קישור מחיצת כבד וקשירת ורידים פורטלית לכריתת כבד בשלבים (ALPPS) הוכח כגורם להתחדשות כבד יוצאת דופן לאחר מספר שבועות לאחר ניתוח בשלב הראשון. מודלים של בעלי חיים שעברו ALPPS פותחו כדי לחקור יכולת התחדשות פוטנציאלית של הכבד ולהשיג תוצאות קליניות חיוביות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל עכברי של מחיצת הכבד המשויכת וקשירת ורידים פורטלית להליך כריתת כבד בשלבים בעזרת מיקרוסקופ
במאמר זה
סיכום
תקציר
כריתת כבד נחשבת באופן נרחב כטיפול העיקרי לממאירויות בכבד; עם זאת, אי ספיקת כבד לאחר הניתוח נותרה הגורם העיקרי לתמותה לפני הניתוח, ומשפיעה באופן חמור על תוצאות החולים. בסביבה כבדית חזקה, שארית הכבד העתידית (FLR) חייבת לעלות על 25%, ובמקרים של שחמת הכבד, דרישה זו עולה ליותר מ -40%. אי כשירותו של FLR מהווה כיום מכשול מרכזי בהתקדמות ניתוחי הכבד.
שיטות מסורתיות לשיפור היפרטרופיה FLR מתמקדות בעיקר באמבוליזציה של ורידים פורטליים (PVE), אך יעילותה מוגבלת במידה ניכרת. בשנים האחרונות, היו דיווחים רבים על שיטה חדשנית לכריתת כבד ביפאזית הכוללת חלוקת כבד וקשירת ורידים פורטליים, הידועה בשם שיוך מחיצת כבד וקשירת ורידים פורטלית לכריתת כבד בשלבים (ALPPS). ALPPS עולה על PVE בהיפרטרופיה יעילה ומשמעותית של FLR. עם זאת, המנגנונים המפורטים המניעים התחדשות כבד בסיוע ALPPS אינם מובנים במלואם. לפיכך, שכפול ALPPS במודלים של בעלי חיים הוא חיוני כדי לחקור ביסודיות את המנגנונים המולקולריים של התחדשות הכבד, ומציע תובנות תיאורטיות ומעשיות יקרות ערך.
מבוא
הכבד טומן בחובו פוטנציאל התחדשות אדיר, מתרבה במהירות ומחזיר את הדרישות המטבוליות תוך 3 חודשים בלבד לאחר כריתה של מחלות כבד מגוונות1. עם זאת, ההכרח לוודא את שלמות שולי הגידול מחייב את הבלתי נמנע של כריתה נרחבת בכבד. לפיכך, הבטחת נפח נרחב של הסביבה הכבדית ההשתתפותית, המכונה שארית הכבד העתידית (FLR), מקבלת חשיבות עליונה2. ALPPS היא טכניקה פורצת דרך בניתוחי כבד בעשורים האחרונים, המותאמת במיוחד לחולים עם נפח כבד שיורי לא מספיק לאחר כריתת גידול, שהוכרזה כאחת מפריצות הדרך המשמחות ביותר בתחום הכירורגיה האונקולוגית של הכבד3.
התקדמות מרשימה נעשתה בפיתוח מודלים של בעלי חיים ALPPS. מודל אידיאלי דורש בדרך כלל זרימת דם עצמאית (וריד פורטלי ועורק הכבד) ויציאה (וריד הכבד) באונת הכבד המשומרת והפרדה ברורה בין אונות הכבד המשומרות לאונות הכבד המיועדות לכריתה כדי למנוע זרימת דם בטחונית4. למרות ALPPS מגרה התחדשות מהירה בכבד ברקמת הכבד הנותרת, המנגנונים הספציפיים של תהליך זה עדיין לא ברורים.
כיום, מודלים של ALPPS מסווגים לשלושה סוגים: מודלים של בעלי חיים גדולים (למשל, חזירים וכבשים), מודלים בינוניים (למשל, ארנבות ומכרסמים), ומודלים קטנים (למשל, עכברים)5. השימוש בעכברים, עם הרבייה המהירה שלהם וקלות השינוי הגנטי שלהם, יעיל במיוחד למחקרים מעמיקים של מנגנוני התחדשות הכבד6. יתר על כן, מבנה הכבד של עכברים, במיוחד וריד הכבד האמצעי שלהם, דומה מאוד לזה של בני אדם, מה שהופך אותם מתאימים מאוד לפיתוח מודל ALPPS.
חשוב לציין כי לרוב חולי קרצינומה הפטוצלולרית בפרקטיקה הקלינית יש מחלות כבד בסיסיות, בניגוד למודלים של כבד בריא המשמשים בדרך כלל במחקרים7. לכן, שימוש בעכברים מותנים בפיברוזיס בכבד או זיהומים ויראליים יכול לדמות בצורה מדויקת יותר את התגובות הכירורגיות ואת התחדשות הכבד לאחר הניתוח הנראית בחולים עם מחלות כבד שונות8. גישה זו עשויה לחשוף מטרות טיפוליות חדשות בעלות רלוונטיות קלינית.
עד כה, כמה קבוצות מחקר ידועות, כגון אלה באוניברסיטת ציריך ואוניברסיטת טוקיו, פיתחו בהצלחה מודלים ALPPS 9,10. יצירת מודל מורין סטנדרטי בתנאים מבוקרים יכולה לקדם את הבנתנו את התחדשות הכבד המהירה שנצפתה לאחר הליכי ALPPS.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הרשויות הווטרינריות של בית החולים העממי המחוזי ג'יאנגשי (מספר 70/2022). יתר על כן, כל שלבי הניסוי בוצעו תוך עמידה קפדנית בוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
1. תחילת הניתוח
הערה: עכברי C57BL/6 זכרים במשקל 20-22 גרם שוכנו בכלוב מאוורר היטב, המתוחזק בסביבה סטנדרטית נטולת פתוגנים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות. לבעלי החיים ניתנה גישה למזון ומים בטמפרטורת סביבה מבוקרת של 22 ± 1 מעלות צלזיוס. הניתוח בוצע בחדר מיקרוכירורגי ייעודי באמצעות מיקרוסקופ כירורגי (איור 1). העכברים בקבוצת הדמה נותחו רק על ידי לפרטומיה, אך לא בוצע ניתוח בכבד. בקבוצת PVL קושרים חלק מענפי הוורידים הפורטליים, ובקבוצת ALPPS הועברה אונת הכבד האמצעית על בסיס קשירת ורידים פורטליים (PVL).
- העבירו את העכברים לתקופת צום של 4-6 שעות לפני הניתוח.
הערה: צום נדרש מכיוון שאכילה גורמת לבליטת קיבה בעכברים, היא גורמת לשדה כירורגי לקוי ומועדת לנזק מקרי לדופן הקיבה. - סדרו כלי ניתוח סטריליים, כולל מיקרו-מלקחיים, מספריים, משחזרי בטן ומוכנים מראש 8-0 תפרים של רצועות ורידים פורטליים, על שולחן צד. יש להשרות חומרים תוך ניתוחיים הכוללים גזה סטרילית וכדורי צמר גפן בתמיסת מלח בטמפרטורה של 37°C.
- לזירוז, יש לחשוף את בעלי החיים לאיזופלורן 5% v/v למשך 30 שניות, ולאחר מכן לבצע הרדמה תחזוקתית באמצעות איזופלורן 3% נפח עד להשגת מצב הרדמה עמוקה. בדוק את רפלקס צביטת הבוהן כדי לוודא את רמת ההרדמה. תת עורית להזריק medetomidine במינון של 5 מ"ג / ק"ג במהלך שלב הזירוז.
- יש למרוח משחה על עיני בעלי החיים ולהזריק 1 מ"ל של תמיסת רינגר מניקה מעורבבת עם 5% גלוקוז תת עורית, תוך חלוקת המינון שווה בשווה בין הבטן התחתונה מכל צד.
- יש לגלח בקפדנות את אזור הבטן באמצעות קוצצי שיער קטנים של בעלי חיים, המקיפים אזור רוחבי של 2 ס"מ מתהליך הקסיפואיד לאזור איברי המין.
- ביסודיות לחטא את האתר כירורגי 3 פעמים עם סיבובים לסירוגין של povidone-יוד ואלכוהול.
- בצע חתך אורך של 2.5-3.0 ס"מ בקו האמצע על העור באמצעות אזמל כירורגי, ולאחר מכן באמצעות מספריים כירורגיים כדי לפתוח בעדינות את חלל הבטן.
- השתמש במשענת הבטן כדי להרחיב את החתך, להקל על המתיחה העדינה של התריסריון ומקטע של המעי הדק באמצעות צמר גפן סטרילי ולח. לכסות מבנים אלה עם גזה סטרילית מוכן מראש, בו זמנית לחשוף את קטע הכבד של וריד הפורטל.
2. קשירת ורידים פורטלית (PVL)
הערה: ודא שכל הפעולות עדינות לאורך כל ההליך. השתמש כדורי צמר גפן לחים בעת מניפולציה רקמת הכבד.
- מקלפים את הצפק ואת מערכת העיכול ומוודאים שווריד הפורטל חשוף במלואו.
- במהלך חשיפת וריד השער הראשי, המשיכו על ידי הקפת ענפיו באמצעות תנועות איטיות ומכוונות של דחיפה והתפשטות קדימה.
- זהו ברצף את הענפים השונים של וריד הפורטל בסדר הבא: (1) הענף האחורי הימני, (2) הענף החציוני השמאלי והשמאלי המשולב, ו-(3) הענף הקאודטי (איור 2A).
3. דיסקציה של הענף האחורי הימני של ענפי ורידים פורטליים
- כאשר חוצים את הילום הכבד דרך וריד השער הראשי, שימו לב לענף בולט של האונה האחורית הימנית שהפך גלוי.
- השתמשו בכדורי צמר גפן לחים כחומר מילוי והפרידו בין האונה האמצעית של הכבד לבין האונה האחורית הימנית כדי למנוע פציעה אפשרית.
- הקפידו לנתח לאורך הקפסולה של גליסון (הצפק המשתרע על פני הכבד) ומשכו משי בקוטר 1.5 ס"מ כדי לקשור סביב ענפי ורידים פורטליים.
- קשר את הענף האחורי הימני של וריד הפורטל עם 8-0 תפר משי. אינדיקטור אמין לקשירת ורידים פורטלית מוצלחת הוא החיוורון הנראה לעין של הכבד.
4. דיסקציה של הענפים המדיאליים השמאליים והשמאליים של וריד הפורטל
- האונה הצידית השמאלית (LLL) והאונה האמצעית השמאלית (אהבה לחיי) חולקות וריד פורטלי ראשי משותף. הקפד לנתח כל interstice פוטנציאלי בין LLL לבין האונה caudate.
הערה: קשירה של ענפי LLL ואהבת חיי של וריד הפורטל היא הקשה ביותר במודל כירורגי זה מכיוון שהמיקרו-מלקחיים חייבים לחצות את החלל סביב וריד הפורטל ולהימנע מפגיעה בכבד. - הכניסו את המלקחיים דרך הכניסה בשלב 4.1 והניעו את היד לאט, שכן אפילו ההתנגדות הקלה ביותר מרמזת על הקרבה הפוטנציאלית לכבד או לכלי הדם.
- כאשר מורגשת התנגדות, התאימו מעט את המלקחיים כדי לנוע קדימה ודרך פני השטח של הקפסולה של האונה האמצעית הימנית (RML) של גליסון (איור 3C).
- להעסיק את המוכן 8-0 תפר משי לקשור סביב וריד השער של LLL ולאהוב את ענפי חיי. חפשו תיחום איסכמי בולט בתוך האונה האמצעית של הכבד, בעוד האונה השמאלית מקבלת חיוורון, עם קשירת ענפי הווריד הפורטלי.
5. דיסקציה של ענף caudate של ענפי הווריד הפורטלי
- נתחו את האונה הקאודטית והשתמשו בצמר גפן כדי למלא את החלל הפוטנציאלי בין וריד השער הראשי לאונה הקאודטה.
- לקלף את הצפק של האונות caudate כדי לדמיין את ענפי הווריד הפורטל של האונה.
- השתמש בתפר תפר במקום לקשור סביב כדי לקשור את ענף הקאודטה, וודא שנתיב המחט עוטף כראוי את ענף הקאודטה של וריד הפורטל.
הערה: הקושי בקשירת הענף הקאודטי של הווריד הפורטלי נובע מכך שווריד פורטל האונה הקאודטית עוטף את רקמת הכבד וקרוב לווריד הפורטלי הראשי. מומלץ עומק חדירת מחט של 1 מ"מ.
6. טרנסקציה של הכבד וכריתת כיס הכבד
- התבוננו בקו תיחום ברור באונת הכבד האמצעית ובצעו את הטרנסקציה לאורך הקו הזה (איור 2B).
- השתמש בעט electrocautery כדי ליצור קו חיתוך מראש של 0.5 מ"מ לאורך קו התיחום.
- השתמש מלקחיים מיקרו עט electrocautery לחתוך רקמת כבד, להחיל צמר גפן כדי לעצור דימום.
הערה: הקושי בטרנסקציה הוא לשלוט בעומק. המטרה היא לפצל את הכבד קרוב ככל האפשר לווריד הנבובה. דימום תוך ניתוחי קשה להימנע ודורש תרגול חוזר ונשנה כדי לשלוט בעומק הטרנסקציה. ניתן להשתמש בצריבה חמה, צמר גפן וספוגי ג'לטין כדי לסייע בהמוסטאזיס. - הסר את כיס המרה האחרון כמו זה יספק נקודת משיכה טובה במהלך כל הניתוח.
- השתמש בצמר גפן כדי להפעיל לחץ מבוקר על המוסטאזיס, ואם הדימום נמשך, הווריד קאווה התחתון נפגע וההשפעה של תיקון התפרים תהיה גרועה; להרדים את החיה ללא היסוס.
7. שלבים אחרונים של הניתוח
- יש להקפיד על מיקום מוקפד של המעי הדק בתוך חלל הבטן לפני הסגירה.
- סגור היטב את הצפק ואת דופן הבטן באמצעות 6-0 תפרים נספגים ואת העור עם 4-0 תפרים נספגים.
- יש לחטא שוב את פני העור כדי להבטיח ניקיון מיטבי.
- תת עורית לתת 1 מ"ל של תמיסת מלח פנטניל 0.02 מ"ג / ק"ג בתוספת meloxicam 4 מ"ג / ק"ג באתר החתך כדי להקל על כאב לאחר הניתוח ולטפל בכל אובדן נוזלים תוך ניתוחי משלים.
- הניחו את בעל החיים על משטח מחומם כדי להקל על התעוררות טבעית, ועקבו אחר אספקת הדם לגפיים. לאחר מכן, לשכן אותם בנפרד בכלובים להמשך השגחה כשהם חוזרים להכרה.
- יש להזריק מדטומידין תת עורית במינון של 4 מ"ג/ק"ג עם ההחלמה, ולהמשיך 24 שעות לאחר הניתוח.
8. מדידה תוך ניתוחית של התחדשות הכבד ותפקוד הכבד
- הרדימו את העכברים ואספו דגימות כבד ודם במרווחים של 1, 2, 3 ו-7 ימים לאחר הניתוח.
- לבצע בדיקת צביעה ותפקודי כבד של HE ולבחון סמנים דלקתיים בסרום, ובכך לספק תיקוף נוסף להשפעת בניית המודל.
- תעד את השינויים היומיים במשקל הגוף וביחס FLR/BW (משקל גוף) של העכברים במשך שבוע לאחר הניתוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בניגוד ל-PVL (שלבי פרוטוקול 2,3,4 ו-5), העכברים שהיו נתונים להתערבות כירורגית של ALPPS (שלבים 2,3,4,5 ו-6) הפגינו נטייה מוגברת להתרבות תאים. איור 2 מתאר את התיחום האיסכמי של אונת הכבד האמצעית לאחר קשירת ורידים פורטליים, יחד עם שדה הראייה במהלך טרנסקציה של הכבד, אשר מייצג הבדל מרכזי בין ALPPS ו-PVL. יש לציין כי רמות מתווכי הדלקת, כולל (Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), אינטרלוקינים וגורם גדילה בכבד (HGF), בתוך רקמת הכבד, עולות על אלה שנצפו בקבוצת PVL. זה נראה באיור 4C
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה מציג פרוטוקול לשלב הראשוני של ניתוח ALPPS בעכברים, הכולל קשירה חלקית של הווריד הפורטלי וחלוקה של אונת הכבד החציונית. שיטה זו מחקה באופן הדוק את הליך ALPPS האנושי, עם המבנה הלובולרי הייחודי של כבד העכבר ואספקה ורידית פורטלית כפולה לאונה החציונית המבטיחים זרימת דם ברורה לאחר הניתוח11. ראוי לציין כי הליך ALPPS כולל שני שלבים כירורגיים נפרדים. במחקר זה, אנו מציגים באופן בלעדי את השלב הראשוני הכולל קשירת ענף ורידים פורטלי וטרנסקציה של הכבד, המסומן כ- PVL+T. יש ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| הזרקת גלוקוז 5% (500 מ"ל) | Shapuaisi פארמה (http://www.zjspas.com/)H20003666 | יעילה, זולה, קלה לגישה | |
| מכונת הרדמה | RWD (www.rwdls.com) | R500 | מחיר נמוך ואיכות יקרה. הוא מתאים לפעולות עם מתחילים |
| C57 BL/6 | מעבדת ג'קסון | 22349-2023 | יציבות של זנים |
| איזופלורן | KCSW (kcsw.szqisoubao.com) | H19980141 | מלוקסיקם עמיד וחסכוני |
| Boehringer-Ingelheim | H20020217 | עמידים ויעילים | |
| עשויים 60018920 | עמיד ויעיל | ||
| מיקרו-מכשיר | CH מפעל מכשירים מיקרוכירורגיים | HC-A804-1 | עמידה וחסכונית |
| Shapuaisi פארמה (http://www.zjspas.com/)H20193277 | יעיל, זול, קל לגישה | ||
| קו תפרים | CH מפעל מכשירים מיקרוכירורגיים | 6-0/8-0 | יחס ביצועים-מחיר |
| גבוה נוגדנים מקומיים | Chenxin פרמקולוגיה ( www.cisen-pharma.com | )H20020217 | הימנע ביעילות מזיהום בחתך |
מקורות
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: Biological and pathological mechanisms and implications. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 18 (1), 40-55 (2021).
- Chapelle, T., et al. Estimation of the future remnant liver function is a better tool to pr edict post-hepatectomy liver failure than platelet-based liver scores. Eur J Surg Oncol. 43 (12), 2277-2284 (2017).
- Isfordink, C. J., et al. Portal vein ligation versus portal vein embolization for induction of hypertrophy of the future liver remnant: A systematic review and meta-analysis. Surg Oncol. 26 (3), 257-267 (2017).
- Linecker, M., et al. Risk adjustment in alpps is associated with a dramatic decrease in ear ly mortality and morbidity. Ann Surg. 266 (5), 779-786 (2017).
- Darnis, B., et al. Subtotal hepatectomy in swine for studying small-for-size syndrome and portal inflow modulation: Is it reliable. HPB (Oxford). 17 (10), 881-888 (2015).
- Casellas, J. Inbred mouse strains and genetic stability: A review. Animal. 5 (1), 1-7 (2011).
- Zhang, J., et al. Evolution of associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy from 2012 to 2021: A bibliometric analysis. Review. Int J Surg. 103, 106648(2022).
- Parola, M., Pinzani, M. Liver fibrosis: Pathophysiology, pathogenetic targets and clinical iss ues. Mol Aspects Med. 65, 37-55 (2019).
- Kikuchi, Y., et al. Impact of associating liver partition and portal vein occlusion for st aged hepatectomy on tumor growth in a mouse model of liver metastasis. Eur J Surg Oncol. 44 (1), 130-138 (2018).
- Schlegel, A., et al. Alpps: From human to mice highlighting accelerated and novel mechanism s of liver regeneration. Ann Surg. 260 (5), 839-846 (2014).
- Dili, A., Lebrun, V., Bertrand, C., Leclercq, I. A. Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepate ctomy: Establishment of an animal model with insufficient liver remnan t. Lab Invest. 99 (5), 698-707 (2019).
- Schadde, E., Hertl, M., Breitenstein, S., Beck-Schimmer, B., Schläpfer, M. Rat model of the associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy (alpps) procedure. J Vis Exp. (126), e55895(2017).
- Allaire, M., et al. New frontiers in liver resection for hepatocellular carcinoma. JHEP Rep. 2 (4), 100134(2020).
- Memi, F., Ntokou, A., Papangeli, I. Crispr/cas9 gene-editing: Research technologies, clinical applications and ethical considerations. Semin Perinatol. 42 (8), 487-500 (2018).
- Saviano, A., Henderson, N. C., Baumert, T. F. Single-cell genomics and spatial transcriptomics: Discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology. J Hepatol. 73 (5), 1219-1230 (2020).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
