מאמר שיטה

השפעה אנטגוניסטית של Jiawei Shengjiang San על מודל חולדה של נפרופתיה סוכרתית: קשור למסלול איתות EGFR/MAPK3/1

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66179

⸱

10 במאי 2024

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Hebei University of Chinese Medicine, 2School of Basic Medical Sciences, Hebei University of Chinese Medicine, 3Department of Endocrinology and Nephrology, Renal Research Institute of Beijing University of Chinese Medicine, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 4Hebei Province Academy of Chinese Medicine Sciences, 5Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Hebei University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר פרמקולוגיה של רשת וטכניקות עגינה מולקולרית כדי לחקור את מנגנון הפעולה של Jiawei Shengjiang San (JWSJS) בטיפול בנפרופתיה סוכרתית.

תקציר

מטרתנו הייתה להתעמק במנגנונים העומדים בבסיס פעולתו של Jiawei Shengjiang San (JWSJS) בטיפול בנפרופתיה סוכרתית ובפריסת פרמקולוגיה רשתית. תוך שימוש בפרמקולוגיה של רשתות ובטכניקות עגינה מולקולריות, חזינו את המרכיבים והמטרות הפעילים של JWSJS ובנינו רשת קפדנית של "רכיבי תרופות-מטרה". אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) ניתוחי העשרה שימשו כדי להבחין במסלולים ובמטרות הטיפוליות של JWSJS. Autodock Vina 1.2.0 נפרס לאימות עגינה מולקולרית, וסימולציית דינמיקה מולקולרית של 100-ns נערכה כדי לאשר את תוצאות העגינה, ואחריה אימות בעלי חיים in vivo . הממצאים גילו כי JWSJS שיתף 227 מטרות מצטלבות עם נפרופתיה סוכרתית, ובנה טופולוגיית רשת אינטראקציה חלבון-חלבון. ניתוח העשרה של KEGG ציין כי JWSJS מקל על נפרופתיה סוכרתית על ידי אפנון שומנים וטרשת עורקים, מסלול האיתות PI3K-Akt, אפופטוזיס ומסלול האיתות HIF-1, עם חלבון קינאז 1 המופעל על ידי מיטוגן (MAPK1), MAPK3, קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR), וסרין/תראונין-פרוטאין קינאז 1 (AKT1) שזוהו כמטרות קולקטיביות של מסלולים מרובים. עגינה מולקולרית טענה כי רכיבי הליבה של JWSJS (קוורצטין, חומצה פלמיטולאית ולוטאולין) יכולים לייצב קונפורמציה עם שלוש מטרות מרכזיות (MAPK1, MAPK3 ו-EGFR) באמצעות קשרי מימן. בדיקות In vivo הצביעו על עלייה ניכרת במשקל הגוף וירידה בחלבון סרום מסוכרר (GSP), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-C), אורידין טריפוספט (UTP) ורמות גלוקוז בדם בצום (FBG) עקב JWSJS. מיקרוסקופ אלקטרונים יחד עם המטוקסילין ואוזין (HE) וצביעת חומצה תקופתית שיף (PAS) הדגישו את הפוטנציאל של כל קבוצת טיפול בהקלה על נזק לכליות בהיקפים שונים, והציגו ירידות מגוונות ב-p-EGFR, p-MAPK3/1 ו-BAX, ועליות בביטוי BCL-2 ברקמות הכליה של החולדות שטופלו. באופן חד משמעי, תובנות אלה מצביעות על כך שהיעילות המגנה של JWSJS על נפרופתיה סוכרתית עשויה להיות קשורה לדיכוי ההפעלה של מסלול האיתות EGFR/MAPK3/1 ולהקלה על אפופטוזיס של תאי הכליה.

מבוא

סוכרת (DM) היא מחלה כרונית המשפיעה על מערכות מרובות ועלולה לגרום לסיבוכים שונים עקב היפרגליקמיה מתמשכת, כגון נפרופתיה סוכרתית (DN), רטינופתיה ונוירופתיה1. DN הוא סיבוך חמור של DM, המהווה כ-30%-50% ממחלת כליות סופנית (ESRD)2. הביטוי הקליני שלה הוא microalbuminuria, אשר יכול להתקדם ESRD מאופיין נפח גלומרולרי מוגבר, hyperplasia סטרומה mesangial, קרום מרתף גלומרולרי מעובה3. הפתוגנזה של DN היא מורכבת ולא הובהרה במלואה. שיטות קליניות כגון הורדת רמת הגלוקוז בדם, ויסות לחץ הדם והפחתת פרוטאינוריה משמשות בעיקר כדי לעכב את התקדמותה, אך ההשפעה היא כללית.

נכון לעכשיו, לא נמצאה תרופה ספציפית לטיפול ב- DN4. במשך מאות שנים, עם זאת, תרופות צמחי מרפא סיניות היו בשימוש נרחב בטיפול DM וסיבוכיה5 ושיפרו את הסימפטומים הקליניים של החולים ועיכבו את התקדמות המחלה. בשל היתרונות של השפעות מרובות רכיבים, מרובות מטרות ורב-מסלוליות, תרופות צמחיות סיניות צפויות להיות מקור תרופתי חדשני לטיפול ב- DN6.

מקורו של "שנג-ג'יאנג סאן" ב"וואנבינג הוי-צ'ון" (Wanbing Huichun) של הרופא גונג טינגשיאן משושלת מינג. הספר "Neifu Xianfang" מתאר את השימוש ב- Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma ו- Radix Rhei et Rhizome. בהתבסס על זה, לאחר הוספת Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, ו- Smilacis Glabrae Rhixoma, הוא מפעיל את הפונקציה של שנגג'יאנג סאן של הגברת צלילות, הפחתת עכירות, שחרור "חום" עומד, והרמוניה "צ'י" ואת הדם 7,8. זה גם מגביר את ההשפעה של חיזוק הטחול וחיטוב הכליות. יעילותו עולה בקנה אחד עם הפתוגנזה של "צ'י" DN לעלות ולרדת מהסדר עקב מחסור ב"אנרגיה חיונית", יובש ו"חום" מוגזמים, וקיפאון של "חום" הנגרם על ידי אנרג'ייזר משולש 7,8.

מחקרים קליניים קודמים הראו שימוש בצמחי מרפא סיניים לטיפול במחלת DM וסיבוכיה, והוכח כי ג'יאווי שנגג'יאנג סאן (JWSJS) מווסת את רמת הגלוקוז והשומנים בדם, מפחית פרוטאינוריה ומשפר משמעותית את היעילות הקלינית של חולים עם DN7 מוקדם. היכולת של JWSJS להפחית את רמות החלבון בשתן ואת רמות הגלוקוז בדם בחולדות DN אושרה על ידי מחקרים קודמים. זה קורה כנראה על ידי עיכוב מסלולי איתות TXNIP/NLRP3 ו- RIP1/RIP3/MLKL, הפחתת פירופטוזיס פודוציטים, ומניעת אפופטוזיס נמק ברקמות הכליה של חולדות DN, ובכך להשיג הגנה כלייתית9. JWSJS יכול לווסת את ביטוי החלבונים נפרין ופודוצין ולהפחית את הפגיעה בפודוציטים בחולדות DN, ובכך להציע כי ל- JWSJS יש השפעה מעכבת על פגיעה בפודוציטים. ל- JWSJS יש אפקט אנטי-DN מסוים עם פרופילי בטיחות טובים, אך יש מעט מחקר עליו, ועבודה זו מתמקדת בעיקר בפירופטוזיס ובאפופטוזיס נמק. הספרות אינה מעמיקה או שיטתית דיה10. הממצאים הקודמים שלנו אישרו כי JWSJS יכול להפחית פרוטאינוריה ולהקל על נזק לכליות בחולדות DN7. עם זאת, ישנם רק מחקרים מעטים על המנגנון של JWSJS לטיפול ב- DN, ואלה חסרים עומק ושיטתיות. לפיכך, מחקר זה נועד לנתח את החומרים המולקולריים ומנגנוני הפעולה של JWSJS לטיפול ב- DN באמצעות פרמקולוגיה רשתית ולספק בסיס מוצק למחקר עתידי.

פרמקולוגיה של רשת היא שיטה מתפתחת לחקר מנגנון הפעולה של תרופות, כולל כימינפורמטיקה, ביולוגיה של רשתות, ביואינפורמטיקה ופרמקולוגיה 11,12. תכנון מחקר פרמקולוגיה ברשת דומה למדי לתפיסה ההוליסטית של הרפואה הסינית המסורתית13,14, וזוהי שיטה חשובה לחקר המנגנון של צמחי מרפא סיניים. עגינה מולקולרית יכולה לחקור אינטראקציות בין מולקולות ולחזות את דפוסי הקישור והזיקה שלהן. עגינה מולקולרית התפתחה כטכניקה קריטית בתחום מחקר תרופות בעזרת מחשב15. לכן, מחקר זה בנה רשת אינטראקציה JWSJS-DN-target באמצעות פרמקולוגיה של רשת ושיטות עגינה מולקולרית המציעה בסיס אמין ותיאורטי לחקירה נוספת של טיפול DN עם JWSJS.

פרוטוקול

כל בעלי החיים הוחזקו ושימשו בהתאם למדריך מועצת המחקר הלאומית של ארה"ב לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מהדורה8, ודווחו כמומלץ בהנחיות ARRIVE16,17. המחקר נערך בהתאם למדריך מועצת המחקר הלאומית של סין לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת חביי לרפואה סינית (DWLL2019030).

1. החומרים הפעילים של JWSJS ואיסוף היעד

  1. הזן את ההרכב הרפואי JWSJS (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome, and Curcumaelongae Rhizoma) למסד הנתונים של פלטפורמת הפרמקולוגיה ופלטפורמת הניתוח של מערכות הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP)18 כדי לאחזר את כל הרכיבים הכימיים.  על פי ספיגה, הפצה, מטבוליזם והפרשה (ADME) הזמינות הביולוגית האוראלית (OB) ≥ 30% ותכונות דמויות תרופות (DL) ≥ 0.18 מרכיבים כימיים19,20.
  2. השתמש במסד הנתונים TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, גירסה. 2.3) כדי לאחזר את המטרות המתאימות של מרכיבים כימיים.
  3. השג את המרכיבים הפעילים של Bombyx Batryticatus ו - Cicadae Periostracum על ידי חיפוש במאגרי המידע של הרפואה הסינית המסורתית וההרכב הכימי21.
  4. לאמינות הניסוי, בחר תרכובות עם מספרי שירות תקצירים כימיים (CAS) עבור מחקר זה. לאחר מכן הורד דיאגרמות מבנה דו-ממדיות (פורמט .sdf) של חומרים פעילים מ- PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, עודכן בשנת 2021)22.
  5. השתמש ב- SwissADME (www.swissadme.ch, עודכן בשנת 2021)23כדי לסנן את הרכיבים עם ספיגה גבוהה במערכת העיכול (GI) כדמיון תרופתי (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) ששני הפריטים ≥ שלהם היו 'כן'. זה הוביל את המרכיבים הפעילים של Bombyx Batryticatus ו Cicadae Periostracum.
  6. ייבא אותם למסד הנתונים TCMSP לחיזוי חלבון מטרה (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, גרסה. 2.3)18.
  7. תקנן את היעדים במסד הנתונים של UniProt (https://www.uniprot.org, עודכן בשנת 2021) כאשר הסטטוס מוגדר כנבדק והמינים מוגדרים כ - Human24.

2. איסוף יעדים תואם DN

  1. חיפוש נפרופתיה סוכרתית באמצעות GeneCards (https://www.genecards.org/, גרסה. 5.1)25, OMIM (https://omim.org/, עודכן בשנת 2021)26, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, עודכן בשנת 2021)27, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, עודכן בשנת 2021)28,ומאגרי המידע של DrugBank (https://www.drugbank.ca/, עודכן בשנת 2021)29. השג את המטרות של DN לאחר שילוב וביטול כפילויות.
  2. סינון מטרות נפוצות של JWSJS ו- DN ובניית רשת
    1. סנן את המטרות הנפוצות של JWSJS ו- DN באמצעות תוכנת R 4.2.0 וצייר דיאגרמות חיתוך קבוצות (Venn). ייבא את החומרים הפעילים ואת המטרות הפוטנציאליות של JWSJS לתוכנת Cytoscape 3.8.030 כדי לבנות דיאגרמת רשת של תרופה-רכיב-יעד הממחישה את הקשר בין תרופות, מרכיבים, מטרות ומחלות.
    2. תן לגודל הצומת לשקף את גודל ערך המעלות, כאשר ערך מעלה גבוה יותר מציין שהצומת חשוב יותר ברשת.
  3. בניית רשת אינטראקציה חלבון-חלבון PPI וסינון מטרות ליבה
    1. נתח את הגנים המצטלבים באמצעות הפלטפורמה המקוונת STRING (גרסה:11.5) כדי לבנות רשת אינטראקציה חלבון-חלבון (PPI)31. בנה את הרשת באמצעות מצב ניתוח חלבונים מרובים , הגדר את המין להומו ספיאנס, והגדר את ציון האינטראקציה המינימלי הנדרש ל- >0.930.
    2. השתמש ב- Cytoscape 3.8.0 כדי לנתח את הרשת מבחינה טופולוגית, לחשב את מרכזיות בין (BC), מרכזיות הקרבה (CC), מרכזיות המעלות (DC), מרכזיות Eigenvector (EC), שיטה מבוססת קישוריות ממוצעת מקומית (LAC) ומרכזיות הרשת (NC) עבור כל צומת, ולסנן את ששת הצמתים עם כל הערכים הגדולים מ-32 החציוני. חזור על תהליך זה מספר פעמים כדי לזהות את מטרות הליבה של JWSJS לטיפול ב- DN.
  4. ניתוחים פונקציונליים של GO וניתוח העשרת מסלול KEGG
    1. בצע ניתוחי העשרה של GO ו- KEGG כדי לזהות את התהליכים הביולוגיים, הפונקציות המולקולריות, המרכיבים התאיים והמסלולים הקשורים למטרות המשותפות של JWSJS ו- DN.
    2. השתמש בארגון. חבילה Hs.eg.db כדי לקבל את המזהים של יעדי הצומת, ולהשתמש ב - clusterProfiler, org. חבילות Hs.eg.db, enrichplot ו - ggplot2 לניתוחי העשרה33.
    3. מסך לניתוח העשרת GO פונקציונלי על 10 הלהיטים הביולוגיים המובילים עם ערך P מתוקן < 0.05, ובחר 30 מסלולים מובילים עם ההעשרה הגבוהה ביותר לניתוח KEGG.

3. עגינה מולקולרית

  1. השתמש בתוכנת AutoDock Vina כדי לבצע עגינה מולקולרית בין רכיבי הליבה של JWSJS לבין מטרות הליבה של טיפול DN34.
  2. חפש במסד הנתונים PubChem כדי להשיג את קובץ ה- sdf של המבנה הדו-ממדי של רכיבי הליבה של JWSJS. השתמש בתוכנת ChemBio 3D Ultra14.0 כדי ליצור ולייעל את המבנה התלת-ממדי שלה, לשמור אותו בפורמט mol2 ולהשתמש בו כקובץ ליגנד.
  3. מצא והורד את תבנית pdb של המבנה התלת-ממדי של יעדי הליבה ממסד הנתונים Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB). השתמש בתוכנת Pymol 2.4.0 כדי להסיר מולקולות מים וליגנדות ממבנה החלבון, לשמור אותו כפורמט pdb ולהשתמש בו כקובץ קולטן.
  4. ייבא את קובץ הקולטן pdb לתוכנת AutoDockTools 1.5.7 עבור הידרוגנציה, המר הן חלבון קולטן והן ליגנד מולקולות קטנות לפורמט pdbqt, הגדר כיס פעיל לחלבון קולטן עם מקדם מרווח מוגדר על 1.
  5. השתמש ב- Autodock vina 1.2.0 לעגינה מולקולרית וחשב אנרגיית קשירה; אם זיקה < 0, קחו בחשבון שמולקולה נקשרת באופן ספונטני לחלבון, ערך מוחלט גדול יותר של אהדה מצביע על קשירה יציבה יותר ביניהם. לבסוף, הצג תוצאות עגינה באופן חזותי באמצעות תוכנת Pymol 2.3.0 ו- LigPlot 2.2.5.

4. סימולציה דינמית מולקולרית

  1. כדי לבצע סימולציות MD באמצעות תוכנת Desmond, בצע את הפעולות הבאות:
    1. השתמש בגרסה האקדמית 2019-1 של תוכנת דזמונד להערכת היציבות והגמישות של אינטראקציות חלבון-ליגנד.
    2. ביצוע חקירות דינמיקה מולקולרית (MD) על שלושה מכלולי ליגנדים מבטיחים ביותר הנגזרים ממחקרי עגינה. ביצוע סימולציות בסביבה מימית SPC עם 0.15 M NaCl, המשכפל את התנאים היוניים הפיזיולוגיים. קופסת הסימולציה נועדה להבטיח שהמומס יישאר במרחק של לפחות 10 Å מגבולותיו. מונים מוכנסים כדי לנטרל את המטען החשמלי של המערכת. בנוסף, מוחלים תנאי גבול תקופתיים, הנשלטים על ידי הפרמטרים של שדה הכוח OPLS 2005.
    3. התחל שלב מזעור אנרגיה עבור 100 ps באמצעות פרמטרי ברירת המחדל של Desmond.
    4. ודא ייצוב טמפרטורה ולחץ ב- 26.85 ° C (300 K) ו- 1.01325 בר באמצעות שרשרת Nosé-Hoover ומתודולוגיות Martyna-Tobias-Klein בכל מערכות MD הייצור. סימולציית הדינמיקה המולקולרית מבוצעת עם צעד זמן של 2 fs למשך כולל של 100 ns, רישום הקואורדינטות האטומיות כל 100 ps.
    5. פתח את מודול דיאגרמת אינטראקציות הסימולציה (SID). טען את קבצי נתוני תוצאות הסימולציה למודול.
    6. בחר את סוג הניתוח הרצוי מבין האפשרויות הזמינות במודול (לדוגמה, סטיית שורש-ממוצע-ריבוע [RMSD], תנודות ריבועיות ממוצע שורש [RMSF], ניתוח קשרי מימן וכו '). ציין פרמטרים נוספים הדרושים לסוג הניתוח שנבחר.
    7. הפעל את הניתוח על ידי לחיצה על לחצן נתח או התחל.
    8. לאחר השלמת הניתוח, הצג ופרש את התוצאות בתוך ממשק מודול SID. יצא תוצאות במידת הצורך לשימוש נוסף או להצגה.

5. אימות ניסויים בבעלי חיים

  1. בעלי חיים ועיצוב ניסויים
    הערה: במחקר זה השתתפו 75 חולדות Sprague-Dawley זכרים, שהתקבלו ממתקן ייצור בעלי חיים ברמת SPF והיו בנות 8 שבועות עם מסת גוף של 150 גרם ± 20 גרם (מספר תעודת ייצור בעלי חיים SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. אחסנו את החולדות במעבדת בעלי חיים ברמת SPF וחלקו אותן באופן אקראי לקבוצות נורמליות וקבוצות מודל לאחר שבוע אחד של האכלה אדפטיבית. ספק לקבוצה הרגילה תזונה רגילה ולקבוצת המודל דיאטה עתירת סוכר ושומן. לאחר 4 שבועות, לצום את החולדות אבל לא לשלול מהם מים במשך 12 שעות.
    2. הזריקו לקבוצת המודל הזרקה תוך-צפקית של סטרפטוזוטוקין (STZ; 35 מ"ג·ק"ג-1). לאחר 72 שעות, בדוק את רמות הסוכר בדם באמצעות דגימת דם של ורידים בזנב. אם רמת הגלוקוז בדם בצום היא ≥16.7 mmol · L-1, לאשר את זה כמו מודל סוכרת מוצלח.
    3. אשר את מודל ה- DN המוצלח על ידי התבוננות בשינויים היסטופתולוגיים בכליה של חולדה.
    4. חלקו באופן אקראי את המודלים ששוכפלו בהצלחה לקבוצת המודלים, שקיבלה JWSJS במינון של 4.37 גרם/ק"ג, 8.73 גרם/ק"ג ו-17.46 גרם/ק"ג (שווה ערך לפי 3.2, 6.3 ופי 12.6 מהמינון המקביל הקליני) וכן לקבוצת irbesartan (0.014 גרם/ק"ג). כל קבוצה כללה 10 חולדות. יש לתת את כל התרופות דרך הפה פעם ביום. שמור על משטר מינון זה באופן עקבי במשך 4 שבועות.
    5. מרדימים את החולדות באמצעות הזרקה תוך צפקית של 1% נתרן פנטוברביטלי (50 מ"ג/ק"ג) ומאשרים הרדמה מתאימה על ידי אובדן רפלקס הגמילה מדוושה. לאסוף דגימות דם מאבי העורקים הבטני לפני המתת חסד.
    6. לאסוף את הכליות לאחר המתת חסד החולדות באמצעות הזרקה intraperitoneal של pentobarbital נתרן במינון של 150 מ"ג / ק"ג.
      הערה: בעלי החיים הומתו באופן הומני, בהתאם להנחיות המעודכנות ביותר של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית (AVMA) (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) להמתת חסד.
  2. ניתוחי היסטולוגיה כלייתית
    הערה: רקמות הכליה היו קבועות ב -4% paraformaldehyde והתייבשו באתנול לאחר 48 שעות; חלקים היו משובצים בפרפין. החלקים נחתכו לפרוסות דקות (4 מיקרומטר) עבור צביעת המטוקסילין ואאוסין (HE) וחומצה תקופתית שיף (PAS), והשינויים המורפולוגיים של היסטולוגיה של הכליות נצפו תחת מיקרוסקופ אור.
    1. הוא מכתים:
      1. ניקוי והידרציה: יש לטפל בחלקי הרקמה עם קסילן I ו-II (10 דקות כל אחד), אלכוהול מוחלט I ו-II (3 דקות כל אחד). לאחר מכן, לטבול את חלקי הרקמה ב 95%, 90%, 80%, ו 70% אתנול (2 דקות כל אחד), ולאחר מכן לשטוף מים מזוקקים במשך 5 דקות.
      2. מניחים את קטעי הרקמה בכתם hematoxylin במשך 5 דקות ולאחר מכן להבדיל את החלקים עם אלכוהול הידרוכלורי במשך 5 שניות.
      3. מניחים את החלק בתמיסת צביעת האאוזין למשך 3 דקות.
      4. התייבשות, ניקוי והרכבה: יש לייבש את המקטעים בזמנים שונים באתנולים שונים (70%,80%,90%,95% ואתנולים מוחלטים), לאחר מכן לנקות אותם בקסילן I ו-II, ולאחר מכן להרכיב עם מסטיק נייטרלי.
    2. צביעת PAS:
      1. בצע את שלבי הסרת השעווה המתוארים בשלב 5.2.1 וטפל בקטע עם תמיסת צביעת החומצה התקופתית למשך ~8 דקות.
      2. שטפו את החלקים במים מזוקקים במשך 2 דקות ולאחר מכן הכתימו אותם עם מגיב Schiff למשך 15 דקות בחושך.
      3. שטפו את החלקים במי ברז במשך 10 דקות לאחר הטיפול בהם עם מגיב שיף.
      4. כתם נגדי את החלקים באמצעות hematoxylin במשך 1 דקות ולאחר מכן להבדיל אותם עם HCl- אלכוהול במשך 30 שניות. שטפו שוב את החלקים במי ברז למשך 5 דקות כדי לצבוע את הגרעין בכחול.
    3. מיקרוסקופ אלקטרונים:
      1. תקן את הדגימות ב -2.5% גלוטראלדהיד במשך 3 שעות, ולאחר מכן שטוף אותן ב- PBS במשך 3 שעות. יתר על כן, לטפל בדגימות בחומצה אוסמית 1% במשך 3 שעות ולאחר מכן לשטוף שוב PBS במשך 3 שעות.
      2. להתייבש באמצעות סדרה מדורגת של אמבטיות אלכוהול המסתיימות באצטון (כל צעד נמשך כשעתיים בסך הכל).
      3. יש להחדיר את הדגימות עם תערובת של אפוקסי פרופאן ושרף אפוקסי (1:1) בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעתיים, ולאחר מכן שרף אפוקסי טהור ב-37°C למשך שעתיים נוספות.
      4. לאחר מכן, לרפא ולהקשיח את הדגימות בטמפרטורות גבוהות יותר ויותר על פני תקופה של 36 שעות לפני חתך. תהליך זה מבטיח שהרקמה תוחדר היטב עם השרף, אשר לאחר מכן מתקשה כדי לאפשר חיתוך דק למיקרוסקופ אלקטרונים.
      5. כתם כפול עם 3% אורניל אצטט וחומצת עופרת, ולצפות ולצלם את הדגימות במיקרוסקופ אלקטרונים תוך 15 דקות.
        הערה: הגדרות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) הן כדלקמן: הגדלה של 7000x במצב ניגודיות גבוהה (Zoom-1 HC-1), עם מתח האצה של 80.0 kV במערכת TEM.
  3. אימונוהיסטוכימיה
    1. Dewaxing: מניחים את חלקי הרקמה בקסילן I ו-II למשך 10 דקות כל אחד.
    2. התייבשות: התייבשו מחדש את חלקי הרקמה שעברו שעווה על ידי הצבתם ברצף באתנול מוחלט I ו-II למשך 3 דקות כל אחד, ולאחר מכן 95%, 90%, 80% ו-70% אתנול למשך 2 דקות כל אחד.
    3. שליפת אנטיגן: יש לטבול את חלקי הרקמה בתמיסת חיץ חומצת לימון ציטראט 0.1M בלחץ גבוה למשך כ-5 דקות ולאחר מכן לקרר ל-RT.
    4. חסימה: למניעת קשירה לא ספציפית של הנוגדנים, יש לחסום על ידי דגירה של חלקי הרקמה בסרום עיזים תקין 5% בטמפרטורה של כ-37°C למשך 30 דקות.
    5. דגירה ראשונית של נוגדנים: יש להוסיף את הנוגדנים הראשוניים p-EGFR (מדולל 1:200) ו-p-MAPK3/1 (מדולל 1:200) על חלקי הרקמה ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C בתוך תא לח.
    6. דגירה שניונית של נוגדנים: יש לשטוף את המקטעים שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף נוגדנים משניים המסומנים בביוטין (מדוללים ב-PBS בהתאם להוראות היצרן) על המקטעים ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
    7. יש למרוח תמיסת עבודה סטרפטאבידין מצומדת על חלקי הרקמה בטמפרטורה של 37°C ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים באמצעות מלח חוצץ פוספט (PBS).
    8. לפיתוח DAB, יש לדגור על המקטעים עם תמיסת פיתוח DAB (3 דקות בחושך ב-RT), ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים. DAB משמש כמצע כרומוגני עבור האנזים חזרת פרוקסידאז (HRP), שהופך חום עם חמצון.
    9. השתמש hematoxylin עבור counterstaining במשך כ 2 דקות, להבדיל את החלקים עם 1% אלכוהול הידרוכלורי במשך 5 שניות, ולאחר מכן לשטוף תחת מים זורמים כדי להפוך כחול.
    10. יש לייבש על ידי הנחת החלקים ברצף בסדרה של אתנול מריכוז נמוך לגבוה, צלולים בקסילן I ו- II, ולהרכיב את החלקים עם מסטיק ניטרלי.
      הערה: הליך זה אורך כ-18-24 שעות, כולל דגירה של נוגדנים ראשוניים למשך הלילה.
    11. בחר באופן אקראי שלושה שדות חזותיים (200x) עבור כל מקטע ונתח את תוצאות הצביעה של מקטעים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. תוכנת Image Pro Plus 6.0 שימשה לפי השלבים הבאים.
    12. ראשית, ייבא תמונה של הקטע לתוך התוכנה.
    13. תיקון צפיפות: כדי להבטיח תוצאות מדויקות, בצע תיקון צפיפות.
      1. נווט אל מדידת > כיול > עוצמה > > std חדש. אפשרויות > דחיסות אופציונליות > תמונה. לאחר מכן, לחץ על אזור ריק בתמונה כדי להקליט את ערך הרקע ולאשר אותו על ידי לחיצה על אישור.
    14. הגדרת פרמטרי מדידה: הגדר פרמטרי מדידה לחישוב שטח וצפיפות אופטית משולבת (IOD).
      1. לחץ על מדוד > ספירה/גודל > למדוד > בחר מדידות. בחר אזור(100) ו - IOD ולאחר מכן לחץ על אישור.
      2. עבור אל אפשרויות, סמן רקע כהה על דוגמה, 4-Connect Pre-Filter ולחץ על אישור.
    15. בחירת צבע: כדי לקבוע במדויק את החיוביות, בחרו צבעים לזיהוי אזורים מוכתמים לעומת אזורים לא מוכתמים.
      1. לחץ על Select Colors > Histogram בהתבסס >- HSI. התאם את ערך H בהתאם לתמונה תוך השארת S ללא שינוי ו - I בטווח שבין אפס לערך הרקע. לאחר מכן, אשר על ידי לחיצה על סגור.
      2. איסוף נתונים וחישובם: בצע איסוף וחישוב נתונים על-ידי לחיצה על Measure > Data Collector > Layout, כאשר Name, Area(Sum) ו - IOD(Sum) נבחרים. לאחר מכן, לחץ על ספירת > אסוף עכשיו > רשימת נתונים כדי לייצא את הנתונים לניתוח או אחסון נוספים.
        הערה: זה הביא למדידה כמותית למחצה של ביטוי חלבון בכל סעיף במונחים של IOD/שטח, אשר מציין כמה חלבון קיים ביחס לשטח הכולל שנותח.
  4. כתם מערבי
    1. להשיג את רקמת הכליה לחתוך אותו לחתיכות. הכניסו את החתיכות הללו לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, הוסיפו את תמיסת החלבון ליזה המקוררת מראש (50 mM Tris [pH 7.4],150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% נתרן deoxycholate, 0.1% נתרן דודציל סולפט [SDS]), והומוגניז.
    2. השאירו אותו על קרח למשך 30 דקות, ואז צנטריפוגה ב 13400 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (75 °F). אחסנו את הדגימה המתקבלת במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
    3. השתמש בשיטת ברדפורד כדי לכמת את החלבונים.
      1. הכינו את פתרון העבודה Coomassie Brilliant Blue על ידי ערבוב מגיב ומים מזוקקים ביחס של 1:4.
      2. קבע שלוש קבוצות - קבוצת חלבון ריקה, סטנדרטית, וקבוצת חלבון מדגם. הוסף 3 מ"ל של תמיסת עבודה Coomassie Brilliant Blue לכל קבוצה, יחד עם מלח פיזיולוגי עבור הקבוצה הריקה, חלבון סטנדרטי עבור הקבוצה הסטנדרטית, וחלבון supernatant מופק עבור קבוצת הדגימה.
      3. לאחר מתן התערובות לעמוד במשך 5 דקות, למדוד את ערכי הספיגה שלהם באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה סגול.
      4. חשב את ריכוז הדגימה באמצעות נוסחה זו: ריכוז חלבון (מ"ג/מ"ל) = (ערך ספיגת דגימה/ערך ספיגת צינור סטנדרטי) x ריכוז חלבון סטנדרטי x 5.
    4. הוסף נפח שווה של מאגר העמסה פי 6 לכל דגימת חלבון. מרתיחים ב-100°C למשך 5 דקות לפני שמתחילים ומאחסנים אותם במקפיא של -20°Cfreezer עד לשימוש חדש.
    5. בצע אלקטרופורזה סטנדרטית, הכתמה וחסימה.
      1. בצע אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל SDS-polyacrylamide (PAGE) באמצעות ג'ל פותר 12%. יש למרוח מתח קבוע של 100 וולט על ג'ל הערימה ו-120 וולט על ג'ל הפירוק עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.
      2. העבירו חלבונים לקרומי פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) במתח של 100 וולט למשך שעתיים בחדר קר בטמפרטורה של 4°C באמצעות מערכת העברה רטובה.
      3. לאחר העברת חלבון, לחסום קרומים עם חלב 5% ללא שומן TBST במשך 1 שעה ב RT.
    6. דילול נוגדנים ראשוניים EGFR (1:2,000), p-EGFR (1:2,000), MAPK3/1 (1:2,000), p-MAPK3/1 (1:2,000), Bcl-2 (1:2,000), BAX (1:2,000) ו-CAPDH (1:5,000) ב-TBST עם 5% BSA. הוסיפו את הנוגדנים הראשוניים המדוללים הללו ודגרו על הקרומים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה.
    7. לאחר שטיפת הממברנה שלוש פעמים עם TBST, מוסיפים נוגדנים משניים מדוללים (1:5,000), ולאחר מכן דגירה למשך שעה. לאחר פיתוח צבע, לבצע ניתוח כמותי של פסי המטרה באמצעות תוכנת ImageJ.
  5. ניתוח qPCR
    1. קיבוץ: הקצאת דוגמאות לקבוצות - Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. מיצוי RNA: ביצוע הומוגניזציה של רקמות ומיצוי RNA, ולאחר מכן הוספת כלורופורם, צנטריפוגה ומשקעים RNA בהתאם להוראות היצרן.
    3. RNA משקעים ושטיפה: לזרז RNA עם isopropanol ולשטוף עם אתנול.
    4. מסיסות RNA: יבשו את כדורית ה-RNA והמיסו אותה במים שטופלו ב-DEPC.
    5. cDNA Synthesis: בצע שעתוק לאחור באמצעות תערובות תגובה ספציפיות בהתאם להוראות היצרן.
    6. qPCR הגברה: השתמש בפריימרים ספציפיים עבור GAPDH, MAPK3, MAPK1 ו- EGFR עבור qPCR ובצע הגברה בהתאם להוראות היצרן.
      רצפי פריימר היו כדלקמן:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. שיטות סטטיסטיות

  1. בצע את הניתוח באמצעות תוכנה מתאימה (למשל, SPSS) וייצג את הנתונים הנמדדים כממוצע ± סטיית תקן. אם הנתונים עמדו בקריטריונים של התפלגות נורמלית והומוגניות שונות, השווה בין קבוצות באמצעות ANOVA חד-כיווני ובצע השוואות מרובות עם שיטת בונפרוני.
  2. השתמש במבחן T2 להשוואות מרובות אם השונות אינה הומוגנית. ניקח בחשבון את P < 0.05 כמובהק סטטיסטית.

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, 90 מרכיבים פעילים של JWSJS התקבלו לבסוף מהניתוח לאחר סינון ומניעת כפילויות על פי הסטנדרטים שנקבעו של OB ו- DL. אלה כללו 20 סוגים של Hedysarum Multijugum Maxim, 23 סוגים של Epimrdii Herba, 15 סוגים של Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 סוגים של Radix Rhei et Rhizome, ארבעה סוגים של Curcumaelongae Rhizoma, 15 סוגים של Cicadae Periostracum, ושישה סוגים של רכיבי Bombyx Batryticatus . מכיוון שישנם מרכיבים פעילים רבים ב- JWSJS, רק 20 רשומים (ראה טבלה 1). לאחר מניעת כפילויות, הושגו לבסוף 396 מטרות המתאימות לחומרים הפעילים של JWSJS.

לאחר חיפוש אחר גנים הקשורים למחלות, 3035 גני מטרה הקשורים ל- DN הושגו לבסוף לאחר מיזוג ומניעת כפילויות. המטרות המקבילות של DN הושוו ונותחו עם המטרות של החומרים הפעילים של תרופות. הצומת נקבע, מה שהביא ל-227 מטרות הצטלבות של JWSJS ו-DN. לאחר מכן שורטטה דיאגרמת ויין (ראו איור 1A). דיאגרמת הרשת "תרופה-רכיב-מטרה" נבנתה באמצעות תוכנת Cytoscape 3.8.0 (ראו איור 1B), ובוצע ניתוח טופולוגי. כל צומת דורג מגבוה לנמוך בהתאם לערך התואר. חמשת מרכיבי התרופות המובילים היו קוורצטין, חומצה פלמיטולאית, לוטאולין, קמפפרול ונרינגנין, וחמשת היעדים המובילים היו PTGS2, PTGS1, NCoA2, AR ו-ESR1.

לאחר מכן, פותחה רשת PPI עבור יעדי חיתוך JWSJS ו- DN (196 צמתים ו- 1714 קצוות עם ערך תואר ממוצע של 17.4). יתר על כן, שבע מטרות מפתח שעשויות להיות המטרות העיקריות של JWSJS לטיפול בדנ"ן התקבלו לאחר שלוש הקרנות: MAPK14, TP53, MAPK3, MYC, HIF1A, ESR1 ו-MAPK1 (ראו איור 1C).

לאחר מכן, בוצע ניתוח העשרת GO כדי לשער את המאפיינים הביולוגיים של המטרה של JWSJS בטיפול ב- DN. בין BP, CC ו-MF, עשרת הערכים המועשרים המובילים מתוארים באיור 1D. התוצאות מראות כי JWSJS יכול לווסת את התפשטות התא, התמיינות ואפופטוזיס על ידי קשירה עם גורמי שעתוק וקינאזות חלבונים ברפסודות ממברנה ובמיקרו-דומיינים של ממברנה, ובכך לגרום להשפעה טיפולית על DN. ניתוח העשרת מסלולי KEGG בוצע על המטרות המשתתפות כדי לחקור את מסלולי הפעולה הפוטנציאליים של JWSJS ב- DN. שלושים המסלולים המועשרים המובילים משורטטים באיור 1E. התוצאות מראות כי הטיפול של JWSJS בדנ"ן עשוי לפעול על 181 מסלולי איתות, הכוללים בעיקר שומנים וטרשת עורקים, מסלול איתות PI3K-Akt, קרצינוגנזה כימית, צהבת, סרטן הערמונית, אפופטוזיס, מסלול איתות HIF-1 ומסלול איתות TNF.

כדי להמשיך לחקור את המטרות של 30 המסלולים הראשונים המועשרים ב-KEGG, השתמשנו בתוכנת Cytoscape 3.8.0 כדי לבנות מפת רשת קשרי מסלול איתות KEGG עבור DN שטופל ב-JWSJS. MAPK1, MAPK3, EGFR ו-AKT1 נמצאו כמטרות של מסלולים מרובים הפועלים יחד (ראו איור 1F), דבר המצביע על כך שהחלבונים האלה עשויים למלא תפקיד מרכזי בתיווך ההשפעות של JWSJS על DN.

כדי לאמת עוד יותר את המטרות הפוטנציאליות של JWSJS בטיפול ב- DN, סקרנו כעת שלוש מטרות מפתח, MAPK1, MAPK3 ו- EGFR, עם ערכי דרגה גבוהה ברשת PPI וברשת מסלולי האיתות של KEGG. אלה עוגנו מולקולרית עם קוורצטין, חומצה פלמיטולאית, ולוטאולין - שלושת המרכיבים העליונים של JWSJS לטיפול ב- DN. התנאים לבדיקת מזהה PDB הם כדלקמן: (1) להיגזר מבני אדם; (2) רזולוציית קונפורמציה ≤ 2.5Å, כלומר קטנה ככל האפשר; (3) רצף קונפורמטיבי כדי להיות שלם ככל האפשר, כלומר, המכלול המבני חייב להיות בעל מידע ליגנד מולקולה קטנה; ו-(4) ערך החומציות הגבישי צריך להיות קרוב ככל האפשר לטווח הפיזיולוגי הנורמלי של גוף האדם35. לבסוף, מזהי PDB של MAPK1, MAPK3 ו-EGFR היו 4QTA, 4QTB ו-7JXQ.

כדי לאמת את אמינות תוכנת AutoDock למערכת העגינה במחקר זה36, תחילה עגנו מחדש את שלושת החלבונים של MAPK1, Mapk3 ו-EGFR. קונפורמציית הליגנד במבנה הגבישי המקורי של שלושת חלבוני המטרה הוחלפה עם הליגנדות לאחר העגינה (איור 2A). לאחר מכן חושבו ערכי סטיית השורש-ממוצע-ריבוע (RMSD) בין קונפורמציית הליגנד לאחר העגינה לבין המבנה הגבישי המקורי. ערכי RMSD היו 1.129, 1.201 ו- 1.877 Å, בהתאמה, כולם ≤- 2Å. זה הראה כי שיטת העגינה הייתה אמינה וניתן להשתמש בה לאימות העגינה המולקולרי הבא. כדי להשוות ולהצהיר על הפוטנציאל המעכב של רכיבי הליבה, הליגנדות המקוריות של MAPK1, MAPK3 ו-EGFR שימשו לאחר מכן כבקרות. ניתוח העגינה חזה בהצלחה את אנרגיית הקישור בין לוטאולין, חומצה פלמיטולאית, קוורצטין ושלוש מטרות הליבה. כל אלה היו שליליים ופחות מ -637; ראו טבלה 2. יש לציין כי העגינה המולקולרית בין לוטאולין ל-MAPK1 היא בעלת גודל החלל הגבוה ביותר ואנרגיית הקישור הנמוכה ביותר. באופן כללי, תוצאות העגינה המולקולרית הראו כי לוטאולין, חומצה פלמיטולאית וקוורצטין היו בעלי פעילות קישור טובה עם שלוש מטרות ליבה (איור 2B,C).

ה-RMSD משמש לכימות שינויי התזוזה הממוצעים של קבוצת אטומים נבחרת ביחס למסגרת ייחוס. בינתיים, RMSF מאפיין ביעילות שינויים מקומיים לאורך שרשרת החלבון. תרשים RMSD (איור 2D) מראה שערכי RMSD של קומפלקס לוטאולין-MAPK1 וקומפלקס קוורצטין-MAPK3 התייצבו בטווח של 5 ns. קומפלקס luteolin-EGFR הראה RMSD תנודתי נע בין 0-35 ns; ערך זה התייצב על 35 ns עד סוף סימולציית MD של 100 ns. כל הקומפלקסים קיימו אינטראקציה יציבה בסוף סימולציית MD של 100 ns. ערך RMSF הוערך על פי מסלול סימולציית MD: אטומים באתר הפעיל ובשרשרת הראשית שנעה באופן מינימלי רמזו על שינוי קונפורמטיבי מינימלי, דבר המצביע על כך שתרכובת העופרת שהוזכרה מעוגנת היטב בתוך חלל כיס הקישור של חלבון המטרה. תוצאות RMSF הראו תנודות מוגבלות במבנים המורכבים.

לבסוף, אנו מאמתים את התוצאות לעיל in vivo. ראשית ראינו שמשקל החולדות בקבוצת המודל ירד באופן משמעותי, ו-GSP, LDL-C, UTP ו-FBG עלו באופן משמעותי (P <-0.05). משקל הגוף של חולדות עלה באופן משמעותי בקבוצת irbesartan ובכל קבוצת JWSJS לעומת קבוצת המודל. GSP, LDL-C, UTP ו-FBG ירדו בדרגות שונות (P < 0.05; ראו טבלה 3).

לאחר מכן, צביעת HE הראתה כי glomeruli בקבוצה נורמלית היה בגודל נורמלי. הם היו סדירים ושקופים במבנה שלהם והיו להם קרום מרתף חלק, צינוריות כליות מסודרות בקפידה, וללא חדירת תאים דלקתיים. בקבוצת המודל, הגלומרולי היו היפרטרופיים, קרום המרתף התעבה, והמטריצה המסנגיאלית הוגדלה. לאינטרסטיציום חדרו תאים דלקתיים. הביטויים הפתולוגיים של כל קבוצת ניהול הוקלו בהיקפים שונים בהשוואה לקבוצת המודל (ראו איור 3A).

צביעת PAS הראתה כי לקבוצת המודל היו נפחים גלומרולריים גדלים, קרום מרתף מעובה ומטריצה מסנגיאלית מוגברת לעומת הקבוצה הנורמלית. ביטויים פתולוגיים אלה הוקלו באופן משמעותי על ידי כל קבוצת ממשל (ראו איור 3B). באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, מצאנו כי קרום המרתף הגלומרולרי בקבוצת המודל היה מעובה לעומת הקבוצה הנורמלית. המטריצה המסנגיאלית גדלה, ותהליכי כף הרגל של פודוציטים התמזגו באופן נרחב. ביטויים מיקרוסקופיים של חולדות בכל קבוצת ניהול הוקלו בהיקפים שונים בהשוואה לקבוצת המודל (ראו איור 3C).

לבסוף, הביטויים של סך כל EGFR, p-EGFR, MAPK3/1 ו-p-MAPK3/1 זוהו כדי לראות אם הם השתנו בחולדות DN שטופלו ב-JWSJS. לא היה שינוי משמעותי בביטוי הכולל של EGFR ו-MAPK3/1 בקבוצות המודל לעומת הקבוצה הרגילה. הביטוי של p-EGFR, p-MAPK3/1 ו-BAX גדל באופן משמעותי, והביטוי BCL-2 ירד באופן משמעותי. לעומת קבוצת המודל, הביטוי של p-EGFR, p-MAPK3/1 ו-BAX הופחת באופן משמעותי, וביטוי BCL-2 היה מווסת באופן משמעותי בדרגות שונות ברקמות הכליה של חולדות בכל קבוצת מינון (איור 3D,E). תוצאה זו אושרה על-ידי אימונוהיסטוכימיה (איור 3F,G). מחקר זה הראה כי JWSJS יכול להגן על הכליות בחולדות DN על ידי ויסות הביטוי של חלבוני p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX ו-BCL-2 והפחתת אפופטוזיס של תאים. בנוסף, נעשה שימוש ב-qPCR כדי להעריך את רמות הביטוי של MAPK3, MAPK1 ו-EGFR mRNA בקבוצות שונות. התוצאות הראו כי הביטוי היחסי בקבוצת ה-DN היה גבוה משמעותית בהשוואה לקבוצת הביקורת, כמו גם לקבוצות Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M ו-JWSJS-H. ממצא זה מאשש עוד יותר את התוצאות הראשוניות (איור 3H).

figure-results-1
איור 1: פרמקולוגיה של רשת הבהירה את המטרות האפשריות של JWSJS ואת מסלולי האיתות בנפרופתיה סוכרתית. (A) דיאגרמת Venn של המטרות המצטלבות של JWSJS ונפרופתיה סוכרתית. ירוק מייצג את מספר המטרות הטיפוליות של מרכיבי JWSJS, וסגול מייצג את מספר המטרות הרלוונטיות של DN. החלק המצטלב מייצג את מספר המטרות המצטלבות (כלומר, מספר המטרות של JWSJS עבור DN). (B) דיאגרמת רשת "תרופה-רכיב-מטרה" של JWSJS בטיפול ב-DN. הכחול הבהיר מייצג את המטרות הרלוונטיות של JWSJS לטיפול ב- DN. פוקסיה מייצגת את המרכיב הפעיל של Bombyx Batryticatus. ירוק מייצג את המרכיבים הפעילים של Hedysarum Multijugum Maxim. כחול כהה מייצג את המרכיבים הפעילים של Radix Rhei et Rhizome. אדום מייצג את המרכיבים הפעילים של Cicadae Periostracum. סגול מייצג את המרכיבים הפעילים של Epimrdii Herba. צהוב מייצג את המרכיבים הפעילים של Smilacis Glabrae Rhixoma. כחול שמיים מייצג את המרכיבים הפעילים של Rhizoma Curcumaelongae. (C) רשת PPI של יעדי הצטלבות JWSJS ו-DN. (D) 10 הגנים המשמעותיים ביותר שזוהו באמצעות ניתוח אונטולוגי של גני מטרה טיפוליים המעורבים בטיפול JWSJS ב- DN. (E) 30 הגנים המשמעותיים ביותר שזוהו באמצעות ניתוח מסלול של גני מטרה טיפוליים המעורבים בטיפול JWSJS ב- DN. (F) רשת היחסים של מסלול האיתות KEGG בטיפול ב- DN על ידי JWSJS. סמלים צהובים מייצגים נתיבי איתות. סמלים כחולים מייצגים יעדי פעולה. גרף גדול יותר מרמז על כך שיותר מסלולים מחוברים אליו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הדמיית מסלולי עגינה מולקולרית ודינמיקה מולקולרית של JWSJS בטיפול בנפרופתיה סוכרתית. (A) הקונפורמציות של הליגנד במבנה הגבישי המקורי של שלושת קומפלקסי חלבוני המטרה 7JXQ (a), 4QTA (b) ו-4QTB (c) מושוות לקונפורמציות של הליגנד לאחר העגינה. ירוק, כתום וורוד הם חלבוני המטרה EGFR, MAPK1 ו-MAPK3, בהתאמה. זהב היא מולקולת הליגנד המקורית, וכחול היא מולקולת הליגנד לאחר העגינה. (B) הדמיית עגינה מולקולרית תלת-ממדית של JWSJS בטיפול בנפרופתיה סוכרתית. ירוק, כתום וורוד הם חלבוני המטרה 7JXQ, 4QTA ו-4QTB, בהתאמה. 1a-3a מייצג את דיאגרמת האינטראקציה של 7JXQ, 4QTA ו- 4QTB עם המעכב המקורי (כחול). 1b-3b מייצג את דיאגרמת האינטראקציה של 7JXQ, 4QTA, 4QTB ולוטאולין (צהוב). 1c-3c מייצג את דיאגרמת האינטראקציה של 7JXQ, 4QTA, 4QTB וחומצה פלמיטולאית (פוקסיה). 1D-3D מייצג את דיאגרמת האינטראקציה של 7JXQ, 4QTA, 4QTB וקוורצטין (סגול). (C) הדמיית עגינה מולקולרית דו-ממדית של JWSJS בטיפול בנפרופתיה סוכרתית. 1a-3a מייצג את דיאגרמת האינטראקציה של 7JXQ, 4QTA ו- 4QTB עם המעכב המקורי. 1b-3b מייצג את דיאגרמת האינטראקציה של 7JXQ, 4QTA, 4QTB ולוטאולין. 1c-3c מייצג את דיאגרמת האינטראקציה של 7JXQ, 4QTA, 4QTB וחומצה פלמיטולאית. 1D-3D מייצג את דיאגרמת האינטראקציה של 7JXQ, 4QTA, 4QTB וקוורצטין. (D) ניתוח RMSD ו-RMSF של מסלולי הדינמיקה המולקולרית של (א) לוטאולין וחלבון מטרה 7JXQ, (ב) לוטאולין וחלבון מטרה 4QTA, ו-(ג) קומפלקסים של קוורצטין וחלבון מטרה 4QTB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: JWSJS מקל על פגיעה בכליות ומדכא את הפעלת מסלול האיתות EGFR/MAPK3/1 בניסויי vivo . (A) צביעת HE ו-(B) צביעת חומצה תקופתית (PAS) של רקמות כליות של חולדות בקבוצות שונות (הגדלה, 200x; n = 10). (C) מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה של רקמת כליה בקבוצות שונות של חולדות (הגדלה, 5000x; n = 3). (D) EGFR, p-EGFR, MAPK3/1, p-MAPK3/1, BAX ו-BCL-2 ברקמת כליות של חולדה של סוכרת דרך כתם מערבי (n = 3). (E) ניתוח סטטיסטי של ביטוי p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX ו-BCL-2. (F) אנליזה אימונוהיסטוכימית של ביטוי p-EGFR ו-p-MAPK3/1 בשש הקבוצות (n = 6). (G) ניתוח סטטיסטי של ביטוי p-EGFR ו-p-MAPK3/1. (H) ניתוח qPCR של ביטוי mRNA מסוג MAPK3, MAPK1 ו-EGFR בשש קבוצות. *P < 0.05 לעומת שליטה. **P < 0.01 לעומת שליטה. ▲P < 0.05 לעומת DN. ▲▲P < 0.01 לעומת DN. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מידע על כמה מרכיבים פעילים של JWSJS. הוא נותן פרטים על כל רכיב ועל המאפיינים או המאפיינים שלהם. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: טבלת תוצאות עגינה של מטרות ליבה ומרכיבים פעילים עיקריים של JWSJS. הטבלה מציגה את התוצאות ממחקרי עגינה של מטרות ליבה ורכיבים פעילים עיקריים של JWSJS. טבלה זו מראה כיצד מרכיבים אלה מתקשרים עם המטרות שלהם, מה שיכול לספק תובנה לגבי מנגנון הפעולה של JWSJS. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: השפעת JWSJS על משקל הגוף ומדדים ביוכימיים בחולדות עם נפרופתיה סוכרתית (מבוטא כממוצע ± סטיית תקן, n = 10). בהשוואה לקבוצה הנורמלית: * P < 0.05. בהשוואה לקבוצת המודל: # P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

המחקר שלנו השתמש בשילוב של פרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית ומודלים של בעלי חיים in vivo . צעד קריטי היה הקמתה של רשת "תרופה-רכיב-מטרה", שהייתה חיונית לזיהוי המנגנונים הפוטנציאליים של JWSJS בטיפול בדנ"ן, והתמקדה במיוחד באינטראקציה שלה עם מסלול האיתות EGFR/MAPK3/1.

במהלך מחקר זה, ביצענו מספר שינויים, במיוחד בתהליך העגינה המולקולרית, כדי לשפר את דיוק התחזיות שלנו. פתרון הבעיות התמקד בעיקר באופטימיזציה של התנאים עבור מודל בעלי החיים in vivo כדי להבטיח את הרלוונטיות שלו ל- DN האנושי. על ידי זיהוי המרכיבים והיעדים הפעילים העיקריים של JWSJS, מחקר זה מספק בסיס תיאורטי להמשך המחקר והפיתוח של JWSJS כמועמדת פוטנציאלית לטיפול ב- DN.

המחקר בדק את מנגנון הפעולה הפוטנציאלי של JWSJS בהפחתת אפופטוזיס כלייתי ב- DN. תוצאות עגינה מולקולרית הראו כי קוורצטין, חומצה פלמיטולאית ולוטאולין הם בעלי פעילות קישור קבועה למטרות מפתח, כולל MAPK1, MAPK3 ו- EGFR. בחרנו יעדים אלה למחקר נוסף בשל פעולתם המשותפת במספר מסלולים. בחולדות DN, הטיפול ב- JWSJS הביא לירידה משמעותית ברמות FBG ו- GSP, שיפור ב- UTP ו- LDL-C, עלייה במשקל ושיפור בביטויים מיקרוסקופיים של רקמת הכליה, מה שמצביע על היעילות הפוטנציאלית של JWSJS בטיפול ב- DN.

אפופטוזיס הוא מצב קריטי של מוות תאי, וחוסר ויסות יכול להגביר את הסיכון למחלות שונות38. מחקרים קודמים הראו כי לחולדות DN היה ביטוי מוגבר של חלבונים הקשורים לאפופטוזיס BAX וקספאז-3, ועלייה משמעותית במספר התאים האפופטוטיים ברקמת הכליה39,40. התוצאות הראו כי הטיפול ב- JWSJS הפך שינויים אלה, מה שמרמז על כך שהוא יכול להחליש אפופטוזיס פודוציטים בתנאי סוכרת.

חקירה נוספת של מנגנון הפעולה הפוטנציאלי של JWSJS הראתה כי יש לו השפעה מרובת מטרות ורב-נתיבים על DN. התמקדנו בחקר MAPK1, MAPK3 ו-EGFR, מכיוון שהיה להם את המספר הגדול ביותר של מסלולי העשרה. מסלול ERK, המעורב בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים כגון גדילת תאים, התפשטות, התמיינות, אפופטוזיס והפרשת סטרואידים חריגה, הוא מסלול חיוני במסלול העברת אותות MAPK 13,41,42,43. הוא הסיק כי JWSJS הציל אפופטוזיס פודוציטים על ידי עיכוב מסלול האיתות EGFR/MAPK3/1.

מצאנו גם כי JWSJS יכול לווסת את הביטוי של p-EGFR ו- p-MAPK3/1, וכתוצאה מכך רמות מווסתות במידה ניכרת של Bcl-2 אך רגולציית מטה ניכרת של Bax. זה, בתורו, הוביל אפופטוזיס תאי הכליה מופחת. תוצאות דומות נמצאו גם במחקרים קודמים. לדוגמה, חן דיווח כי מחיקת EGFR בפודוציטים החלישה נפרופתיה סוכרתית44. כמה חוקרים מצאו כי מסלול EGFR/ERK קידם את ההתרבות וההתמיינות של תאי אפיתל מעיים חזיריים9. עיכוב של EGFR יכול לווסת את הביטוי של TGF-β ו- BAX, ובכך לשפר פיברוזיס כליות ואפופטוזיס45. ממצאים אלה מצביעים על כך ש- JWSJS הוא מרשם לרפואה סינית מסורתית עם תפקיד משמעותי בטיפול האדג'ובנטי ב- DN על ידי עיכוב מסלול האות EGFR/MAPK3/1. עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין באופן מלא את מנגנון הפעולה הפוטנציאלי של JWSJS בטיפול ב- DN.

היו כמה מגבלות למחקר זה. ראשית, ההסתמכות על מודלים של בעלי חיים עשויה שלא לשכפל באופן מלא את התגובה האנושית ל-JWSJS. בנוסף, תחזיות פרמקולוגיות רשת, למרות שהן בעלות תובנה, דורשות אימות נוסף באמצעות נתונים ניסיוניים. מחקרים קליניים נוספים על בני אדם נחוצים כדי לאמת את הממצאים. שנית, למרות שפרמקולוגיה רשתית היא כלי שימושי לניתוח יחסי תרופות-מחלות, יש לפרש את התוצאות בזהירות מכיוון שהן מבוססות על תחזיות ולא על נתונים ניסיוניים. שלישית, מנגנון הפעולה של JWSJS לטיפול בדנ"א עדיין אינו ברור, והמחקר התמקד רק במטרות הפוטנציאליות של MAPK1, MAPK3 ו-EGFR.

השיטות המשמשות במחקר זה יכולות להיות מיושמות על פורמולציות אחרות של הרפואה הסינית המסורתית, מה שעשוי להוביל לגילוי אפשרויות טיפוליות חדשות עבור DN ומחלות מורכבות אחרות. יתר על כן, גישה זו מניחה את היסודות לשילוב הרפואה המסורתית והמודרנית במחקר פרמקולוגי עתידי. מחקרים נוספים נדרשים כדי להבהיר באופן מלא את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההשפעות הטיפוליות של JWSJS. לבסוף, המחקר לא בדק את תופעות הלוואי או הרעילות האפשריות של JWSJS, שהם שיקולים חשובים בפיתוח של כל תרופה חדשה. יש צורך במחקר נוסף כדי להעריך את הבטיחות של JWSJS ולהבטיח את היישום הקליני שלה.

לסיכום, מחקר זה חוקר בעיקר את הפוטנציאל הטיפולי של Jiawei Shengjiang San לנפרופתיה סוכרתית תוך שימוש בפרמקולוגיה רשתית, עגינה מולקולרית ותיקוף בעלי חיים in vivo . הוא מדגיש את ההיבטים הפרוצדורליים, תוך התמקדות במתודולוגיה המשמשת להבנת האינטראקציות בין JWSJS לבין מסלול האיתות EGFR/MAPK3/1 וכיצד אינטראקציות אלה עשויות להפחית אפופטוזיס של תאי הכליה ב- DN.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי הפרויקט הכללי של הקרן למדעי הטבע של מחוז חביי, סין (מס 'H2019423037).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פעמיים; SYBR ירוק qPCR מאסטר מיקס Servicebio, ווהאן, סיןG3320-05
24-h כימות חלבון שתן (UTP)המכון להנדסה ביולוגית נאנג'ינג ג'יאנצ'נגN/A
3,3'-Diaminobenzidineשנחאי Huzheng Biotech, סין91-95-2
מכשיר ניתוח ביוכימי אוטומטיהיטאצ'י, יפן7170A
אתנול נטול מיםBiosharp, טיאנג'ין, סיןN/A
BAX נוגדנים ראשוניים Affinity, ארה"בAF0120חולדה
BCL-2 נוגדנים ראשוניים Affinity, ארה"בAF6139עכברוש
BX53 מיקרוסקופאולימפוס, יפןBX53
תחליף כלורופורםECOTOP, גואנגג'ואו, סיןES-8522
תוכנת דזמונד ניו יורק, ניו יורק, ארה"במהדורה 2019-1
אמבט מים דיגיטלי בטמפרטורה קבועהצ'אנגג'ואו ג'ינטאן ליאנגיו מכשיר, סיןDK-8D
EGFR נוגדנים ראשוניים Affinity, ארה"בAF6043
Rat Embed-812 RESINShell Chemical, ארה"ב14900
גלוקוז בדם בצום (FBG)מכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגיתN/A
FC-סוג FC מנתח תוויות אנזים באורך גל מלאMultiskan; Thermo, ארה"בלא ישים GAPDH
  נוגדנים ראשוניים Affinity, ארה"בAF7021
חלבון סרום מסוכרר עכברוש (GSP)מכון נאנג'ינג ג'יאנצ'נג להנדסה ביולוגיתN/A
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורהיטאצ'י, יפןH-7650
המטוקסילין/אאוזין (HE) תמיסת צביעהServicebio, ארה"בG1003
Image-Pro Plusמדיה קיברנטיקה, ארה"בN/A
מכשיר הגברת PCR בזמן אמתApplied Biosystems, ארה"בiQ5 
טבליות IrbesartanHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanolBiosharp, טיאנג'ין, סיןN/A
  גרגירי JWSJSגואנגדונג Yifang פרמצבטיקהN/A
Kodak Image Station 2000 MM מערכת הדמיהקודאק, ארה"בIS2000
כולסטרול בצפיפות נמוכה (LDL-C)נאנג'ינג ג'יאנצ'נג המכון להנדסה ביולוגיתN/A
MAPK3/1 נוגדנים ראשוניים זיקה, ארה"בAF0155
צנטריפוגה רפואיתהונאן Xiangyi פיתוח מכשירי מעבדה, סין TGL-16K
Mini מערכת העברת טרנס-בלםBio-Rad, ארה"בN/A
מערכת אלקטרופורזה Mini-PROTEANBio-Rad, ארה"בN/A
NanoVue Plus ספקטרופוטומטרHealthcare Bio-Sciences AB, שוודיה111765
p-EGFR נוגדנים ראשוניים Affinity, ארה"בAF3044
תמיסת צביעה חומצה תקופתית של חולדה (PAS)Servicebio, ארה"בG1008
p-MAPK3/1 נוגדנים ראשוניים Affinity, ארה"בAF1015
חולדה נוגדנים משניים  סנטה קרוז, ארה"בsc-2357ארנב
סטרפטוזוטוציןסיגמא, ארה"בS0130
SureScript ערכת סינתזה cDNA גדיל ראשוןGeneCopeia, ארה"בQP056T
TriQuick ReagentSolarbio, בייג'ינג, סיןR1100
עבודה נקי במיוחדציוד טיהור Suzhou, סיןSW-CJ-1F 
חולדה שולחן

מקורות

  1. Viigimaa, M., Sachinidis, A., Toumpourleka, M., Koutsampasopoulos, K., Alliksoo, S., Titma, T. Macrovascular complications of Type 2 diabetes mellitus. Curr Vasc Pharmacol. 18 (2), 110-116 (2020).
  2. Umanath, K., Lewis, J. B. Update on diabetic nephropathy: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 71 (6), 884-895 (2018).
  3. Han, W., et al. Huangkui capsule alleviates renal tubular epithelial-mesenchymal transition in diabetic nephropathy via inhibiting NLRP3 inflammasome activation and TLR4/NF-kappaB signaling. Phytomedicine. 57, 203-214 (2019).
  4. Giralt-Lopez, A., et al. Revisiting experimental models of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 21 (10), 3587(2020).
  5. Lu, Z., Zhong, Y., Liu, W., Xiang, L., Deng, Y. the efficacy and mechanism of Chinese herbal medicine on diabetic kidney disease. J Diabetes Res. 2019, 2697672(2019).
  6. Niu, H., et al. The therapeutic mechanism of PuRenDan for the treatment of diabetic nephropathy: Network pharmacology and experimental verification. J Ethnopharmacol. 293, 115283(2022).
  7. Gao, F., Wang, Z., Yang, B., Tan, J. Mechanism of Jiawei Shengjiang San in the treatment of membranous nephropathy based on network pharmacology. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 37 (5), 132-138 (2021).
  8. Li, W., Xie, M. Analysis of composing and application rule in the evolution of Shengjiang San. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 44 (10), 894-898 (2021).
  9. Zhang, Y., et al. Mechanism of Jiawei Shengjiang powder in inhibiting renal inflammation and fibrosis in diabetic rats based on TLR4/NF-kappaB and Raf/MEK pathways. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (5), 20-27 (2022).
  10. Zhao, L., et al. Pharmacodynamic mechanism of Yishen Tongluo Formula in treatment of diabetic kidney disease based on network pharmacology and verification of key regulation pathway. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 45 (8), 824-834 (2022).
  11. Zhang, J., Liang, R., Wang, L., Yang, B. Effects and mechanisms of Danshen-Shanzha herb-pair for atherosclerosis treatment using network pharmacology and experimental pharmacology. J Ethnopharmacol. 229, 104-114 (2019).
  12. Chen, L., et al. Network pharmacology-based strategy for predicting active ingredients and potential targets of Yangxinshi tablet for treating heart failure. J Ethnopharmacol. 219, 359-368 (2018).
  13. Zhu, M., Qin, Y. C., Gao, C. Q., Yan, H. C., Wang, X. Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food Funct. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  14. Ding, Z., et al. Systems pharmacology reveals the mechanism of activity of Ge-Gen-Qin-Lian decoction against LPS-induced acute lung injury: A novel strategy for exploring active components and effective mechanism of TCM formulae. Pharmacol Res. 156, 104759(2020).
  15. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).
  16. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412(2010).
  17. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guides for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press (US). Washington (DC. (2011).
  18. Ru, J., et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  19. Xu, X., et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability. Int J Mol Sci. 13 (6), 6964-6982 (2012).
  20. Tao, W., et al. Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Chinese herbal Radix Curcumae formula for application to cardiovascular disease. J Ethnopharmacol. 145 (1), 1-10 (2013).
  21. Traditional Chinese Medicine and Chemical Composition databases in Chemistry Database[DB/OL]. , Available from: http://www.organchem.csdb.cn (2021).
  22. Halladay, C. W., Trikalinos, T. A., Schmid, I. T., Schmid, C. H., Dahabreh, I. J. Using data sources beyond PubMed has a modest impact on the results of systematic reviews of therapeutic interventions. J Clin Epidemiol. 68 (9), 1076-1084 (2015).
  23. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 7, 42717(2017).
  24. UniProt, C. Reorganizing the protein space at the Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 40 (D1), D71-D75 (2012).
  25. Stelzer, G., et al. The GeneCards Suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1-33 (2016).
  26. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Curr Protoc Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  27. Zhou, Y., et al. Therapeutic target database update 2022: facilitating drug discovery with enriched comparative data of targeted agents. Nucleic Acids Res. 50 (D1), D1398-D1407 (2022).
  28. Whirl-Carrillo, M., et al. Pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 92 (4), 414-417 (2012).
  29. Law, V., et al. DrugBank 4.0: shedding new light on drug metabolism. Nucleic Acids Res. 42 (D1), D1091-D1097 (2014).
  30. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  31. Xu, J., et al. Pharmacological mechanisms underlying the neuroprotective effects of Alpinia oxyphylla Miq. on Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 2071(2020).
  32. Tang, Y., Li, M., Wang, J., Pan, Y., Wu, F. X. CytoNCA: a cytoscape plugin for centrality analysis and evaluation of protein interaction networks. Biosystems. 127, 67-72 (2015).
  33. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
  34. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
  35. Yang, X., et al. Rational selection of the 3D structure of biomacromolecules for molecular docking studies on the mechanism of endocrine disruptor action. Chem Res Toxicol. 29 (9), 1565-1570 (2016).
  36. Diller, D. J., Merz, K. M. throughput docking for library design and library prioritization. Proteins. 43 (2), 113-124 (2001).
  37. Hsin, K. Y., Ghosh, S., Kitano, H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology. PLoS One. 8 (12), e83922(2013).
  38. Godse, N. R., et al. TMEM16A/ANO1 inhibits apoptosis via downregulation of Bim expression. Clin Cancer Res. 23 (23), 7324-7332 (2017).
  39. Ilhan, I., et al. Irbesartan decreased mitochondrial stress-related apoptosis in cisplatin-induced acute kidney injury via regulating BCL-2/BAX signaling. Mol Biol Rep. 49 (7), 6125-6133 (2022).
  40. Lee, M., et al. Protective effect of hydroxysafflor yellow a on nephropathy by attenuating oxidative stress and inhibiting apoptosis in induced Type 2 diabetes in rat. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7805393(2020).
  41. Schlessinger, J. Ligand-induced, receptor-mediated dimerization and activation of EGF receptor. Cell. 110 (6), 669-672 (2002).
  42. Gu, X., Chu, L., Kang, Y. Angiogenic factor-based signature predicts prognosis and immunotherapy response in non-small-cell lung cancer. Front Genet. 13, 894024(2022).
  43. Chu, L., et al. Age-related changes in endogenous glucocorticoids, gonadal steroids, endocannabinoids and their ratios in plasma and hair from the male C57BL/6 mice. Gen Comp Endocrinol. 301, 113651(2021).
  44. Chen, J., Chen, J. K., Harris, R. C. EGF receptor deletion in podocytes attenuates diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 26 (5), 1115-1125 (2015).
  45. Skibba, M., et al. New EGFR inhibitor, 453, prevents renal fibrosis in angiotensin II-stimulated mice. Eur J Pharmacol. 789, 421-430 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אותות EGFRנתיב MAPK3/1פרמקולוגיה של רשתותעגינה מולקולרית (Molecular Docking)רשת אינטראקציית חלבוניםבקרה על אפופטוזיסהיסטופתולוגיה של הכליות
השפעה אנטגוניסטית של Jiawei Shengjiang San על מודל חולדה של נפרופתיה סוכרתית: קשור למסלול איתות EGFR/MAPK3/1
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.