הפרוטוקול כאן מדגים זרימת עבודה מהירה ומתוקננת של הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר הלקוח (M-ROSE), הכוללת שלושה שלבים: יצירת שקופיות, צביעה ופענוח. פרוטוקול זה יסייע לרופאים לקבל החלטות קליניות מהירות.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
הפרוטוקול כאן מדגים זרימת עבודה מהירה ומתוקננת של הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר הלקוח (M-ROSE), הכוללת שלושה שלבים: יצירת שקופיות, צביעה ופענוח. פרוטוקול זה יסייע לרופאים לקבל החלטות קליניות מהירות.
ההתחלה המהירה של טיפול אמפירי אנטי זיהומי היא קריטית בחולים המציגים זיהום ריאתי בלתי מוסבר. למרות שרכישת הדמיה היא פשוטה יחסית בפרקטיקה הקלינית, חוסר הספציפיות שלה מחייב לעתים קרובות בדיקות נוספות הגוזלות זמן רב כגון תרבית כיח, תרבית נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי או ריצוף גנטי כדי לזהות את האטיולוגיה הבסיסית של המחלה במדויק. יתר על כן, היעילות המוגבלת של טיפול אמפירי אנטי זיהומי עלולה לתרום לשימוש לרעה באנטיביוטיקה. ההתקדמות האחרונה בפענוח רקע מיקרוביאלי בשקופיות הערכה מהירה באתר (ROSE) אפשרה לרופאים להשיג דגימות במהירות באמצעות ברונכוסקופיה (למשל, שטיפת נאדיות, צחצוח רירית, מהדק רקמות), מה שמקל על צביעה לצד המיטה ופרשנות המספקת מידע רקע מיקרוביאלי חיוני. כתוצאה מכך, זה מבסס בסיס לפיתוח טיפול ממוקד נגד זיהום ותוכניות טיפול תרופתי אישיות. עם הבנה טובה יותר של אילו פתוגנים גורמים לזיהומים בזמן אמת, רופאים יכולים להימנע מאנטיביוטיקה רחבת טווח מיותרת התורמת לעמידות לאנטיביוטיקה. הקמת תהליך עבודה מהיר וסטנדרטי של M-ROSE במחלקות לרפואה נשימתית או ביחידות לטיפול נמרץ תסייע רבות לרופאים לגבש אסטרטגיות טיפול מדויקות לחולים, דבר שיש לו השלכות קליניות משמעותיות.
הטכניקה של הערכה מהירה באתר (ROSE) היא שיטה יעילה ביותר המיושמת בתחום הליכי מחלות ריאה. הוא מאפשר דגימה בזמן אמת והתערבות אבחנתית, ומאפשר ניתוח ציטולוגי מיידי1. גישה חדשנית זו כוללת הטבעה של חלק מדגימת הרקמה על שקופית תוך שמירה על שלמותה. אחד היתרונות העיקריים של ROSE טמון ביכולתו להקל על פרשנות מהירה של מידע קליני באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה מיוחדות. זה כולל ניתוח של מורפולוגיה של התא, סיווג, כימות, קביעת יחסים מרכיבים, הערכת סידור, ניתוח מתאם, הערכת רקע, וזיהוי של אובייקטים זרים. על ידי שילוב כל הנתונים הללו עם המידע הקליני של המטופל, ROSE ממלא תפקיד מרכזי בהערכת הלימות הדגימה ובהנחיית הליכים וטכניקות התערבותיות בזמן אמת2.
כחברת בת של טכנולוגיית ROSE, טכנולוגיית M-ROSE מתמקדת בעיקר ברכישת הרקע המיקרוביולוגי של נגעי מטרה במקום להבחין בין תאים שפירים לממאירים 3,4. מצד אחד, M-ROSE מאפשר זיהוי מיקרוסקופי של פתוגנים כגון אספרגילוס, קריפטוקוקוס, פנאומוציסטיס וקנדידה5. מצד שני, יש לו השלכות מנחות משמעותיות בהערכת איכות הדגימות הנשימתיות, הבחנה בין מחלות זיהומיות ללא זיהומיות, הבחנה בין זיהום לזיהום, כמו גם הערכת חומרת זיהום ופרוגנוזה 6,7. לדוגמה, בתוך דגימה נשימתית, דו-קיום של חיידקים בעלי מורפולוגיה זהה לצד חדירת תאי דלקת מצביע על זיהום; לעומת זאת, נוכחותם של חיידקים רבים בעלי מגוון מורפולוגי המלווים בתאי אפיתל מצביעה על זיהום. היכולת לנתח באופן מקיף מידע קליני ולחזות תוצאות הופכת את M-ROSE לכלי רב ערך בהליכים של מחלות ריאה.
לסיכום, ROSE משמש כנשא ציטולוגי חיוני המשפר משמעותית את היעילות והדיוק של אבחון מחלות ריאה. יכולותיו הרב-גוניות תורמות לשיפור תוצאות המטופלים בכך שהן מבטיחות התערבות בזמן ומקלות על אבחון מדויק באמצעות טכניקות דגימה והתערבות אבחונית בזמן אמת. עם זאת, חשוב לציין כי התקדמות זו מסתמכת על השגת דגימות מוסמכות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול M-ROSE סטנדרטי הכולל הכנת שקופיות, טכניקות צביעה והנחיות פרשנות. פרוטוקול זה משמש כנקודת התייחסות רבת ערך עבור קלינאים כדי לקבוע תוכניות הערכה וטיפול מדויקות תוך הקלה על קבלת החלטות לגבי טיפול עוקב בדגימות מטרה.
הניסוי הקליני אושר על ידי ועדת האישורים של בית החולים צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית (מס '2022-ky-31). המקרה הטיפוסי כלל חולה שאובחן עם דלקת ריאות פנאומוציסטיס, והתקבלה הסכמה מדעת מהמטופל.
1. דרישות ציוד וחומרים עבור ROSE
2. זרימת עבודה של M-ROSE
במקרה טיפוסי, גבר בן 63 הגיע לבית החולים עם שיעול, חום וכאבים בחזה. החולה אובחן בעבר עם תסמונת נפרוטית, המאופיינת בפרוטאינוריה ובבצקת, וקיבל טיפול בפרדניזון וטקרולימוס במשך זמן רב. ממצאי המעבדה הראשוניים הדגימו ספירת תאי דם לבנים של 10.49 x 109/L, ספירת נויטרופילים של 8.87 x 109/L, חלבון מגיב C בדם מלא וריכוזים (1-3)-β-D-גלוקן של 155.81 מ"ג/ליטר ו-249.7 pg/mL. סריקת טומוגרפיה ממוחשבת בחזה (CT) הראתה אופסיפיקציה של זכוכית קרקע במיקום מפוזר, דו-צדדי ומרכזי (איור 3A). טיפול אנטי זיהומי ראשוני עם cefoperazone tazobactam לא היה יעיל, הסימפטומים שלו הוחמרו על ידי עייפות לבבית, קוצר נשימה, קוצר נשימה, קוצר נשימה לאחר פעילות גופנית; הדמיית CT חוזרת לא הראתה שיפור משמעותי (איור 3B). לאחר מכן הועבר החולה ליחידה לטיפול נמרץ לצורך הנשמה מכנית ועבר ברונכוסקופיה. הדגימה הממוקדת נעשתה בהנחיית ניווט וירטואלי, ונאספו שלוש דגימות ביופסיה של מלקחיים (איור 4). ROSE היה זמין להערכה מיקרוסקופית מיידית של הרקמה, והאבחנה של Pneumocystis jiroveci אושרה (איור 5A). החולה קיבל מיד טיפול אנטי פטרייתי עם sulfamethoxazole (1.92 גרם, q6h); כתמים מאוחרים יותר (איור 5B-E) אישרו את האבחנה הזו. עם זאת, הדמיות CT חוזרות עדיין לא הראו שיפור משמעותי (איור 3C). המטופל קיבל carbofungin (היום הראשון של 70 מ"ג ואחריו 50 מ"ג ביום), methylprednisolone (80 מ"ג ביום), ו immunoglobulin (10 גרם ביום) עבור זיהום פטרייתי. הסימפטומים הוקל במהירות, והמטופל המשיך בטיפול המשך.

איור 1: ציוד וחומרים. (A) מיקרוסקופ ציטולוגי ומערכת הדמיה גרפית. (B) תמיסת צביעה Diff Quik (DQ) A. (C) תמיסת צביעה Diff Quik (DQ) B. (D) כפפות לטקס ללא אבקה. (E) שקופיות של תרבית תאים סטרילית. (F) מחטי מזרק חד פעמיות בנפח 2.5-5 מ"ל. (ז) נייר סופג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זרימת עבודה של M-ROSE. (A) הדפסת השקופית. (B) השקיעו את המגלשה בתמיסת Diff A למשך 10-30 שניות. (C) שטפו את המגלשה באמבט הצבע PBS כדי להסיר עודפי תמיסת Diff A. (D) כתם ונגב את שאריות הנוזל מהשקופית בנייר סופג. (E) טבלו את המגלשה בתמיסת Diff B למשך 20-40 שניות. (F) נקו את המגלשה במיכל צביעת המים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: צילומי CT חזה. (A) בעת הקבלה. (ב) ביום ההעברה לטיפול נמרץ. (C) לאחר הטיפול של sulfamethoxazole אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: לוקליזציה של המקטע הבסיסי האחורי של האונה התחתונה של הריאה הימנית על-ידי VBN. (A) סימפונות ראשיים ימניים. (B) סימפונות אמצעיים ימניים. (C) מקטע בזאלי אחורי של סימפונות באונה התחתונה של הריאה הימנית. (D) מפה תלת-ממדית של VBN. (E) מפה קורונלית של CT חזה. (F) מפה צירית של CT חזה. (G) מפת קשת של CT חזה אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות המתעדות הופעת פנאומוציסטיס בשיטות צביעה שונות. (א) ורד 100 x 10; חץ לבן: ציסטות המכילות אסקוספורים. (B) המטוקסילין ואוזין (H-E), 60 x 10. (C) כחול אלקיאני, 60 x 10. (D) GIEMSA, 40 x 10. (E) כסף בחן, 20X10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
פולמונולוגיה התערבותית היא ענף חשוב של מחלות נשימה מודרניות; בפרט, זה כבר בשימוש נרחב באבחון של מחלות ריאה 8,9. בשנים האחרונות, פולמונולוגיה התערבותית אבחנתית משגשגת בשל שכיחות מוגברת של גידולים ממאירים ריאתיים, יותר זיהומים פתוגניים עמידים לתרופות המתרחשים בדרכי הנשימה התחתונות, ובקשות לאבחון של מחלות נשימה מבלבלות וקריטיות 10,11,12. יעילות האבחון ההתערבותי תלויה בגורמים כמו גודל והמיקום האנטומי של אזורי מוקד, שיעורי סיבוכים ומספר אתרי ביופסיה, ומחלות רקע, קידום השימוש הקליני בטכנולוגיות ובמתקנים מתקדמים רבים13. ROSE זכתה לתשומת לב יוצאת דופן והתפתחה במהירות כ"טכניקת ליווי בזמן אמת" לאבחון בפולמונולוגיה התערבותית.
ROSE מיועד להערכה מהירה, אבחון ראשוני ותעדוף שביעות רצון הדגימה במהלך הליכים כגון ניקוב, ביופסיה והברשה. הוא מספק משוב כדי להנחות את ההתקדמות הטכנולוגית הבאה 14,15,16,17. M-ROSE, ענף של ROSE, מתמקד בעיקר בהערכת הרקע המיקרוביאלי ולא בהערכת ממאירות תאי רקמה5. שיטת M-ROSE היא טכניקת הערכה מהירה ולא כלי אבחון, ולכן אין להפריז ביעילותה האבחנתית. היישום הקליני שלה כולל בעיקר את ההיבטים הבאים: זיהוי חזותי של מיקרואורגניזמים פתוגניים מסוימים, הבחנה בין זיהום לזיהום, ואפליה בין זיהום ללא זיהום7.
לאחר צביעה מהירה, גרעין התא של הרקמה הציג גוון ארגמני-אדום, בעוד הציטופלסמה הציגה צבע כחלחל-סגול. חיידקים ופטריות נראו כחולים, וכתוצאה מכך נוצר ניגוד מובהק בין תאי רקמה לפתוגנים7. M-ROSE יכול להדגים רמה מסוימת של יכולת בזיהוי חיידקים ופטריות. באופן ספציפי, הוא מציג שיעור חיובי גבוה עבור Aspergillus, cryptococcus, Pneumocystis jiroveci, ופטריות אחרות 3,18. עם זאת, יש לו מגבלות כשמדובר בזיהוי פתוגנים עם נפח וקוטר קטן או סוכני פתוגניים תאיים. חשוב להדגיש כי האבחנה של כל מחלה צריכה להתבסס על הערכה מקיפה הכוללת את מצבו הבסיסי של המטופל, ביטויים קליניים, בדיקות הדמיה וגורמים אחרים ולא להסתמך רק על זיהוי מיקרוסקופי של מיקרואורגניזמים פתוגניים.
M-ROSE מציעה גם יתרונות בזיהוי זיהום וזיהום, כגון הערכת האיכות של דגימות נוזל שטיפה בנאדיות. במחלקות בהן התנאים מאפשרים זאת, ניתן לבצע הערכה של נוזל שטיפה באמצעות צנטריפוגה וצביעה. דגימות מוסמכות של נוזל שטיפת מכתשית מראות כי שיעור תאי הקשקש בין כל התאים (למעט תאי דם אדומים) תחת מיקרוסקופ בעוצמה נמוכה הוא פחות מ-1%, תאי אפיתל טוריים פחות מ-5%, ותאי דם אדומים נמוכים מ-10% (לא כולל גורמים הקשורים לטראומה או דימום)19. הבדיקה המיקרוסקופית של הרקע הציטולוגי תקל עלינו לבצע הערכות בזמן.
יתר על כן, M-ROSE יכול לסייע בהבחנה בין נגעים נגועים ולא נגועים5. בנגעים נגועים, יש לעתים קרובות חדירה של נויטרופילים, מקרופאגים, ולימפוציטים על ידי תאים דלקתיים, עם תצפית מדי פעם של phagocytosis נויטרופילים. לעומת זאת, נגעים שאינם נגועים בדרך כלל חסרים חדירת תאים דלקתיים.
הפרוטוקול המוצג כאן מדגים את תהליך הפעולה של M-ROSE; באמצעות פרשנות הרקע המיקרוביולוגי, ניתן לבצע את האבחנה הראשונית או לצמצם את האבחנה המבדלת. כפי שעולה מהממצאים שלנו, האבחנה של PCP דורשת ראיות מאושרות של Pneumocystis jiroveci, אשר לא צריך להתבסס על ביטויים קליניים והדמיה, אפילו בחולים סימפטומטיים בסיכון גבוה. זיהוי מיקרוסקופי של צורות אסקוס וטרופיות הוא הראיה האינטואיטיבית ביותר. יעילות האבחון נקבעת במידה רבה על ידי שיטת הצביעה של הדגימה. מבחינה היסטורית, כתמים קונבנציונליים כגון Wright's-Giemsa, כסף הקסאמין וכחול טולוידין זמינים עבור PCP אך הם גוזלים זמן רב ובעלי רגישות נמוכה יותר. במקרה זה, האבחנה המיידית של PCP אושרה ביום הראשון להעברת המטופל לטיפול נמרץ עם שימוש ברוז. Diff-quick הראה את יתרונו בזיהוי פנאומוציסטיס המאופיין במבנה ברור, ניגודיות חדה וזיהוי קל של ascus (איור 5A).
ביישום הרפואה האתנית, ROSE מחזיקה גם ערך משמעותי. לדוגמה, במחלות סופורטיביות, רופאים יכולים לזהות מגוון רחב של תאים דלקתיים הנשלטים בעיקר על ידי נויטרופילים בתוך הרקע המיקרוביולוגי5. כתוצאה מכך, תרופות עם תכונות ניקוי חום וניקוי רעלים ניתן לבחור כטיפולים פוטנציאליים עבור תנאים אלה, כגון יערה, שן הארי, פטריניה, בין היתר.
מאז ROSE היא תוכנית נוספת כי לא צריך להיות נבחר פולמונולוגיה התערבותית, ביצוע ROSE חייב להגדיל את עלויות העבודה והכלכלה. זה שנוי במחלוקת כי ROSE צריך לשמש על בסיס קבוע. במונחים של היתרונות של כלכלה, זמן ועלויות עבודה הם מה שאנחנו מודאגים לגביו. הצורך העיקרי בעבודה נוספת הוא המעריך. הערכת ROSE יכולה להתבצע על ידי ציטוטכנולוג, פתולוג או קלינאי. ציטוטכנולוגים הם כוח האדם הסביר ביותר להליך ROSE. עם זאת, בפרקטיקה הקלינית, קלינאים מחליפים את התפקיד, אך הוא עשוי לדרוש בסיס הכשרה מסוים15. מחקר קודם הראה כי תוכנית הכשרה יכולה לעזור לשפר את הדיוק של הערכת הלימות המבוצעת על ידי קלינאים, ולמנוע משתנים מבלבלים20. בנוסף, M-ROSE, כטכניקת אבחון מורפולוגית, יש גורמים סובייקטיביים בדו"ח התוצאות שלה. על הרופאים לבצע הערכה מקיפה המבוססת על מידע קליני נוסף.
אנו ממליצים לבתי חולים עם מתקנים מתאימים ואנשי מקצוע מיומנים לשקול ליישם את נוהל ROSE במחלקות הנשימה או בטיפול נמרץ שלהם, מכיוון שהוא יכול להקל על הערכה מוקדמת של מחלות קריטיות נשימתיות מאתגרות ולהנחות טיפול קליני ביעילות.
המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.
אנו מעריכים את פרויקט התמריץ וההדרכה לביצועים של מוסד המחקר המדעי בצ'ונגצ'ינג (jxyn-2021-1-15 ו- jxyn-2021-2-6) לתמיכה כספית.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיקרוסקופ ציטולוגי | Olympus Corporation | CX43 | |
| Diff Quik (DQ) פתרונות צביעה | Besso Biotechnology Co. Ltd | G1541 | |
| חד פעמי 2.5-5 מ"ל מחטי מזרק | שאנדונג ג'ו פרמצבטיקה 20183150304 | ||
| כפפות לטקס ללא אבקה | Henan Yadu Industrial Co., LTD | 20182140728 | |
| תא סטרילי מגלשות תרבות | ג'ינאן Preret תעשייה ומסחר ושות', בע"מ | 7101 |
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה