הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניטור רמת הסוכר בדם בצאצאי עכבר לאחר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66212

⸱

17 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל עכבר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI)-העברת עוברים (ET), המאפשר לנו לצפות בשינויים הקשורים לגיל במטבוליזם של גלוקוז שניתן לייחס ל- ICSI, ומספקים תובנות לגבי ההשפעות ארוכות הטווח הפוטנציאליות שלו על ההתפתחות האנושית.

תקציר

תוחלת החיים האנושית ארוכה במידה ניכרת, בעוד שמודלים של עכברים יכולים לדמות את כל תוחלת החיים האנושית בתקופה קצרה יחסית, כאשר שנה אחת של חיי עכבר שווה בערך ל-40 שנות אדם. הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI) היא טכנולוגיית רבייה נפוצה בסיוע בפרקטיקה קלינית. עם זאת, בהתחשב בהופעתה האחרונה יחסית לפני כ -30 שנה, ההשפעות ארוכות הטווח של טכניקה זו על ההתפתחות האנושית עדיין לא ברורות. במחקר זה ביססנו את שיטת ICSI בשילוב עם החזרת עוברים (ET) באמצעות מודל עכבר. התוצאות הראו כי זרע עכבר תקין, לאחר שעבר תרבית חוץ גופית ולאחר מכן ICSI, הציג שיעור הפריה של 89.57% ושיעור שני תאים של 87.38%. לאחר ET, שיעור הילודה של צאצאים היה כ 42.50%. יתר על כן, ככל שהעכברים הזדקנו, נצפו תנודות ברמות חילוף החומרים של גלוקוז, אשר עשויות להיות קשורות ליישום טכניקת ICSI. ממצאים אלה מצביעים על כך שטכניקת ICSI-ET של העכבר מספקת פלטפורמה רבת ערך להערכת ההשפעה של הפרעות זרע על התפתחות העובר והשפעותיהן ארוכות הטווח על בריאות הצאצאים, במיוחד בנוגע למטבוליזם של גלוקוז. מחקר זה מספק תובנות חשובות למחקר נוסף על ההשפעות האפשריות של טכניקת ICSI על התפתחות האדם, תוך הדגשת הצורך בחקירה מעמיקה של ההשלכות ארוכות הטווח של טכנולוגיה זו.

מבוא

בעיות פוריות התגלו כמוקד עיקרי של דאגה רפואית וסוציולוגית, במיוחד בחברה המודרנית שבה שיעורי הפריון היורדים, והחומרה הגוברת של שכיחות וחומרת אי פוריות עלו לגדולה. טכנולוגיית רבייה מסייעת (ART) מספקת מגוון רחב של אפשרויות להתמודד עם אתגרים אלה, עם הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI) המשמשת בדרך כלל כהתערבות טיפולית.

מאז שפלרמו דיווחה על ההריון המוצלח הראשון שהושג באמצעות הזרקת זרע תוך ציטופלזמית (ICSI) בשנת 1992, ICSI הפכה לטכניקה מרכזית בטכנולוגיות רבייה מסייעות (ART)1. עם זאת, בהתחשב בכך ש- ICSI נמצא בשימוש במסגרות קליניות במשך 30 שנה בלבד, תקופה קצרה יחסית לתוחלת החיים האנושית, ההשפעות ארוכות הטווח של ICSI, במיוחד על התפתחות צאצאים, לא נחקרו והובהרו בהרחבה. כיום, עכברים המאופיינים ברקע גנטי אחיד ותוחלת חיים קצרה יותר, התגלו כמודל חלופי נפוץ במחקר רפואי. יתר על כן, מודל העכבר יכול לשחזר את כל תוחלת החיים האנושית במסגרת זמן דחוסה, כאשר שנה אחת בעכברים מקבילה בערך ל -40 שנה בבני אדם2.

במהלך העשור האחרון, מספר מחקרים בקנה מידה קטן דיווחו כי אנשים שנולדו באמצעות ICSI עשויים להיות בסיכון מוגבר לפתח תסמונות מטבוליות, כגון רמות סוכר חריגות בדם, מאוחר יותר בחיים 3,4. למרות שהראיות אינן חד-משמעיות, ממצא זה בכל זאת עורר חששות רציניים בקרב הקהילה המדעית לגבי ההשלכות הבריאותיות ארוכות הטווח של ICSI. מצב זה מדגיש את הצורך הדחוף בהערכות קפדניות יותר של ART והשלכותיו הבריאותיות ארוכות הטווח. במיוחד לאור המגבלות והשיקולים האתיים של מחקרים בבני אדם, פיתוח מודלים של בעלי חיים שיכולים לשחזר במדויק את התפתחות הצאצאים האנושיים בעקבות ICSI הפך חיוני יותר ויותר. בהקשר זה, מודל ICSI-ET (הזרקת זרע תוך ציטופלזמית-העברת עוברים), בשל יכולתו לחקות את ICSI האנושי ולהקל על ניטור ארוך טווח של תוצאות בריאותיות של צאצאים, הפך לכלי יעיל להערכת הסיכונים הבריאותיים הפוטנציאליים של טכנולוגיית ICSI לצאצאים5.

מחקר זה נועד לחקור את ההשפעה של טכנולוגיית ICSI-ET על פנוטיפ מטבולי נפוץ, כלומר בריאות מטבולית של גלוקוז בצאצאים, על ידי שימוש בניטור אקראי של סוכר בדם, בדיקות גלוקוז בדם בצום ובדיקות סבילות לגלוקוז כדי להעריך את המצב המטבולי של גלוקוז בעכברים. ניטור אקראי של רמת הסוכר בדם משמש ללכידת התנודות הטבעיות במטבוליזם של גלוקוז במהלך פעילויות פיזיולוגיות רגילות, בעוד שבדיקות גלוקוז וסובלנות לגלוקוז בדם בצום משמשות להערכת מצבים טרום סוכרתיים פוטנציאליים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול של ICSI-ET המתואר להלן עוקב אחר ההנחיות ואושר על ידי הסקירה האתית של בעלי חיים של מכון שנגחאי לחקר הורות מתוכננת. נהלי בטיחות: יש ללבוש תמיד ציוד מגן אישי (PPE) מתאים בעת טיפול בכימיקלים או בחומרים ביולוגיים. שימוש במנדפים: בצע את כל ההליכים הכוללים כימיקלים נדיפים או ייצור תרסיסים בתוך מכסה אדים מאושר או ארון בטיחות ביולוגית. השתמש עכברים נקבה (6-8 שבועות בן 6-8 שבועות B6D2F1 זן) עבור הליך superovulation.

1. ICSI בעכברים

  1. ביוץ יתר של עכברים
    1. יש לבצע זריקה תוך-צפקית של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG) במינון של 7.5 IU לעכבר בסביבות השעה 20:00 ביום הראשון.
    2. מתן זריקה תוך צפקית של גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG) במינון של 7.5 IU לעכבר בסביבות השעה 20:00 (48 שעות לאחר הזרקת PMSG) ביום השלישי.
  2. הכינו את HTF בינוני לתוך 1 מ"ל aliquots ולהשאיר אותם חשופים עבור שיווי משקל לילה ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 באותו יום של הזרקת HCG בעכברות נקבות.
  3. הכנת טיפות הפריה ICSI
    1. באותו יום של הזרקת HCG בעכברים נקבות, לחלק מכסה צלחת תרבית תאים 50 x 9 מ"מ לחצאים עליונים ותחתונים. השתמש בחצי העליון כדי ליצור 4-6 טיפות של 5 μL כל אחת, באמצעות 10% polyvinylpyrrolidone (PVP) עבור מיקום זרע. השתמש בחצי התחתון כדי ליצור 8-10 טיפות של 5 μL כל אחת, באמצעות מדיום M2 עבור הליך ICSI.
    2. כסו את הטיפות הבינוניות PVP ו-M2 בכ-3 מ"ל שמן מינרלי (איור 1).
  4. הכנת מנות תרבות
    1. באותו יום של הזרקת HCG בעכברים נקבות, יש לפזר 12 טיפות של מדיום KSOM (MR-020P-D) של 20 μL באופן שווה בצלחת תרבית תאים בגודל 35 x 10 מ"מ. מכסים את הטיפות בכ-3 מ"ל שמן מינרלי.
  5. קצירת זרע:
    1. הרדימו עכברים זכרים על ידי פריקת צוואר הרחם בסביבות השעה 9:00 בבוקר ביום הרביעי (13 שעות לאחר הזרקת HCG).
    2. בודדו את הקאודה האפידידימלית ונקו אותה ביסודיות כדי לחסל את רקמת השומן ושאריות הדם על ידי כתמים עדינים עם גזה סטרילית ושטיפה בתווך HTF שחומם מראש.
    3. פתח את האפידידימיס קאודה כדי לאפשר לזרע לשחות בחופשיות החוצה למדיום HTF. סחטו בעדינות את הקאודה באמצעות מלקחיים כדי לשחרר את הזרע, אספו אותם בצינורות HTF מאוזנים מראש, ושמרו אותם חשופים באינקובטור 37°C, 5% CO2 לקיבול זרע לשימוש נוסף.
  6. שאיבת ביציות
    1. המתת חסד של נקבות עכברים שעוררו לשאיבת ביציות על ידי פריקת צוואר הרחם בסביבות השעה 9:30 בבוקר ביום הרביעי. בזהירות לבצע חתך לאורך קו האמצע של העור הבטן ואת שכבת השרירים כדי לחשוף את חלל הבטן.
    2. השתמשו במלקחיים עדינים כדי לבודד בעדינות רקמות משני צידי האובידוקט, במיוחד מאזורי האמפולה הנפוחה, והעבירו אותה למדיום M2 בצלחת תרבית מעוקרת. חזור על הליך זה עד לאיסוף האובידוקט מכל העכברים המיועדים.
    3. תחת מיקרוסקופ ניתוח, להשתמש מחט מזרק 1 מ"ל כדי לנקב את החלק השקוף של אמפולה נפוחה של oviduct בעדינות, להקל על שחרור של קומולוס-ביצית קומולוס-קומוציטים (COC) לתוך המדיום.
    4. באמצעות אותו מזרק, בזהירות לבחור ולהעביר את COC לתוך צלחת חדשה המכילה 100 μL של מדיום M2 טרי. חזור על שלב זה עד שכל COC יועברו בהצלחה מקטעי האובידוקט המקוריים.
    5. נגבו דם ונוזלי רקמות, ותחת מיקרוסקופ מנתח, קרעו את האמפולה של האובידוקט באמצעות מחט 25 גרם, וכתוצאה מכך שוחררו COC רבים.
    6. מוציאים את האובידוקט ואת שברי הרקמות, מעבירים את COC לטיפות של מדיום M2 המכיל היאלורונידאז (HY), ומחממים אותם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
    7. לאחר הדגירה במשך כ 5 דקות, לבצע pipetting עדין כדי להקל על ההפרדה של תאי קומולוס וביציות. להעביר את הביציות metaphase II (MII) מן התמיסה המכילה HY למדיום M2 טרי; לאחר מכן, בצע את ההעברה הרציפה למספר טיפות של מדיום M2.
    8. לאחר 2-3 סבבי שטיפה, העבירו את הביציות לטיפות של מדיום תרבית KSOM ושמרו אותן באינקובטור של 37°C, 5% CO2 לשימוש נוסף.
  7. בסביבות השעה 10:00 בבוקר ביום הרביעי, סוניק 100 μL של הזרע הקיבול (ראה שלב 1.5.2.) במשך 5 שניות כדי להפריד את הראשים מהזנבות בתדר של 46 קילוהרץ, עם הגדרת הספק של 50 וואט.
    הערה: בעת סוניקת זרע כדי לחתוך את הזנב, היזהר לשלוט בזמן, אשר לא יעלה על 5 שניות. מספר שניות לאחר הסוניקציה, ניתן לצפות בזרע תחת מיקרוסקופ הפוך; הפסיקו לסניק כאשר כמחצית מהזרע מראה זנבות קטועים.
  8. הליך ICSI
    1. השתמש במחט מיקרומניפולציה זמינה מסחרית עם קצה שטוח וקוטר פנימי של 6 מיקרומטר, מוגדר בזווית של 25°, עבור ההזרקה. מלאו את המחט בנוזל הניתוח כאשר החלק המלא באורך של 0.5 ס"מ בתוך המחט. ודא כי רמת הנוזל מגיע ~ 0.5 ס"מ.
      הערה: יש לשמור על טמפרטורת החדר בטמפרטורה של 19°C במהלך ההזרקה כדי להימנע מטמפרטורות גבוהות שעלולות להפחית את שיעור ההישרדות של ביציות מופרות. הדיוק בהבטחת רמת נוזלים שתגיע ל-0.5 ס"מ הוא קריטי לשמירה על שלמות תהליך ההזרקה ולהבטחת כדאיות הביציות.
    2. התקן את מחט ההזרקה על זרועו הימנית של המיקרומניפולטור, קבוע היטב על ידי הידוק מכסה ההחזקה. התקינו פיפטה בעלת מיקרומניפולציה שטוחה המיועדת לביציות עכבר על זרועו השמאלית של המיקרומניפולטור, ומקמו את מחט ההזרקה ואת פיפטת האחיזה בשדה הראייה של המיקרוסקופ.
    3. הוסף 1 μL של זרע סוני לטיפת תמיסת PVP באמצעות פיפטה.
    4. מניחים 20 ביציות MII בטיפה של M2 בינוני.
    5. השתמש במחט ההזרקה כדי לשאוף 10-20 ראשי זרע בתמיסת PVP. לאחר מכן, העבירו את מחט ההזרקה לתוך הטיפה המכילה את הביציות.
    6. קבע ישירות את מיקום ציר המטאפאזות בתוך הביצית תחת מיקרוסקופ קיטוב כדי להבטיח שמנגנון הציר אינו בצד ההזרקה, כאשר גוף הקוטב ממוקם בדרך כלל בשעה 12 או 6 ביחס לכיוון הביצית.
    7. שמור את הביצית במגע עם החלק התחתון של צלחת התרבית. התאימו את מישור המוקד כך שהזונה פלוצ'ידה של הביצית ומחט ההזרקה יהיו באותו מישור.
    8. עם מגע של מחט ההזרקה עם zona pellucida, להפעיל לחץ שלילי קל על מחט ההזרקה, ציור חלק של zona pellucida.
    9. בו זמנית להפעיל פולסים piezo עם הגדרת עוצמה של 5 ותדר של 1, למעשה ליצור נקב zona pellucida ולאפשר למחט ההזרקה לעבור.
    10. מקדמים את מחט ההזרקה לחלל הפריביטלין, דוחפים את ראש הזרע לקצה המחט. הכנס את מחט ההזרקה לתוך הביצית עד שהיא מגיעה לצד הנגדי של zona pellucida.
    11. השתמש בפעימות פיאזו שנקבעו לעוצמה של 1 ולתדירות של 1 כדי ליצור נקבובית קטנה בקרום הפלזמה, ולהבטיח שראש הזרע מוזרק לתוך הביצית עם כניסה מינימלית של PVP ושמירה אופטימלית על שלמות הביצית.
    12. חזור על שלב 1.8.11 עד להזרקת כל 20 הביציות, ולאחר מכן דגירה של 15 דקות ב -19 מעלות צלזיוס.
    13. מעבירים את הביציות ששרדו למדיום KSOM ומניחים אותן באינקובטור. שימו לב לשיעורי היווצרות של 2 תאים, 4 תאים, מורולה ובלסטוציסט.
      הערה: יש לשלוט בעיתוי הזרקת זרע יחיד תוך ציטופלזמי (ICSI) לתוך הביצית, במטרה להשלים את ההליך תוך 14-18 שעות לאחר הזרקת HCG.

2. השתלת רחם של בלסטוציסטים עכברים

  1. הכנת עכברים זכרים vasectomized
    הערה: השתמש בעכברים זכרי ICR בגילאי 6-8 שבועות עבור המחקר.
    1. יש להשרות הרדמה על ידי הזרקה תוך צפקית של 1.25% 2,2,2-tribromoethanol במינון של 0.2 מ"ל/10 גרם משקל גוף. היעדר כל תגובה לכאב מעיד על הרדמה מוצלחת.
      הערה: בעוד שהפרוטוקול הנוכחי אינו כולל מריחת משחה וטרינרית על עיניהם של בעלי חיים מורדמים, מומלץ כשיטת עבודה מומלצת למניעת יובש בעיניים ולהבטחת בריאותם ונוחותם של בעלי החיים במהלך ההליכים. לאורך כל תהליך הניתוח וההחלמה, כל כלי הניתוח עוקרו לפני השימוש, ואזור הניתוח הוכן באמצעות תמיסות חיטוי כדי להבטיח סביבת הפעלה נקייה.
    2. כדי להגן מפני לחץ או פציעה פוטנציאליים, אכסנו את העכברים שעברו ניתוח בנפרד בשלב ההחלמה הראשוני.
    3. מתן buprenorphine במינון של 0.05 מ"ג / ק"ג של משקל הגוף כדי להבטיח הקלה אופטימלית בכאב.
      הערה: כדי להבטיח את רווחתם של העכברים, עקבו מקרוב אחר העכברים במהלך תקופת ההחלמה ואל תשאירו אותם ללא השגחה עד שהם יחזרו להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
    4. הכן את האתר הכירורגי באזור הבטן התחתונה, עדיף על האשכים. מוציאים את הפרווה ומחטאים עם פובידון-יוד. בעזרת מספריים סטריליים, לבצע חתך אורכי 1 ס"מ לאורך linea alba. הסר בעדינות כל דם עם נייר סטרילי, ללא אבק ולהמשיך לנתח בבוטות את שרירי הבטן לאורך linea alba וגישה לחלל הבטן.
    5. בעזרת מלקחיים מעוקלים, אחזו בעדינות וחשפו את האשך השמאלי ואת כרית השומן הקשורה אליו. זהו את כלי הדם ובודדו אותו בזהירות באמצעות מלקחיים מחודדים, תוך יצירת קטע של 10 מ"מ למניפולציה.
    6. עקרו את המלקחיים המעוקלים על ידי החזקתם בלהבה החיצונית של מנורת אלכוהול למשך מספר שניות. אוחזים בעדינות בכלי הדם, מה שגורם לו להיות שטוח ולהלבין עקב צריבה. יוצרים נקודת צריבה שנייה 3-5 מ"מ דיסטלית לראשונה. באמצעות מספריים כירורגיות סטריליות, הבלו את הקטע של vas deferens בין שתי נקודות הצריבה.
    7. בדקו היטב את הקצוות הצרוביים של כלי הדם, וודאו שנשאר קטע קצר, שטוח ומולבן. בעזרת מלקחיים מעוקלים, מחזירים בעדינות את האשך ואת כרית השומן הקשורה אליו לחלל הבטן.
    8. חזור על ההליך המתואר בשלב 2.1.6 בצד הנגדי (הימני).
    9. סגור את אתר הניתוח באמצעות תפרים, בדרך כלל הנחת תפר אחד בשכבת השריר ושלושה תפרים בעור. להבטיח יישור תקין של החתך הניתוחי ולחטא עם פובידון-יוד. העבירו את בעל החיים לכרית חימום להשגחה, ניטור במשך 10-15 דקות עד שבעל החיים חוזר להכרה. לאחר שהתאושש, החזירו את החיה לכלוב הדיור שלה.
      הערה: לאחר ניתוח כריתת כלי דם, עכברים זקוקים לתקופת החלמה של 14 יום, ואחריה ניסוי הזדווגות של שבוע.
    10. במהלך שבוע זה, יש להזדווג ברציפות עם הזכרים שעברו כריתת כלי דם עם נקבות ולבחון את מצב ההריון של כל הנקבות המופיעות עם פקקים כפייתיים. הזדווגות מוצלחת מסומנת על ידי נוכחות של תקע נרתיקי צהבהב-לבן, בלוקים בפתח הנרתיק של העכבר הנשי.
      1. זוג העכברים בין 16:00 ל-18:00 ביום הראשון ובדיקת פקקי הנרתיק בין 7:00 ל-9:00 בבוקר ביום השני. שקול נקבות עם פקקים בנרתיק להיות במצב pseudopregnant ב 0.5 ימים ולהשתמש בהם עבור ניסויים הבאים החזרת עוברים. להחזיר נקבות ללא אטמים וגינליים לקבוצת המקבלים.
        הערה: נקבות אלה ללא פקקים בנרתיק יכולות להמשיך לשמש להזדווגות להכנת נקבות פסאודו-הרות. ודא שכל הנקבות המחוברות אינן נכנסות להריון; רק אז ניתן להשתמש בזכרים שעברו כריתת כלי דם לניסויים רשמיים.
      2. בעוד זכרים vasectomized יכול להזדווג מדי יום, לאפשר יום אחד של מנוחה בין פגישות הזדווגות.
        הערה: בהתבסס על הניסיון שלנו, זכרים שעברו כריתת כלי דם יכולים לשמור על קצב תקע פולטורי גבוה במשך יותר משנה. עם זאת, זכרים שעברו כריתת כלי דם שאינם מצליחים לייצר תקעים כפייתיים בנקבות הזדווגות במשך 4-6 ניסיונות רצופים צריכים להיות מוסרים מהמחקר.
  2. הכנת נקבות פסאודו-הרות
    1. יצירת עכברות נקבות פסאודו-הרות על ידי הזדווגות עכברות נקבות ICR (בגילאי 7-10 שבועות, במשקל מעל 25 גרם) עם עכברים זכרים שעברו כריתת כלי דם (בני 3-6 חודשים) ביחס של 1:1.
      הערה: הזכרים שעברו כריתת כלי דם שימשו לגירוי צוואר הרחם של נקבות העכברים, וכתוצאה מכך הפעלת הקורפורה לוטאה.
  3. הכנת פיפטה להעברת בלסטוציסטים
    1. קח את העוברים להשתלה מתוך האינקובטור ולהעביר אותם לתוך טיפה של M2 בינוני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. השתמשו בפיפטת העברה כדי לשאוב כמות קטנה של נוזל, לשאוב כמות קטנה של אוויר ולשאוף 6-10 עוברים. לבסוף, שאפו עוד נפח קטן של אוויר כדי לאטום את הפיפטה.
      הערה: אורך הנוזל בפיפטת ההעברה לא יעלה על 0.5 ס"מ.
  4. השתלת רחם (בלסטוציסטים)
    1. לשקול את נקבות העכברים המדומים (2.5 ימים לאחר ההזדווגות) ולהרדים אותם על ידי הזרקה intraperitoneal של 1.25% 2,2,2-tribromoethanol במינון של 0.2 מ"ל / 10 גרם של משקל הגוף. לחץ בעדינות על האוזן עם מלקחיים.
    2. לאחר מתן הרדמה לעכברים והבטחת אספסיס באמצעות חיטוי אלכוהול, לבצע חתך אורכי קו האמצע על הבטן הגחון. תוך ניצול הרקמה התת עורית הרופפת, הסיטו את החתך לצד שמאל או ימין כנדרש להשתלה. השתמש מספריים קטנים כדי לבצע דיסקציה קהה של שכבת שריר דופן הבטן ב ~ 0.5 ס"מ לרוחב לעמוד השדרה המותני כדי לגשת לחלל הצפק.
    3. באמצעות מלקחיים א-טראומטיים, בזהירות החוצה את השחלות, oviducts, ואת הרחם.
    4. באמצעות קצה של מחט מזרק, לבצע חתך קטן, זווית כלפי מעלה על דופן הרחם מתחת צומת הרחם-צינורית, הימנעות כלי דם. חתך זה מספק גישה לחלל הרחם; הכנס בעדינות את האובידוקט 2-3 מ"מ דרך החור הקטן.
    5. הוציאו בזהירות את בועת האוויר הקטנה בקצה פיפטת ההעברה תוך התבוננות זהירה בפיפטת ההעברה במהלך ההזרקה האיטית של העוברים. לאחר אישור הגירוש של החלק המרכזי של מדיום התרבית, עצרו את ההליך והסירו בעדינות את פיפטת ההעברה.
    6. מקמו מחדש את השחלות, הביציות והרחם בחזרה לחלל הבטן. תפרו את שכבת השריר והעור בנפרד. הניחו את העכברים על כרית חימום עד שיתאוששו מההרדמה. כדי להבטיח את רווחתם של העכברים, עקבו מקרוב אחר העכברים במהלך תקופת ההחלמה ואל תשאירו אותם ללא השגחה עד שהם יחזרו להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה.
  5. תצפית על הריון
    1. לאחר הניתוח, התבוננו בעכברים במשך 18-21 ימים כדי לעקוב אחר מספר הצאצאים שנולדו. במקרה של דיסטוסיה (לידה קשה), לבצע ניתוח קיסרי. אפשרו לעכברים שזה עתה נולדו להיות מטופחים על ידי סכרים מניקים מאותה קבוצת גיל.

3. גלוקוז אקראי בדם, גלוקוז בדם בצום ובדיקת סבילות לגלוקוז

  1. מעקב אחר רמות גלוקוז אקראיות בדם במהלך גדילת עכברים
    1. מאז לידת העכברים, עקוב אחר רמת הגלוקוז בדם אקראית כל 4 שבועות בשעה 9 בבוקר לאחר לילה טוב של האכלה והנאה.
      1. נקב את קצה זנב העכבר כדי להשיג דם וריד הזנב.
      2. טיפת הדם הראשונה יש ערך מדידת סוכר גבוה יותר בשל נוכחות של נוזל הרקמה מעורבב עם זה. לכן, נגבו בעדינות את טיפת הדם הראשונה באמצעות נייר סופג נקי.
      3. מדוד את רמת הגלוקוז בדם מהטיפה השנייה (~ 4 μL) מווריד הזנב באמצעות גלוקומטר כף יד.
  2. מעקב אחר שינויים בצום גלוקוז בדם וסבילות לגלוקוז במהלך התפתחות עכברים
    הערה: בהתחשב בכך שנקודת הזמן הראשונה של דגימת הדם היא 15 דקות, יש להזריק לכל העכברים תוך 15 דקות. מכיוון שכל הזרקת עכבר ארכה 20-30 שניות, כדי להבטיח שהזריקות יושלמו במסגרת זמן זו, מספר העכברים המרבי שניתן להשתמש בו בכל בדיקה לא יעלה על 30.
    1. בצע את בדיקות הגלוקוז והסובלנות לגלוקוז בדם בצום כל 4 שבועות לאחר הלידה בעכברים שצמו לילה.
      1. ביום הראשון, הכינו מצעי שבב טריים ומוקרנים, כלובים נקיים, מכסים ובקבוקי מים. מעבירים את העכברים לכלוב טרי ללא מזון. הוסף תגי אל תאכיל לכלובים.
      2. הכינו מספיק הזרקת גלוקוז 10% (סטרילית וללא פירוגן) ומזרקים 1 מ"ל.
      3. ודאו שהעכברים בכל קבוצה צמים במשך 16 שעות, מ-17:00 ביום הראשון ועד 9:00 בבוקר ביום השני, אך אפשרו גישה חופשית למים. מדוד את רמות הגלוקוז בדם בצום כמתואר בשלבים 3.1.1.1-3.1.1.3 באמצעות מד גלוקוז.
    2. שקלו את העכברים וסמנו את זנבותיהם כדי לאפשר זיהוי מהיר. הכינו מזרקי גלוקוז עם משקל עכבר של 10 מיקרוליטר/גרם.
    3. במרווחים של 30 שניות, הזריקו גלוקוז של 10 μL/g לחלל התוך צפקי של העכבר.
      הערה: יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לטכניקות הזרקה כאן כדי למנוע נפח הזרקת נוזלים לא מדויק. נקודות הפעולה העיקריות הן כדלקמן:
      1. לשתק את העכבר ולרסן את הזנב ביד אחת. שמור על הראש מעט נמוך יותר מאשר הישבן, כך האיברים בחלל הבטן יזוזו לכיוון הראש, משאיר מספיק מקום הזרקה.
      2. מקם את המחט בין קו האמצע לעצם הירך, הכנס אותה דרך העור בזווית של 45 מעלות, ולאחר מכן הנחה בעדינות את המחט עמוק יותר לתוך חלל הבטן תוך שמירה על יישור מקביל לפני העור במשך ~0.5 ס"מ.
        הערה: שים לב לכל התנגדות במהלך ההזרקה כדי לקבוע אם האיברים הפנימיים מנוקבים בטעות.
      3. מוציאים את המזרק לחלל הבטן.
      4. רשום את הזמן שבו החלה ההזרקה והשתמש בטיימר כדי לשלוט בקצב ההזרקה. הגדר את הטיימר ל- 90 שניות עבור שלושה עכברים כדי למנוע אובדן זמן בטיפול בטיימר.
    4. בצע את מדידת הגלוקוז בדם מווריד הזנב במרווחי הזמן הרצויים (0 לפני מתן גלוקוז, 15, 30, 60, 90 ו-120 דקות לאחר העמסת הגלוקוז).
      הערה: בדיקת גלוקוז בדם לאחר מכן צריכה לקחת גם 20-30 שניות עבור כל עכבר.
    5. החזירו את העכברים לכלובים הביתיים שלהם מצוידים במזון ומים לאחר הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במעבדה שלנו, השגנו שיעור הפריה של 89.57% ושיעור 2 תאים של 87.38% באמצעות ICSI עם זרע קאודלי אפידידימלי בעכברים. שיעור הילודה של צאצאים לאחר ET הוא כ 42.50%. למרבה הפלא, כל שיעורי ההפריה, שיעורי 2 התאים ושיעורי הילודה של צאצאים דומים לרמות שהושגו באמנות אנושית, מה שמאפשר סימולציה מקיפה של שלבים שונים של טכניקות ART אנושיות בעכברים. פרטים נוספים מופיעים בטבלה 1 ובטבלה 2. לא הייתה תנודה משמעותית ברמות הגלוקוז בדם אקראיות בין עכברים שנולדו באופן טבעי לבין עכברי ICSI במהלך תהליך הגדילה וההתפת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה שילב הזרקת זרע תוך ציטופלזמית של עכבר (ICSI) וטכניקות העברת עוברים (ET) כדי לשחזר באופן מקיף טכנולוגיית רבייה בסיוע אנושי (ART) ולבחון את ההשפעה של ICSI בשילוב עם ET על התפתחות צאצאים. היישום של טכניקת ICSI עם זרע עכבר רגיל הניב הפריה גבוהה (86.76%) ושיעורי 2 תאים (88.48%). לאחר ET, שיעור הילודה של עכברים צאצאים היה כ 42.50%, מה שמצביע על החוסן של הפלטפורמה הטכנית. הממצא הבולט ביותר של מחקר זה היה התנודות הקשורות לגיל ברמות חילוף החומרים של גלוקוז בצאצאי ICSI, אשר ניתן לייחס לייש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית הפרויקט העיקרי של קרן הפיתוח המיוחדת לאזור הדגמת החדשנות העצמאית הלאומית של שנחאי ג'אנג-ג'יאנג (ZJ2022-ZD-006), פרויקט מימון ממוקד של ועדת המדע והטכנולוגיה העירונית של שנחאי (22DX1900400), תוכנית הנוער של ועדת הבריאות העירונית של שנחאי (20204Y0276). הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070849).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.25% אברטין (2,2,2-tribromoethanol)נאנג'ינג AibeiM2960להרדמה
צלחות פטרי בקטריולוגיות בסגנון 35 x 10 מ"מ עם מכסה הדוק, פוליסטירן בתולי בדרגת קריסטל,
סטרילי בסגנון 50 x 9 מ"מ עם מכסה הדוק, פוליסטירן בתולי בדרגת קריסטל,ביולוגית 351006
ESCOclass figure-materials-1פעולות אספטיות של BSC, הכנת מנות תרבות, ציטוט ריאגנטים וכו'.
חממת CO2Thermo8000DHתרבית עובר
דיסקציה מיקרוסקופאולימפוסSZX16שימוש בהעברת עוברי עכבר
פלואורינרט Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 הוא נוזל פלואוריניטי מלא יציב תרמית עם חוזק דיאלקטרי והתנגדות גבוהים, המשמש כנוזל הפעלה
גלוקומטר כף ידRocheAccuChekperforma דם מדידת גלוקוז
HTFMerckMR-070-Dנוזל הצינוריות האנושי EmbryoMax (HTF) (1x), נוזל המיועד לשימוש עם הפריה חוץ גופית של עכברים זמין בפורמט של 50 מ"ל ועבר אופטימיזציה ותוקף עבור תרבית עוברים.
מיקרו-מזרק הידראוליEppendorfCellTram 4r שמן, 5196000030להזרקת זרע
מיקרוסקופ הפוךNikonTI2-Uמארח תצפית מיקרומניפולציה
KSOMMerckMR-020P-D(1x), אבקה, ללא פנול אדום, 5 x 10 מ"ל
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 בינוני (1x), נוזלי, עם מיקרומניפולטור אדום פנול
NARISHIGENTX-N4זרוע מיקרומניפולציה
 SIGMAM8410מתאים לשימוש כשכבת כיסוי לבקרת אידוי וזיהום צולב ביישומי ביולוגיה מולקולרית שונים.
חותך מחטיםנאנג'ינג AibeiSutter MF-800שימוש לייצור מחטי מיקרומניפולציה
חולץ מחטיםנאנג'ינג AibeiSutter דגם p-100שימוש להכנת מחטי מיקרומניפולציה Piezo
Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087יישום מחט הזרקת ICSI.
מיקרומניפולטור פיזואלקטרי (מפסק ממברנה)EppendorfEppendorf PiezoXpertשימוש במיקרו-פולסים כדי לשבור את ה-zona pellucida וה-oolemma של המיקרו-מזרק הפנאומטי של הביציות
EppendorfCellTram 4r Air, 5196000013לקיבוע הביצית
מוכן לשימוש גונדוטרופין כוריוני אנושי (Hcg)Nanjing AibeiM2520מגיב עיקור, הזרקה תוך צפקית. 50 יחב"ל/מ"ל
גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון מוכן לשימוש (PMSG)Nanjing AibeiM2620מגיב לעיקור, הזרקה תוך צפקית. 50 IU/mL
סטריאומיקרוסקופOlympusSZX7שאיבת ביציות ותצפית על התפתחות העובר
כלי פטרי בקטריולוגיים 353001 BD ארון בטיחות BD סטרילי שמן מינרלי שמן מינרלי

מקורות

  1. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
  2. Flurkey, K. M., Currer, J., Harrison, D. E. Vol. III Mouse models in aging research. Ch. 20. The mouse in biomedical research (second edition). Fox, J. G., et al. , Academic Press. Burlington. 637-672 (2007).
  3. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (art). J Dev Orig Health Dis. 8 (4), 388-402 (2017).
  4. Heber, M. F., Ptak, G. E. The effects of assisted reproduction technologies on metabolic health and diseasedagger. Biol Reprod. 104 (4), 734-744 (2021).
  5. Ma, R. C. W., Ng, N. Y. H., Cheung, L. P. Assisted reproduction technology and long-term cardiometabolic health in the offspring. PLoS Med. 18 (9), e1003724(2021).
  6. De Waal, E., et al. The cumulative effect of assisted reproduction procedures on placental development and epigenetic perturbations in a mouse model. Hum Mol Genet. 24 (24), 6975-6985 (2015).
  7. Carlin, J., George, R., Reyes, T. M. Methyl donor supplementation blocks the adverse effects of maternal high fat diet on offspring physiology. PLoS One. 8 (5), e63549(2013).
  8. Hiraoka, K., et al. Piezo-icsi for human oocytes. J Vis Exp. (170), e60224(2021).
  9. Sullivan-Pyke, C. S., Senapati, S., Mainigi, M. A., Barnhart, K. T. In vitro fertilization and adverse obstetric and perinatal outcomes. Semin Perinatol. 41 (6), 345-353 (2017).
  10. Luke, B., et al. The risk of birth defects with conception by art. Hum Reprod. 36 (1), 116-129 (2021).
  11. Norrman, E., et al. Cardiovascular disease, obesity, and type 2 diabetes in children born after assisted reproductive technology: A population-based cohort study. PLoS Med. 18 (9), e1003723(2021).
  12. Goldsmith, S., Mcintyre, S., Badawi, N., Hansen, M. Cerebral palsy after assisted reproductive technology: A cohort study. Dev Med Child Neurol. 60 (1), 73-80 (2018).
  13. Hansen, M., et al. Intellectual disability in children conceived using assisted reproductive technology. Pediatrics. 142 (6), e20181269(2018).
  14. Chang, R. C., Wang, H., Bedi, Y., Golding, M. C. Preconception paternal alcohol exposure exerts sex-specific effects on offspring growth and long-term metabolic programming. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 9(2019).
  15. Grasemann, C., et al. Parental diabetes: The akita mouse as a model of the effects of maternal and paternal hyperglycemia in wildtype offspring. PLoS One. 7 (11), e50210(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניטור גלוקוז בדםמבחן סבילות לגלוקוזהעברת עובריםטכנולוגיה מסייעת להפריהקפציטציה של זרעהפרעה מטבוליתגלוקוז בדם בצוםמעקב אחר משקל גוף
ניטור רמת הסוכר בדם בצאצאי עכבר לאחר הזרקת זרע תוך ציטופלזמית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.