מאמר שיטה

כימות נוגדנים אוטוריאקטיביים בעכברים על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

DOI:

10.3791/66218

⸱

1 בדצמבר 2023

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Brody School of Medicine, East Carolina University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל בעל חיים של טרשת נפוצה (MS), אשר חולק עם המחלה האנושית תגובה אוטואימונית הומורלית חזקה. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול ELISA פשוט וגמיש לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברים מחוסנים EAE.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל מחלה המשחזר את ההפרעה האוטואימונית טרשת נפוצה (MS) ברמה היסטופתולוגית ומולקולרית. EAE מושרה על ידי חיסון חיות ניסוי באמצעות הזרקה תת עורית של פפטידי מיאלין קצרים יחד עם אדג'ובנטים ספציפיים כדי להגביר את התגובה החיסונית. בדומה למקבילו האנושי, עכברי EAE מפתחים נגעים דה-מיאלינטינג, חדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS), הפעלת גליה ופגיעה עצבית. גוף עקבי של ראיות תומך גם בתפקיד מכניסטי לתפקוד לקוי של תאי B באטיולוגיה של טרשת נפוצה ו- EAE. תאי B יכולים לשמש כתאים מציגי אנטיגן, כמו גם מקור עיקרי של ציטוקינים מעודדי דלקת ונוגדנים עצמיים. ב- EAE, נוגדנים נוצרים כנגד פפטידים של המיאלין ששימשו לגרימת המחלה. נוגדנים עצמיים כאלה הוכחו כמתווכים אובדן מיאלין או הפעלה מחדש של תאי T פתוגניים למערכת העצבים המרכזית. מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל מבוסס ELISA לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברי C57BL/6J שחוסנו בפפטיד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין 35-55 (MOG35-55). השיטה המוצעת משמשת כלי רב עוצמה לחקר הספציפיות והעוצמה של התגובה ההומורלית החריגה בהקשר של דמיאלינציה אוטואימונית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית כרונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירה מוקדית של תאי מערכת החיסון לפרנכימה במוח, פירוק נדן המיאלין העוטף אקסונים, הפעלת גליה ואובדן עצבי1. בנוסף לתפקיד המבוסס היטב של תאי T פתוגניים, קווי ראיות רבים הדגישו את מעורבותם של תאי B בתיווך התגובה האוטואימונית נגד מערכת העצבים המרכזית. תאי B עוברים התרחבות שבטית במוח הטרשת הנפוצה ונוגדנים כנגד מרכיבי המיאלין התגלו בתוך נגעים מיוצרים 2,3. ההפעלה הסלקטיבית של תאי B היקפיים עם תחילת המחלה תועדה לאחרונה, דבר המצביע על תפקיד משוער לתא חיסוני זה גם בהתחלת מחלה4. ההצלחה של טיפולים מדללי תאי B כגון נוגדנים חד-שבטיים נגד CD20 מאששת עוד יותר את הקשר המכניסטי בין תפקוד חריג של תאי B לבין דמיאלינציה אוטואימונית 5,6. מנקודת מבט מולקולרית, תאי B יכולים לתרום למחלה באמצעות הצגת אנטיגן עצמי, הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים וייצור נוגדנים אוטו-ריאקטיביים.

מודלים רבים של בעלי חיים פותחו כדי לשחזר תכונות ספציפיות של פנוטיפ הטרשת הנפוצה המורכב. ביניהם, אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא פרדיגמת in vivo הנפוצה ביותר ומסתמכת על חיסון של חיות ניסוי עם פפטידים קצרים הנגזרים מחלבוני מיאלין כגון גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים במיאלין (MOG) וחלבון בסיסי מיאלין (MBP)7. בעלי חיים מחוסנים של EAE מפתחים פתולוגיה דה-מיאלינציה הדומה לטרשת נפוצה בהיבטים רבים, כולל תגובה הומורלית חזקה נגד הפפטיד אנצפליטוגני8. מסיבה זו, מחקרי EAE סייעו לנתח את תפקודם של תאי B ונוגדנים עצמיים בהקשר של מחלה. לדוגמה, הוכח כי נוגדנים ספציפיים ל-MOG שבודדו מחולי טרשת נפוצה יכולים להחמיר את המהלך הקליני במודלים9 של EAE. יש לציין כי שאריות הפרולין במיקום 42 ב-MOG האנושי הוכחו כקריטיות לקביעת פתוגניות הנוגדנים העצמיים10. לאחרונה, נוגדנים עצמיים ספציפיים ל-MOG נמצאו כמקדמים מחלות לא רק על ידי תיווך אובדן מיאלין, אלא גם על ידי הגברת ההפעלה מחדש של תאי T אוטו-ריאקטיביים בתוך מערכת העצבים המרכזית11.

בהתחשב בחשיבות של תגובות נוגדנים באוטואימוניות CNS, מאמר זה מציג פרוטוקול מבוסס ELISA למדידה יעילה של רמות הנוגדנים האוטו-תגובתיים בסרום בעכברי C57BL/6J EAE שחוסנו בפפטיד MOG35-55. בחלק הראשון של הפרוטוקול תתואר השיטה לאיסוף סרום באמצעות ניקוב תוך לבבי. לאחר מכן, יפורטו הנהלים להקמת בדיקת ELISA ורכישת הנתונים. לבסוף, יידונו ניתוח נתונים ופרשנותם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המערבים עכברים בוצעו בהתאם להנחיות הניסוי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מזרח קרוליינה (IACUC). במחקר זה נעשה שימוש בנקבות עכברי Wildtype C57BL/6J בגילאי 8-10 שבועות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). EAE הושרה בעקבות דוחות שפורסמו בעבר 12,13,14.

1. קולקציית סרום

  1. הרדימו את עכבר הניסוי על ידי חנקCO2 או מנת יתר של איזופלורן בנקודת הזמן הנדרשת (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) לאחר השראת EAE באמצעות חיסון MOG35-55.
    הערה: המספר הכולל של עכברים ונקודות זמן לאיסוף נסיוב יכול להשתנות בהתאם לניסוי הספציפי.
  2. לאחר היעדר סימנים חיוניים הוא אישר על ידי צביטת הבוהן או הזנב, מניחים את העכבר במצב שכיבה גבי על מגש דיסקציה ומדביקים את הגפיים במקומו עם סיכות או קלטת. כוון את גוף העכבר למקור אור LED (ראה טבלת חומרים) כדי להאיר את בית החזה של החיה.
  3. רססו את פרוות העכבר באתנול 70% ובצעו חתך בקו האמצע של 3-4 ס"מ לאורך הבטן מהאגן ועד לקסיפואיד באמצעות מספריים לכריתה, תוך הקפדה להימנע מכל איברים וכלי דם עיקריים (איור 1A-C). כדי להקל על ההליך, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את העור על תהליך xiphoid.
  4. חתכו דרך הסרעפת לרוחב ואז חתכו את כלוב הצלעות קדמית בשני הקצוות הרוחביים באמצעות מספריים קפיציים, ועצרו לפני שתגיעו לעצם החזה בקו האמצע (איור 1D). קפלו את דש הצלעות שנוצר מעל ראש העכבר כדי לחשוף את הלב (איור 1E).
    הערה: יש להימנע מחיתוך עצם החזה מכיוון שהדבר יפגע בעורקי החזה הראשיים הסמוכים לעצם ויקטין את נפח הדם שניתן לאסוף.
  5. הכניסו מחט של 25 גרם שמחוברת למזרק של 1 מ"ל לחדר השמאלי ואספו את הדם על-ידי משיכה עדינה לאחור של הבוכנה (איור 1F). כדי להקל על ניקוב המחט, סד בעדינות את הלב נגד זוג מלקחיים.
    הערה: אם הדם אינו מופיע מיד לתוך המזרק, המחט צריכה להיות מסובבת לאט, זווית אחרת יש לבדוק. עם זאת, יש לעשות מאמצים למקם את המחט כראוי בניסיון הראשון כדי למנוע יצירת חורים מיותרים בלב שבהם הדם יכול לדלוף החוצה.
  6. מעבירים את הדם לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל ומאפשרים לו להיקרש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הקריש על ידי צנטריפוגה ב 2000 × גרם למשך 20 דקות ב 4 ° C. אספו את הסופרנטנט, המייצג את מקטע הסרום, ואחסנו אליציטוטים חד-פעמיים בצינורות קריוגניים בטמפרטורה של -80°C לבדיקות עתידיות.

2. בדיקת אליסה

  1. יש להשהות מחדש את הפפטיד MOG35-55 שעבר ליופיליזציה (ראו טבלת חומרים) במים כדי לקבל מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. לפני תחילת הניסוי, יש לדלל את הציר ל-10 מיקרוגרם/מ"ל בחיץ ציפוי (ראו טבלת חומרים) ופיפטה 100 מיקרוליטר/באר של התמיסה הסופית לצלחת בת 96 בארות. אטמו את הצלחת בסרט הדבקה כדי למנוע אידוי ודגרו על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: יש לחשב לפחות 2 בארות עבור כל מדגם ולכלול גם 2 בארות נוספות עבור בקרה ריקה.
  2. במקביל, צפו את אותו מספר בארות ב-100 מיקרוליטר/באר של אלבומין בסרום בקר (BSA) המומס בחיץ ציפוי בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל. בארות נוספות אלה ישמשו כבקרות רקע.
    הערה: מומלץ לצפות עם BSA את בארות הבקרה מכיוון שלמאגרי הציפוי והחסימה יש הרכבים שונים. שים לב כי פפטידים אנצפליטוגניים אחרים (כגון PLP139-151 או MBP84-104) יכולים לשמש כאנטיגנים לא רלוונטיים כחלופה ל- BSA.
  3. ביום שאחרי, שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של מלח חיץ פוספט בתוספת 0.05% Tween 20 (PBS-T). לאחר מכן, יש להוסיף 100 μL/well של תמיסת חסימה העשויה מ-3% BSA ב-PBS (ללא Tween 20) ולדגור על הצלחת אטומה למשך שעה אחת ב-37°C בתנור הכלאה.
  4. שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. יש לדלל כל דגימת סרום ביחס 1:100 בתמיסת חסימה ולהוסיף 100 μL/well הן לבארות מצופות MOG35-55 והן לבארות מצופות BSA. הוסף את אותו נפח של פתרון חסימה לבארות המיועדות ריקות. דוגרים על הצלחת אטומה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, תוך רעידות קבועות (250 סל"ד).
  5. שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. לדלל את הנוגדן המשני המצומד HRP (1:2000, ראה טבלת חומרים) בתמיסה העשויה 0.2% BSA ב- PBS-T ולהוסיף 100 μL / באר לכל הבארות. יש לדגור על הצלחת אטומה למשך שעה בטמפרטורת החדר, תוך רעידות קבועות (250 סל"ד).
  6. שטפו את הצלחת 3 פעמים עם 200 μL/well של PBS-T. הוסף 100 μL / באר של מצע 3,3',5,5' tetramethylbenzidine (TMB) (ראה טבלת חומרים) לכל הבארות ודגר בחושך במשך 1-5 דקות, מעקב אחר התפתחות של צבע כחול.
    1. עצור את התגובה על ידי הוספת 100 μL/well של תמיסת עצירה (ראה טבלת חומרים) ומדידת הצפיפות האופטית (OD) בכל באר באמצעות קורא לוחות המוגדר באורך גל של 450 ננומטר.
      הערה: מצע TMB צריך להיות מאוזן בטמפרטורת החדר במשך 30-60 דקות לפני הוספתו לבארות.

3. ניתוח נתונים

  1. אכלס גיליון אלקטרוני של Excel בערכי OD שנקראו מהצלחת. ממוצע ערכי OD המתקבלים מבארות כפולות (הן MOG35-55 והן BSA מצופה) עבור כל דגימה.
  2. עבור כל דגימה, הפחת את הערך הממוצע של הבארות מצופות BSA מזה של בארות מצופות MOG35-55. ערכי הרקע המתוקנים שיתקבלו יהיו פרופורציונליים לריכוז נוגדנים נגד MOG35-55 בדגימות הסרום השונות.
    הערה: בארות ריקות אמורות לגרום לערכים מתוקנים סביב 0.
  3. החל מבחן סטטיסטי לא פרמטרי כגון מבחן Mann-Whitney U כדי להשוות את ערכי OD ממוצעים בין שני תנאי ניסוי. כלול לפחות 3 דגימות בלתי תלויות עבור כל מצב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים את החוסן של בדיקת ELISA הנוכחית, השיטה נבדקה על דגימות סרום שבודדו מעוקבה של עכברות C57BL/6J לאחר 20 יום לאחר החיסון (dpi) עם 100 מיקרוגרם של פפטיד MOG35-55 באדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) בעקבות פרוטוקול אינדוקציה מאומת של EAE 12,13,14. החיות קיבלו גם 400 ננוגרם של רעלן שעלת ביום 0 ו-2. דגימות סרום מבעלי חיים מחוסנים מדומים עם הכל אך ללא הפפטיד שימשו כבקרות שליליות. כל עכברי EAE פיתחו את סימני המחלה הראשונים בין 11-14 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, דווח על פרוטוקול פשוט ויעיל מבוסס ELISA כדי לכמת במדויק את התגובה ההומורלית במודל חייתי רלוונטי של פתולוגיה של טרשת נפוצה. שיטה זו שימשה לאחרונה לתיאור התפקיד החדש של חלבון אטקסין-1 בשליטה על רמות הנוגדנים העצמיים בסרום בפרדיגמת MOG35-55/C57BL6J EAE12. בהקשר זה, יש לקחת בחשבון מספר גורמים, על מנת להשיג תוצאות עקביות ובעלות משמעות ביולוגית בשיטה זו.

ראשית, חשוב לאסוף דגימות סרום באיכות גבוהה ולהימנע מהמוליזה. המוגלובין ורכיבים תוך-תאיים אחרים המשתחררים מתאי דם אדומי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R03NS131908) ומשרד ההגנה באמצעות תוכנית המחקר לטרשת נפוצה תחת פרס מס 'W81XWH-22-1-0517. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן של המחבר ואינן בהכרח מאושרות על ידי משרד ההגנה. מחקר זה נתמך גם על ידי קרנות סטארט-אפ של אוניברסיטת מזרח קרוליינה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרקים 1 מ"לBD Biosciences309628
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהפישר05-408-129
25 גרם מחטיםBD Biosciences305122
מצע 3,3',5,5'-טטרמתילבנזידין (TMB)Thermo FisherN301חנות ב-4 מעלות;
אטמי דבקThermo FisherAB0558
אלבומין סרום בקר (BSA)SigmaA7906חנות ב-4 מעלות; C
C57BL/6J עכברים נקבותמעבדת ג'קסון000664בעלי חיים בגילאי 8-10 שבועות צריכים לשמש לניסויי EAE
צינורות קריוגנייםפישר10-500-25
מגש דיסקציהפישרS111022
דיסקטורכלי מדע עדינים14082-09
מאגר ציפוי ELISABioLegend421701יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות;
C Excel תוכנהמיקרוסופטאנליזה גיליון אלקטרוני
מלקחייםFine Science Tools11152-10
עז נגד עכבר IgG, מודעות אנושיות-HRPSouthernBiotech1030-05חנות ב-4 & deg; מקור
אור LEDפישרAMPSILED21
קורא מיקרופלייטפישר14-377-575 
ביולוגיה מולקולרית כיתהמים קורנינג46-000-Cl
עכבר MOG35-55 פפטידEZBiolabcp7203חנות ב -80 מעלות; C
פיפטה רב ערוציתAxygenAP-12-200-P
מספריים קפיציים NoyesFine ScienceTools 15011-12
Nunc MaxiSorp צלחות 96 בארותBioLegend423501
שייקר אורביטליפישר88-861-023
תנורVWR445-0024
מלח מאגר פוספט (PBS)Thermo פישר14190144
צנטריפוגה שולחנית מקוררתתרמו פישר75002441
תמיסת עצירהתרמו פישרN600
טווין 20ביו-ראד1706531
C מספריים C

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
  2. Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
  3. Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
  4. Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118(2021).
  5. Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
  6. Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
  7. Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
  8. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
  9. Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
  10. Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
  11. Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
  12. Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
  13. Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
  14. Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297(2020).
  15. Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BELISAMOG35 55G

מאמרים קשורים