הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טכניקות גידול במבחנה למידול אורגנוגנזה של כבד, בניית מכלולים ותכנון רקמות סינתטיות באמצעות קווי תאים אנושיים

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66229

⸱

18 באפריל 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

במאמר זה

סיכום

אורגנואידים מחוללים מהפכה במידול רקמות מותאם אישית לפיתוח איברים, גילוי תרופות וחקר מחלות. הנדסת אורגנואידים מתקדמת ליצירת רקמות סינתטיות מורכבות. המטרה היא לשלב מורפוגנזה, טכנולוגיית אסמבלואידים וביומטריצות כדי לקדם את הנדסת הרקמות. פרוטוקול זה מסייע במידול אורגנוגנזה בכבד ובקביעת הנחיות לבניית רקמות סינתטיות.

תקציר

מחלת כבד כרונית הגיעה לממדים של מגיפה, והשפיעה על למעלה מ-800 מיליון אנשים ברחבי העולם. לטיפול הנוכחי, השתלת כבד אורתוטופית, יש מספר מגבלות. פתרונות מבטיחים צצו בתחום הרפואה הרגנרטיבית של הכבד, כאשר אורגנוגנזה בכבד טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי. אורגנוגנזה מוקדמת של הכבד, המתרחשת בין E8.5 ל-11.5, כרוכה בהיווצרות אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות המובילות למורפוגנזה, היווצרות חבל הכבד והגירה קולקטיבית. עם זאת, חסרות שיטות לדוגמנות חוץ גופית של תהליך זה. במחקר זה מוצגת סדרה מפורטת של שיטות, המאפשרות מידול של שלבים והיבטים שונים של אורגנוגנזה בכבד עם קווי תאים אנושיים. בסדרת שיטות אחת, נעשה שימוש בטכנולוגיה אסמבלואידית עם ספרואידים כבדיים (HEP) ומזנכימליים (MES), המשחזרת מבנים מוקדמים שנמצאו באורגנוגנזה בכבד, מודלים מורפוגנזה מוקדמת ומדגימה נדידת תאים אינטרסטיציאלית כפי שניתן לראות in vivo. מערכות אסמבלואידיות חדשניות אלו עוזרות לזהות גורמים המשפיעים על היווצרות אסמבלואידים ונדידתם. מערכות גידול ספרואידים HEP שימשו גם למודל הגירה קולקטיבית ומורפוגנזה מסועפת. מדיה מותנית מזנכימלית (M-CM) ממלאת תפקיד משמעותי בהתחלת נדידת הסתעפות תלוית מינון. כל השיטות שהוצגו הוכחו כניתנות לשחזור עם אחוזי הצלחה גבוהים. על ידי קישור אירועים אלה יחד, עבודתנו תאפשר לשחזר אירועים מורפוגנטיים עוקבים כדי להנדס לאחור אורגנוגנזה במבחנה וב-vivo.

מבוא

נדידת תאי כבד ממלאת תפקיד משמעותי באורגנוגנזה של הכבד, מחלות וטיפול בתאים. במהלך אורגנוגנזה של הכבד (E8.5-9.0, עכבר), האפיתל הקדם-כבדי של המעי הקדמי הגחוני מתחיל לבטא גנים בכבד עקב אותות אינדוקטיביים הנובעים מהמזנכימה והלב שמסביב. ב-E9.0, אפיתל המעי הקדמי מתעבה כאשר התאים עוברים ממורפולוגיה עמודית קובואידית לפסאודוסטארית, ויוצרים את הכבד דיברטיקולום1,2. בשלב קריטי זה, דיברטיקולום הכבד מורכב מ~1,500 תאים בלבד. לאחר מכן, האנדודרם של הכבד המצפה את דיברטיקולום הכבד מתעבה, מתפרק ויוצר מיתרים של הפטובלסטים נודדים (HBs). HBs אלה נודדים יחד עם תאי אנדותל ותאים מזנכימליים, מסתעפים לתוך הרקמה המזנכימלית שמסביב, ומתחילים נדידת תאים קולקטיבית תלת מימדית ליצירת ניצ<ני הכבד class="xref">3,4. למעשה, במהלך שלב זה, תאים עוברים באופן קולקטיבי (1) נדידה משותפת, או תנועה יחד עם סוגי תאים אחרים, (2) מורפוגנזה מסועפת או היווצרות מבנים דמויי צינור מסועפים, ו-(3) נדידת ביניים, או נדידה על גבי תאים אחרים או ביניהם. עד E11.5, הנדידה נפסקת, והכבד הפרימיטיבי נוצר, ומתרחב פי 1033. נדידת תאי כבד עשויה להידרש גם בשלבים מאוחרים יותר של אורגנוגנזה בכבד, מכיוון שביטוי HBs עוברי של חולדות הראה עדויות לגנים מווסתים מאוד הקשורים לנדידת תאים קולקטיבית תלת מימדית, מורפוגנזה ושיפוץ מטריצות חוץ-תאיות5. בנוסף לתפקידה באורגנוגנזה מוקדמת של הכבד, הגירה קולקטיבית תלת מימדית קשורה באופן מורכב להתפשטות מקומית וגרורות של קרצינומה הפטו-תאית מתקדמת (HCC), מה שמוביל בסופו של דבר להחמרה בפרוגנוזה ולעמידות מוגברת לטיפול6. הפטוציטים בוגרים ועובריים משתמשים גם בנדידה קולקטיבית בעת מעבר מהטחול לתוך הכבד במהלך אכלוס מחדש של הכבד. מחקרי הדמיה in vivo הראו כי הפטוציטים מושתלים נכנסים לווריד הפורטלי ולאחר מכן לנימים תוך שעות, נודדים דרך הסינוסואידים בכבד ודרך רקמת הכבד7,8,9. לבסוף, מחקרים אחרונים מראים כי HBs נודדים מתעוררים במהלך התחדשות הכבד של עכברים ובני אדם, עם עדויות מסוימות לתנועה ב-sheets10. בסך הכל, הגירה קולקטיבית של כבד, המסוגלת למספר מצבים של מורפוגנזה, ממלאת תפקיד משמעותי באורגנוגנזה, סרטן, טיפול בתאי הפטוציטים והתחדשות הכבד.

מחקרים גנטיים רבים חקרו את המסלולים המולקולריים העומדים בבסיס נדידת תאי כבד קולקטיביים תלת-ממדיים. מחקרים אלה מגלים כי היעדר חבלי הכבד מעכב את היווצרות הכבד, ומדגיש את הצורך ביצירת חבל הכבד ואת האינטראקציות שלהם עם תאים תומכים ליצירת כבד1,11,12,13. מחקרים אלה גם מדגימים כי צמיחת הכבד יוזמת על ידי גורמים שונים, כולל FGF-2 המופרש מהמזודרם הלבבי, BMP4 המופרש מהמזנכימה שמסביב, HGF ואינטראקציות של תאי אנדותל. בנוסף, גורמי שעתוק הקשורים להגירה, כולל HEX, PROX1 ו-TBX3, ממלאים תפקידים מכריעים2,14. לסיכום, מחקרים גנטיים מספקים ראיות לכך שאיתות גורמים מסיסים, המוביל לביטוי גורמי שעתוק, מניע נדידה, איתות ואינטראקציות מולקולריות בין HBs למזנכימה הסובבת אותם.

בעוד שנדידת תאים באורגנוגנזה מוקדמת של הכבד נחקרה בהרחבה, מחקרים נוכחיים במבחנה של נדידת כבד משתמשים לעתים קרובות במבחנים דו-ממדיים המשתמשים בתאי HCC נודדים מאוד לצד מודלים של גידול in vivo15. מחקרים אלה סיפקו תובנה לגבי מספר גורמים המשפיעים על נדידת הכבד, כולל TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20, ו-miRNAs21,22,23. למרות שנעשתה התקדמות ראויה לציון בהבנת המנגנונים המולקולריים בנדידת תאי כבד תלת מימדית, הפערים הברורים בין נדידת תאים דו-ממדית ותלת-ממדית מצביעים על כך שלבדיקות דו-ממדיות יש מגבלות מובנות. יתר על כן, מודלים אלה לרוב חסרים הכללה של סוגי תאים מזנכימליים, החיוניים הן לנדידה והן לצמיחה. למרות שחלה התקדמות בפיתוח מודלים תלת מימדיים לנדידת כבד המשלבים את המזנכימה התומכת, מודלים אלה מדגישים בעיקר הגירה משותפת במקום לחקור את האופנים המגוונים של הגירה קולקטיבית.

היכולת לייצר רקמות מספרואידים באמצעות תהליכים שונים של הרכבה עצמית ומורפוגנטית מקלה על חקירה מדעית של רקמות סינתטיות. לרקמות אלו יש יישומים נרחבים בפיתוח וסינון תרופות, מידול מחלות, טיפול ויישומים ביו-רפואיים וביוטכנולוגיים אחרים. הפרטים המתודולוגיים של מספר מערכות גידול תלת מימדיות במבחנה שתוכננו להציג מצבים שונים של נדידה קולקטיבית תלת מימדית של כבד מסופקים. מערכות אלו כוללות (1) תרבית ספרואידית משותפת עם ספרואידים HEP ו-MES במטריצה, (2) טיפות מטריצה ספרואידיות HEP שתרבית עם M-CM, (3) ספרואידים מעורבים של HEP-MES, ו-(4) מטריצת ספרואידים HEP שתרבית עם צפיפות גבוהה של תאי MES. מערכות אלו מאפשרות מידול חזק של נדידה קולקטיבית של כבד בסביבה תלת מימדית, ובכך מקדמות את ההבנה שלנו לגבי תהליכים מולקולריים ותאים העומדים בבסיס אורגנוגנזה של כבד, סרטן וטיפול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר מפורטים בטבלת החומרים. הקיצורים המשמשים במאמר זה מוגדרים בקובץ משלים 1.

1. הכנת תמיסת אגרוז נמוכה של 1% אלקטרואנדוזמוזה (EEO)

  1. שקלו 2.5 גרם אבקת אגרוז EEO נמוכה והעבירו אותה לכוס.
    הערה: ודא שהכוס היא לפחות פי שניים מגודל הנפח הרצוי כדי להכיל בעבוע במהלך הכנת התמיסה.
  2. השתמש בגליל מדורג כדי למדוד 250 מ"ל מים מזוקקים ולשפוך אותם לתוך הכוס, במטרה להגיע לריכוז סופי (w/v) של 1%.
  3. מכסים את פתח הכוס בניילון נצמד ומשאירים חור קטן לאוורור. מחממים את הכוס במיקרוגל למשך 30 שניות.
  4. הסר בזהירות את הכוס וסובב את התוכן. חזור על תהליך זה כל 30 שניות עד לפירוק מוחלט.
    זהירות: טפל בזהירות בכלי זכוכית במיקרוגל, תוך שימוש בכפפות מתאימות. עקוב מקרוב אחר התמיסה כדי למנוע התחממות יתר או רתיחה.
  5. לאחר השגת תמיסה הומוגנית, הוציאו את הכוס מהמיקרוגל. סובבו בעדינות את התמיסה לפני העברתה לבקבוק מעוקר מראש. חיטוי התמיסה ואחסן את תמיסת האגרוז בטמפרטורת החדר (RT) עד שהיא מוכנה לשימוש.

2. ציפוי צלחת 96 בארות

הערה: ניתן להשתמש במיקרו-לוחות ספרואידים מחוברים נמוכים במיוחד של 384 בארות בניסויים אלה ובניסויים נוספים.

  1. שחרר את מכסה הבקבוק המכיל את תמיסת האגרוז הסטרילית של 1%. מחממים את התמיסה במיקרוגל במרווחים של 30 שניות עד שהיא עוברת לשלב הנוזלי; לאחר מכן הדק את המכסה.
    זהירות: טפל בזהירות בכלי זכוכית במיקרוגל, תוך שימוש בכפפות מתאימות. עקוב מקרוב אחר התמיסה כדי למנוע התחממות יתר או רתיחה.
    הערה: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסה זרימה למינרי סטרילי של תרבית רקמות.
  2. העבירו 55-65 מיקרוליטר מתמיסת האגרוז של 1% לבאר כדי לצפות את הצלחת המתורבתת ברקמות של 96 בארות וסובבו מיד את הצלחת.
  3. לאחר שתמיסת האגרוז של 1% הועברה למספר הבארות הרצוי, הניחו את הצלחות במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לאפשר לאגרוז להתמצק. לפני השימוש, הביאו את הצלחת לטמפרטורת החדר (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A).

3. הכנת ספרואידים HEP

  1. לטפח תאי HepG2-WT בבקבוק T-75 באמצעות מצע גידול מושלם (cDMEM) המורכב ממדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep). שמור על תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, ושנה את מצע הגידול מדי יום.
  2. עם הגעה למפגש של 80%, יש לשטוף את התאים במי מלח 1x עם חוצץ פוספט (PBS) ולהשליך את השטיפה. הוסף 5 מ"ל של 0.05% של טריפסין-EDTA לבקבוק ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5-10 דקות.
  3. הוסף כמויות שוות של cDMEM ושטוף את התאים מהבקבוק. לאחר ניתוק התאים, העבירו את התערובת לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה את תרחיף התאים ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT.
    הערה: כל שלבי הצנטריפוגה המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בטמפרטורת החדר (RT). עם זאת, הליכי צנטריפוגה אלה יכולים להתבצע לחלופין בטמפרטורות קרות.
  4. השעו מחדש את תרחיף התאים ב-cDMEM טרי וספרו את התאים כדי לקבוע את הריכוז הסופי בתאים/מ"ל (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1B).
  5. תיוג צבע של התאים
    הערה: זהו שלב אופציונלי.
    1. העבירו את הכמות הרצויה של תרחיף התאים לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה את תרחיף התא ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
    2. השעו מחדש את כדור התא במצע גידול נטול סרום כדי להשיג ריכוז סופי של 1.0 x 106 תאים/מ"ל. הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת תיוג תאים פלואורסצנטיים לכל מ"ל של תרחיף תאים ודגירה על תרחיף התא ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בסיבוב למשך 20 דקות.
      הערה: מצע הגידול נטול הסרום הוא DMEM ומתווסף רק עם 1% עט סטרפטוקוקוק. התאם את זמן הדגירה לצביעה אחידה על סמך צפיפות מתלה התאים.
    3. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה את תרחיף התא ב-450 x גרם למשך 5 דקות והשעיה מחדש של גלולת התא ב-cDMEM טרי. חזור על תהליך הכביסה הזה פעמיים נוספות (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1C).
  6. היווצרות ספרואידים
    1. השעו את התאים ב-cDMEM טרי כדי להשיג ריכוז סופי של 5.0 x 104 תאים/מ"ל בהתבסס על ספירת התאים. מערבבים היטב את מתלה התאים ומעבירים 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לבאר לצלחת 96 בארות מצופה אגרוז><. הערה: צפיפות תרחיף התאים מוגדרת להשיג 5,000 תאים לבאר בצלחת 96 בארות מצופה אגרוז. לשימוש בלוחות של 384 בארות, תאים מושעים בריכוז סופי של 2.0 x 105 תאים/מ"ל, ו-50 מיקרוליטר של תרחיף תאים מועבר לכל באר כדי להשיג ריכוז של 10,000 תאים לבאר.
    2. צנטריפוגה של הצלחת ב-340 x גרם למשך 10 דקות ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5-9 ימים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1D).
      הערה: החלף את מצע הגידול כל יומיים לאחר הציפוי, הסר בעדינות 50% מה-cDMEM והחלף אותו. ספרואידים HEP מתאימים למודל ההרכבה HEP-MES או לדגם M-CM.

4. הכנת ספרואידים MES

  1. טפחו תאי HFF/MRC-5 בבקבוק T-175 באמצעות cDMEM המורכב מ-DMEM, בתוספת 10% FBS ו-1% Pen-Strep. שמור על תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, והחלף את המדיום כל יומיים.
  2. עם הגעה למפגש של 80%, בצע שטיפה של התאים עם 1x PBS והשליך את השטיפה. הוסף 5 מ"ל של 0.25% של טריפסין-EDTA לבקבוק ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5-10 דקות.
  3. הוסף כמויות שוות של cDMEM ושטוף את התאים מהבקבוק. לאחר ניתוק התאים, העבירו את התערובת לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה את תרחיף התאים ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
  4. השעו מחדש את תרחיף התאים ב-cDMEM טרי וספרו את התאים כדי לקבוע את הריכוז הסופי בתאים/מ"ל (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1B).
  5. תיוג צבע של תאים
    הערה: זהו שלב אופציונלי.
    1. העבירו את הכמות הרצויה של תרחיף התאים לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל וצנטריפוגה את תרחיף התא ב-300 x גרם למשך 5 דקות.
    2. השעו מחדש את כדור התא במצע גידול נטול סרום כדי להשיג ריכוז סופי של 1.0 x 106 תאים/מ"ל. הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת תיוג תאים פלואורסצנטיים לכל מ"ל של תרחיף תאים ודגירה על תרחיף התא ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בסיבוב למשך 20 דקות.
      הערה: מצע הגידול נטול הסרום הוא DMEM ומתווסף רק עם 1% עט סטרפטוקוקוק. התאם את זמן הדגירה לצביעה אחידה על סמך צפיפות מתלה התאים.
    3. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה את תרחיף התא ב-450 x גרם למשך 5 דקות והשעיה מחדש של גלולת התא ב-cDMEM טרי. חזור על תהליך הכביסה הזה פעמיים נוספות (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1C).
  6. היווצרות ספרואידים
    1. השעו את התאים ב-cDMEM טרי כדי להשיג ריכוז סופי של 1.0 x 105 תאים/מ"ל בהתבסס על ספירת התאים. מערבבים היטב את מתלה התאים ומעבירים 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לבאר לצלחת 96 בארות מצופה אגרוז><. הערה: צפיפות תרחיף התאים מוגדרת להשיג צפיפות של 10,000 תאים לבאר בצלחת 96 בארות מצופה אגרוז.
    2. צנטריפוגה של הצלחת ב-340 x גרם למשך 10 דקות ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 5-9 ימים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1D).
      הערה: החלף את מצע הגידול כל יומיים לאחר הציפוי, הסר בעדינות 50% מה-cDMEM והחלף אותו. ספרואידים MES מתאימים למודל ההרכבה HEP-MES.

5. תצורת מכלול HEP-MES

הערה: עיין בשלבים 3 ו-4 להיווצרות HEP (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2A) וספרואידים MES (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2B).

  1. אסוף ספרואידים HFF/MRC-5 בנפרד באמצעות פיפטה מצלחת 96 הבארות. העבירו אותם לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי בנפח 15 מ"ל המכיל cDMEM טרי. הניחו לספרואידים להתיישב בשפופרת למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו בעדינות עם cDMEM חם.
    הערה: בצע את תהליך השטיפה בעדינות ובזהירות.
  2. העבר בעדינות ספרואיד HFF/MRC-5 יחיד באמצעות פיפטה לבאר המכילה ספרואיד HepG2-WT. הוסיפו מטריג'ל מופחת (MG) או קולגן זנב עכברוש (CG) בדילול של 1:1 ו-1:5 ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך 3 שעות (איור 2C).
    הערה: הפשירו MG למשך הלילה על קרח במקרר של 2 מעלות צלזיוס עד 8 מעלות צלזיוס. הקפידו על שימוש בפיפטות מקוררות מראש, קצות וצינורות בעת הטיפול ב-MG, מכיוון שהוא יוצר ג'ל מעל 10 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר הדגירה, יש להוסיף 75 מיקרוליטר cDMEM טרי לכל באר ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך 2-3 ימים.
    הערה: החלף את מצע הגידול כל יומיים לאחר הציפוי, הסר בעדינות 50% מה-cDMEM והחלף אותו. מכלולים עדיין ייווצרו ללא שינויי מדיה עד 3-4 ימים. היווצרות אסמבלואידים HEP-MES יכולה להתרחש ללא שימוש במטריצה.

6. היווצרות טיפות ספרואיד HEP

הערה: עיין בשלב 3 להיווצרות ספרואידים HEP (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3A). ניתן להשתמש בשני חומרים שונים לתליית ספרואידים HEP בטיפות. שתי השיטות מובאות להלן.

  1. טיפות GFR MG
    1. אסוף ספרואידים HepG2-WT בנפרד באמצעות פיפטה מצלחת 96 הבארות, מה שמאפשר להם להתיישב בצנטריפוגה חרוטית סטרילית של 15 מ"ל על קרח.
    2. בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי נפרד של 15 מ"ל, מערבבים 1 מ"ל של GFR MG קר כקרח ומדיום גידול בקרת קרח בדילול של 1:1. שאפו את המדיום באמצעות פיפטה מצינור ה-15 מ"ל המכיל את הספרואידים HepG2-WT והניחו אותו על קרח.
      הערה: הפשירו MG למשך הלילה על קרח במקרר של 2 מעלות צלזיוס עד 8 מעלות צלזיוס. הקפידו על פיפטות, קצות וצינורות מקוררים מראש בעת הטיפול ב-MG, מכיוון שהוא יוצר ג'ל מעל 10 מעלות צלזיוס.
    3. הוסף את פתרון MG לספרואידים HepG2-WT, כדי להבטיח פיזור ספרואידים אחיד בתוך פתרון MG.
    4. בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר אספו נפח של 15 מיקרוליטר של ספרואיד בודד בתמיסת MG וזרעו אותו באיטיות על צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3B).
      הערה: אם נזרע יותר מכדור אחד לכל טיפה, הסר וזרע מחדש כראוי. ספרואידים ממוקמים מחדש במידת הצורך כדי להבטיח שהם נמצאים במרכז הטיפה. לזריעה כדורית אופטימלית, שקול להשתמש בפיפטינג הפוך כדי למזער את היווצרות בועות האוויר.
  2. טיפות CG של זנב חולדה
    הערה: כל הכנת ה-CG צריכה להיעשות על קרח.
    1. אסוף ספרואידים HepG2-WT בנפרד באמצעות פיפטה מהצלחת של 96 בארות, מה שמאפשר להם להתיישב בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל על קרח (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3B).
    2. בצינור מיקרו-צנטריפוגה, הוסף 358.8 מיקרוליטר של מים דה-יונים, 100 מיקרוליטר של 10x PBS, 12.1 מיקרוליטר של 1 N NaOH ו-529.1 מיקרוליטר של זנב חולדה CG לנפח כולל של 1 מ"ל.
      הערה: תמיד יש להוסיף CG של זנב עכברוש בסוף.
    3. הוסף את פתרון ה-CG לספרואידים HepG2-WT, כדי להבטיח פיזור ספרואידים אחיד בתוך פתרון ה-CG.
    4. בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר, אספו נפח של 15 מיקרוליטר של ספרואיד בודד בתמיסת ה-CG וזרעו אותו לאט לאט על צלחת פטרי בגודל 60 מ"מ.
      הערה: אם נזרע יותר מכדור אחד לכל טיפה, הסר וזרע מחדש כראוי. ספרואידים ממוקמים מחדש כדי להבטיח שהם נמצאים במרכז הטיפה. לזריעה כדורית אופטימלית, שקול להשתמש בפיפטינג הפוך כדי למזער את היווצרות בועות האוויר.
  3. דגרו את הטיפות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 60 דקות לפני הוספת מצע הגידול.
  4. מוסיפים לאט לאט 5 מ"ל ממצע הגידול הרצוי לצלחת הפטרי ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% CO2 עם שינויים במצע הגידול כל שלושה ימים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3C).
    הערה: M-CM שימש בבדיקת היווצרות טיפות HEP.

7. הכנת M-CM

  1. קצרו תאי HFF/MRC-5 וזרעו אותם לתוך בקבוק שטופל בתרבית רקמה T-75 בצפיפות זריעה של 5,000 תאים/סמ"ר ודגרו את הבקבוק ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 72 שעות ב-15 מ"ל של cDMEM.
    הערה: עקוב אחר הבקבוק בתקופה זו כדי להבטיח בריאות תאים מיטבית.
  2. לאחר הדגירה של 72 שעות, אסוף את ה-M-CM בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל. צנטריפוגה את ה-M-CM ב-290 x g למשך 5 דקות להסרת פסולת וסינון באמצעות מסנן μm 0.2 עבור עיקור (איור 4A).
  3. לדלל את ה-M-CM במצע גידול מלא ביחס דילול של 1:1 עד 1:7 ולהוסיף לניסוי הרצוי (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4B).
    הערה: השתמש ב-M-CM בבדיקת היווצרות טיפות HEP.

8. היווצרות ספרואידים מעורבת HEP-MES

הערה: עיין בשלבים 3.1-3.5. להכנת תרחיף תאים HepG2-WT ושלבים 4.1-4.5 להכנת תרחיף תאים HFF/MRC-5.

  1. השעו את תאי HepG2-WT ב-cDMEM טרי כדי להשיג ריכוז סופי של 1.0 x 105 תאים/מ"ל עבור כל תרחיף תאים.
  2. השעו את תאי HFF/MRC-5 ב-cDMEM טרי כדי להשיג ריכוז סופי של 1.0 x 105 תאים/מ"ל עבור כל תרחיף תאים.
  3. העבר תרחיפי תאים HepG2-WT ו-HFF/MRC-5 לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל ביחס של 1:1 כדי לקבל ריכוז סופי של 2.0 x 105 תאים/מ"ל. מערבבים היטב את תרחיף התאים ומעבירים 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לבאר לצלחת 96 בארות מצופה אגרוז.< br /> הערה: צפיפות תרחיף התאים מוגדרת להשיג 20,000 תאים לבאר בצלחת 96 בארות מצופה אגרוז.
  4. צנטריפוגה של הצלחת ב-340 x גרם למשך 10 דקות ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 1-2 ימים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 5C).
  5. תוספת הידרוג'ל פיברין
    הערה: זהו שלב אופציונלי שנעשה תוך 72 שעות לאחר ציפוי ספרואידים מעורבים HEP-MES.
    1. בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 15 מ"ל, מערבבים פיברינוגן (3.25 מ"ג/מ"ל) ותרומבין (12.5 יחידות/מ"ל) ביחס של 4:1 ליצירת פיברין ומניחים את הצינור על קרח.
  6. העבירו את הפיברין לכל באר עם ספרואיד מעורב קיים מראש בדילול של 1:1 עם cDMEM הנוכחי בבאר. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות.
  7. לאחר הדגירה, יש להוסיף 75 מיקרוליטר cDMEM טרי לכל באר ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך 1-2 ימים.
    הערה: החלף את מצע הגידול כל יומיים לאחר הציפוי, הסר בעדינות 50% מה-cDMEM והחלף אותו.

9. מודל נדידה MES בצפיפות גבוהה

הערה: עיין בשלב 3 עבור הכנת ספרואידים HepG2-WT (איור 6A) ושלבים 4.1-4.5 עבור הכנת תרחיף תאים HFF/MRC-5 (איור 6B).

  1. השעו את תאי HFF/MRC-5 ב-cDMEM טרי כדי להשיג ריכוז סופי של 6.0 x 105 תאים/מ"ל והניחו אותם על קרח.
  2. מערבבים את תרחיף התאים HFF/MRC-5 ו-MG/CG קר כקרח בדילול של 1:1 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 6C).
    הערה: צפיפות תרחיף התאים מוגדרת להשיג 30,000 תאים לבאר בצלחת 96 בארות מצופה אגרוז. הפשירו MG למשך הלילה על קרח במקרר של 2 מעלות צלזיוס עד 8 מעלות צלזיוס. הקפידו על פיפטות, קצות וצינורות מקוררים מראש בעת הטיפול ב-MG, מכיוון שהוא יוצר ג'ל מעל 10 מעלות צלזיוס.
  3. העבירו 100 מיקרוליטר של תמיסת HFF/MRC-5 ו-MG באמצעות פיפטה לבאר המכילה ספרואיד HepG2-WT. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות.
  4. לאחר הדגירה, הוסיפו 75 מיקרוליטר cDMEM טרי לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 למשך עד 12 ימים.

10. ניתוח סטטיסטי

  1. סקור ונתח את הנתונים שנאספו באמצעות Microsoft Excel או כל תוכנה סטטיסטית/גרפית.
    הערה: לצורך הערכה סטטיסטית בין שתי קבוצות, בוצע מבחן t של סטודנט (סוג II עם שני זנבות), וערכי p השווים או קטנים מ-0.05 נחשבו כבעלי מובהקות סטטיסטית ומוגדרים בתוך הטקסט והאיורים/מקרא האיורים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

העניין ברקמות סינתטיות למגוון יישומים ביו-רפואיים, כגון מודלים של מחלות, גילוי תרופות והנדסת רקמות (איור 7), נמצא בעלייה. בתחום זה, אורגנואידים, ספרואידים ותאים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הופכים לרקמות סינתטיות, מורכבות וגדולות יותר. טרנספורמציה זו כוללת יישום של עקרונות מורפוגנזה, שימוש בכלים כגון מיקרו-פבריקציה ושילוב של ביו-מטריצות, המאפשרים הנדסה מדויקת של רקמות סינתטיות (איור 7). כאן מוצגות מספר שיטות העולות בקנה אחד עם נושא על זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מקיף שיטות מרובות לטיפוח אסמבלואידים פשוטים ומורכבים כאחד, כמו גם טכניקות להשראת נדידת תאים קולקטיבית תלת מימדית באורגנוגנזה מוקדמת של הכבד24,25. הפרוטוקולים המתוארים מדגישים מספר שלבים קריטיים, כאשר היווצרות ספרואידים היא היבט מרכזי בכל המתודולוגיות. מיקרו-בארות (96 או 384 בארות) מנוצלות עם לוחות לא נדבקים או מצופים אגרוז כדי להשיג היווצרות כדורית. שיטה זו מבטיחה ייצור בשפע של ספרואידים לניסויים הבאים, תוך התחשבות באלה שאולי לא יגיעו לגודל הצפוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

NP הוא המייסד של Khufu Therapeutics, חברת הנדסת אורגנואידים המפתחת טיפולים למחלות כבד חריפות וכרוניות.

תודות

המחברים מבקשים להביע תודה כנה לאוגצ'י אוגוקה ולאוסמה יוסף על תרומתם רבת הערך לנתונים המשמשים במאמר זה. NP נתמך על ידי קרנות הסטארט-אפ של UB CBE, מלגת מארק דיימונד, C024316 מדעי תאי הגזע של מדינת ניו יורק, מרכז תאי הגזע של UB ברפואה רגנרטיבית (ScIRM), המרכז להנדסת תאים, גנים ורקמות של אוניברסיטת באפלו (CGTE).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
384 בארות שחור/שקוף תחתון עגול נמוך במיוחד חיבור ספרואידMicroplate Corning3830
96-wl צלחת תרבית תאים שטוחה, TC, STRL, 1/pk, 100/CSמכירת מוצרי מעבדה701001
AgaroseSigma-AldrichA0576Low EEO
Axiovision SoftwareZEISSגרסה 4
צלחת תרבית תאים, 60 מ"מ, TC, STRL, 20/pk500 / CSמכירת מוצרי מעבדה705001
בקבוק תרבית תאים, 175 ס"מ &2;, Vent, TC, STRL, 5 / pk, 40 / CSמכירת מוצרי מעבדה709003
בקבוק תרבית תאים, 75 ס"מ &2;, אוורור, TC, STRL, 5 / pk, 100 / CSמכירת מוצרי מעבדה708003
צינורות צנטריפוגה, 15mL, PP, STRL, grad, 50 / bg, 500 / CSמכירת מוצרי מעבדהL226010
קולגן I, זנב עכברוש, 100 מ"גקורנינג354236
DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובטThermoFisher Scientific10569010
EVOS פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניגודיות פאזהEVOSAMEFC4300R1,360 x 1,024 צפיפות פיקסלים
סרום בקר עוברי, מוסמך, ארצות הבריתThermoFisher Scientific26140079
פיברינוגן מפלזמה אנושיתSigma-AldrichF4883-500MG500 מ"ג
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r; https://imagej.net/ij/
ממברנת בסיס מופחתת גורם גדילה מטריג'ל (GFR) מטריקס, ללא LDEV, 10 מ"לקורנינג354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT ערכת צמיחת תאי גזע מזנכימליים אנושייםLonzaPT-3001
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)ThermoFisherScientific15140122
תרומבין מפלזמה אנושיתSigma-AldrichT6884-100UN100 יחידות
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדוםThermoFisher Scientific25300062
Trypsin-EDTA (0.25%), פנול אדוםThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD Cell-Labeling SolutionThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI Cell-Labeling SolutionThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO Cell-Labeling פתרוןThermoFisher ScientificV22886
Zeiss Axio מיקרוסקופ פלואורסצנטיZEISSSE64, 1,344 ופעמים; צפיפות פיקסלים של 1,024

מקורות

  1. Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development. Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).
  2. Gualdi, R., et al. Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: Cell signaling and transcriptional control. Genes Dev. 10 (13), 1670-1682 (1996).
  3. Ogoke, O., et al. Spatiotemporal imaging and analysis of mouse and human liver bud morphogenesis. Dev Dyn. 251 (4), 662-686 (2022).
  4. Ogoke, O., Oluwole, J., Parashurama, N. Bioengineering considerations in liver regenerative medicine. J Biol Eng. 11, 46(2017).
  5. Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver. Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).
  6. Yang, M. H., et al. Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology. 50 (5), 1464-1474 (2009).
  7. Gupta, S., et al. Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium. Hepatology. 29 (2), 509-519 (1999).
  8. Koenig, S., Stoesser, C., Krause, P., Becker, H., Markus, P. M. Liver repopulation after hepatocellular transplantation: Integration and interaction of transplanted hepatocytes in the host. Cell Transplant. 14 (1), 31-40 (2005).
  9. Rajvanshi, P., Kerr, A., Bhargava, K. K., Burk, R. D., Gupta, S. Studies of liver repopulation using the dipeptidyl peptidase iv-deficient rat and other rodent recipients: Cell size and structure relationships regulate capacity for increased transplanted hepatocyte mass in the liver lobule. Hepatology. 23 (3), 482-496 (1996).
  10. Matchett, K., et al. Multimodal decoding of human liver regeneration. bioRxiv. , 10.1101/2023.02.24.529873 2023.2002.2024.529873 (2023).
  11. Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J., Zaret, K. S. Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function. Science. 294 (5542), 559-563 (2001).
  12. Sosa-Pineda, B., Wigle, J. T., Oliver, G. Hepatocyte migration during liver development requires prox1. Nat Genet. 25 (3), 254-255 (2000).
  13. Suzuki, A., Sekiya, S., Büscher, D., Izpisúa Belmonte, J. C., Taniguchi, H. Tbx3 controls the fate of hepatic progenitor cells in liver development by suppressing p19ARF expression. Development. 135 (9), 1589-1595 (2008).
  14. Rossi, J. M., Dunn, N. R., Hogan, B. L., Zaret, K. S. Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm. Genes Dev. 15 (15), 1998-2009 (2001).
  15. Ng, L., et al. Suppression of actopaxin impairs hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of cell migration and invasion. Hepatology. 58 (2), 667-679 (2013).
  16. Fransvea, E., Angelotti, U., Antonaci, S., Giannelli, G. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates e-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 47 (5), 1557-1566 (2008).
  17. Zhao, Y., et al. RNAi silencing of c-myc inhibits cell migration, invasion, and proliferation in hepg2 human hepatocellular carcinoma cell line: C-myc silencing in hepatocellular carcinoma cell. Cancer Cell Int. 13 (1), 23(2013).
  18. Fitamant, J., et al. Yap inhibition restores hepatocyte differentiation in advanced HCC, leading to tumor regression. Cell Rep. 10 (10), 1692-1707 (2015).
  19. Xue, T. C., et al. Goosecoid promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by modulating the epithelial-mesenchymal transition. PLoS One. 9 (10), e109695(2014).
  20. Biname, F., Lassus, P., Hibner, U. Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin. Mol Biol Cell. 19 (3), 945-956 (2008).
  21. Chen, J. S., et al. MiR-338-3p inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cells. Oncotarget. 8 (42), 71418-71429 (2017).
  22. Yang, C., et al. MiR-1301 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration, invasion, and angiogenesis by decreasing Wnt/beta-catenin signaling through targeting BCL9. Cell Death Dis. 8 (8), e2999(2017).
  23. Zeng, Y. B., et al. MiRNA-135a promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion by targeting forkhead box o1. Cancer Cell Int. 16, 63(2016).
  24. Ogoke, O., et al. Dynamic changes in the niche and transcription trigger early murine and human pluripotent stem cell-derived liver organogenesis. bioRxiv. , 10.1101/2022.07.24.501313 (2023).
  25. Ogoke, O., et al. Modeling liver organogenesis by recreating three-dimensional collective cell migration: A role for TGF-beta pathway. Front Bioeng Biotechnol. 9, 621286(2021).
  26. Kanton, S., Pasca, S. P. Human assembloids. Development. 149 (20), dev201120 (2022).
  27. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerg Top Life Sci. 3 (5), 615(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Hepatic
טכניקות גידול במבחנה למידול אורגנוגנזה של כבד, בניית מכלולים ותכנון רקמות סינתטיות באמצעות קווי תאים אנושיים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.