הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התמיינות של שושלות מערכת העצבים האנטרית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66133

⸱

17 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 2Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, 3Program in Craniofacial Biology, University of California, San Francisco

במאמר זה

סיכום

הפקת שושלות של מערכת העצבים האנטרית (ENS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מספקת מקור מדרגי של תאים לחקר התפתחות ומחלות של ENS, ולשימוש ברפואה רגנרטיבית. כאן, מוצג פרוטוקול מבחנה מפורט להפקת נוירונים אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית.

תקציר

מערכת העצבים האנטרית האנושית, ENS, היא רשת גדולה של סוגי תאי גלייה ותאי עצב עם מגוון נוירוטרנסמיטרים מדהים. מערכת ENS שולטת בתנועתיות המעי, בהפרשת אנזימים ובספיגת אבות מזון, ומקיימת אינטראקציה עם מערכת החיסון ועם מיקרוביום המעי. כתוצאה מכך, פגמים התפתחותיים ונרכשים של ENS אחראים למחלות אנושיות רבות ועשויים לתרום לסימפטומים של מחלת פרקינסון. מגבלות במערכות מודל של בעלי חיים וגישה לרקמות ראשוניות מציבות אתגרים ניסיוניים משמעותיים במחקרים של ENS אנושי. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט לגזירה חוץ גופית יעילה של שושלות ENS מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, hPSC, תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים. הפרוטוקול שלנו מתחיל בהתמיינות מכוונת של hPSCs לתאי פסגה עצבית אנטרית תוך 15 יום ומניב תת-סוגים מגוונים של נוירונים אנטריים פונקציונליים תוך 30 יום. פלטפורמה זו מספקת משאב מדרגי למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות, גילוי תרופות ויישומים רגנרטיביים.

מבוא

מערכת העצבים האנטרית (ENS) היא המרכיב הגדול ביותר של מערכת העצבים ההיקפית. ה-ENS מכיל יותר מ-400 מיליון תאי עצב הממוקמים במערכת העיכול ושולטים כמעט בכל תפקודיהמעי 1. הבנה מולקולרית של התפתחות ותפקוד ENS ופגמיו בנוירופתיות אנטריות דורשת גישה למקור אמין ואותנטי של נוירונים אנטריים. הגישה לרקמה הראשונית האנושית מוגבלת, ומודלים של בעלי חיים אינם מצליחים לשחזר פנוטיפים של מחלות מפתח בנוירופתיות אנטריות רבות. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הוכחה כמועילה ביותר במתן מקור בלתי מוגבל של סוגי תאים רצויים, במיוחד אלה שקשה לבודד ממקורות ראשוניים 2,3,4,5,6,7. כאן, אנו מספקים פרטים על שיטת מבחנה מדורגת וחזקה להשגת תרביות ENS מ- hPSCs. תרביות hPSC מדרגיות אלה פותחות אפיקים למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות וסינון תרופות בתפוקה גבוהה ויכולות לספק תאים להשתלה לרפואה רגנרטיבית.

שושלות נוירונים אנטריים נגזרות מתאי עצב (NC) העוקבים אחר נתיב ההתפתחות של ENS במהלך האמבריוגנזה. בעוברים, תאי NC מופיעים לאורך השוליים של הצלחת העצבית המתקפלת. הם מתרבים, נודדים ומולידים סוגי תאים רבים ושונים, כולל נוירונים חושיים, תאי Schwann, מלנוציטים, שלד גולגולתי ונוירונים אנטריים וגליה 8,9,10. ההחלטה על גורל התא תלויה באזור הנפרד לאורך הציר הקדמי-אחורי שממנו יוצאים תאי NC, כלומר NC גולגולתי, NC ווגאלי, גזע NC ו-NC סקרלי. ה-ENS מתפתח מתאי NC ואגליים וסקרליים כאשר הראשון שולט באוכלוסיית תאי העצב האנטריים בשל הנדידה הנרחבת לאורך המעי והתיישבות במעיים11.

גזירה של תאי NC מתאי PSC כרוכה בדרך כלל בשילוב של עיכוב SMAD כפול והפעלת מסלול WNT12,13. עד לאחרונה, כל פרוטוקולי האינדוקציה של NC כללו סרום ותוספים אחרים של מוצרים מן החי בתנאי התרבית. מדיה לא מוגדרת כימית לא רק מורידה את יכולת השחזור של אינדוקציה NC, אלא גם מאתגרת מחקרים התפתחותיים מכניסטיים. כדי להתגבר על אתגרים אלה, Barber et al14 פיתחו פרוטוקול אינדוקציה NC תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים כימית ולכן היה יתרון על פני שיטות חלופיות המסתמכות על גורמי החלפת סרום (למשל, KSR)13,14. זה הושג על ידי החלפת מדיה בסיסית ואופטימיזציה של פרוטוקול שהוצג במקור על ידי Fattahi et al כדי להפיק תאי NC אנטריים מ hPSCs. מערכת משופרת זו היא הבסיס לפרוטוקול הבידול hPSC המוצג כאן. זה מתחיל עם אינדוקציה של תאי עצב אנטרי (ENC) בתקופה של 15 יום על ידי אפנון מדויק של BMP, FGF, WNT ו TGFβ איתות בנוסף חומצה רטינואית (RA). לאחר מכן אנו גוזרים את שושלות ENS על ידי טיפול בתאים עם גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF). כל הרכבי המדיה מוגדרים כימית ומניבים תרביות עצביות אנטריות חזקות תוך 30-40 יום.

בנוסף למערכת תרבית התאים החד-שכבתית המתוארת כאן, פותחו גישות אינדוקציה חלופיות של NC המשתמשות בגופי עובר צפים חופשיים15,16. תאים נודדים בתרביות אלה הוכחו כמבטאים סמני NC עם תת-קבוצה המייצגת את NC הווגאלי. תרביות משותפות עם רקמת מעיים ראשונית שימשו להעשרת מבשרי NC אנטריים בתרבויות אלה. הרכבי המדיה במחקרים אלה מכילים שילוב של גורמים שונים כגון גורם גדילה עצבי, NT3 וגורם נוירוטרופי מוחי. בשלב זה, לא ברור לחלוטין כיצד גורמים אלה עשויים להשפיע על זהויות המחויבות של מבשר הנוירון האנטרית. להשוואה יעילה של השראת NC אנטרית בתרביות החד-שכבתיות ובתרביות מבוססות גוף עובר, נדרשים נתונים נוספים. בהתחשב בפריסות התרבות השונות באסטרטגיות אלה, יש לשקול את השימוש בכל שיטה ולייעל אותה בהתאם ליישום ספציפי בחשבון.

הפרוטוקול המוצג כאן ניתן לשחזור ונבדק בהצלחה על ידינו ועל ידי אחרים באמצעות קווי hPSC שונים (מושרית ועוברית) 8,14,16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה

הערה: הריכוזים המוזכרים לאורך הפרוטוקול הם ריכוזים סופיים של רכיבי המדיה. הכינו את כל המדיה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של זרימה למינרית, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C בחושך. יש להשתמש תוך שבועיים.

  1. אמצעי תחזוקה hPSC: יש לערבב תוסף בינוני לתחזוקת hPSC ללא מזין (20 מיקרוליטר/מ"ל) עם מדיום הבסיס שלו.
  2. בינוני A: הוסף חלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP4; 1 ננוגרם/מ"ל), SB431542 (10 מיקרומטר) ו-CHIR99021 (600 ננומטר) לתווך בסיס התמיינות (Differentiation Base Medium).
  3. בינוני B: הוסף SB431542 (10 μM) ו- CHIR99021 (1.5 μM) למדיום בסיס התמיינות (differentiation base medium).
  4. בינוני C: הוסף SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1.5 μM) ו- RA (1 μM) למדיום בסיס בידול.
  5. Neural crest Complete (NCC) בינוני: הוסף FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), תוסף N2 (10 μL/mL), תוסף B27 (20 μL/mL), תוסף L-גלוטמין (10 μL/mL) ו-MEM NEAAs (10 μL/mL) למדיום הנוירו-בסיסי.
  6. ENC Medium: הוסף GDNF (10 ng/mL), חומצה אסקורבית (100 μM), תוסף N2 (10 μL/mL), תוסף B27 (20 μL/mL), תוסף L-גלוטמין (10 μL/mL) ו-MEM NEAAs (10 μL/mL) למדיום נוירו-בסיסי.
  7. חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) 1x: לדלל 500 mM EDTA (1000x) לריכוז סופי של 500 מיקרומטר ב- PBS.
    הערה: השתמש ב- PBS בחינם Ca2+ ו- Mg2+ לאורך פרוטוקול זה, אלא אם צוין אחרת.

2. ציפוי צלחות תרבות

  1. לוחות מצופים מטריצת ממברנת מרתף: הפשירו במהירות, ודיללו אליקוט קפוא של 500 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף ב 50 מ"ל של DMEM מקורר:F12 על ידי פיפטציה נמרצת באמצעות פיפטה סרולוגית 50 מ"ל. מצפים את הבארות בתמיסת מטריצת קרום מרתף מדוללת (100 מיקרוליטר לס"מ2 משטח הבאר) ודגרים עליהם למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס. יש לשאוף את מצע הציפוי לפני השימוש. כדי למנוע ג'לטיניזציה של מטריצת קרום המרתף, בצע שלב זה מהר ככל האפשר והשתמש ב- DMEM קר:F12 להמסת aliquot קפוא.
    הערה: טמפרטורת מטריצת קרום המרתף צריכה להישמר קרה במהלך הפשרה (על קרח) ו aliquoting (צינורות על קרח) כדי למנוע קרישה.
  2. לוחות מצופים PO/FN/למינין: הכינו תמיסת פוליאורניתין (PO) של 15 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS על ידי דילול ציר פי 1000. מצפים בארות עם 100 μL של תמיסת PO / PBS לכל ס"מ 2 של שטח הפנים של הבאר ולדגור את הלוחות לילה ב 37 ° C. למחרת, שאפו PO/PBS וציפו את הבארות ב-100 מיקרוליטר לסמ"ר2 משטח הפנים של הבאר בתמיסת FN/למינין/PBS טרייה המכילה 2 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין (FN) ו-2 מיקרוגרם/מ"ל למינין. צלחות ניתן להשתמש לאחר מינימום של 2 שעות דגירה ב 37 ° C. יש לשאוף FN/למינין/PBS לפני השימוש.

3. תחזוקה של תרבות hPSC

הערה: כל שלבי הדגירה של התאים הם ב-5% CO2 וב-37°C באינקובטור לח.

  1. יש לשאוף מדיום hPSC מתרבית hPSC ולהוסיף מדיום טרי (200 μL לס"מ2 משטח פני הבאר) כל יומיים עד שהמושבות יהיו ~80% מתמזגות.
  2. כדי לעבור, לשאוף hPSC בינוני ולשטוף תאים עם 100 μL של PBS לכל ס"מ2 של שטח הפנים היטב.
    הערה: חשוב להשתמש ב- PBS חינם Ca2+ ו- Mg2+ כדי לשטוף את התאים.
  3. הוסף 500 μM EDTA (100 μL לכל ס"מ2 של שטח הפנים היטב). החלף את מכסה הצלחת. צפו דרך מיקרוסקופ הפוך ועקבו אחר ניתוק התאים מקצוות המושבה (2-4 דקות).
  4. השתמש פיפטה סרולוגית 5 או 10 מ"ל כדי להעביר את אותו נפח של תווך hPSC לתוך כל באר ולקצור מכנית את התאים על ידי pipeting למעלה ולמטה כמה פעמים.
    הערה: זמן הדגירה האופטימלי של EDTA תלוי בקו iPSC. הימנע pipetting נמרץ עבור ניתוק מושבות כפי שהוא יכול להוביל דיסוציאציה מוגזמת מושבה מוות תאים. כאשר עוברים כדי להתחיל צלחת התמיינות, לדגור על תאים עם EDTA במשך 1-2 דקות יותר.
  5. מעבירים את תרחיף התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט.
  6. להשהות מחדש את התאים בנפח מתאים של מדיום hPSC ולהעביר לבארות של צלחת מטריצת ממברנה חדשה במרתף.
    הערה: עבור תחזוקה שוטפת של hPSC השתמש ביחס מעבר של 1:18 - 1:24 (1:18 פירושו העברת שליש מהתאים שנותקו מבאר אחת של צלחת בת 6 בארות לצלחת חדשה מלאה). כדי להתחיל לוחית בידול, בצע יחס מעבר של 5:6.
  7. יש לדגור ב-5%CO2 וב-37°C.

4. אינדוקציה עצבית

הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1A. התחל התמיינות NC כאשר התאים נמצאים בערך 80% במפגש. זה יושג תוך 1-2 ימים כאשר תאים עוברים ביחס של 5:6 (ראה לעיל). התחל התמיינות NC ביום 0 עם תאי hPSC פלוריפוטנטיים ובלתי ממוינים לחלוטין. לקבלת יעילות גבוהה, גבולות המושבה צריכים להיות בעלי תאים מתמיינים מינימליים. מעבר ולוח hPSC להתמיינות כאשר המושבות גדולות, או מרכז המושבה מתחיל להתעבות/להתכהות כאשר מנוטרים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. תשומת לב למפגש ולמורפולוגיה נוטה להיות אמינה יותר ממספר התאים המצופים מכיוון שזה עשוי להשתנות בהתאם לקו התא ויכול לנוע בין 50,000-200,000 לסמ"ר2.

  1. ביום 0, החלף את אמצעי התחזוקה hPSC במדיום A המכיל 1 ננוגרם/מ"ל BMP4, 10 מיקרומטר SB431542, 600 ננומטר CHIR99021 (200 מיקרוליטר בינוני לס"מ2 משטח הבאר).
  2. ביום השני, התאים צריכים להיות 100% חופפים. לשאוף בעדינות מדיום A ולהזין תאים עם מדיום B המכיל 10 מיקרומטר SB431542, 1.5 מיקרומטר CHIR99021 (200 מיקרוליטר של בינוני לכל ס"מ2 של שטח פני הבאר).
    הערה: כאשר תרביות גדלות במהלך השראת NC, תאים עשויים להתנתק מהחד-שכבה הבסיסית. הימנע מאובדן תאים עודף על ידי הסרה עדינה של מדיה ישנה והוספת מדיה טרייה לצד הבאר.
  3. ביום הרביעי, הזינו שוב תאים עם מדיום B (200 מיקרוליטר בינוני לס"מ 2 משטח הבאר).
  4. ביום 6, החלף את מדיום B בבינוני C המכיל 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 ו- 1 μM חומצה רטינואית (400 μL של בינוני לכל ס"מ 2 של שטח פנים הבאר).
  5. בימים 8 ו-10, יש להאכיל כמו ביום 6.

5. היווצרות ספרואידים ENC

הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1B.

  1. ביום ה-12, יש לשאוף בעדינות מדיום C ולשטוף תאים עם 100 מיקרוליטר PBS לס"מ2 משטח הבאר. הוסף את אותו נפח של תמיסת ניתוק תאים ודגור במשך 30 דקות ב 5% CO2 ו 37 ° C.
  2. לדלל את תמיסת ניתוק התאים על-ידי הוספת נפח זהה של מדיום NCC המכיל 10 ננוגרם/מ"ל FGF2, CHIR99021 3 מיקרומטר, תוספת N2 של 10 מיקרוליטר/מ"ל, תוספת B27 של 20 מיקרוליטר/מ"ל, תוספת L-גלוטמין של 10 מיקרוליטר/מ"ל ו-10 מיקרוליטר/מ"ל מם NEAA. באמצעות פיפטה סרולוגית קוצרים את התרחיף החד-תאי ומוסיפים אותו לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל.
  3. סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט.
  4. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף 12 מ"ל (לצלחת מלאה של 6 בארות) של מדיום NCC והשהה מחדש את התאים לחלוטין על ידי צנרת מכנית למעלה ולמטה 1-2 פעמים. העבירו את מתלה התא ללוחית חיבור נמוכה במיוחד.
    הערה: כ-10 ס"מ2 של תאים חד-שכבתיים מסוג ENC מרחפים מחדש ב-2 מ"ל של תווך NCC ומועברים לבאר אחת של לוחית חיבור נמוכה במיוחד. זה שווה ללוחית אינדוקציה NC מלאה של 6 בארות המועברת לצלחת חיבור מלאה של 6 בארות נמוכה במיוחד.
  5. ביום ה-14, מערבלים בעדינות את הצלחות עד שבמרכז כל באר נאספים כדוריות קטנות. באמצעות מיקרופיפטה P1000 ובתנועה מעגלית איטית, שואפים את תווך NCC המשומש סביב היקף כל באר. נסו להימנע מהסרת הספרואידים הצפים בחופשיות.
  6. הזן את התאים בנפח המקורי של מדיום NCC.

6. אינדוקציה EN

הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1B.

  1. ביום ה-15, יש ליישם את אותה טכניקה המשמשת ביום ה-14 כדי להסיר בעדינות את המדיום ולשטוף את הספרואידים עם PBS. הסר PBS ככל האפשר הימנעות הספרואידים.
  2. הוסף תמיסת ניתוק תאים (100 μL לכל ס"מ2 של שטח הפנים היטב) ולנתק את הספרואידים לתאים בודדים על ידי דגירה במשך 30 דקות ב 5% CO2 ו 37 ° C.
  3. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף נפח שווה של מדיום ENC (המכיל 10 ng/mL GDNF, 100 μM חומצה אסקורבית, תוסף 10 μL/mL N2, תוסף B27 20 μL/mL, תוסף L-גלוטמין 10 μL/mL ו-10 μL/mL MEM NEAA בתווך נוירובזאלי) לכל באר ושבור את הספרואידים הנותרים על ידי 2-3 סיבובים של צנרת מכנית. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
    הערה: הימנעו ממתח מוגזם ומוות תאי שיכולים להתרחש כתוצאה מפיפטים כפויים או שימוש בפיפטות עם פתח קצה קטן יותר.
  4. סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף ~ 5-10 מ"ל של מדיום ENC והשהה מחדש את התאים לחלוטין על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 1-2 פעמים.
  5. ספרו את ריכוז התאים בני קיימא באמצעות טריפאן כחול ושיטת ספירת תאים כגון המוציטומטר.
    זהירות: טריפאן כחול הוא חומר החשוד כמסרטן. טפל בזהירות, השליך כראוי.
  6. הוסף נפח מספיק של תווך ENC במטרה לצפות כ 300,000-400,000 תאים קיימא לכל ס"מ 2 של שטח הפנים בצפיפות של כ ~ 1,000,000 תאים למ"ל. שאפו לתמיסת FN/למינין/PBS מבארות הצלחת.
    הערה: בחר את פורמט הלוח בהתאם לבדיקות המתוכננות עבור תרביות EN מכיוון ששלב זה מסמן את שלב הציפוי מחדש הסופי של הפרוטוקול. אבות נוירון אנטרי ניתן להקפיא ביום 15. לאחר ניתוק הכדורים עם תמיסת ניתוק תאים, השהה מחדש את האבות בערך 5 x 106 תאים / מ"ל בתווך הקפאה כגון 10% DMSO או Stem-cellbanker. בעת הצורך, יש להפשיר במדיית ENC חמה עם מעכב ROCK Y-27632 בגודל 5 מיקרומטר. תאי צלחת בפורמט הצלחת הרצוי. החלף את המדיה ב- ENC טרי לאחר מספר שעות.
  7. הוסיפו בעדינות את התאים לבארות מצופות PO/FN/למינין. הימנע מבועות שנלכדות מתחת לתרחיף התא ומונעות חיבור תאים לציפוי PO/FN/למינין, במיוחד בעת שימוש בצלחות עם גודל באר קטן יותר כגון לוחות 384 בארות. זה עלול להוביל למוות תאי.
  8. תאי הזנה אחת ליומיים עם מדיום ENC (200 מיקרוליטר לסמ"ר2 משטח באר) עד יום 30-40, ולאחר מכן להפחית את תדירות ההזנה (לפעם או פעמיים בשבוע) אך להכפיל את נפח ההזנה (ל 400 מיקרוליטר של בינוני לכל ס"מ2 של שטח פני הבאר).
    הערה: זה חשוב מכיוון שהסרה והוספה מוגזמות של מדיה יכולות להקל על ניתוק התרבית העצבית מפני השטח של הבארות. כדי למנוע ניתוק באופן פרוספקטיבי, במיוחד עבור תרביות לטווח ארוך, יש להוסיף ל-ENC FN (2 מיקרוגרם/מ"ל) ולמינין (2 מיקרוגרם/מ"ל) פעם בשבוע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מספק שיטה להפיק פסגה עצבית אנטרית ותאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית (איור 1A-B). יצירת נוירונים באיכות גבוהה תלויה בשלב אינדוקציה יעיל של סמל עצבי אנטרי. ניתן להעריך זאת באופן חזותי על-ידי בדיקת המורפולוגיה של הכדורים הצפים בחופשיות שאמורים להיראות עגולים עם משטחים חלקים בגודל של 0.1-0.4 מ"מ בקירוב, כפי שניתן לראות באיור 1C. הספרואידים האלה צריכים גם לבטא את סמן הפסגה העצבית SRY-Box tra...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה חזקה במבחנה להשגת תאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) בתוך 30-40 יום (איור 1E) ותאי גליה אנטריים המבטאים חלבון חומצי גליה פיברילרי, GFAP ו-SOX10 בתרביות ישנות יותר (> יום 55)13,14,19,22. תאי עצב וגליה אלה מושרים על ידי התמיינות הדרגתית של hPSCs לתאי פסגה עצבית ואגלית ואנטרית, ואחריה נוירון אנטרי ואבות גליה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

העבודה נתמכה על ידי מענקים מתוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך וקרן סנדלר, מענק March of Dimes מס' 1-FY18-394 ו- 1DP2NS116769-01, פרס החדשנות החדשה של מנהל ה- NIH (DP2NS116769) ל- F.F. והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK121169) ל- F.F., H.M. נתמך על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט של קרן לארי ל. הילבלום, מלגת NIH T32-DK007418 ותוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך מלגת פוסט-דוקטורט עצמאית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תוסף חומצה אסקורביתSigma-AldrichA5960
B27 (ללא סרום, מינוס ויטמין A)Gibco12587-010
מטריצת ממברנת הבסיס, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R& D systems314-BP
צנטריפוגה תרבית תאיםEppendorf, דגם מס' 5810R02262501
תמיסת ניתוק תאים, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021 Tocris4423
צינורות חרוטייםארה"ב מדעי1475-0511, 1500-1211
מדיום בסיס התמיינות, Essential 6Life טכנולוגיותA1516401
DMEM/F-12 ללא גלוטמיןLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
מדיום תחזוקה hPSC ללא מזין, Essential 8 Flex Medium KitLife TechnologiesA2858501
FGF2R& D systems233-FB/CF
פיברונקטיןקורנינג356008
GDNFPeprotech450-10
HemocytometerHausser Scientific1475
תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
אינקובטור עם לחות, טמפרטורה ו-CO2 מבוקריםThermo Fisher ScientificHerralcell 150i
מיקרוסקופ הפוךThermo Fisher ScientificEVOS FL
קולט אדים זרימה למינאריThermo Fisher Scientific1300 series Class II, סוג A2
LamininCultrex3400-010
תוסף L-גלוטמין, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
צלחות Multiwell, FalconBD353934, תוסף
CTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (ללא Ca ו-Mg)Life Technologies10010023
מילוי פיפטותEppendorfZ768715-1EA
טיפים לפיפטהארה"ב מדעי1111-2830
פיפטותפישרברנד13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
לוחות הדמיה תחתונים של כיסוי פולימר, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542 R& D systems1614
כתם כחול טריפאן, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
לוחות חיבור נמוכים במיוחדFisher Scientific07-200-601
Y-27632 דיהידרוכלורידR& מערכות D1254
N-2 353075

מקורות

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
  3. Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson's disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
  5. Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  8. Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
  9. Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
  10. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  11. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
  12. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
  13. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  14. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  15. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  16. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
  17. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
  18. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
  19. Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
  20. Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
  21. Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
  22. Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אינדוקציית רב-עצבייםהתמיינות נוירונים אנטרייםמידול מחלותגילוי תרופותיצירת ספרואידיםסמן SOX10תרחיף תאיםבארות מצופות למינין
התמיינות של שושלות מערכת העצבים האנטרית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.