הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66231

⸱

26 בינואר 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.

תקציר

ריצוף חד-תאי איפשר מיפוי של אוכלוסיות תאים הטרוגניות בסטרומה של איברים המטופויטיים. מתודולוגיות אלה מספקות עדשה שדרכה ניתן לחקור הטרוגניות שלא נפתרה בעבר במצב יציב, כמו גם שינויים בייצוג סוג התא הנגרמים על ידי לחצים חיצוניים או במהלך ההזדקנות. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים הדרגתיים לבידוד אוכלוסיות תאי סטרומה באיכות גבוהה מבלוטת התימוס האנושית והמורין, כמו גם עצם מורין ומח עצם. תאים המבודדים באמצעות פרוטוקולים אלה מתאימים ליצירת מערכי נתונים מולטיומיים באיכות גבוהה של תא יחיד. ההשפעות של עיכול דגימות, דלדול שושלת המטופויטית, ניתוח/מיון FACS וכיצד גורמים אלה משפיעים על תאימות עם ריצוף תא בודד נדונים כאן. עם דוגמאות של פרופילי FACS המצביעים על דיסוציאציה מוצלחת ולא יעילה ותפוקות תאי סטרומה במורד הזרם בניתוח שלאחר ריצוף, ניתנים מצביעים מזוהים למשתמשים. התחשבות בדרישות הספציפיות של תאי סטרומה היא קריטית להשגת תוצאות איכותיות וניתנות לשחזור שיכולות לקדם את הידע בתחום.

מבוא

אצל מבוגר בריא, ייצור דה נובו של תאי דם מתרחש במח העצם ובבלוטת התימוס. תאי סטרומה באתרים אלה חיוניים לתחזוקת המטופויזה, אך סטרומה מהווה פחות מ-1% מהרקמה 1,2,3,4. השגת מבודדים טהורים של המטופויזה התומכת בסטרומה מהווה אפוא אתגר משמעותי, במיוחד עבור מולטיומיקה של תא בודד הדורשת עיבוד מהיר כדי לקבל דגימות באיכות גבוהה. רכיבים של קוקטיילים שונים לעיכול עלולים להפריע לשלבים מסוימים בניתוח מולטיומיקס 5,6. הפרוטוקולים המוצגים כאן מפרטים את בידודם של מגוון רחב של תאי סטרומה ממח עצם ומרקמות תימיות.

הפרעות של מרכיבי סטרומה הן במח העצם והן בבלוטת התימוס גורמות להפרעה עמוקה בהתפתחות תאי הדם ויכולות לגרום לממאירויות 7,8,9. המטופויזה התומכת בסטרומה נפגעת בעקבות התניה ציטוטוקסית והשתלת מח עצם, וכתוצאה מכך מופחתת הפרשת ציטוקינים וגורמי גדילה המקיימים תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs)2,10,11. יתר על כן, הזדקנות משפיעה על מח העצם ותאי סטרומה של בלוטת התימוס, מה שככל הנראה תורם לפנוטיפים המטופויטיים מזדקנים. בלוטת התימוס היא האיבר הראשון שעבר אינבולוציה נרחבת הקשורה לגיל. רקמות שומן ופיברוטיקה מתחילות להחליף סטרומה תומכת תאי T כבר בתחילת ההתבגרות המינית12,13. במוח העצם, תכולת האדיפוציט עולה עם הגיל ונישות כלי הדם והאנדוסטל משופצות באופן משמעותי 14,15,16.

כדי לאפשר מחקר של סטרומה תומכת בהמטופויזיס במצבי עקה מרובים ובמקרה של בלוטת התימוס של רקמת האדם ושל רקמת מורין, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולי עיכול 1,2,8,17,18 שפורסמו בעבר. פרוטוקולים אלה מבטיחים בידוד יעיל וניתן לשחזור של תאים, והם תואמים לריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) ולסוגים אחרים של מולטיומיקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העבודה עם רקמות אנושיות בוצעה לאחר אישור על ידי מועצת הביקורת הפנימית של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (IRB). כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (IACUC). C57Bl/6 עכברים, בני 8-10 שבועות, וזכרים ונקבות כאחד, שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. הכנת רקמת מורין תימית

  1. הכן את המאגרים והפתרונות הבאים.
    1. בינוני 199 (M199) עם 2% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS) (ראה טבלת חומרים).
    2. קוקטייל דיסוציאציה מורין: 0.5 WU/mL Liberase TM ו-6.3 U/mL DNase I ב-M199 + 2% FBS (ראה טבלת חומרים).
    3. M199 עם 2% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA).
      הערה: FBS המכיל מדיום ניתן לעבור BSA כדי לשפר את איכות RNA.
  2. ביצוע דיסקציה של בלוטת התימוס
    1. הרדימו את העכבר על ידי חנקCO2 (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) והניחו אותו על גבו. להרטיב את הפרווה על החזה על ידי ריסוס 70% אתנול ולהמשיך לפתוח את חלל החזה.
    2. נתחו בזהירות את בלוטת התימוס על ידי ביצוע חתך רוחבי ממש מתחת לכלוב הצלעות בעזרת מספריים כירורגיים. חותכים את הצלעות בכל צד של העכבר עד עצם הבריח. לאחר מכן לחתוך את הסרעפת כך קיר החזה יכול להשתחרר. הרימו את הצלעות בעזרת זוג מלקחיים כדי לחשוף את חלל בית החזה.
      1. בלוטת התימוס היא איבר לבן, דו-בולרי, היושב בחלק העליון של החלל, ממש מעל הלב. החזיקו את בלוטת התימוס עם המלקחיים וחתכו בעדינות את רקמת החיבור שמחזיקה את בלוטת התימוס במקומה. שים את הרקמה התימנית המנותחת בבאר של צלחת 6 בארות עם M199 + 2% FBS על קרח.
        הערה: כאשר עובדים עם עכברים זקנים או מותני קרינה או זנים מוטנטיים עם פגמים תימיים, בלוטת התימוס עשויה להיות כה קטנה עד שנדרש מיקרוסקופ דיסקציה כדי לכרות את האיבר באופן אמין.
    3. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, הסר כל רקמה חוץ-תימית באמצעות מלקחיים קהים ומספריים מיקרו-קפיציים.
  3. ביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמת מורין תימית (30 דקות במרווחים של 10 דקות)
    1. מניחים את בלוטת התימוס הנקייה במכסה של צינור 15 מ"ל וטוחנים דק את הרקמה במספריים כירורגיים סטריליים.
      הערה: טחינת הרקמה במכסה הצינור המשמש לעיכול ממזערת את אובדן הרקמה עקב העברה ממיכל אחד למשנהו. זה חשוב מאוד כאשר עובדים עם עכברים מזדקנים או מותנים מקרינה או זנים מוטנטיים עם פגמים תימיים. גודל בלוטת התימוס הקטנה בהגדרות אלה מחייב לצמצם את אובדן החומר במידת האפשר.
    2. הוסיפו 2 מ"ל של קוקטייל דיסוציאציה מורין לצינור 15 מ"ל, חברו את הפקק המכיל את חתיכות התימוס, והפכו 5 פעמים כדי להבטיח שהרקמה תשהה מחדש בקוקטייל הדיסוציאציה.
    3. כדי למנוע דליפה, עטפו את מכסה הצינור בסרט פרפין. לאחר מכן הניחו את הצינור אופקית באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול של 250 סל"ד. דוגרים במשך 10 דקות.
      הערה: הצלחת פרוטוקול העיכול תלויה בכך שהדגירה מבוצעת בטמפרטורה של 37°C ועם תסיסה. הפרוטוקול המתואר עבר אופטימיזציה באמצעות אמבט מים רועד. אם אפשרות זו אינה זמינה, ייתכן שגישות אחרות המאפשרות תסיסה בסביבה מחוממת יפעלו, אך מומלץ למטב תחילה את הפרוטוקול עבור הגדרות אלה.
    4. הניחו את הצינור בנפח 15 מ"ל במדף והניחו לחתיכות הרקמה לשקוע. הסר בזהירות את הסופרנאטנט והעבר אותו מעל מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור קר כקרח של 50 מ"ל.
    5. חזור על שלבים 2-4 פעמיים עבור סך של 3 סיבובים של עיכול. הרקמה צריכה להיות פחות או יותר מנותקת לחלוטין עד סוף הדגירה האחרונה.
    6. הוסף 20 מ"ל של M199 + 2% FBS להשעיית התא שנאסף. סחרור כלפי מטה ב- 500 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 ° C.
    7. הסר את supernatant והשהה מחדש בנפח מתאים של M199 + 2% FBS. לאחר מכן המשך לספירת תאים.
      הערה: נפח M199 + 2% FBS להשהיה מחדש יהיה תלוי במצב בלוטת התימוס. עבור עכברים בני 6-10 שבועות, אנו ממליצים להשעות מחדש את הרקמה ב 3-4 מ"ל של M199 + 2% FBS. עם זאת, בניסויים המשתמשים ברקמה מיושנת או מותנית בקרינה או בזנים מוטנטיים עם פגמים תימיים, גודל בלוטת התימוס הקטנה ידרוש נפחים נמוכים יותר הנעים בין 0.1-1 מ"ל.
    8. ספור תאים על-ידי דילול תרחיף התא ביחס של 1:2 בתמיסת טריפאן כחול של 0.4% (w/v). העמיסו תאים על המוציטומטר וספרו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. ספרו תאים לא מוכתמים כדי לקבוע את מספר התאים החיים למיליליטר ואת מספר התאים המוכתמים בכחול כדי להעריך את כדאיות הדגימה.
  4. ביצוע מיון תאים מופעל פלואורסצנטי של סטרומה תימנית מורין
    1. סובב את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. תאי השעיה מחדש בריכוז של 5 x 107 תאים / מ"ל ב- M199 + 2% FBS בתוספת מעכב 25 U/mL Protector RNase (ראה טבלת חומרים).
    2. מוסיפים בלוק Fc מורין (ראו טבלת חומרים) בריכוז של 2 מק"ג/מ"ל ודגרים במשך 10 דקות ב-4°C.
    3. צבעו את התאים בנוגדנים הבאים: CD45-PE/Cy7 (4 מיקרוגרם/מ"ל), Ter119-PE (4 מיקרוגרם/מ"ל), CD31-BUV737 (2 מיקרוגרם/מ"ל) ו-EpCam-BV711 (2 מיקרוגרם/מ"ל) (ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות ב-4°C.
    4. שטפו את הדגימות ב-M199 + 2% BSA וסחררו מטה ב-500 x גרם במשך 5 דקות ב-4°C.
    5. הסר תאי סופרנאטנט והשהיה מחדש ב- M199 + 2% BSA המכילים צבע כדאיות כגון DAPI (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) או 7-AAD (1 מיקרוגרם / מ"ל) (ראה טבלת חומרים). המשך לבידוד FACS של תאי סטרומה תימיים בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו19.

2. הכנת רקמה תימית אנושית

  1. הכן את המאגרים והפתרונות הבאים.
    1. בינוני 199 (M199) עם FBS של 2% (v/v).
    2. M199 עם 1.5% (עם v) BSA.
    3. קוקטייל דיסוציאציה אנושית: 1 מ"ג/מ"ל Collagenase IV ו-2 מ"ג/מ"ל Dispase ו-6.3 U/mL DNase I ב-M199 +1.5% BSA (ראה טבלת חומרים).
      הערה: שלב העיכול האחרון בהכנת רקמת תימית אנושית כולל טריפסין. לכן חיוני שכל השלבים עד לנקודה זו יבוצעו במאגר המכיל BSA מכיוון ש- FBS יעכב את פעילות הטריפסין.
  2. ביצוע בידוד רקמות תימיות אנושיות
    1. מניחים את בלוטת התימוס האנושית (שנאספה בעקבות שיטה19 שפורסמה בעבר) בנפח מתאים של M199 + 1.5% BSA ואחסנו אותה על קרח עד לתחילת העיבוד.
    2. תוך כדי עבודה עם רקמה תימית אנושית, טפל בה כאילו היא עלולה להיות מדבקת על ידי ביצוע העבודה בתרבית רקמה ושימוש באמצעי זהירות סטנדרטיים בהתאם להנחיות CDC20.
    3. שים את הרקמה בצלחת פטרי 10 ס"מ עם 10 מ"ל של M199 קר כקרח + 1.5% BSA. בעזרת מלקחיים ומספריים סטריליים, נקו בזהירות שומן חיצוני או רקמה שניזוקה בעת הוצאת האיבר.
    4. בעזרת מספריים כירורגיים וזוג מלקחיים, חותכים את בלוטת התימוס ל-1 ס"מ3 קוביות ומשתמשים בבוכנה של מזרק 10 מ"ל כדי לדחוף בעדינות את החתיכות. זה ישחרר חלק מהתימוציטים המתפתחים, ובכך יפחית את נפח הרקמה לעיכול.
      הערה: שמור את החלק ההמטופויטי ששוחרר אם יש צורך בניתוח עוקב של שלבי התפתחות תימוציטים. עם זאת, אין לשלב חלק זה עם חלק תאי סטרומה שנוצר במהלך עיכול אנזימטי. נצפה כי איגום שני השברים מגדיל באופן משמעותי את הסיכון להיווצרות סתימות בתרחיף התא, ובסופו של דבר מפחית את התפוקה של תאי סטרומה. מעט תאי סטרומה הולכים לאיבוד במהלך הריסוק העדין של הרקמה.
  3. ביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמה תימית אנושית (90 דקות במרווחים של 30 דקות)
    1. מעבירים כ-5 מ"ג של חתיכות הרקמה התימנית המרוסקות קלות למכסה של צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל. לאחר מכן לחתוך את הרקמה דק באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים.
    2. פיפטה 8 מ"ל של קוקטייל דיסוציאציה אנושית לתוך צינור 50 מ"ל, לחבר את הפקק המכיל את הרקמה התימנית האנושית הטחון, ולאחר מכן בעדינות להפוך את הצינור 5 פעמים כדי להבטיח כי כל הרקמה מעורבבת עם קוקטייל אנזים.
    3. אבטח את מכסה הצינור עם סרט פרפין כדי למנוע דליפה. יש לדגור אופקית על הצינור באמבט מים מטלטל (250 סל"ד) בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
    4. הניחו את הצינור בנפח 50 מ"ל במדף והניחו לחתיכות הרקמה התימנית האנושית לשקוע לפני שתוציאו את הסופרנאטנט והעבירו אותו מעל מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל המונח על קרח.
    5. חזור על שלבים 2.3.2-1.3.4 בסך הכל שני סבבי עיכול עם קוקטייל הדיסוציאציה האנושי.
    6. לאחר הסבב השני של העיכול נעשה, להוסיף 8 מ"ל נוספים של קוקטייל הדיסוציאציה האנושי לרקמה הנותרת. ואז גם פיפטה 2 מ"ל של 0.25% טריפסין לתוך צינור דיסוציאציה רקמות. יש לדגור במשך 30 דקות נוספות ב-37°C, תוך רעידות ב-250 סל"ד.
      הערה: חיוני לחלוטין שזמן העיכול של רקמה אנושית יהיה לפחות 90 דקות, מכיוון שזמני דגירה קצרים יותר מובילים לירידה דרסטית בתפוקת תאי סטרומה.
    7. לאחר ביצוע שלב הדגירה האחרון, אגרו את תרחיף התא ואת שברי הרקמה הנותרים עם הסופרנאטנט שנאסף בשלבים קודמים על ידי מעבר מעל מסננת תאים של 70 מיקרומטר. הוסף 3 מ"ל של FBS לדגימה כדי לשבור את תגובת טריפסין ומניחים על קרח.
    8. המשך לספירת התאים כמתואר בשלב 1.3.
  4. ביצוע מיון תאים מופעל פלואורסצנטי של סטרומה תימית אנושית
    1. יש לסחרר את תרחיף התאים של בלוטת התימוס האנושית ולהשהות מחדש בריכוז של 5 x 107 תאים/מ"ל ב-M199 + 2% FBS בתוספת מעכב 25 U/mL Protector RNase.
    2. יש לדגור עם בלוק Fc אנושי (5 מיקרוגרם/מ"ל) (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות ב-4°C.
    3. צבעו את הדגימה למשך 30 דקות ב-4°C עם CD45-BV711 (2.5 מיקרוגרם/מ"ל), CD235a-BV711 (2.5 מיקרוגרם/מ"ל), שושלת-קוקטייל-FITC (3.76 מיקרוגרם/מ"ל), CD66b-FITC (דגימה של 20 מיקרוליטר/100 מיקרו-ליטר), CD8-APC/Cy7 (דגימה של 5 מיקרוליטר/100 מיקרו-ליטר), CD4-BV605 (דגימה של 5 מיקרוליטר/100 מיקרו-ליטר), CD31-PE/Dazzle594 (10 מיקרוגרם/מ"ל) ו-EpCam-BV421 (2.5 מיקרוגרם/מ"ל) (ראו טבלת חומרים).
    4. שטפו את הדגימות ב-M199 + 1.5% BSA וסחררו כלפי מטה ב-500 x גרם במשך 5 דקות ב-4°C.
    5. הסר את תאי supernatant ו resuspend ב M199 + 1.5% BSA המכיל צבע קיימא כגון DAPI (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) או 7-AAD (1 מיקרוגרם / מ"ל). המשך לבידוד FACS של תאי סטרומה תימיים בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו19.

3. הכנת עצם מורין ורקמת מח עצם

הערה: שברים של מח עצם ומח עצם מוכנים בשתי תגובות עיכול נפרדות כדי להשיג טוהר מרבי של תאי סטרומה ודיסוציאציה אופטימלית של רקמות. ניתן לאגד את הדגימות לאחר שלבי העיכול כדי למיין אותן כתא סטרומה אחד.

  1. הכן את המאגרים והפתרונות הבאים.
    1. M199 עם FBS של 2% (v/v).
    2. קוקטייל דיסוציאציה של Murine B&M (עצם ומח): Stemxyme 2 mg/mL, Dispase 1 mg/mL ו-10 U/mL DNase I (ראה טבלת חומרים) ב-M199 +2% FBS.
      הערה: הכינו את תערובת הדיסוציאציה B&M טרייה ושמרו את התערובת על קרח עד לשימוש.
    3. M199 עם 0.5% (w/v) BSA.
    4. מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 0.5% (w/v) BSA.
    5. M199 עם אלבומין בסרום בקר (BSA) של 2% (w/v) ו-2 mM EDTA.
      הערה: FBS המכיל מדיום ניתן לעבור BSA כדי לשפר את איכות RNA.
  2. ביצוע הפרדת מח עצם מורין
    1. הרדימו את העכבר על ידי חנק CO2 (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). יש לרסס באתנול 70% כדי להרטיב את הפרווה.
    2. הסירו בזהירות את עצם הירך, השוקה, האגן וההומרוס מכל צד והניחו אותם בבאר המכילה M199 + 2% FBS על קרח 21,22.
    3. הסר את כל רקמת השריר, הרצועות והסחוס באמצעות מגבוני רקמה כדי למזער את הנזק לעצם ולשמר את השכבה הפריאוסטיאלית. הניחו אותם בבאר חדשה עם M199 + 2% FBS על קרח.
    4. השתמש אזמל לחתוך דרך לוחות הצמיחה של העצמות הארוכות כדי להסיר את epiphysis ומניחים אותו בצלחת 10 ס"מ עם M199 + 2% FBS על קרח.
    5. שוטפים את מח העצם מהעצמות עד לקבלת צבע לבן בהיר. השתמש מחט 28 G מזרק 10 מ"ל מלא 10 מ"ל M199 + 2% FBS כדי לשטוף את המוח לתוך צינור 15 מ"ל על קרח. מניחים את העצם סמוקה בצלחת 10 ס"מ עם epiphysis.
      הערה: שטיפה מלאה של מח העצם להפרדה מלאה של רקמות תביא להכנת דגימה טובה יותר.
  3. ביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמת מח עצם מורין (סה"כ 30 דקות במרווחים של 10 דקות)
    1. השאירו את הצינור בנפח 15 מ"ל עומד זקוף על קרח עד שהמח שוקע לתחתית הצינור. הסר לאט את 10 מ"ל M199 + 2% FBS על ידי pipetting.
    2. הוסיפו 4 מ"ל של קוקטייל דיסוציאציה B&M לצינור 15 מ"ל והכניסו אותו לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (ללא רעידות) למשך 10 דקות.
    3. לאחר 5 דקות, הפוך את הצינור שלוש פעמים והחזיר אותו לאמבט המים.
    4. לאחר 10 הדקות הראשונות, ודא שהגלולה נמצאת בתחתית ואספו את הסופרנאטנט תוך סינון דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור קר כקרח של 50 מ"ל. הוסיפו 2 מ"ל של קוקטייל דיסוציאציה B&M טרי לגלולת BM הנותרת והחזירו אותה לאמבט המים.
    5. נתקו את כל חתיכות מח העצם שנותרו על ידי פיפטינג נמרץ באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. אסוף את כל השעיית התאים המתקבלת באותו צינור כמו בשלבים הקודמים. הוסף 20 מ"ל של M199 + 0.5% BSA + 2 mM EDTA לתרחיף התאים שנאסף.
      הערה: בשלב 3.3.5, המאגר שנוסף לאחר הדגימה המעוכלת הסופית מכיל EDTA כדי לסייע בעיכוב פעילות אנזימטית נוספת.
  4. בצע דלדול תאים hematopoietic של רקמת מח עצם murine.
    1. תאי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השהיה מחדש ב-500 מיקרוליטר PBS + 0.5% BSA עם נוגדנים לביוטין (5 מ"ג/מ"ל) המכוונים ל-CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 ו-CD3 (ראה טבלת חומרים). מעבירים לצינור בעל תחתית עגולה עם מכסה.
    2. יש לדגור על שייקר אורביטלי למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    3. מערבלים היטב את החרוזים המגנטיים ומוסיפים 25 μL של חרוזים מגנטיים לצינור.
    4. יש לדגור על שייקר אורביטלי למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    5. מניחים את הצינור במגנט התואם למשך 2-3 דקות ואוספים את הסופרנאטנט בשפופרת חדשה.
      הערה: ניתן לאגד את מח העצם או לשמור אותו בנפרד ממקטע העצם לאחר שלב זה. אם דלדול השושלת מוצלח, השעיית התאים המתקבלת צריכה להיות נטולת תאים אדומים.
  5. בצע דיסוציאציה אנזימטית של רקמת עצם מורין.
    1. שוברים את העצמות לחתיכות קטנות יותר בצלחת בגודל 10 ס"מ עם קצה מכסה שטוח של צינור 50 מ"ל. סננו את הסופרנאטנט דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לבודד שברי עצם בתוך המסנן.
      הערה: לחלופין, טיט ומזיק יכולים לשמש לפיצול עצם. אפשרות זו, לעומת זאת, נוטה לייצר יותר פסולת ולהפחית את הכדאיות של תאי סטרומה כאשר העצם נטחנת ולא שבורה. תאי הסטרומה עדיין מחוברים לעצם ובתוכה, ויש להיפטר מהסופרנאטנט המכיל תאים המטופויטיים.
    2. השתמש מספריים כדי לחתוך את שברי העצם במסננת התא. זה יגדיל את שטח הפנים לדיסוציאציה אנזימטית יעילה יותר. לשטוף את העצם עם 5 מ"ל של M199 + 2% FBS.
    3. מניחים את שבר העצם בתערובת 5 מ"ל של דיסוציאציה B&M מורין (ראו טבלת חומרים) בצינור חדש של 50 מ"ל.
    4. כדי למנוע דליפה, עטפו את מכסה הצינור בסרט פרפין. לאחר מכן הניחו את הצינור אופקית באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול של 120 סל"ד למשך 30 דקות.
    5. לאחר העיכול, להוסיף 25 מ"ל של M199 + 0.5% BSA + 2 mM EDTA ולסנן את supernatant המכיל את תאי סטרומה דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר לתוך צינור קר כקרח 50 מ"ל.
      הערה: בדוק כי שברי העצם שנוצרו הופחתו באופן ניכר על ידי העיכול. בשלב 3.5.5, המאגר שנוסף לאחר הדגימה הסופית שעוכלה מכיל EDTA כדי לסייע בעיכוב פעילות אנזימטית נוספת.
  6. בצע מיון תאים מופעל פלואורסצנטי של עצם מורין וסטרומה מח עצם.
    1. סובב את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    2. יש להשהות מחדש בבלוק Fc מורין בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA ולדגור במשך 10 דקות ב-4°C.
    3. לצבוע את התאים (עד 10 מיליון תאים / נפח צביעה כולל של 100 מיקרוליטר) עם הנוגדנים הבאים: CD45-PE / Cy7 (1 מיקרוגרם / מ"ל), Ter119-PE / Cy7 (1 מיקרוגרם / מ"ל), CD31-BV421 (0.66 מיקרוגרם / מ"ל), CD140a-APC (2 מיקרוגרם / מ"ל), Sca1-AF700 (0.66 מיקרוגרם / מ"ל), CD51-PE (2 מיקרוגרם / מ"ל), CD105-PE / סנוור (2 מיקרוגרם / מ"ל) (ראה טבלת חומרים).
    4. השאירו את Calcein-AM לאיזון לטמפרטורת החדר והשהינו מחדש ב-50 μL של DMSO. יש להכין טרי לכל שימוש. יש לשמור בטמפרטורת החדר לאחר ההשעיה. לדלל מראש את הקלצין ב- PBS (0.1 מ"ג / מ"ל) לפני הוספה לדגימה (20 מיקרוגרם / מ"ל) שכבר הושהה מחדש בקוקטייל צביעת הנוגדנים ולדגור במשך 20-30 דקות ב 4 ° C בחושך.
    5. לשטוף את הדגימות PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    6. הסר את supernatant ו resuspend את התאים PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA. המשך לבידוד FACS של תאי סטרומה של עצם ומח עצם בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקולים אלה מניבים זני תאי סטרומה הניתנים לשחזור מהתימוס וממח העצם המתאימים לאנליזה ציטומטרית של זרימה, כמו גם מולטיומיקה של תא יחיד, כגון ריצוף scRNA. רקמת מורין תימית עוברת שיפוץ משמעותי בתגובה לגורמי סטרס, כגון ההתניה הציטוטוקסית שקודמת להשתלת מח עצם או תהליך ההזדקנות הטבעי. כתוצאה מכך, התאיות התימיות מצטמצמות באופן דרסטי בשתי ההגדרות האלה (איור 1A). בעוד שבלוטת תימוס של עכבר פראי בן 8 שבועות מכילה כ-100 מיליון תאים, התאיות של עכבר בן שנתיים צפויה להיות חצי מזה, ובלוטת תימוס 4 ימים לאח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תאי סטרומה באיברים המטופויטיים הם קריטיים לייצור דם תקין והפרעות סטרומה המטופויטיות עלולות לגרום לליקויים חמורים בתחזוקה ההמטופויטית ובתגובה ללחץ 9,23,24. תובנה של תאי סטרומה hematopoietic חיונית להבנת מחלות המטולוגיות 7,9,10,24 וליכולת לפתח טיפולים להילחם בהם25,26

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

D.T.S. היא דירקטורית ובעלת מניות ב-Agios Therapeutics וב-Editas Medicines; מייסד, דירקטור, בעל מניות וחבר מועצה מדעית מייעצת עבור Magenta Therapeutics ו- LifeVault Bio, בעל מניות ומייסד של Fate Therapeutics ו- Garuda Therapeutics, ודירקטור, מייסד ובעל מניות ב- Clear Creek Bio, יועץ ל- FOG Pharma, Inzen Therapeutics ו- VCanBio, ומקבל מימון מחקר ממומן מ- Sumitomo Dianippon. D.T.S ו-K.G הם ממציאי US20220143099A1 פטנטים.

תודות

נתמכנו בסיוע טכני מקצועי על ידי מתקן HSCI-CRM Flow Cytometry בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס ומתקן Bauer Core באוניברסיטת הרווארד. T.K ו-K.G נתמכו על ידי מועצת המחקר השבדית ו-C.M. על ידי קרן המחקר הגרמנית. אנו מודים לסרגיי Isaev ול- I-Hsiu Lee על הסיוע בניתוח נתוני ריצוף RNA של תא יחיד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
קוקטייל שושלת אנטי-אנושית 3-FITCBD Biosciences643510
סרום בקר אלבומיןMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 עכבריםג'קסון664זכרים או נקבות, 8-12
Calcein פישר סיינטיפיק65-0853-78
קולגנאז IVMillipore SigmaC5138
מסנני תאים סטריליים קורנינג, לבן, גודל רשת: 70 ומיקרו; מפישר סיינטיפיק08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083  2500 U / mL
Easysep עכבר סטרפטווידין RapidSpheres ערכת בידודStemCell Technologies19860
סרום בקר עובריGibcoA31605-01מוסמך One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001מחקר כיתה
בינוני 199Gibco12350
עכבר אנטי אנושי CD235a-BV77BD Biosciences740785
עכבר אנטי אנושי CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
עכבר אנטי אנושי CD45-BV77Biolegend304050
עכבר אנטי אנושי CD4-BV605BD Biosciences562658
עכבר אנטי אנושי CD66b-FITCBD Biosciences555724
עכבר אנטי אנושי CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
עכבר אנטי אנושי EpCam-BV421Biolegend324220
מגן RNase מעכבMillipore Sigma3335402001
עכברוש נגד עכבר CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
חולדה נגד עכבר CD11b-ביוטיןBiolegend101204
עכברוש נגד עכבר CD140a-APCפישר סיינטיפיק17-1401-81
חולדה נגד עכבר CD16/CD32 (עכבר BD FC בלוק)BD Biosciences553142
חולדה נגד עכבר CD31-BUV737BD Biosciences612802
עכברוש נגד עכבר CD31-BV421Biolegend102424
חולדה נגד עכבר CD3-ביוטיןBiolegend100244
חולדה נגד עכבר CD45.2-ביוטיןBiolegend109804
עכברוש נגד עכבר CD45-PE/Cy7Biolegend103114
עכברוש נגד עכבר CD45-PE/Cy7Biolegend103114
עכברוש נגד עכבר CD45-PE/Cy7Biolegend103114
חולדה נגד עכבר CD45R/B220-ביוטיןBiolegend103204
עכברוש נגד עכבר CD51-PEBiolegend104106
עכברוש נגד עכבר EpCam-BV711BD Biosciences563134
חולדה נגד עכבר Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
חולדה נגד עכבר Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-ביוטיןBiolegend108404
חולדה נגד עכבר Ter119-ביוטיןBiolegend116204
חולדה נגד עכבר Ter119-PEBiolegend116208
עכברוש נגד עכבר Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme וורת'ינגטון ביוכימיקלLS004107
בן שבועות;

מקורות

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
  3. Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
  4. Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
  5. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  6. Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830(2023).
  7. Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
  8. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  9. Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  10. Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
  11. Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
  12. Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
  13. Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
  14. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  15. Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
  16. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  17. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  18. Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951(2013).
  19. Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
  20. Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html (2023).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936(2016).
  22. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  23. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  24. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  25. Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
  26. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  27. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).
  28. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ריצוף תאי יחידדיסוציאציה של הטימוסבידוד מחול ownסינון באמצעות מסנני תאיםהפרדה באמצעות חרוזי מגנטאנליזת FACSתאי סטרומה עכברייםהטרוגניות של אוכלוסיות תאים
בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.