הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דגימת דם של ורידים תת-קלאביים בחולדות מודעות

5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66075

⸱

3 בנובמבר 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Urology, Lanzhou University Second Hospital, 2Key Laboratory of Gansu Province for Urological Diseases, 3Gansu Nephro-Urological Clinical Center, 4The First Clinical Medical College of Lanzhou University, 5The Second Clinical Medical College of Lanzhou University, 6Medical Experimental Center of Lanzhou University

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

כאן אנו מציגים שילוב של הגבלת חולדות יעילה ושיטות ניקור ורידים תת-קרקעיות המאפשרות איסוף דם מהיר, בטוח וחוזר בחולדות ללא הרדמה.

תקציר

ישנן מספר שיטות מבוססות לקבלת דגימות דם חוזרות מחולדות, כאשר השיטות הנפוצות ביותר הן דגימת ורידים צידיים בזנב ללא הרדמה ודגימת ורידים ג'וגולריים בהרדמה. עם זאת, רוב השיטות הללו דורשות סיוע וציוד הרדמה ולעיתים מציבות קשיים מבחינת איסוף הדם או האיכות הירודה של דגימות הדם. בנוסף, שיטות איסוף דם אלה גוזלות זמן ומשאבי אנוש משמעותיים כאשר נדרשת דגימת דם חוזרת למספר רב של חולדות. מחקר זה מציג טכניקה לדגימת דם חוזרת בחולדות לא מורדמות על ידי אדם מיומן יחיד. דגימות דם משביעות רצון מאוד ניתן להשיג על ידי ניקוב הווריד subclavian. השיטה הדגימה שיעור הצלחה כולל מרשים של 95%, עם זמן חציוני של 2 דקות בלבד מריסון החולדות ועד להשלמת איסוף הדם. יתר על כן, ביצוע איסוף דם רצוף בטווח המיועד אינו גורם נזק לחולדות. שיטה זו שווה לקדם לאיסוף הדם, במיוחד במחקרים פרמקוקינטיים בקנה מידה גדול.

מבוא

חולדות הן אחת מחיות הניסוי הנפוצות ביותר, וישנן דרכים רבות להשיג דגימות דם. עבור ניסויים הכוללים איסוף דם יחיד בשלב הסיום, כמות מספקת של דם ניתן להשיג באמצעות ניקוב לב או איסוף דם אבי העורקים הבטני1. עם זאת, מחקרים מסוימים דורשים איסוף דם חוזר מחולדות לצורך בדיקת דם שגרתית או ביוכימית, במיוחד במחקרי פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה, שבהם נדרשת איסוף דם חוזר כדי לקבוע את הספיגה, ההפצה והמטבוליזם של תרופות2.

כיום, למרות שאיסוף דם וורידי זנב היא השיטה הנפוצה ביותר לדגימת דם מחולדות, למרות שאינה דורשת הרדמה, שיטה זו יכולה להיות מאתגרת לאיסוף חוזר, ונפח הדם שנאסף קטן יחסית 3,4. בנוסף, למרות שניתן לאסוף דם מהוורידים הספנוס והפין , כמות הדם המתקבלת מוגבלת, והרדמה נדרשת 1,5. יתר על כן, דגימות דם שנאספו ממקלעת הוורידים התת-לסתית, כמו גם ורידים תת-לשוניים, ג'וגולריים וסובקלאביים מספקים דגימות באיכות גבוהה יותר, אך בדרך כלל דורשים הרדמה או סיוע של מספר אנשים 1,6,7,8,9. לבסוף, איסוף דם רטרו-אורביטלי בסינוסים/תעלה לא רק מצריך הרדמה, אלא גם עלול לגרום לפציעה ולחץ לחולדות9.

איכות דגימות הדם המתקבלות בדרך כלל מוורידים ראשיים היא בדרך כלל ברמה הגבוהה ביותר1. כיום, מחקרים מסוימים מצאו כי מיקרו-דגימה רציפה דרך הווריד הצווארי היא שיטה מתאימה מאוד למחקר טוקסיקולוגי בחולדות, אם כי שיטה זו דורשת בדרך כלל צנתור ורידים ג'וגולרי 10,11,12. לכן, כדאי לבחון כיצד להשיג דגימות דם באיכות גבוהה בהתאם לעיקרון 3R של מחקר בבעלי חיים ללא התערבות כירורגית. מטרת המחקר הייתה להציג שיטה לשאיבה יעילה של דם מהווריד הסובקלאבי בחולדות. טכניקה זו מאפשרת איסוף מהיר של דגימות משביעות רצון באמצעות הליך של אדם אחד ללא צורך בהרדמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה דבק בהנחיות המפורטות במהדורה השמינית של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה13. המחקר קיבל אישור מוועדת האתיקה של בית החולים השני של אוניברסיטת לאנז'ו ותועד בהתאם להנחיות ARRIVE 2.014. 12-16 חולדות וויסטאר בריאות (שישה זכרים במשקל 290-330 גרם ושש נקבות במשקל 250-280 גרם) בגילאי 12-16 שבועות שוכנו במעבדת בעלי החיים GLP באוניברסיטת לאנז'ו במשך 3 ימים לפני הניסוי בפועל. כלובי החולדות בהם נעשה שימוש היו מסוג R5, בגודל 545 מ"מ x 395 מ"מ x 200 מ"מ, וצוידו בחומר מצע אוטוקלאבי. לכל החולדות ניתנה גישה בלתי מוגבלת הן למזון והן למים. המעבדה שמרה על לחות ממוצעת של 25%, טמפרטורה ממוצעת של 24 מעלות צלזיוס ומחזור אור לסירוגין בין היום ללילה (7:00 בבוקר/19:00). בסיום המחקר, כל בעלי החיים עברו המתת חסד הומנית באמצעות מנת יתר של איזופלורן. למידע מקיף על החומרים והמכשירים בהם נעשה שימוש במחקר זה, עיין בטבלת החומרים.

1. חישוב גודל מדגם ובחירת בעלי חיים

  1. בחר את משוואת המשאבים בשיטה15 כדי להעריך את גודל מדגם בעלי החיים באמצעות משוואה (1).
    E = המספר הכולל של בעלי חיים − מספר כולל של קבוצות (1)
    כאשר E היא מידת חופש הניתוח של השונות (ANOVA) ונעה בין 10 ל -20.
    הערה: במחקר זה, 12 בעלי חיים חולקו לשתי קבוצות A ו - B (שלושה זכרים ושלוש נקבות בכל קבוצה).
  2. הגדר את התוצאה העיקרית של מחקר זה כשיעור ההצלחה וצריכת הזמן של דגימת דם חוזרת על ידי אדם יחיד.
  3. הגדירו את מדדי התוצאה המשניים כשינויים במשקל גוף החולדה, צריכת מזון ומים, וכן שכיחות תופעות לוואי (כגון שברים בעצם הבריח, המטומות תת עוריות, דלקת ריאות ותמותה).
  4. להגדיר דגימת דם מוצלחת כעונה על הקריטריונים הבאים: 1) פחות משלושה נקבים לאיסוף דם יחיד; 2) זמן כולל (מריסון חולדות ועד השלמת איסוף הדם) שלא יעלה על 5 דקות; ו-3) השגת נפח הדם הממוקד תוך קבלת פלזמה שקופה. ראו בכל חריגה מקריטריונים אלה כשל דגימה.

2. ריסון בעלי חיים ואיסוף דם

הערה: דגימות דם מחולדות מקבוצה A ו-B נאספו על ידי שני חוקרים מנוסים, ששניהם לקחו לפחות 100 דגימות דם. דגימות דם נאספו משתי קבוצות החולדות במשך 96 פעמים במשך 4 ימים. שיטת איסוף דם זו אינה דורשת הרדמה או אמצעי ריסון נוספים עבור החולדות. עם זאת, זה דורש טכניקות טיפול מיומנות.

  1. בשעה 8:00 בבוקר ביום שלפני דגימת הדם (יום 1), הקצו כל חולדה לכלוב האישי שלה בזמן שקילת המזון והמים שלה. לאחר מכן, בקשו מחוקר נוסף, עיוור למדידות, לרשום את משקל החולדות, צריכת המזון וצריכת המים שלהן בכל יום בשעה 8:00 בבוקר מהיום הראשון ואילך.
  2. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, תחילה לשאוב דם בשעה 10:00 בבוקר ולאחר מכן בשעה 22:00 בכל יום, לאסוף 0.15 מ"ל של דם לסירוגין מן הוורידים subclavian משני הצדדים.
    הערה: כמות הדם שיש לאסוף נקבעה לפי הנפח המרבי שהחולדה בעלת המשקל הנמוך ביותר יכלה לסבול תוך שבוע.
  3. שוטפים מזרק בנתרן הפרין (25 U/mL) ומחטאים את מקום ההזרקה באלכוהול.
  4. לטפו בעדינות את עורה האחורי של החולדה וצבטו את צווארה שוב ושוב כדי לעזור לחולדה להירגע (סרטון 1).
  5. בעזרת האגודל והאצבע המורה של היד הלא דומיננטית, אחזו והרימו את עור הצוואר של החולדה בחוזקה (איור 1A ווידאו 1).
  6. בעזרת קואורדינציה מהיד הדומיננטית, השתמשו בשלוש האצבעות ובכף היד הנותרות כדי לאבטח את העור האחורי של החולדה ולשתק את הגפיים הקדמיות שלה (איור 1B,C ווידיאו 2).
    הערה: אם החולדה מתנגדת או נאבקת, ניתן לחזור על הליך זה מספר פעמים כדי לעזור לחולדה להתרגל לטיפול. השלבים הבאים הם המפתח לאיסוף דם מוצלח.
  7. בעזרת האצבע המורה של היד הלא דומיננטית, דחפו בעדינות כלפי מטה את עור ראשה של החולדה בעוד האצבעות האחרות, יחד עם כף היד, מסייעות לסובב כלפי חוץ את מפרק הכתף. במהלך התהליך הזה, השתמשו ביד הדומיננטית כדי להאריך באופן מלא את מפרק הכתף של החולדה (איור 1D-F ווידאו 2).
  8. אחזו בחולדה בחוזקה ביד הלא דומיננטית כדי ליישר את ראשה וגופה של החולדה בקו ישר (איור 1G,H). לאחר מכן, השתמשו ביד הדומיננטית כדי לאתר את מיקום עצם הבריח ולאשר את מיקום הניקוב (איור 1I, וידאו 2 ווידאו 3).
    הערה: גילוח החולדה אינו הכרחי. באיור 1, הגילוח נעשה רק כדי להראות את תנוחת עצם הבריח והניקוב במידה רבה יותר. כאשר מרסנים חולדות, במיוחד חולדות >350 גרם, מתן אפשרות לחולדה להניח את רגליה על משטח מוצק יעזור לתמוך במשקל גופם. בנוסף, על המשנן לעקוב אחר קצב הנשימה של כל חולדה בזמן איסוף הדם כדי לוודא שהריסון אינו הדוק מדי, מה שעלול לגרום למצוקה נשימתית.
  9. החזקת המזרק במקביל לגוף החולדה ביד הדומיננטית, כאשר קצה המחט פונה כלפי מעלה וסולם המזרק לכיוון הנסיין, שומרים על זווית של כ-15 מעלות עם קו האמצע של גוף החולדה. הכניסו את המחט 0.5 ס"מ מתחת לחריץ עצם הבריח (בצומת של השליש הפרוקסימלי של עצם הבריח ועצם החזה), וודאו שהמחט נשארת מקבילה לגוף החולדה (איור 1J ווידאו 3).
    הערה: יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לזווית ולעומק החדרת המחט כדי למנוע פירסינג בכלי הדם או גרימת נזק בשוגג לכלי דם סמוכים.
  10. משכו מעט בעדינות את המזרק כדי ליצור לחץ שלילי, המלווה לעיתים קרובות בתחושה מוחשית של פריצת דרך עם הכניסה לכלי הדם (בולט במיוחד במהלך איסוף הדם הראשוני). שמרו על תנוחה זו ואספו 0.1-1.0 מ"ל דם במהירות קבועה לפי הצורך (בהתאם להנחיות IACUC של כ-4-5.3 מ"ל/ק"ג דם בשבוע1) (איור 1K ווידאו 3).
  11. אם אין דם בעת הניקוב, נסה לכוונן בעדינות את הזווית והעומק של המחט או סובב בעדינות את המזרק (וידאו 3). אם שלושה ניסיונות רצופים באותו צד לא צלחו, עצור את כל הדימום ולאחר מכן עבור לצד הנגדי עבור הנקב.
    הערה: מומלץ לנקב במהירות דרך העור כדי למנוע מהחולדה להיאבק עקב אי נוחות.
  12. מרחו צמר גפן נגד המוסטאזיס והחזירו את החולדה לכלוב שלה (סרטון 4).
  13. לעבד את דגימות הדם בהתאם לדרישות הניסוי.

3. עיבוד דגימות דם

  1. יש להשליך את מחט המזרק למיכל חד. העבר את הדם שנאסף לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל שנשטף בעבר עם הפרין. הכניסו את הצינור לצנטריפוגה, כוונו אותה לטמפרטורה של 4°C ו-1,200 x g, וצנטריפוגה למשך 10 דקות להפרדת פלזמה. מעבירים את הסרום באמצעות פיפטה פסטר 1.0 מ"ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי ומאחסנים אותו ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: כדי למנוע המוליזה כתוצאה מלחץ, הסר את קצה המחט בעת הצורך. במהלך שאיפת פלזמה, הימנע ציור תאי דם מתחתית הצינור. לעיתים, פני השטח של המזרק עשויים לאסוף פרוות חולדה; היזהר לא לאפשר כל פרווה להיכנס הצינור, כפי שהוא יכול להוביל קרישה.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. להציג את כל הנתונים כממוצע ± סטיית תקן ולבדוק אותם להומוגניות של שונות.
  2. השתמש במבחן המדויק של פישר כדי להשוות את שיעורי ההצלחה בין קבוצות.
  3. השתמש במבחן t עצמאי בן שני מדגמים כדי להשוות את האמצעים הכוללים בין שתי הקבוצות.
  4. השתמש בניתוח שונות (ANOVA) למדידות רציפות כגון זמן דגימת דם, משקל גוף, צריכת מזון וצריכת מים. ניקח בחשבון את P < 0.05 מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דגימות פלזמה באיכות גבוהה מציגות גוון, בהירות ושקיפות בצבע צהוב-בהיר, ללא כל גוון אדום או קרישה, כפי שמתואר באיור 2A. איור 2B מראה המוליזה (צד שמאל) או קרישה (צד ימין) כתוצאה מפרוצדורות לא נאותות, בהתאמה. במהלך 96 מפגשי איסוף דם בתוך 4 ימים, זמני איסוף הדם היחידים הממוצעים לקבוצות A ו - B היו 119.87 ± 33.62 שניות ו- 123.28 ±- 30.96 שניות, בהתאמה. לא נמצא הבדל משמעותי בזמני איסוף הדם בין שתי הקבוצות על בסיס יומי (t = 0.6...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות שאיסוף דם של ורידים בזנב הוא השיטה הנפוצה ביותר לדגימת דם חוזרת בחולדות, הוא עשוי להיות מושפע מתרופות הרדמה, ובשל גודלו הקטן של וריד הזנב, כמות הדם שניתן לאסוף במקרה אחד מוגבלת, מה שמוביל למשך איסוף דם ארוך יותר 4,5. למרות שמערכות ספקטרומטריית מסה דו-צדדית (MS/MS) בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם מיקרו-דגימה נימית (CMS) של ורידי זנב חולדה יכולות להפחית את כמות הדם המשמשת בחולדות11, לא כל המוסדות מצוידים בציוד יקר זה. דגימת דם מקלעת הרט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כספיים או לא פיננסיים רלוונטיים לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי Cuiying Plan Project של בית החולים השני של אוניברסיטת Lanzhou (מענק מס '. PR0121015) ומעבדת המפתח המחוזית של גאנסו לחקר מחלות מערכת השתן (מענק מס' 0412D2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.75% מי מלח רגיליםGansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd.— —תמיסת נתרן הפרין מוכנה
1 מ"ל פיפטה פסטר BiosharpBS-XG-01-NSאיסוף דם
מזרק 1 מ"ל (26 גרם, 0.45 מ"מ x 12 מ"מ)Shinva Medical Instrument Co., Ltd.0.45*12RWLBאיסוף דם 
1.5 מ"ל צינור אפנדורףBiosharpBS-15-Mאחסון ואיסוף דם
75% אלכוהול רפואישאנדונג לירקון טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מ— —חיטוי אתר איסוף דם חולדות
מחזיק צינור צנטריפוגהBiosharpBS-05/15-SM60— —
משקל אלקטרונישנחאי PUCHUN מדידה מכשיר ושות', בע"מJE1002לשקול
הזרקת נתרן הפריןהביי צ'אנגשאן ביוכימיה פרמצבטיקה ושות', בע"מ— —יש לשטוף את המזרק ואת צינור ה-EP; לדלל במי מלח רגילים ל-25 יח'/מ"ל
צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכהHuNan Xiang Yi צנטריפוגה מכשיר  ושות', בע"מ  H1750Rהפרדת סרום

מקורות

  1. UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
  2. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  3. Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513(2019).
  4. Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852(2017).
  5. Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513(2023).
  6. Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439(2022).
  7. Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499(2018).
  8. Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
  9. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
  10. Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
  11. Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
  12. Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167(2021).
  13. National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  14. Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  15. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  16. Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
  17. Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
  18. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 3/21/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66075

תגיות

דגימת דם של ורידים תת-קלאביים בחולדות מודעות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.