגה לזמן קצר (10 שניות, עם 2,500 x גרם קבועים). החזירו את הצינורות למתלה המגנטים והפיפט החוצה את הנוזל שנותר. ודא שאין שאריות נוזל על דופן הצינור.
    7. פתח את המכסה של כל צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וייבוש החרוזים ב- RT למשך 5 דקות. שימו לב למצב היבש-רטוב של החרוזים. לאחר ייבוש החרוזים המגנטיים, בדקו שאין כתמי מים על פני השטח. האריכו את זמן הייבוש כראוי אם החרוזים המגנטיים רטובים מדי. סגרו את המכסה מיד אם מתגלים סדקים בחרוזים והמשיכו לשלב הבא כדי להגביר ולטהר את הספרייה.
  6. הגברה וטיהור הספרייה
    1. שים ריאגנטים הקשורים PCR על קרח לפירוק מראש, מערבל אותם, וצנטריפוגה אותם במשך 10 שניות. הסר את צינור המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ממדף המגנטים, החזיר את ה- PCR לצינור לפי טבלה 9 וסגור את המכסה והמערבולת למשך 5 שניות. צנטריפוגה קצרה (10 שניות) כדי לא לקבל נפילת נוזל ברורה על דופן הצינור וכיסוי.
    2. העבר את המוצר לעיל לצינור PCR חדש. לדגור את הדגימה על מחזור תרמי. עבור דגימות הדנ"א, הפעל את תוכנית ההגברה כמפורט בטבלה 10. עבור מוצרי cDNA, הפעל את תוכנית ההגברה כמפורט בטבלה 11.
    3. הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל עם ספיחה נמוכה. צנטריפוגה את צינור ה- PCR למשך 10 שניות לאחר הדגירה. העבר את המוצר מצינור ה- PCR לשפופרת ה- EP.
    4. הוסף 25 μL של DNA חרוזים מגנטיים מטוהרים לתוך כל צינור. מערבבים ומערבבים היטב, צנטריפוגות במהירות נמוכה ודגרים ב-RT במשך 5 דקות.
    5. הניחו את הצינורות על מדף מגנטי למשך 3 דקות והמתינו עד שהתמיסה תהיה ברורה. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים. הימנעו מהוצאת החרוזים החוצה.
    6. הוסף 60 μL של DNA חרוזים מגנטיים מטוהרים לתוך כל צינור. מערבבים ומערבבים היטב, צנטריפוגות במהירות נמוכה ודגרים ב-RT במשך 5 דקות.
    7. הניחו את הצינורות על מדף מגנטי למשך 3 דקות והמתינו עד שהתמיסה תהיה ברורה. השליכו את הסופרנטנט. הימנעו מהוצאת החרוזים החוצה.
    8. העבירו 300 μL של אתנול 75% שהוכן לאחרונה לתוך הצינורות, וסובבו בעדינות את הצינורות 4x בטמפרטורה של 180°. לאחר שהפתרון ברור, במהירות פיפטה ולהשליך את supernatant. הימנעו מהוצאת החרוזים החוצה. חזור על הליך הכביסה 1x.
    9. הסר את צינורות המיקרו-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל מהמדף המגנטי, והצנטריפוגה לזמן קצר (10 שניות). הכנס את הצינורות בחזרה למדף המגנטי והוציא את הנוזל שנותר. ודא שאין שאריות נוזל על דופן הצינור.
    10. פתח את המכסות של צינורות 1.5 מ"ל וייבוש החרוזים ב- RT למשך 5 דקות. שימו לב למצב היבש-רטוב של החרוזים. לאחר ייבוש החרוזים המגנטיים, אין כתם מים על פני השטח. האריכו את זמן הייבוש כראוי אם החרוזים המגנטיים רטובים מדי. סגור את המכסה מיד אם מופיעים סדקים על החרוזים.
    11. פיפטה 50 μL של eluent לתוך הצינורות, מערבולת ומערבבים היטב. צנטריפוגה קצרה (5 שניות, עם קבוע 2,500 x גרם) ומניחים את הצינורות ב RT במשך 5 דקות.
    12. הניחו את הצינורות על מדף מגנטי למשך 3 דקות והמתינו עד שהתמיסה תהיה ברורה. הוציאו בזהירות את הנוזל לתוך צינור חדש וסמנו את שם הספרייה.
    13. אחסנו את הספרייה במקרר בטמפרטורה של 2-8°C באופן זמני והמתינו לקביעה כמותית או אחסנו את הספרייה במקרר בטמפרטורה של -20 ± 5°C לאחסון לטווח ארוך.

4. כימות הספרייה הבנויה

  1. השתמש בכימות חומצת הגרעין כדי לכמת את הספריה. אם ריכוז הספרייה הוא ≥ 0.2 ng/μL, הוא מוסמך. אחרת, בנה מחדש את הספריה.
  2. מערבבים נפח שווה של DNA (או RNA) ומכמתים את התמיסה. על פי התוצאה הכמותית, לדלל את התמיסה המעורבת ל 100 pmol / L באמצעות הנוסחה הבאה.
    figure-protocol-1
    הערה: חלופה היא לדלל את הספרייה ל 100 pmol / L על פי הנוסחה, ולאחר מכן לכמת על ידי PCR כמותי פלואורסצנטי. ערבבו ספריות DNA (או RNA) באופן שווה בהתאם לתוצאות כמותיות של מכשיר PCR.
  3. ערבבו 100 pmol/L ספריית DNA וספריית RNA ביחס של 4:1. השתמש בתמיסה המעורבת של ספריית DNA ו- RNA לריצוף מחשב.

5. רצף

  1. בצע ריצוף על ידי התייחסות למדריך של הערכה האוניברסלית של תגובת רצף24,25 (שיטת ריצוף מוליכים למחצה).

6. בקרת איכות של דגימות

  1. בקרת איכות חיובית של DNA סרטן קיבה: לקחת את השליטה החיובית DNA של סרטן קיבה ולבצע את הבדיקה על פי ההוראות של הערכה. הבקרה מסופקת עם הערכה. התוצאה מראה כי MTHFR, DHFR, MTR, GGH ו SLC19A1 מוטנטים הגן מזוהים.
  2. בקרת איכות שלילית של DNA של סרטן קיבה: לקחת את השליטה השלילית DNA של סרטן קיבה ולבצע את הבדיקה על פי הוראות הערכה. הבקרה מסופקת עם הערכה. התוצאה מראה כי סוגים פראיים של MTHFR, DHFR, MTR, GGH וגנים SLC19A1 מזוהים.
    הערה: ודא עמידה בקריטריונים בשני המקרים, אחרת, נדרש זיהוי מחדש.

7. ניתוח נתונים

  1. הפעל את התוסף המתאים (Variant Caller, Coverage Analysis ו-Ion Reporter Software) בתוכנת Torrent Suite כדי לקבל את תוצאות הניתוח של הדגימות. שפטו את תוצאות זיהוי הדגימה בהתאם לתוצאות הניתוח של התוסף.

תוצאות

קביעת תוצאות הבדיקה מסתמכת על ערך השיפוט החיובי, המוכר גם כמרווח הייחוס. השתמש בשיטת ריצוף מוליכים למחצה כדי לזהות את הדגימות הקליניות שנאספו. כאשר ערך תדירות המוטציה של הגנים MTHFR, DHFR, MTR, GGH ו- SLC19A1 הוא ≥ 5%, תוצאת הזיהוי היא המוטציה של הגן המתאים. כאשר ערך תדירות המוטציה הוא < 5%, תוצאת הזיהוי היא הסוג הפראי של הגן המתאים26.

ניתן להשתמש בקריטריונים הבאים כדי לקבוע אם תוצאות הזיהוי אמינות. ראשית, אם הכיסוי הממוצע של תוצאות ריצוף הדנ"א הוא ≥ 500, והקריאות הממופות של תוצאות ריצוף הרנ"א הן ≥ 20000, תוצאות הבדיקה אמינות27. אחרת, מומלץ לבצע בדיקה חוזרת. שנית, הכיסוי הממוצע של בקרת איכות חיובית ל- DNA של סרטן קיבה הוא ≥ 500, ותוצאת הבדיקה צריכה להתאים למוטציות rs1801131 ו- rs1801133 של הגן MTHFR , rs1650697 ו- rs442767 מוטציות של גן DHFR , מוטציה rs1805087 של גן MTR , מוטציה rs11545078 של גן GGH ומוטציה rs1051298 של SLC19A1 גן כחיובי. אחרת, מומלץ לבצע בדיקה חוזרת. שלישית, הכיסוי הממוצע של בקרת איכות שלילית של DNA של סרטן קיבה הוא ≥ 500, ותוצאות הגילוי אמורות להראות כי כל האתרים בטווח הגילוי של ערכה זו הם מסוג פראי. אחרת, מומלץ לבצע בדיקה חוזרת. לבסוף, ריכוז הספרייה נמוך מ-0.2 ננוגרם/מיקרוליטר, מה שעשוי לנבוע מהתפרקות הדנ"א או הרנ"א בדגימה, או מאי מעקב קפדני אחר תהליך הניסוי או שימוש בריאגנטים שפג תוקפם במהלך הניסוי. התנאים הנ"ל עלולים לגרום לאיכות הרצף לרדת או להיכשל. מומלץ לבנות מחדש את הספרייה.

בעזרת ערכה זו, מתבצעת סדרה של שלבים לבניית ספריית רצף מדגימות קליניות. לאחר מכן הספרייה מרוצפת על פלטפורמת ריצוף מוליכים למחצה של יונים, כאשר ANNOVAR משמש לביאור התוצאות. לאחר ריצוף, מסמך משמש לסיכום סוגי המוטנטים עבור כל דגימה. היעדר סוג מוטנטי הצביע על כך שהדגימה לא עברה את המוטציה הספציפית הזו. טבלה משלימה3 מספקת דוגמה טיפוסית לכך. טבלה 12 כוללת מידע בסיסי על SNPs שזוהו כאן. ניתוח כל SNPs באמצעות ביאור מבוסס מסנן במסדי נתונים שונים, כגון 1000 Genomes Project (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; טבלה 13) ו-Exome Aggregation Consortium (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; טבלה 14), יכולה לגלות כי SNPs שונים נמצאים באופן משמעותי באוכלוסיות שונות.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמת זרימה עבור הפרוטוקול. תרשים זרימה של זיהוי רב גנים לסרטן קיבה בשיטת ריצוף מוליכים למחצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כרומוזוםמקוםמרווח עיצוב פריימרפריימר שמאליפריימר ימני
CHR111854475CHR1:11854175-11854775ACAGGATGGG
GAAGTCACAG		א
GGTCACAAAG
11856377CHR1:11856077-11856677CTTCAGGTCA
GCCTCAAAGC		TCCCTGTGGT
CTCTTCATCC
CHR579950780CHR5:79950480-79951080CGCCGCACAT
AGTAGGTTCT		CTTCCTCCTC
CAGCCCTATC
79951495CHR5:79951195-79951795CTTGGGTCAC
CTGCACAGTA		ATTTTGAAGC
ACCCAAGCTG
CHR1237048499CHR1:237048199-237048799GTCAAAGGCC
AGTCCCTTCT		CTCCCTTCAC
CAACTGTGCT
CHR863938763CHR8:63938463-63939063CAGTGAAGTT
CAGCGGCAT		TATTTTCCTGT
GTGGGGCAC
צרפת46934825CHR21:46934525-46935125CCAACCTGAG
ATGGCTTTTC		TCCTTGGTGC
TCTTGCTTTT

טבלה 1: פריימרים המשמשים לשבעת SNPs שנבחרו בחמישה גנים. גיליון זה מציג את המידע על מיקום הפריימרים של SNPs הקשורים לתנגודת 5-FU בסרטן קיבה.

טמפרטורהזמןלא. של מחזורים
99 מעלות צלזיוס2 דקותמחזור אחד
99 מעלות צלזיוס15 שניות22 מחזורים
60°C4 דקות
10°Cאחזמחזור אחד

טבלה 2: תוכנית מחזור תרמי להגברת DNA. מוצגים תנאי תגובה תרמית כגון טמפרטורה, זמן ומחזורים.

צעדטמפרטורהזמןלא. של מחזורים
הפעלת אנזימים99 מעלות צלזיוס2 דקותמחזור אחד
דנטורציה99 מעלות צלזיוס15 שניות30 מחזורים
אנאל והארכה60°C4 דקות
לשמר10°Cאחזמחזור אחד

טבלה 3: תוכנית מחזור תרמי להגברת cDNA. מוצגים תנאי תגובה תרמית כגון טמפרטורה, זמן ומחזורים.

טמפרטורהזמןלא. של מחזורים
50 °C10 דק'מחזור אחד
55 °C10 דק'מחזור אחד
60°C20 דק'מחזור אחד
10°Cאחזמחזור אחד

טבלה 4: תוכנית מחזור תרמי לעיכול רצף פריימר. מוצגים תנאי תגובות תרמיות כגון טמפרטורה, זמן ומחזורים.

רכיבנפח
מתאם P11.5 מיקרוליטר
מתאם ספציפי X1.5 מיקרוליטר
מים ללא Nuclease3 מיקרוליטר
נפח כולל של מערכת התגובה6 μL
X: מציין את מספר המתאם הספציפי

טבלה 5: רצף הוספת ריאגנטים להכנת תערובת מתאם. הוסף ריאגנטים לצינור בסדר המופיע כאן.

רכיבנפח
חיבור מאגר4 μL
תערובת מתאם X2 μL
ליגאז DNA2 μL
נפח כולל של מערכת התגובה30 מיקרוליטר

טבלה 6: רצף הוספת ריאגנטים לייצור פריימר מעוכל. הוסף ריאגנטים לצינור בסדר המופיע כאן.

טמפרטורהזמןלא. של מחזורים
22 °C30 דק'מחזור אחד
72 °C10 דק'מחזור אחד
10°Cאחזמחזור אחד

טבלה 7: תוכנית מחזור תרמי לחיבור מתאם לדנ"א. מוצגים תנאי תגובות תרמיות כגון טמפרטורה, זמן ומחזורים.

טמפרטורהזמןלא. של מחזורים
22 °C30 דק'מחזור אחד
68°C5 דקותמחזור אחד
72 °C5 דקותמחזור אחד
10°Cאחזמחזור אחד

טבלה 8: תוכנית מחזור תרמי לחיבור מתאם ל- cDNA. מוצגים תנאי תגובות תרמיות כגון טמפרטורה, זמן ומחזורים.

רכיבנפח
פתרון תגובה של הגברה בספרייה50 מיקרוליטר
תערובת פריימר ספרייה2 μL
נפח כולל של מערכת התגובה52 מיקרוליטר

טבלה 9: רצף הוספת ריאגנטים להגברה. הוסף ריאגנטים לצינור בסדר המופיע כאן.

טמפרטורהזמןלא. של מחזורים
98 °C2 דקותמחזור אחד
98 °C15 שניות5 מחזורים
60°C1 דקות
10°Cאחזמחזור אחד

טבלה 10: תוכנית מחזור תרמי להגברת ספריית DNA. מוצגים תנאי תגובות תרמיות כגון טמפרטורה, זמן ומחזורים.

טמפרטורהזמןלא. של מחזורים
98 °C2 דקותמחזור אחד
98 °C15 שניות5 מחזורים
64°C1 דקות
10°Cאחזמחזור אחד

טבלה 11: תוכנית מחזור תרמי להגברת ספריית cDNA. מוצגים תנאי תגובות תרמיות כגון טמפרטורה, זמן ומחזורים.

rs1801131rs1801133rs1650697rs442767rs1805087rs11545078rs1051298
RefTGAGAGG
אלטGAGTGAA
Func.ref
GeneWithVer		אקסוניאקסוניUTR5במעלה הזרםאקסוניאקסוניUTR3
Gene.ref
GeneWithVer		MTHFRMTHFRDHFRDHFRMTRג"גSLC19A1
GeneDetail
.refGeneWithVer		..NG_023304.1:
g.5020T>G		...NM_001205206.1:
ג.*64ג>ט;
NM_001205207.1:
ג. *746ג>ט;
NM_194255.2:ג.
*746C>T
ExonicFunc
.refGeneWithVer		לא שם נרדף;
SNV		לא שם נרדף;
SNV		..לא שם נרדף;
SNV		לא שם נרדף;
SNV		.
AAChange.ref
GeneWithVer		MTHFR:NM_00
1330358.1:exo
n8:c.A1409C:p.
E470A; MTHFR:
NM_005957.4:
exon8:c.A1286
C:P.E429A		MTHFR:NM_00
1330358.1:exo
n5:c.C788T:p.
A263V; MTHFR:N
M_005957.4:ה
xon5:c.C665T:
עמ' A222V		..מטר:NM_0012
91939.1:exon2
5:c.A2603G:p.
D868G; MTR:N
M_001291940.
1:exon25:c.A1
535ז:עמ' ד512ז;
MTR:NM_0002
54.2:אקסון26:ג.
A2756G:p.D91
9 גרם		GGH:NM_003878
.2:exon5:c.C452T:
עמ' T151I		ג'ין
cytoBand1p36.221p36.225Q14.15Q14.11Q438רב12.321Q22.3

טבלה 12: מידע רלוונטי של SNPs. ביאור הדגימות באמצעות ANNOVAR.

MTHFRDHFRMTRג"גSLC19A1
rs1801131rs1801133rs1650697rs442767rs1805087rs11545078rs1051298
1000g2015aug_all0.2494010.2454070.768570.2901360.2182510.0854630.524361
1000g2015aug_afr0.15130.090.93490.03180.28440.0560.5772
1000g2015aug_amr0.15130.47410.7550.39910.17720.04030.4323
1000g2015aug_eas0.21920.29560.66070.58530.10520.08730.5635
1000g2015aug_eur0.31310.36480.75550.31910.1730.09240.4493
1000g2015aug_sas0.41720.11860.67790.2280.32110.14830.5552

טבלה 13: ביאור מבוסס מסנן של SNPs בפרויקט 1000 גנומים.

MTHFRDHFRMTRג"גSLC19A1
rs1801131rs1801133rs1650697rs442767rs1805087rs11545078rs1051298
ExAC_ALL0.2950.3037..0.20910.0936.
ExAC_AFR0.15880.1124..0.26660.0545.
ExAC_AMR0.15550.5141..0.18640.0361.
ExAC_EAS0.21480.3052..0.11320.0824.
ExAC_FIN0.31280.2227..0.18920.0581.
ExAC_NFE0.31910.345..0.19190.0969.
ExAC_OTH0.3040.3062..0.21080.0973.
ExAC_SAS0.41530.1409..0.3160.165.

טבלה 14: ביאור מבוסס מסנן של SNPs ב- Exome Aggregation Consortium.

טבלה משלימה 1: רצף הוספת ריאגנטים להגברת DNA. הוסף ריאגנטים לצינור בסדר המופיע כאן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: רצף הוספת ריאגנטים להגברת cDNA. הוסף ריאגנטים לצינור בסדר המופיע כאן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 3: דוגמה לתוצאות ריצוף דגימות קליניות. רק מוטציות הקיימות בדגימות יירשמו במסמכים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

מומחים קליניים מסכימים פה אחד כי חולים, אפילו עם אותו סוג ושלב של סרטן קיבה, יכולים להיות תגובות שונות במידה ניכרת לגישה טיפולית זהה. שנים של מחקר גילו למדענים כי הווריאציות האינדיבידואליות מיוחסות בעיקר לאופיו של סרטן הקיבה כאוכלוסייה תאית הטרוגנית, פולימורפית ומגוונת, מה שמוביל לפערים אינדיבידואליים משמעותיים בתגובות לטיפול28. כתוצאה מכך, רכישת דגימות סרטן קיבה באמצעות אנדוסקופיה של מערכת העיכול העליונה או ניתוח ודגימות דם, יחד עם ריצוף בתפוקה גבוהה לניתוח גנטי, מאפשרים טיפול מותאם אישית בסרטן הקיבה. אסטרטגיה זו נועדה לשפר את יעילות הטיפול הקליני ולהפחית את הסיכון לתופעות לוואי רעילות חמורות. ההתקדמות בטכנולוגיית ריצוף מוליכים למחצה ליונים הפכה את הטיפול המותאם אישית למציאות מעשית29.

הנה כמה מגבלות של שיטת בדיקה זו. הערכה המשמשת כאן מיועדת בעיקר לאבחון חוץ גופי , ולכן היא מוגבלת לאיתור מוטציות של rs1801131 ו- rs1801133 של הגן MTHFR , rs1650697 ו- rs442767 של גן DHFR , rs1805087 של גן MTR , rs11545078 של גן GGH ו- rs1051298 של SLC19A1. מוטציה במקטעים אחרים אינה ניתנת לזיהוי. בשל הטרוגניות משמעותית ברקמת הגידול, מיקומי דגימה שונים עשויים להשפיע על תוצאות האיתור. עבור דגימות רקמה משובצות פרפין המאוחסנות למשך זמן ארוך יותר, DNA ו- RNA עשויים להתפרק במידה מסוימת, ולהשפיע על תוצאות הבדיקה. איסוף, הובלה ועיבוד בלתי סבירים של דגימות, כמו גם תפעול ניסויי וסביבת ניסוי בלתי תקינים עלולים להוביל לתוצאות שליליות שגויות או חיוביות כוזבות. לא ניתן להבטיח את תוצאת הזיהוי אם ריכוז חומצת הגרעין נמוך מ-2 ננוגרם/מיקרוליטר. תוצאות הבדיקה של הערכה הן להתייחסות קלינית בלבד. יש לשקול את בחירת הטיפול המותאם אישית לחולים בשילוב עם הסימפטומים / הסימנים שלהם, ההיסטוריה הרפואית, בדיקות מעבדה אחרות ותגובות הטיפול. תוצאות שליליות אינן יכולות לשלול לחלוטין את קיומה של מוטציה בגן המטרה. תוצאות שליליות יכולות להיגרם גם על ידי מעט מדי תאי גידול בדגימה, השפלה מוגזמת של חומצת גרעין או ריכוז גן המטרה במערכת תגובת ההגברה מתחת לגבול האיתור.

חלק ממדדי הביצועים של הערכה המשמשת הם כמתואר. רגישות אנליטית: עבור דגימות DNA, הכמות המינימלית הניתנת לזיהוי של חומצת הגרעין הכוללת בערכה זו היא 10 ננוגרם, וניתן לזהות שיעור מוטציות של 5%. עבור דגימות RNA, הכמות המינימלית הניתנת לזיהוי של חומצת הגרעין הכוללת בערכה זו היא 10 ננוגרם. שיעור צירופי מקרים חיוביים ושליליים: שיעור צירופי המקרים החיוביים והשליליים מגיע ל -100%. מגבלת זיהוי (LOD): ניתן להשתמש בסך הכל ב-14 הפניות LOD, ממוספרות L1-L14. L1-L11 הוא הפניות LOD של גנים MTHFR, DHFR, MTR, GGH ו- SLC19A1 , ותוצאות הזיהוי שלהם צריכות להיות שסוגי המוטציות של אתרי הגנים המתאימים הם חיוביים, ושיעורי צירוף המקרים הם 100%. חזרתיות: ניתן להשתמש בסך הכל בחמישה חומרי עזר חוזרים, ממוספרים R1-R5. R1 הוא חומר ייחוס חיובי חזק החוזר על עצמו (rs67376798 מוטציה של הגן DPYD ). R2, המכיל מוטציה זו במספר קטן יותר, הוא חומר ייחוס חיובי חוזר חלש (rs67376798 מוטציה של גן DPYD ), R3 הוא חומר ייחוס שלילי חוזר (6 אתרים של הגנים DPYD, MTHFR ו- ABCB1 מזוהים כסוג פראי). כל מדגם ייחוס חייב להיבדק 10 פעמים, כדי להבטיח שהתוצאות של הערכות חוזרות אלה תואמות את הסיווגים שהוגדרו מראש. נפח הנתונים: נפח הנתונים האפקטיבי של דגימות DNA ו- RNA צריך להיות נשלט מעל 0.05 M. עומק הריצוף של דגימות DNA יהיה מבוקר מעל 500, והקריאות הממופות של דגימות RNA יהיו מבוקרות מעל 20000. בדיקת הפרעה: ערכה זו אינה מושפעת מחומרי הפרעה אנדוגניים (טריגליצרידים ואלבומין) ומחומרי הפרעה אקסוגניים (פורמלין ואלכוהול מיובש).

יש להקפיד על אמצעי זהירות מסוימים במהלך הניסוי. הערכה המשמשת כאן יכולה לשמש רק לבדיקות חוץ גופיות. אנא קרא מדריך זה בעיון לפני הניסוי והשתמש בו במהלך תקופת התוקף. לא ניתן להשתמש ברכיבי הערכה באצוות שונות לסירוגין. מומלץ להשתמש בחומרים מתכלים חד פעמיים לערכה זו למניעת זיהום. במהלך השימוש בערכה זו, מומלץ להשתמש בראש יניקה עם אלמנט מסנן. על מנת למנוע סיכונים ביולוגיים פוטנציאליים בדגימה, יש להתייחס לדגימת הבדיקה כאל חומרים זיהומיים כדי למנוע מגע עם העור והקרום הרירי. מומלץ לטפל בדגימות בארון בטיחות ביולוגית שיכול למנוע יציאת אירוסולים. מבחנות ופראיירים המשמשים בפעולה יש לעקר לפני שהם מושלכים. הפעלת הדגימות וסילוקן יעמדו בדרישות החוקים והתקנות הרלוונטיים: הנחיות כלליות לבטיחות ביולוגית של מעבדות ביו-רפואיות מיקרוביאליות ותקנות טיפול בפסולת רפואית של משרד הבריאות30,31. על אנשי הניסוי לקבל הכשרה מקצועית, לפעול בהתאם להנחיות ולהקפיד על הפרדה בין האזורים בהתאם לתהליך הניסוי. מכשירים וציוד מיוחדים ישמשו בכל שלב של פעולת הניסוי, ולא ייעשה שימוש בפריטים בכל שלב של כל אזור לסירוגין. על אנשי הניסוי להפריד בקפדנות בין האזורים בהתאם לתהליך הניסוי. מכשירים וציוד מיוחדים ישמשו בכל שלב של פעולת הניסוי. יש לנקוט באמצעי הגנה לפי הצורך, כגון כפפות, בגדי עבודה וכו'. פינוי פסולת יעמוד בתקנות הלאומיות הרלוונטיות.

למרות שהמוקד של מאמר זה הוא על שבעת SNPs בתוך חמישה גנים הקשורים לסרטן קיבה, הריצוף ביישומים מעשיים אינו מוגבל לחמשת הגנים האלה בלבד. מאמר זה קובע באופן סופי מתאם משמעותי בין שבעת SNPs לבין הרגישות לכימותרפיה 5-FU בסרטן קיבה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי חקר המנגנון והתפקיד של מסלול ERK2/Snai1/AGPS/PUFA-PL בעמידות תאי סרטן קיבה לפרופטוזיס המושרה על ידי אפאטיניב (מספר פריט: 82172814), בתמיכת הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין; חקירת התפקיד והמנגנון של גורם שעתוק אצבע אבץ 1 בוויסות עמידות תאי סרטן קיבה לפרופטוזיס המושרה על ידי אפאטיניב באמצעות מסלול פוספוליפידים אתר רב בלתי רווי (מספר פריט: 2022A1515010267), בתמיכת הוועדה המחוזית של גואנגדונג למימון מחקר בסיסי ויישומי; והמחקר והיישום של מגיב לאבחון רגישות 5-FU לסרטן קיבה (מספר פריט: 201903010072), פרויקטים מדעיים וטכנולוגיים בגואנגזו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות 1.5 מ"ל DNA LoBindEppendorf30108051
צינורות 50 מ"לGreiner Bio-One227261
פריימר הגברה של סרטן הקיבהThermo Fisherהפריימרים מסונתזים על ידי Thermo Fshier לפי הרצף ב<חזק>טבלה 1.
DeparaffinizationQiagen19093
DNA טיהור חרוזים מגנטייםBechkmanA63881
אלכוהול אתיליגואנגג'ואו מגיב כימי
מפעל תרמו פישר מדעי		http://www.chemicalreagent.com/
יון AmpliSeq ספריית ערכת 2.0Thermo Fisher4480441
מים ללא נוקלאז טכנולוגיותצינורות PCR AM9932
צינורות AxygenPCR-02D-C
צינורות PCRAxygenPCR-02D-C
קצות פיפטה מוצרים מדעיים איכותייםhttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA מיני עמודיםתרמו פישרA29839
Recoverכל ערכת בידוד חומצות גרעין כוללתתרמו פישרAM1975
מיני צנטריפוגה שולחניתSCILOGESS1010E
טכנולוגיות חייםשל מחזור תרמי4375786
מנתח חומצות גרעין אולטרה-מיקרוBEIJING ORIENTAL SCIENCE & פיתוח טכנולוגי בע"מBD-1000
חיי

מקורות

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8, (2017).
  3. Shah, M. A., et al. Immunotherapy and targeted therapy for advanced gastroesophageal cancer: Asco guideline. J Clin Oncol. 41 (7), 1470-1491 (2023).
  4. Loganayagam, A., et al. Pharmacogenetic variants in the dpyd, tyms, cda and mthfr genes are clinically significant predictors of fluoropyrimidine toxicity. Br J Cancer. 108 (12), 2505-2515 (2013).
  5. Giacchetti, S., et al. Phase iii multicenter randomized trial of oxaliplatin added to chronomodulated fluorouracil-leucovorin as first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 18 (1), 136-147 (2000).
  6. Hoff, P. M., et al. Comparison of oral capecitabine versus intravenous fluorouracil plus leucovorin as first-line treatment in 605 patients with metastatic colorectal cancer: Results of a randomized phase iii study. J Clin Oncol. 19 (8), 2282-2292 (2001).
  7. Meulendijks, D., et al. Clinical relevance of dpyd variants c.1679t>g, c.1236g>a/hapb3, and c.1601g>a as predictors of severe fluoropyrimidine-associated toxicity: A systematic review and meta-analysis of individual patient data. Lancet Oncol. 16 (16), 1639-1650 (2015).
  8. Sadighi, S., Mohagheghi, M. A., Montazeri, A., Sadighi, Z. Quality of life in patients with advanced gastric cancer: A randomized trial comparing docetaxel, cisplatin, 5-fu (tcf) with epirubicin, cisplatin, 5-fu (ecf). BMC Cancer. 6, 274(2006).
  9. Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
  10. Ladner, R. D. The role of dutpase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy. Curr Protein Pept Sci. 2 (4), 361-370 (2001).
  11. Capitain, O., et al. The influence of fluorouracil outcome parameters on tolerance and efficacy in patients with advanced colorectal cancer. Pharmacogenomics J. 8 (4), 256-267 (2008).
  12. Askari, B. S., Krajinovic, M. Dihydrofolate reductase gene variations in susceptibility to disease and treatment outcomes. Curr Genomics. 11 (8), 578-583 (2010).
  13. Ceppi, F., et al. DNA variants in dhfr gene and response to treatment in children with childhood b all: Revisited in aieop-bfm protocol. Pharmacogenomics. 19 (2), 105-112 (2018).
  14. Sharp, L., Little, J. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia: A huge review. Am J Epidemiol. 159 (5), 423-443 (2004).
  15. Yousef, A. M., et al. The association of polymorphisms in folate-metabolizing genes with response to adjuvant chemotherapy of colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 82 (2), 237-243 (2018).
  16. Schneider, E., Ryan, T. J. Gamma-glutamyl hydrolase and drug resistance. Clin Chim Acta. 374 (1-2), 25-32 (2006).
  17. Moran, R. G. Roles of folylpoly-gamma-glutamate synthetase in therapeutics with tetrahydrofolate antimetabolites: An overview. Semin Oncol. 26 (2), 24-32 (1999).
  18. Maezawa, Y., et al. High gamma-glutamyl hydrolase and low folylpolyglutamate synthetase expression as prognostic biomarkers in patients with locally advanced gastric cancer who were administrated postoperative adjuvant chemotherapy with s-1. J Cancer Res Clin Oncol. 146 (1), 75-86 (2020).
  19. Cheng, Q., et al. A substrate specific functional polymorphism of human gamma-glutamyl hydrolase alters catalytic activity and methotrexate polyglutamate accumulation in acute lymphoblastic leukaemia cells. Pharmacogenetics. 14 (8), 557-567 (2004).
  20. Zhang, Q., et al. Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human slc19a1. Nature. 612 (7938), 170-176 (2022).
  21. Ulrich, C. M., et al. Polymorphisms in folate-metabolizing enzymes and response to 5-fluorouracil among patients with stage ii or iii rectal cancer (int-0144; swog 9304). Cancer. 120 (21), 3329-3337 (2014).
  22. Zhang, X., et al. Discovery of novel biomarkers of therapeutic responses in han chinese pemetrexed-based treated advanced nsclc patients. Front Pharmacol. 10, 944(2019).
  23. Corrigan, A., et al. Pharmacogenetics of pemetrexed combination therapy in lung cancer: Pathway analysis reveals novel toxicity associations. Pharmacogenomics J. 14 (5), 411-417 (2014).
  24. Ion 520 & ion 530 ext kit - chef user guide. Thermofisherscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0015805_Ion520_530ExTKit_UG.pdf (2023).
  25. Ion genestudio s5 instrument user guide. Thermofisherscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0017528_Ion_GeneStudio_S5_Instrument_UG.pdf (2023).
  26. Parkin, N. T., et al. Multi-laboratory comparison of next-generation to sanger-based sequencing for hiv-1 drug resistance genotyping. Viruses. 12 (7), 694(2020).
  27. Ziller, M. J., Hansen, K. D., Meissner, A., Aryee, M. J. Coverage recommendations for methylation analysis by whole-genome bisulfite sequencing. Nat Methods. 12 (3), 230-232 (2015).
  28. Lordick, F., et al. Unmet needs and challenges in gastric cancer: The way forward. Cancer Treat Rev. 40 (6), 692-700 (2014).
  29. Kumar, K. R., Cowley, M. J., Davis, R. L. Next-generation sequencing and emerging technologies. Semin Thromb Hemost. 45 (7), 661-673 (2019).
  30. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. Ministry of Health of the People's Republic of China. WS 233-2002. Chinese Centres for Disease Control and Prevention. , 1-64 (2002).
  31. China Environmental Protection Industry. Medical waste management regulations. China Environmental Protection Industry. (1), 6-10 (2004).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון


Formal Correction: Erratum: Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform
Posted by JoVE Editors on 6/05/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66058

תגיות

5 FluorouracilDNAPCR

מאמרים קשורים