התמיינות של שושלות מערכת העצבים האנטרית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

סיכום

הפקת שושלות של מערכת העצבים האנטרית (ENS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מספקת מקור מדרגי של תאים לחקר התפתחות ומחלות של ENS, ולשימוש ברפואה רגנרטיבית. כאן, מוצג פרוטוקול מבחנה מפורט להפקת נוירונים אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית.

תקציר

מערכת העצבים האנטרית האנושית, ENS, היא רשת גדולה של סוגי תאי גלייה ותאי עצב עם מגוון נוירוטרנסמיטרים מדהים. מערכת ENS שולטת בתנועתיות המעי, בהפרשת אנזימים ובספיגת אבות מזון, ומקיימת אינטראקציה עם מערכת החיסון ועם מיקרוביום המעי. כתוצאה מכך, פגמים התפתחותיים ונרכשים של ENS אחראים למחלות אנושיות רבות ועשויים לתרום לסימפטומים של מחלת פרקינסון. מגבלות במערכות מודל של בעלי חיים וגישה לרקמות ראשוניות מציבות אתגרים ניסיוניים משמעותיים במחקרים של ENS אנושי. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט לגזירה חוץ גופית יעילה של שושלות ENS מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, hPSC, תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים. הפרוטוקול שלנו מתחיל בהתמיינות מכוונת של hPSCs לתאי פסגה עצבית אנטרית תוך 15 יום ומניב תת-סוגים מגוונים של נוירונים אנטריים פונקציונליים תוך 30 יום. פלטפורמה זו מספקת משאב מדרגי למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות, גילוי תרופות ויישומים רגנרטיביים.

מבוא

מערכת העצבים האנטרית (ENS) היא המרכיב הגדול ביותר של מערכת העצבים ההיקפית. ה-ENS מכיל יותר מ-400 מיליון תאי עצב הממוקמים במערכת העיכול ושולטים כמעט בכל תפקודי^{המעי 1}. הבנה מולקולרית של התפתחות ותפקוד ENS ופגמיו בנוירופתיות אנטריות דורשת גישה למקור אמין ואותנטי של נוירונים אנטריים. הגישה לרקמה הראשונית האנושית מוגבלת, ומודלים של בעלי חיים אינם מצליחים לשחזר פנוטיפים של מחלות מפתח בנוירופתיות אנטריות רבות. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הוכחה כמועילה ביותר במתן מקור בלתי מוגבל של סוגי תאים רצויים, במיוחד אלה שקשה לבודד ממקורות ראשוניים 2,3,4,5,6,7. כאן, אנו מספקים פרטים על שיטת מבחנה מדורגת וחזקה להשגת תרביות ENS מ- hPSCs. תרביות hPSC מדרגיות אלה פותחות אפיקים למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות וסינון תרופות בתפוקה גבוהה ויכולות לספק תאים להשתלה לרפואה רגנרטיבית.

שושלות נוירונים אנטריים נגזרות מתאי עצב (NC) העוקבים אחר נתיב ההתפתחות של ENS במהלך האמבריוגנזה. בעוברים, תאי NC מופיעים לאורך השוליים של הצלחת העצבית המתקפלת. הם מתרבים, נודדים ומולידים סוגי תאים רבים ושונים, כולל נוירונים חושיים, תאי Schwann, מלנוציטים, שלד גולגולתי ונוירונים אנטריים וגליה ^8,9,10. ההחלטה על גורל התא תלויה באזור הנפרד לאורך הציר הקדמי-אחורי שממנו יוצאים תאי NC, כלומר NC גולגולתי, NC ווגאלי, גזע NC ו-NC סקרלי. ה-ENS מתפתח מתאי NC ואגליים וסקרליים כאשר הראשון שולט באוכלוסיית תאי העצב האנטריים בשל הנדידה הנרחבת לאורך המעי והתיישבות במעיים¹¹.

גזירה של תאי NC מתאי PSC כרוכה בדרך כלל בשילוב של עיכוב SMAD כפול והפעלת מסלול WNT^12,13. עד לאחרונה, כל פרוטוקולי האינדוקציה של NC כללו סרום ותוספים אחרים של מוצרים מן החי בתנאי התרבית. מדיה לא מוגדרת כימית לא רק מורידה את יכולת השחזור של אינדוקציה NC, אלא גם מאתגרת מחקרים התפתחותיים מכניסטיים. כדי להתגבר על אתגרים אלה, Barber et al¹⁴ פיתחו פרוטוקול אינדוקציה NC תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים כימית ולכן היה יתרון על פני שיטות חלופיות המסתמכות על גורמי החלפת סרום (למשל, KSR)^13,14. זה הושג על ידי החלפת מדיה בסיסית ואופטימיזציה של פרוטוקול שהוצג במקור על ידי Fattahi et al כדי להפיק תאי NC אנטריים מ hPSCs. מערכת משופרת זו היא הבסיס לפרוטוקול הבידול hPSC המוצג כאן. זה מתחיל עם אינדוקציה של תאי עצב אנטרי (ENC) בתקופה של 15 יום על ידי אפנון מדויק של BMP, FGF, WNT ו TGFβ איתות בנוסף חומצה רטינואית (RA). לאחר מכן אנו גוזרים את שושלות ENS על ידי טיפול בתאים עם גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF). כל הרכבי המדיה מוגדרים כימית ומניבים תרביות עצביות אנטריות חזקות תוך 30-40 יום.

בנוסף למערכת תרבית התאים החד-שכבתית המתוארת כאן, פותחו גישות אינדוקציה חלופיות של NC המשתמשות בגופי עובר צפים חופשיים^15,16. תאים נודדים בתרביות אלה הוכחו כמבטאים סמני NC עם תת-קבוצה המייצגת את NC הווגאלי. תרביות משותפות עם רקמת מעיים ראשונית שימשו להעשרת מבשרי NC אנטריים בתרבויות אלה. הרכבי המדיה במחקרים אלה מכילים שילוב של גורמים שונים כגון גורם גדילה עצבי, NT3 וגורם נוירוטרופי מוחי. בשלב זה, לא ברור לחלוטין כיצד גורמים אלה עשויים להשפיע על זהויות המחויבות של מבשר הנוירון האנטרית. להשוואה יעילה של השראת NC אנטרית בתרביות החד-שכבתיות ובתרביות מבוססות גוף עובר, נדרשים נתונים נוספים. בהתחשב בפריסות התרבות השונות באסטרטגיות אלה, יש לשקול את השימוש בכל שיטה ולייעל אותה בהתאם ליישום ספציפי בחשבון.

הפרוטוקול המוצג כאן ניתן לשחזור ונבדק בהצלחה על ידינו ועל ידי אחרים באמצעות קווי hPSC שונים (מושרית ועוברית) ^8,14,16.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה

הערה: הריכוזים המוזכרים לאורך הפרוטוקול הם ריכוזים סופיים של רכיבי המדיה. הכינו את כל המדיה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של זרימה למינרית, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C בחושך. יש להשתמש תוך שבועיים.

1. אמצעי תחזוקה hPSC: יש לערבב תוסף בינוני לתחזוקת hPSC ללא מזין (20 מיקרוליטר/מ"ל) עם מדיום הבסיס שלו.
2. בינוני A: הוסף חלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP4; 1 ננוגרם/מ"ל), SB431542 (10 מיקרומטר) ו-CHIR99021 (600 ננומטר) לתווך בסיס התמיינות (Differentiation Base Medium).
3. בינוני B: הוסף SB431542 (10 μM) ו- CHIR99021 (1.5 μM) למדיום בסיס התמיינות (differentiation base medium).
4. בינוני C: הוסף SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1.5 μM) ו- RA (1 μM) למדיום בסיס בידול.
5. Neural crest Complete (NCC) בינוני: הוסף FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), תוסף N2 (10 μL/mL), תוסף B27 (20 μL/mL), תוסף L-גלוטמין (10 μL/mL) ו-MEM NEAAs (10 μL/mL) למדיום הנוירו-בסיסי.
6. ENC Medium: הוסף GDNF (10 ng/mL), חומצה אסקורבית (100 μM), תוסף N2 (10 μL/mL), תוסף B27 (20 μL/mL), תוסף L-גלוטמין (10 μL/mL) ו-MEM NEAAs (10 μL/mL) למדיום נוירו-בסיסי.
7. חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) 1x: לדלל 500 mM EDTA (1000x) לריכוז סופי של 500 מיקרומטר ב- PBS.
   הערה: השתמש ב- PBS בחינם Ca²⁺ ו- Mg²⁺ לאורך פרוטוקול זה, אלא אם צוין אחרת.

2. ציפוי צלחות תרבות

1. לוחות מצופים מטריצת ממברנת מרתף: הפשירו במהירות, ודיללו אליקוט קפוא של 500 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף ב 50 מ"ל של DMEM מקורר:F12 על ידי פיפטציה נמרצת באמצעות פיפטה סרולוגית 50 מ"ל. מצפים את הבארות בתמיסת מטריצת קרום מרתף מדוללת (100 מיקרוליטר לס"מ² משטח הבאר) ודגרים עליהם למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס. יש לשאוף את מצע הציפוי לפני השימוש. כדי למנוע ג'לטיניזציה של מטריצת קרום המרתף, בצע שלב זה מהר ככל האפשר והשתמש ב- DMEM קר:F12 להמסת aliquot קפוא.
   הערה: טמפרטורת מטריצת קרום המרתף צריכה להישמר קרה במהלך הפשרה (על קרח) ו aliquoting (צינורות על קרח) כדי למנוע קרישה.
2. לוחות מצופים PO/FN/למינין: הכינו תמיסת פוליאורניתין (PO) של 15 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS על ידי דילול ציר פי 1000. מצפים בארות עם 100 μL של תמיסת PO / PBS לכל ס"^{מ 2} של שטח הפנים של הבאר ולדגור את הלוחות לילה ב 37 ° C. למחרת, שאפו PO/PBS וציפו את הבארות ב-100 מיקרוליטר לסמ"ר² משטח הפנים של הבאר בתמיסת FN/למינין/PBS טרייה המכילה 2 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין (FN) ו-2 מיקרוגרם/מ"ל למינין. צלחות ניתן להשתמש לאחר מינימום של 2 שעות דגירה ב 37 ° C. יש לשאוף FN/למינין/PBS לפני השימוש.

3. תחזוקה של תרבות hPSC

הערה: כל שלבי הדגירה של התאים הם ב-5% CO₂ וב-37°C באינקובטור לח.

1. יש לשאוף מדיום hPSC מתרבית hPSC ולהוסיף מדיום טרי (200 μL לס"מ² משטח פני הבאר) כל יומיים עד שהמושבות יהיו ~80% מתמזגות.
2. כדי לעבור, לשאוף hPSC בינוני ולשטוף תאים עם 100 μL של PBS לכל ס"מ² של שטח הפנים היטב.
   הערה: חשוב להשתמש ב- PBS חינם Ca²⁺ ו- Mg²⁺ כדי לשטוף את התאים.
3. הוסף 500 μM EDTA (100 μL לכל ס"מ² של שטח הפנים היטב). החלף את מכסה הצלחת. צפו דרך מיקרוסקופ הפוך ועקבו אחר ניתוק התאים מקצוות המושבה (2-4 דקות).
4. השתמש פיפטה סרולוגית 5 או 10 מ"ל כדי להעביר את אותו נפח של תווך hPSC לתוך כל באר ולקצור מכנית את התאים על ידי pipeting למעלה ולמטה כמה פעמים.
   הערה: זמן הדגירה האופטימלי של EDTA תלוי בקו iPSC. הימנע pipetting נמרץ עבור ניתוק מושבות כפי שהוא יכול להוביל דיסוציאציה מוגזמת מושבה מוות תאים. כאשר עוברים כדי להתחיל צלחת התמיינות, לדגור על תאים עם EDTA במשך 1-2 דקות יותר.
5. מעבירים את תרחיף התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט.
6. להשהות מחדש את התאים בנפח מתאים של מדיום hPSC ולהעביר לבארות של צלחת מטריצת ממברנה חדשה במרתף.
   הערה: עבור תחזוקה שוטפת של hPSC השתמש ביחס מעבר של 1:18 - 1:24 (1:18 פירושו העברת שליש מהתאים שנותקו מבאר אחת של צלחת בת 6 בארות לצלחת חדשה מלאה). כדי להתחיל לוחית בידול, בצע יחס מעבר של 5:6.
7. יש לדגור ב-5%_CO2 וב-37°C.

4. אינדוקציה עצבית

הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1A. התחל התמיינות NC כאשר התאים נמצאים בערך 80% במפגש. זה יושג תוך 1-2 ימים כאשר תאים עוברים ביחס של 5:6 (ראה לעיל). התחל התמיינות NC ביום 0 עם תאי hPSC פלוריפוטנטיים ובלתי ממוינים לחלוטין. לקבלת יעילות גבוהה, גבולות המושבה צריכים להיות בעלי תאים מתמיינים מינימליים. מעבר ולוח hPSC להתמיינות כאשר המושבות גדולות, או מרכז המושבה מתחיל להתעבות/להתכהות כאשר מנוטרים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. תשומת לב למפגש ולמורפולוגיה נוטה להיות אמינה יותר ממספר התאים המצופים מכיוון שזה עשוי להשתנות בהתאם לקו התא ויכול לנוע בין 50,000-200,000 לסמ"ר².

1. ביום 0, החלף את אמצעי התחזוקה hPSC במדיום A המכיל 1 ננוגרם/מ"ל BMP4, 10 מיקרומטר SB431542, 600 ננומטר CHIR99021 (200 מיקרוליטר בינוני לס"מ² משטח הבאר).
2. ביום השני, התאים צריכים להיות 100% חופפים. לשאוף בעדינות מדיום A ולהזין תאים עם מדיום B המכיל 10 מיקרומטר SB431542, 1.5 מיקרומטר CHIR99021 (200 מיקרוליטר של בינוני לכל ס"מ² של שטח פני הבאר).
   הערה: כאשר תרביות גדלות במהלך השראת NC, תאים עשויים להתנתק מהחד-שכבה הבסיסית. הימנע מאובדן תאים עודף על ידי הסרה עדינה של מדיה ישנה והוספת מדיה טרייה לצד הבאר.
3. ביום הרביעי, הזינו שוב תאים עם מדיום B (200 מיקרוליטר בינוני לס"^{מ 2} משטח הבאר).
4. ביום 6, החלף את מדיום B בבינוני C המכיל 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 ו- 1 μM חומצה רטינואית (400 μL של בינוני לכל ס"^{מ 2} של שטח פנים הבאר).
5. בימים 8 ו-10, יש להאכיל כמו ביום 6.

5. היווצרות ספרואידים ENC

הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1B.

1. ביום ה-12, יש לשאוף בעדינות מדיום C ולשטוף תאים עם 100 מיקרוליטר PBS לס"מ² משטח הבאר. הוסף את אותו נפח של תמיסת ניתוק תאים ודגור במשך 30 דקות ב 5% CO₂ ו 37 ° C.
2. לדלל את תמיסת ניתוק התאים על-ידי הוספת נפח זהה של מדיום NCC המכיל 10 ננוגרם/מ"ל FGF2, CHIR99021 3 מיקרומטר, תוספת N2 של 10 מיקרוליטר/מ"ל, תוספת B27 של 20 מיקרוליטר/מ"ל, תוספת L-גלוטמין של 10 מיקרוליטר/מ"ל ו-10 מיקרוליטר/מ"ל מם NEAA. באמצעות פיפטה סרולוגית קוצרים את התרחיף החד-תאי ומוסיפים אותו לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל.
3. סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט.
4. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף 12 מ"ל (לצלחת מלאה של 6 בארות) של מדיום NCC והשהה מחדש את התאים לחלוטין על ידי צנרת מכנית למעלה ולמטה 1-2 פעמים. העבירו את מתלה התא ללוחית חיבור נמוכה במיוחד.
   הערה: כ-10 ס"מ² של תאים חד-שכבתיים מסוג ENC מרחפים מחדש ב-2 מ"ל של תווך NCC ומועברים לבאר אחת של לוחית חיבור נמוכה במיוחד. זה שווה ללוחית אינדוקציה NC מלאה של 6 בארות המועברת לצלחת חיבור מלאה של 6 בארות נמוכה במיוחד.
5. ביום ה-14, מערבלים בעדינות את הצלחות עד שבמרכז כל באר נאספים כדוריות קטנות. באמצעות מיקרופיפטה P1000 ובתנועה מעגלית איטית, שואפים את תווך NCC המשומש סביב היקף כל באר. נסו להימנע מהסרת הספרואידים הצפים בחופשיות.
6. הזן את התאים בנפח המקורי של מדיום NCC.

6. אינדוקציה EN

הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1B.

1. ביום ה-15, יש ליישם את אותה טכניקה המשמשת ביום ה-14 כדי להסיר בעדינות את המדיום ולשטוף את הספרואידים עם PBS. הסר PBS ככל האפשר הימנעות הספרואידים.
2. הוסף תמיסת ניתוק תאים (100 μL לכל ס"מ² של שטח הפנים היטב) ולנתק את הספרואידים לתאים בודדים על ידי דגירה במשך 30 דקות ב 5% CO₂ ו 37 ° C.
3. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף נפח שווה של מדיום ENC (המכיל 10 ng/mL GDNF, 100 μM חומצה אסקורבית, תוסף 10 μL/mL N2, תוסף B27 20 μL/mL, תוסף L-גלוטמין 10 μL/mL ו-10 μL/mL MEM NEAA בתווך נוירובזאלי) לכל באר ושבור את הספרואידים הנותרים על ידי 2-3 סיבובים של צנרת מכנית. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
   הערה: הימנעו ממתח מוגזם ומוות תאי שיכולים להתרחש כתוצאה מפיפטים כפויים או שימוש בפיפטות עם פתח קצה קטן יותר.
4. סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף ~ 5-10 מ"ל של מדיום ENC והשהה מחדש את התאים לחלוטין על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 1-2 פעמים.
5. ספרו את ריכוז התאים בני קיימא באמצעות טריפאן כחול ושיטת ספירת תאים כגון המוציטומטר.
   זהירות: טריפאן כחול הוא חומר החשוד כמסרטן. טפל בזהירות, השליך כראוי.
6. הוסף נפח מספיק של תווך ENC במטרה לצפות כ 300,000-400,000 תאים קיימא לכל ס"^{מ 2} של שטח הפנים בצפיפות של כ ~ 1,000,000 תאים למ"ל. שאפו לתמיסת FN/למינין/PBS מבארות הצלחת.
   הערה: בחר את פורמט הלוח בהתאם לבדיקות המתוכננות עבור תרביות EN מכיוון ששלב זה מסמן את שלב הציפוי מחדש הסופי של הפרוטוקול. אבות נוירון אנטרי ניתן להקפיא ביום 15. לאחר ניתוק הכדורים עם תמיסת ניתוק תאים, השהה מחדש את האבות בערך 5 x 10⁶ תאים / מ"ל בתווך הקפאה כגון 10% DMSO או Stem-cellbanker. בעת הצורך, יש להפשיר במדיית ENC חמה עם מעכב ROCK Y-27632 בגודל 5 מיקרומטר. תאי צלחת בפורמט הצלחת הרצוי. החלף את המדיה ב- ENC טרי לאחר מספר שעות.
7. הוסיפו בעדינות את התאים לבארות מצופות PO/FN/למינין. הימנע מבועות שנלכדות מתחת לתרחיף התא ומונעות חיבור תאים לציפוי PO/FN/למינין, במיוחד בעת שימוש בצלחות עם גודל באר קטן יותר כגון לוחות 384 בארות. זה עלול להוביל למוות תאי.
8. תאי הזנה אחת ליומיים עם מדיום ENC (200 מיקרוליטר לסמ"ר² משטח באר) עד יום 30-40, ולאחר מכן להפחית את תדירות ההזנה (לפעם או פעמיים בשבוע) אך להכפיל את נפח ההזנה (ל 400 מיקרוליטר של בינוני לכל ס"מ² של שטח פני הבאר).
   הערה: זה חשוב מכיוון שהסרה והוספה מוגזמות של מדיה יכולות להקל על ניתוק התרבית העצבית מפני השטח של הבארות. כדי למנוע ניתוק באופן פרוספקטיבי, במיוחד עבור תרביות לטווח ארוך, יש להוסיף ל-ENC FN (2 מיקרוגרם/מ"ל) ולמינין (2 מיקרוגרם/מ"ל) פעם בשבוע.

תוצאות

פרוטוקול זה מספק שיטה להפיק פסגה עצבית אנטרית ותאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית (איור 1A-B). יצירת נוירונים באיכות גבוהה תלויה בשלב אינדוקציה יעיל של סמל עצבי אנטרי. ניתן להעריך זאת באופן חזותי על-ידי בדיקת המורפולוגיה של הכדורים הצפים בחופשיות שאמורים להיראות עגולים עם משטחים חלקים בגודל של 0.1-0.4 מ"מ בקירוב, כפי שניתן לראות באיור 1C. הספרואידים האלה צריכים גם לבטא את סמן הפסגה העצבית SRY-Box transcription factor 10 (SOX10)^17,18, כפי שניתן לראות באיור 1D. במהלך שלב השראת תאי העצב האנטריים, תאי עצב יכולים להיראות כבר ביום 25-30 (איור 1E). עם זאת, זה יכול להתעכב בהתמיינות עם יעילות נמוכה יותר המכילה זיהומים לא רצויים של תאים מזנכימליים. מערכת העצבים האנטרית האנושית היא אוסף של נוירונים מגוונים המבטאים מוליכים עצביים שונים. הטרוגניות זו משוחזרת בפרוטוקול in vitro המסופק, וניתן להעריך את הביטוי של סמנים מרכזיים באמצעות שיטות צביעת תאים כגון דימות אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה על פי פרוטוקולים 13,14,19,20,21 שתוארו קודם לכן (איור 1F,G).

איור 1: הפקת תאי ENC אנושיים ותת-סוגים של תאי עצב אנטרי מ-hPSC. (A) אינדוקציה של Enteric Neural crest (ENC) מ-hPSC. פרוטוקול (ימים 0-12) המציג הרכבי מדיה לגזירת תאי ENC מתאי hPSC. (B) היווצרות ספרואידים של ENC והשראת נוירון אנטרי מפרוטוקול ENC. (ימים 12-15) המציג הרכב בינוני להיווצרות ספרואיד ENC. לאחר מכן, נוירונים אנטריים נוצרים ומבשילים על ידי טיפול עם מדיום המכיל GDNF ו- AA. (C) תמונות ניגודיות פאזה מייצגות של hPSCs מבדילים בנקודות זמן שונות של הפרוטוקול. סרגל קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (D) SOX10::GFP המבטא ספרואידים ENC הנגזרים מ-H9 iPSC ביום ה-14. סרגל קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (E) תמונת חוזה פאזה של תאי עצב ביום 33. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. (F-G) דימות אימונופלואורסצנטי (F) וציטומטריית זרימה (G) של סמני מוליכים עצביים בתאי עצב ביום 40. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. קיצורים: BMP4 = חלבון BMP4 אנושי רקומביננטי; RA = חומצה רטינואית; FGF2 = FGF אנושי רקומביננטי בסיסי; GDNF = גורם נוירוטרופי רקומביננטי של תאי גליה אנושיים; AA = חומצה אסקורבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה חזקה במבחנה להשגת תאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) בתוך 30-40 יום (איור 1E) ותאי גליה אנטריים המבטאים חלבון חומצי גליה פיברילרי, GFAP ו-SOX10 בתרביות ישנות יותר (> יום 55)13,14,19,22. תאי עצב וגליה אלה מושרים על ידי התמיינות הדרגתית של hPSCs לתאי פסגה עצבית ואגלית ואנטרית, ואחריה נוירון אנטרי ואבות גליה^13,14. תאי הפסגה העצבית מבטאים סמני פסגה עצבית, גורם שעתוק AP-2 אלפא ובטא, TFAP2A ו- TFAP2B, בהתאמה²¹. בעבר הראינו כי CD49 יכול לשמש כסמן כדי לציין את היעילות של תאי פסגה עצבית הנגזרים מ-hPSC¹⁴. היעילות וההצלחה של שיטה זו תלויה בשילוב של גורמים. ראשית, קריטי לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים. בדיקת תרביות hPSC לזיהום מיקופלסמה חשובה מכיוון שהיא יכולה להשפיע לרעה על צמיחת תאי גזע ואינה ניתנת לזיהוי חזותי. שנית, שימוש בלוחות מצופים באופן שווה ומצופה כראוי מפחית את הסיכוי לצמיחה של תרבית hPSC טלאי ולניתוק של תרביות NC ותאי עצב ישנים יותר מפני השטח של הבארות. שלישית, עבור יעילות גבוהה בהתמיינות חיוני להתחיל עם תאי hPSC פלוריפוטנטיים ובלתי ממוינים לחלוטין. מושבות hPSC צריכות להיות בעלות תאים מתמיינים מינימליים בגבולות המושבה. hPSCs צריכים לעבור או להיות מצופים להתמיינות כאשר המושבות גדולות, או שמרכז המושבה מתחיל להתעבות/להתכהות בצבע כפי שנצפה דרך מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. תאים ממוינים לא רצויים (בדרך כלל תאים מזנכימליים), לא רק מורידים את יעילות ההתמיינות הכוללת, אלא שהם יכולים לגרום לניתוק של נוירונים מפני השטח של הבאר ככל שהתרביות מזדקנות. לכן מומלץ לעקוב בקפידה אחר תרביות ה-ENC ב-15 הימים הראשונים. בתנאי התמיינות יעילים, דיסקים כהים מופיעים על פני התרבית ~ יום 6, מה שמצביע על היווצרות ספרואידית יעילה בימים 12-15. נוסף על כך, בשלב הספרואידי (יום 12-15) כדורים שצפים בחופשיות צריכים להיות בעלי משטחים חלקים (איור 1D). שמירה על שלב הספרואיד התלת-ממדי בימים 12-15 מספיקה בדרך כלל כדי לשפר את טוהר ה-ENCs לצורך התמיינות במורד הזרם של תרבויות לשושלות ENS. עם זאת, עבור מחקרים הדורשים אוכלוסיות תאי אב ENC מוקדמים וטהורים, FACS באמצעות CD49D מומלץ. CD49D הוא סמן פני שטח ספציפי עבור שושלות NC הנגזרות מ-SOX10:hPSC ונעשה בו שימוש בהצלחה בקווי תאים^13,14. למידע נוסף על בידוד תאי CD49D+ באמצעות FACS והמלצות על אסטרטגיית gating, הקוראים מופנים למאמר של Barber et al, איור 2D, Box1 ואיור משלים 6¹⁴. רביעית, כדי למקסם את היעילות, הבידול צריך להתחיל כאשר תרביות hPSC הן חד-שכבתיות ו~80% חופפות. משמעות הדבר היא קיום תרבות מתלכדת לחלוטין ביום השני. מפגש נמוך יותר משפיע לרעה על היעילות ותרביות צפופות מאוד נוטות להיות בעלות שיעור גבוה יותר של מוות תאי ועלולות להוביל להופעתם של תאים ממוינים לא רצויים.

ציפוי מחדש של תאים ביום ה-15 מסמן שלב חשוב בפרוטוקול זה. זהו שלב העברת התאים האחרון עבור תרבית עצבית חד-שכבתית ולכן יש לבחור את פריסת הצלחת בהתאם לבדיקות המתוכננות. מספר התאים המועברים לכל באר יכול להשפיע במידה ניכרת על המגוון העצבי ועל תאי עצב ישנים יותר שנותרו מחוברים לפני השטח של הבארות. באופן כללי, צפיפות תאים בטווח של 250,000-350,000 תאים לסמ"^{ר 2} (כ-75,000-100,000 תאים לבאר של צלחת בת 96 בארות או 500,000-700,000 לבאר של צלחת בת 24 בארות) רצויה. החל מהיום ה-30-40, ניתן לשקול הוספת פיברונקטין ולמינין למדיום ההזנה (לא יותר מפעם בשבוע) כדי למנוע באופן פרוספקטיבי ניתוק של תאי עצב, במיוחד עבור תאים המתוכננים לתרביות נוירונים ארוכות יותר. בשלב זה מומלץ להפחית את תדירות ההאכלה לפעם ב 5-7 ימים ולהשאיר קצת מדיום בכל באר לפני הוספת מדיום טרי נוסף. זה מקטין את הסיכוי להפעיל לחץ פיזי מיותר על התחזיות העצביות. בהתחשב באידוי של מדיום (במיוחד עבור בארות בגבול הצלחת) ניתן להסיר 75 μL ולהוסיף 100 μL של מדיום טרי לכל באר. בהתבסס על ניסיון, תרביות הגדלות על לוחות הדמיה פולימריים נוטים לחיות ולהישאר מחוברים לפני השטח של הבאר במשך זמן רב יותר. לכן, מומלץ לשקול את לוחות ההדמיה התחתונים של כיסוי הפולימר לניסויים הדורשים תרביות עצביות ישנות מאוד כגון תרביות משותפות עם סוגי תאים אחרים. למרות שלוחות מצופים PO/FN/למינין מיובשים באוויר עדיין עשויים להניב בידול יעיל, הדבר לא נבדק באופן שיטתי לצורך פרוטוקול זה. לפיכך, מומלץ להשתמש בצלחות מצופות טריות.

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על פרוטוקול שפורסם בעבר על ידי Barber et al¹⁴. בהשוואה לשיטות אינדוקציה ישנות יותר של ENC המשתמשות במדיה המכילה גורמי החלפת סרום (לדוגמה, KSR)^13,14, תנאי המדיה הנוכחיים של הפרוטוקול מוגדרים כימית. זה יתרון לקראת הבדלים עקביים יותר ומאפשר מחקרים התפתחותיים מדויקים יותר על ידי מניפולציה של תנאי התרבות. פרוטוקול חזק זה מייצר תרביות של נוירונים אנטריים מקווי תאי גזע מושרים ועובריים עצמאיים שנבדקו, כגון H9, UCSF4 ו- WTC11. היבט רב עוצמה של הפרוטוקול המוצג הוא יכולתו ליצור מגוון של תת-סוגים עצביים של ENS הדומים לאלה הנמצאים ב- ENS האנושי. לדוגמה, ביטוי של סמנים ספציפיים עבור זהויות נוירוכימיות שונות של ENS יכול להיבדק על-ידי ציטומטריית זרימה והדמיית פלואורסצנטיות (איור 1F,G). הטווח האופייני של אוכלוסיות נוירונים אנטריים שמקורם ב-hPSC חיוביים לסינתאז תחמוצת החנקן 1 (NOS1) הוא 5%-20%; כולין O-אצטילטרנספראז (CHAT) הוא 40%-60%; חומצה גמא-אמינובוטירית (GABA) היא 15%-30% וסרוטונין (5-HT) הוא 15%-30%. עם זאת, המידה שבה קישוריות מבנית ותפקודית במבחנה בין תת-סוגים אלה מדגמנת במדויק את רשתות הסלולר in vivo דורשת מחקרים נוספים. בנוסף, אנליזות של תאים בודדים כדי להרחיב את פרופיל השעתוק של תת-סוגים בודדים לא רק יסייעו להשוות טוב יותר את הזהויות התאיות in vivo ו-in vitro, אלא גם יועילו למחקרים התפתחותיים ומולקולריים, כמו גם אופטימיזציות פרוטוקולים עתידיות לקראת העשרת תת-סוגים ספציפיים לגילוי תרופות ורפואה רגנרטיבית.

למרות התרביות המכילות תאי עצב שונים, ובתרביות ישנות יותר תאי גלייה, פרוטוקול זה אינו מייצר את סוגי התאים האחרים הנמצאים באופן טבעי בנישה in vivo של ENS, כגון תאי שריר, תאי אפיתל ותאי מערכת החיסון. חקר האינטראקציה של ENS עם סוגי תאים אלה בהקשר של בריאות ומחלות דורש השקעה באופטימיזציה של מערכות תרבית משותפת ואורגנואידים במעי. בסך הכל, שיטה רבת עוצמה ליצירת תת-סוגים שונים של ENS ב- מ- hPSCs in vitro מתוארת כאן. התרביות הניתנות להרחבה מתאימות למחקרים התפתחותיים של ENS אנושי, בדיקות טוקסיקולוגיה וניסויים במידול מחלות שמטרתם לפתח טיפולים תרופתיים ולספק תאים להשתלה לטיפול בנוירופתיות אנטריות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוסף חומצה אסקורבית	Sigma-Aldrich	A5960
B27 (ללא סרום, מינוס ויטמין A)	Gibco	12587-010
מטריצת ממברנת הבסיס, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R& D systems	314-BP
צנטריפוגה תרבית תאים	Eppendorf, דגם מס' 5810R	02262501
תמיסת ניתוק תאים, Accutase	Stemcell Technologies	07920
	CHIR99021 Tocris	4423
צינורות חרוטיים	ארה"ב מדעי	1475-0511, 1500-1211
מדיום בסיס התמיינות, Essential 6	Life טכנולוגיות	A1516401
DMEM/F-12 ללא גלוטמין	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
מדיום תחזוקה hPSC ללא מזין, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R& D systems	233-FB/CF
פיברונקטין	קורנינג	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
אינקובטור עם לחות, טמפרטורה ו-CO2 מבוקרים	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
מיקרוסקופ הפוך	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
קולט אדים זרימה למינארי	Thermo Fisher Scientific	1300 series Class II, סוג A2
Laminin	Cultrex	3400-010
תוסף L-גלוטמין, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
צלחות Multiwell, Falcon	BD	353934, תוסף
	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (ללא Ca ו-Mg)	Life Technologies	10010023
מילוי פיפטות	Eppendorf	Z768715-1EA
טיפים לפיפטה	ארה"ב מדעי	1111-2830
פיפטות	פישרברנד	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
לוחות הדמיה תחתונים של כיסוי פולימר, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
	SB431542 R& D systems	1614
כתם כחול טריפאן, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
לוחות חיבור נמוכים במיוחד	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 דיהידרוכלוריד	R& מערכות D	1254