הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל מהדק הילארי ריאתי שמאלי של פגיעה באיסכמיה ריאתית

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66232

⸱

12 באפריל 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

הפרוטוקול מתווה שיטה ישימה, אמינה וניתנת לשחזור של הידוק הילארי ריאתי שמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לחקור פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה ריאתית במודלים של עכברים.

תקציר

פגיעה באיסכמיה רפרפוזיה (IRI) במהלך השתלת ריאות היא גורם סיכון עיקרי לסיבוכים לאחר ההשתלה, כולל תפקוד לקוי ראשוני של השתל, דחייה חריפה וכרונית ותמותה. מאמצים לחקור את היסודות של IRI הובילו לפיתוח מודל עכבר אמין וניתן לשחזור של הידוק הילאר ריאה שמאלית. מודל זה כולל הליך כירורגי המבוצע בעכבר מורדם ואינטובציה. מבוצעת כריתת בית חזה שמאלי, ואחריה גיוס ריאות זהיר ודיסקציה של הילום הריאה השמאלי. המהדק ההילארי כרוך בקשירת תפר הפיכה של הילום הריאתי עם חלקלק, אשר עוצר את זרימת העורקים, זרימת ורידים וזרימת אוויר דרך הסימפונות הראשיים השמאליים. זילוח הוא יזם על ידי הסרה זהירה של התפר. המעבדה שלנו משתמשת 30 דקות של איסכמיה ו 1 שעה של זילוח עבור המודל הניסויי בחקירות הנוכחיות. עם זאת, פרקי זמן אלה ניתנים לשינוי בהתאם לשאלת הניסוי הספציפית. מיד לפני ההקרבה, ניתן לקבל גז דם עורקי מהחדר השמאלי לאחר פרק זמן של 4 דקות של הידוק הילאר ימני כדי להבטיח שערכי PaO2 המתקבלים מיוחסים לריאה השמאלית הפגועה בלבד. אנו מתארים גם שיטה למדידת אקסטרווסציה של תאים באמצעות ציטומטריית זרימה, הכוללת הזרקה תוך ורידית של נוגדן עם תווית פלואורוכרום ספציפי לתא(ים) שיש לחקור לפני הקרבה. לאחר מכן ניתן לקצור את הריאה השמאלית לצורך ציטומטריית זרימה, קפוא או קבוע, אימונוהיסטוכימיה משובצת פרפין ותגובת שרשרת כמותית של פולימראז. טכניקת הידוק הילארי זו מאפשרת מחקר מפורט של המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס IRI. תוצאות מייצגות חושפות ירידה בחמצון הריאה השמאלית ועדות היסטולוגית לפגיעה ריאתית בעקבות הידוק הילארי. טכניקה זו ניתנת ללמידה ולשכפול בקלות על ידי אנשי צוות עם וללא ניסיון מיקרוכירורגי, מה שמוביל לתוצאות אמינות ועקביות ומשמש כמודל הניתן לאימוץ נרחב לחקר IRI ריאות.

מבוא

IRI במהלך השתלת איברים הוא גורם סיכון עיקרי לתפקוד לקוי ראשוני של השתל ולאפיזודות מאוחרות יותר של דחיית השתל 1,2. במהלך ההשתלה, זמן איסכמיה חמה מוגדר כפרק הזמן שבין הידוק צולב אבי העורקים של התורם להתחלת זילוח קר ומהסרת איברים מקרח להשתלת איברים. זמן אחסון קר מוגדר כפרק הזמן מתחילת הזלוף הקר ועד להוצאת האיבר מקרח3. איסכמיה חמה מזיקה יותר לתפקוד איברים מאוחר יותר מאשר איסכמיה קרה 4,5,6, והמנגנונים הבסיסיים שלה מצדיקים מחקר נוסף במודלים פרה-קליניים. בנוסף, השתלת איברים מתרומה לאחר מוות לבבי (DCD) קשורה לזמנים איסכמיים חמים ארוכים יותר מאשר תרומה מסורתית לאחר מוות מוחי (DBD)7. בעוד שהשימוש בתורמי DCD יכול להרחיב את מאגר התורמים ולהגדיל את ניצול הריאות, נדרשים מחקרים פרה-קליניים נוספים להערכת ההשפעות של איסכמיה חמה על תפקוד הריאות לאחר ההשתלה. להלן נתאר מודל של IRI חם בעכברים דרך מהדק הילאר ריאתי שמאלי.

מספר מודלים בבעלי חיים של הידוק הילאר ריאות פותחו והותאמו במהלך השנים האחרונות ועשויים לכלול שימוש במהדק מיקרו-וסקולרי א-טראומטי 8,9,10,11,12,13, חוסם עורקים רומל 14,15 או קשירת תפרים16 כמו מהדק hilar. עיקר המהדק ההילארי הוא שהוא חייב להיות הפיך ולגרום נזק מינימלי או ללא נזק למבנים ההילאריים, כך שניתן יהיה להשיג זילוף. כאן, אנו מתארים את טכניקת המהדק ההילארי שלנו בעכברים הכוללת קשירת תפר הפיכה של הילום ריאתי שמאלי עם חלקלק. שיטה זו חוסמת את זרימת עורקי הריאה, את הזרימה הוורידית ואת זרימת האוויר פנימה והחוצה מהסימפונות הראשיים. היתרון העיקרי של החלקה על מהדק כלי דם, קליפס או חוסם עורקים הוא שניתן לסגור את החזה בתקופות ממושכות של איסכמיה, ובכך למזער איבוד נוזלים וחום בלתי נתפס בעכבר. אנו מספקים פרוטוקול להשגת מדידות אמינות של גז דם עורקי (ABG) ולמדידת אקסטרווציה של תאים לאחר הידוק הילארי.

טכניקת הידוק הילארי זו תופסת מקום חשוב במחקר הרחב יותר של השתלת ריאות. בהשוואה למודלים של בעלי חיים קטנים של השתלת ריאות אורתוטופית, טכניקת ההידוק ההילארי יכולה לבודד את ההשפעות של IRI ללא תוספת של טראומה אנסטומוטית כירורגית או אלוגניות17. בנוסף, ניתן לשלוט בקלות ובמהירות רבה יותר בטכניקת ההידוק הילאר מאשר השתלת ריאות עכבר. למעשה, באמצעות טכניקות מהדק hilar, מספר מנגנונים חשובים בפתוגנזה של IRI זוהו בעשור האחרון, כגון TLR4, NADPH oxidase, וקולטן אדנוזין A2A 14,18,19,20. בפרוטוקול הבא, אנו מציגים שיטה אמינה, ניתנת ללימוד וניתנת לשחזור של הידוק hilar ככלי לחקר IRI ריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון. בעלי חיים קיבלו טיפול הומני בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, מהדורה 821 שהוכן על ידי האקדמיה הלאומית למדעים ופורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, ועקרונות הטיפול בחיות מעבדה שגובשו על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי.

1. הרדמה ואינטובציה

  1. בחר עכבר ששוקל לפחות 25 גרם. זה יקל על אינטובציה בשל הפתח הגדול יותר בין מיתרי הקול.
  2. הזריקו לעכבר תערובת של קטמין (מינון של 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (מינון של 10 מ"ג/ק"ג משקל גוף). תערובת זו צריכה להיות טעונה לתוך מזרק 1/2 סמ"ק עם מחט 1/2 אינץ '29G. המתינו כ-5 דקות עד שהקטמין ייכנס לתוקף - העכבר לא אמור להפגין תנועה ספונטנית ואינו מגיב לצביטה בבוהן, המאשרת הרדמה נאותה.
  3. יש להזריק בופרנורפין (מינון של 0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף) תת עורית לפני הניתוח לשליטה נוספת בכאב.
  4. החל משחה אופתלמית לא תרופתית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית במהלך הניתוח.
  5. גלחו את העכבר עם קוצץ מעל החזה השמאלי והגב (ראו איור 1A), המשתרע על הבטן אם מתוכננת לפרטומיה (ראו שלב 5.3).
  6. לאחר שהעכבר מורדם, בצע את האינטובציה באמצעות מערך אינטובציה מועדף ואת שאר ההליך תחת מיקרוסקופ מעל שטיחון מחומם ב~ 37 מעלות צלזיוס (כדי לשמור על נורמותרמיה בעכבר).
  7. לאחר השגת תצוגה נאותה של מיתרי הקול, הכניסו מבוא תוצרת בית (ראו איור משלים 1) עם קימור בקצה לתוך אנגיוקטטר 20G בגודל 1 אינץ', המשמש כצינור האנדוטרכאלי (ETT). הנחו את קצה המבוא ולאחר מכן את ה-ETT בין מיתרי הקול ועברו אותם.
    הערה: חשוב לדמיין את ETT עובר דרך מיתרי הקול כדי למנוע אינטובציה מזויפת לתוך הוושט. יש להקפיד להימנע מפגיעה במיתרי הקול במהלך האינטובציה (כלומר, מספר ניסיונות האינטובציה צריך להיות מוגבל ל-5 ואין לקדם את ה-ETT אם מתקיימת התנגדות).
  8. לאחר הכנסת ה-ETT, הסר את המבוא וחבר את ה-ETT למכונת הנשמה של בעלי חיים קטנים. שימו לב לעלייה סימטרית בחזה כדי לאשר אינטובציה אנדוטרכאלית נכונה. הגדרות ההנשמה צריכות להיות 100-105 נשימות לדקה ושבריר חמצן השראה של 100%. נפח הגאות הוא 0.35 מ"ל ולחץ הפקיעה הסופי החיובי הוא 1 ס"מ H2O.
    הערה: ודא כי החזה ולא הבטן עולה כמו אינטובציה בשוגג הוושט יוביל למוות אם לא לתקן מיד.
  9. לאחר שאושר שהוא נמצא במקומו, אבטח את ה-ETT באמצעות רצועה של 5 ס"מ של סרט משי בגודל 1 אינץ' סביב אף העכבר, כדי להבטיח מגע הולם עם ה-ETT והאף כך שה-ETT לא יחליק החוצה מהפה (ראה איור 1B-C).
  10. כדי לשמור על הרדמה מספקת לאורך כל הניתוח, יש לתת איזופלורן 1%-1.5% בקו אחד עם זרימת החמצן.

2. Thoracotomy

  1. מקמו את העכבר בתנוחת דקוביטוס צידית ימנית, כאשר שתי הכפות הקדמיות מודבקות לפינה השמאלית העליונה, הכף האחורית הימנית מודבקת לפינה השמאלית התחתונה, והכף האחורית השמאלית מודבקת לפינה הימנית התחתונה (ראו איור 2G להקשה).
  2. יש לחטא עם העור מעל החזה השמאלי עם לפחות 3 סבבים לסירוגין של יוד פובידון ואחריו מריחת 70% אלכוהול.
  3. בצעו חתך מעל החלל הבין-קוסטליה-4 מקו בית השחי הקדמי לקו בית השחי האחורי, באמצעות מספריים כדי לפתוח את העור שמעליו (ראו איור 2A). החלל הבין-קוסטליהרביעי ממוקם כ-1 ס"מ מתחת לבית השחי בקו אמצע בית השחי.
  4. כדי למזער את איבוד הדם, קריש כלי דם גלויים בתוך השכבות התת עוריות והשריריות באמצעות עט צריבה ידני.
  5. חלקו את השרירים הקדמיים latissimus dorsi ו-serratus בחדות באמצעות מספריים לאורך חתך העור (ראו איור 2B).
  6. בעזרת מלקחיים מעוקלים עדינים, הרימו בזהירות את הצלעה-4 (תוך זהירות שלא לפגוע בריאה שמתחתיה) ובצעו חיתוך נקודתי עם מספריים עדינים ממש מעל הצלעה-5 כדי להיכנס לחלל הבין-קוסטליה-4 (ראו איור 2C). בצע את בית החזה מעל הצלע ה- 5 ולאמתחת לצלע ה -4 כדי למנוע פגיעה בצרור הנוירו-וסקולרי הבין-קוסטלי.
  7. ברגע שהלחץ על חלל הפלאורל השלילי אובד והריאה נסוגה מדופן בית החזה, הרחיבו את בית החזה קדימה ואחורה בחלל הבין-קוסטליה-4 ממש מעל הצלעה-5 (ראו איור 2D-E). אורך החתך כולו צריך להיות ארוך מספיק כדי לחשוף את הריאה כולה, בדרך כלל ~ 1 ס"מ.
    הערה: דימום בעורק החלב הפנימי יכול להתרחש אם בית החזה מורחב רחוק מדי קדמית - אם נתקלים, זה צריך להיות צרוב כדי למנוע איבוד דם מוגזם.
  8. יש למרוח שני מחזירי צלעות כדי לפתוח את חלל הצלעות, ולאפשר חלון עבודה של לפחות 1 ס"מ2 להדמיה נאותה (ראו איור 2F-G).

3. יישום של מהדק hilar

  1. בעזרת אפליקטורים בעלי שתי נקודות כותנה, גייסו את הריאה השמאלית על-ידי הגבהתה ולאחר מכן חלוקה בוטה של הרצועה הריאה התחתונה השקופה (ראו איור 3A-B).
    הערה: אם זה מאתגר לבצע מבלי לקרוע את הריאה, הרצועה הריאה התחתונה ניתן גם לחלק בחדות באמצעות מספריים עדינים.
  2. לשקף את הריאה הקדמית, כך הילום ריאתי שמאלי אחורי ניתן לדמיין. חתכו פיסת עניבת משי 6-0 ל~10 ס"מ והניחו את נקודת האמצע של עניבה זו אחורית להילום (ראו איור 3C).
  3. לאחר מכן, הפכו את הריאה השמאלית לאחור כדי לשכב מעל העניבה ומשכו את שני קצוות העניבה קדימה (ראו איור 3D).
  4. עם שני הקצוות החופשיים (A ו-B) של העניבה, קשר-מכשיר מחליק הפיך עם מלקחיים ומהדק יתושים מעוקל. ראה תיאור מפורט בשלבים 3.4.1 ו- 3.4.2. הזמן האיסכמי החם מתחיל עם קשירת החלקה. הריאה השמאלית כבר לא אמורה להתנפח עם כל נשימה של מכונת הנשמה ברגע שהקשר קשור. זה צריך להיות לבן חיוור מרמז על הפסקת זילוח.
    הערה: יש להקפיד לוודא שהקשר יושב באמצע ההילום, ולהימנע מלחרור בשוגג של האטריום השמאלי במרכז ושל פרנכימת הריאה לרוחב (ראו איור 3F).
    1. עם מהדק ביד הדומיננטית ומלקחיים ביד הלא דומיננטית, החזיקו את קצה A עם מלקחיים וסובבו את נקודת האמצע של A סביב המהדק הסגור פעם אחת (ראו איור 3E).
    2. אחוז את נקודת האמצע של B עם המהדק ומשוך בשתי הידיים כדי לצבוט את החלקה. אל תתנו לקצה של B למשוך את הקשר, מה שיהפוך את הקשר לבלתי הפיך. לאחר קשירת הקשר, B צריכה להיות לולאה שיוצאת מהקשר, בעוד A צריכה להיות ישרה (ראו איור 3F). הקשר יכול להשתחרר על ידי משיכת הקצה של B.
  5. אשרו חסימה נאותה של הסימפונות על-ידי חסימה ידנית של צינור הזרימה מה-ETT למכונת ההנשמה, מה שאמור לגרום לריאה השמאלית לא להתנפח (ראו איור 3G). חסימת כלי דם מניחה עם חסימת הסימפונות בהתחשב בקריסה מוגברת של עורק הריאה והוורידים בהשוואה לסימפונות הסחוסיים.
  6. לאחר יישום המהדק ההילארי, סגור את חתך העור בתפר אחד פשוט וקטוע באמצעות תפר ניילון 6-0, כדי למזער הפסדי נוזלים בלתי מורגשים במהלך תקופת איסכמיה חמה.

4. שחרור מהדק hilar

  1. לאחר התקופה הרצויה של איסכמיה חמה, שחררו את החלקה על-ידי משיכה עדינה בקצה החופשי הקצר של עניבת המשי (B מאיור 3F ושלב 3.4). התחל את זמן הרפרפוזיה עם שחרור החלקה.
    הערה: לאחר שחרור העניבה, אוורור הריאות יכול להיות מאושר על ידי חסימה ידנית שוב של זרימת ETT, אשר אמור כעת לגרום להרחבה של הריאה השמאלית. שוב, זילוח נרמז עם ניפוח של הריאה, אולם הוא יכול להיות מאושר גם על-ידי כך שהריאה מתכווצת כלפי מעלה (ראו איור 4A).
  2. במהלך תקופת הרפרפוזיה, סגור את החזה בשלוש שכבות כדי למזער הפסדים בלתי מורגשים. ראשית, סגרו את חלל הצלעותה-4 בתפר יחיד עם תפר ניילון 6-0, עם נגיסה אחת ממשמעל הצלע הרביעית ונשיכה אחת ממשמעל הצלע ה-6 (ראו איור 4B-C). קשרו זאת לניפוח ריאות מקסימלי, כדי למזער את הסיכון לדלקת ריאות יאטרוגנית (ראו איור 4D-E).
  3. לאחר מכן, סגרו את שכבת השריר באמצעות תפר ריצה פשוט עם תפר ניילון 6-0.
  4. לבסוף, סגרו את חתך העור בתפר פשוט וקטוע עם תפר ניילון 6-0 (ראו איור 4F). הימנעו מביצוע תפרים על העור בשל הסיכון שבעלי חיים ערים יקטפו את החתך שלהם ויובילו לפגיעה מוחלטת בפצע.
  5. מנקודה זו, ניתן לקצור את הריאה ישירות בתום זמן הזילוח הרצוי. אם הערכת ABG רצויה, ראה שלב 5. אם יש צורך בהזרקה תוך ורידית נוספת לפני ההקרבה, ראה שלב 6. זהו ניתוח סופני.
  6. אם זמן הרפרפוזיה מיועד להיות גדול מכמה שעות, כבו את האיזופלורן כדי לאפשר לעכבר להתעורר מהרדמה ולהוציא החוצה. קריטריוני אקסטובציה כוללים עוויתות עם צביטת כפות ונשימות ותנועה ספונטניות. התעוררות עכבר מהרדמת קטמין ואיזופלורן אורכת בדרך כלל 30-45 דקות. זהו ניתוח הישרדות.
    1. לניתוח הישרדות, יש להזריק 1 מ"ל של מי מלח חמים באופן תת-עורי כדי להסביר את אובדן הנוזלים מהניתוח. יש להזריק בופרנורפין (מינון 0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) תת עורית לפני ניתוח לשליטה בכאב. יש לחזור על ההרדמה כל 4-6 שעות במשך 3 ימים לפחות לאחר הניתוח. שקול בלוק bupivacaine לאורך החתך עבור שליטה נוספת בכאב.

5. הערכת ABG

הערה: אם רוצים למדוד ABG, זה מתקבל בצורה הטובה ביותר באמצעות שאיפת דם עורקית מהחדר השמאלי. כדי לוודא כי ABG משקף רק את תפקוד הריאה השמאלית, דם עורקי זה צריך להתקבל לאחר כ 4 דקות של הילום ימין להיות מהודק22,23, שבמהלכו רק הריאה השמאלית מבצעת חמצון ואוורור.

  1. אם העכבר התעורר מהרדמה לאחר הידוק הילארי, יש להרדים מחדש ולבצע אינטובציה לעכבר בהתאם לשלב 1.
  2. כ 15-20 דקות לפני סוף זמן הזילוח הרצוי, מקם את עמוד השדרה של העכבר, מאבטח את כל ארבעת הגפיים עם נייר דבק.
    הערה: יש להקצות מספיק זמן לביצוע השלבים הבאים לפני סיום הרפרפוזיה. תזמון ספציפי לפתיחת הבטן והחזה ישתנה בהתאם למנתח ולניסיונו.
  3. בצעו לפרוטומיה בקו האמצע מעצם הערווה ועד לקסיפואיד, וחתכו במספריים את העור ואחריו את דופן הבטן לאורך הלינאה אלבה (ראו איור 5A-B).
  4. בקסיפואיד, מרחיבים את הלפרטומיה ימינה ושמאלה לקו בית השחי הקדמי, בעקבות העקומה של הצלע התחתונה ביותר (ראו איור 5C).
  5. מהבטן, חתכו את הסרעפת הקדמית בקו האמצע כדי להיכנס לחזה, והיזהרו לא להיכנס עמוק מדי כדי להימנע מפגיעה בלב (ראו איור 5D-E). לאחר מכן, הרחיבו את החתך הקדמי בסרעפת שמאלה וימינה לקו בית השחי הקדמי, לאורך הצלע התחתונה ביותר (ראו קו לבן מקווקו באיור 5D).
  6. חלקו את הצלעות הדו-צדדיות לאורך קו בית השחי הקדמי, הנמשך כלפי מעלה לכיוון בית השחי, כדי ליצור בית חזה צדפה. לאחר מכן, שיקפו את דופן בית החזה הקדמי (עצם החזה והצלעות הקדמיות הדו-צדדיות), מה שמאפשר חשיפה מלאה של הלב והריאות הדו-צדדיות (ראו קווים לבנים מנוקדים באיור 5F).
  7. יש למרוח מהדק על דופן החזה הקדמית ההפוכה כדי להקל על הנסיגה. משכו את הסרעפת כלפי מטה בעזרת מהדק יתושים מעוקל בקו האמצע כדי לשפר את ההדמיה של החזה (ראו איור 5F).
  8. כדי לנייד באופן מלא את הריאה הימנית (שיש לה 4 אונות), החזירו את האונה האביזרית המשתרעת מעבר לקו האמצע אל החזה השמאלי בחזרה אל החזה הימני (ראו איור 5G-H). יש רצועה דקה המחברת את האונה הזו לחזה השמאלי - מחלקים אותה בבוטות עם אפליקטורים עם צמר גפן או בחדות עם מספריים.
    הערה: אונת אביזר זו חוצה את קו האמצע האחורי לווריד הנבוב התחתון (IVC), ולכן יש להיזהר שלא לפגוע ב- IVC במהלך תמרון זה.
  9. לאחר שכל האונות מוחזרות לחזה הימני, יש לשקף את כל הריאה הימנית קדימה ולהניח עוד 6-0 עניבת משי (חתוכה ל~10 ס"מ) אחורית להילום הימני. לאחר מכן, החליפו את הריאה הימנית בחזרה לחזה מעל העניבה.
  10. קשרו החלקה נוספת סביב הילום הימני באותה טכניקה המתוארת בשלב 3.4, תוך הקפדה להקיף את כל ארבע האונות של הריאה הימנית. שלב מהדק הילארי ימני זה צריך להיות מתוזמן כ -4 דקות לפני סוף הזילוח.
  11. מצפים מחט 1/2 אינץ '31G על מזרק שחפת 1 סמ"ק עם כ 200 μL של הפרין 1000 יחידה / מ"ל. כדי לעשות זאת, למשוך את נפח הפרין שוב ושוב למשוך את הבוכנה קדימה ואחורה 3-4 פעמים כדי לאפשר הפרין לצפות את כל החלק הפנימי של המזרק. זה נעשה כדי למזער את הסיכון של דם שואף קרישת במהלך ההובלה מתחנת הניתוח למכונת ABG .
  12. לאחר 4 דקות של הידוק הילאר ימני, שאפו דם עורקי מהחדר השמאלי לתוך המזרק המצופה בהפרין (ראו איור 5I). יש להקפיד להימנע מניקוב מחיצת החדר ומשאיפת דם ורידי החדר הימני בשוגג. יש הבדל צבע ברור בין החדר הימני הכהה יותר לחדר השמאלי הבהיר יותר (ראו כניסה לתמונה 5I). זווית המחט לכיוון הצוואר השמאלי. נקבים מרובים עשויים להידרש כדי להשיג מספיק דם כדי להפעיל ABG (~ 150 μL).
    הערה: במהלך 4 הדקות של מהדק הילרי הימני, העכבר עשוי להתחיל להפגין נשימה מייסרת, המבשרת את המוות הממשמש ובא. אם זה קורה, דם עורקי צריך להיות שואף במהירות לפני דום לב. לא ניתן לשאוף דם מלב שאינו פועם.
  13. הפעל את הדם העורקי על מכונת ABG כדי להשיג רוויית חמצן, לחץ חלקי של חמצן, לחץ חלקי של פחמן דו חמצני, בין מדידות אחרות. יש להרדים את העכבר לאחר איסוף ABG ו/או טיפול בנוגדנים (ראה שלב 6).

6. הזרקת נוגדנים תוך ורידית למדידת אקסטרווסציה של תאים

הערה: טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע אקסטרווסציה של תאים באמצעות הזרקה של נוגדנים המסומנים פלואורוכרום תוך ורידי לתוך IVC לפני הקרבה ואחריו ניתוח ציטומטרי זרימה, כפי שפורסם בעבר18. בקצרה, ניתן להבחין בין נויטרופילים תוך וסקולריים לבין נויטרופילים אינטרסטיציאליים באמצעות נוגדנים ספציפיים לנויטרופילים נגד Ly6G. Fluorescein isothiocyanate-labeled (FITC-labeled) anti-Ly6G (שיבוט 1A8) מוזרק לווריד 5 דקות לפני ההקרבה, אשר מסמן את הנויטרופילים התוך-וסקולריים במחזור. הריכוז של נוגדן FITC-Ly6G בשימוש הוא 100 ng מדולל ב 200 μL של מלוחים חוצצים פוספט. לאחר מכן, לאחר הכנת תרחיף תא בודד מהריאה השמאלית לצורך ציטומטריית זרימה, כל הנויטרופילים מסומנים באלופיקוציאנין (APC-labeled) אנטי-Ly6G (שיבוט 1A8). לפיכך, APC-Ly6G+FITC-Ly6G+ נויטרופילים הם תוך-וסקולריים ואילו APC-Ly6G+FITC-Ly6G- הם חוץ-וסקולריים או אינטרסטיציאליים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת מונוציטים עם נוגדנים anti-Ly6C, תאי B עם נוגדנים anti-CD19, למשל.

  1. טען את הנוגדן הרצוי לתוך מזרק 3/10 סמ"ק עם מחט 5/16 אינץ '31G, תוך הקפדה על מזעור בועות האוויר בתוך המזרק. השתמש בו להזרקה תוך ורידית לתוך IVC בשלב 6.5.
  2. בצע laparotomy על פי שלבים 5.3-5.4.
  3. לאחר הלפרוטומיה, יש לבצע סיבוב ויסצרלי מדיאלי ימני בצורה בוטה באמצעות שני אפליקטורים מחודדים מכותנה. בעכבר, זה נעשה על ידי הסרת כל המעי משמאל לבטן, אשר יאפשר מבט ברור של IVC (ראה איור 6A).
  4. נקו את השומן שמעל ה-IVC בבוטות בעזרת אפליקטורים עם צמר גפן.
  5. הזריקו את תמיסת הנוגדנים לתוך IVC באמצעות ניקור (ראו איור 6B). עם עקירת המחט, מיד להפעיל לחץ עדין עם צמר גפן על האתר של venipuncture עד שהוא hemostatic (בדרך כלל כ 2-3 דקות).
  6. החזירו את המעי הגס לתוך הבטן מעל צמר גפן כדי להמשיך להפעיל לחץ על IVC (ראו איור 6C).
  7. בצע צדפה thoracotomy על פי שלבים 5.5-5.7 כדי לקצור את הריאה השמאלית. יש לאפשר לנוגדנים לפחות 5 דקות לזרום באופן מערכתי לפני ההקרבה והקציר. יש להרדים את העכבר לאחר איסוף ABG ו/או טיפול בנוגדנים.

7. צביעת היסטולוגיה (H&E)

  1. לאחר קיבוע פורמלין והטמעת פרפין של הריאה השמאלית וחתך לעובי של 5 מיקרומטר, מפרקים את המגלשה בקסילן (שתי שטיפות של 10 דקות).
  2. יש לייבש בשטיפות אתנול סדרתיות: שטיפה של 2x 5 דקות עם 100%, שטיפה של 1x 2 דקות עם 95%, ושטיפה של 1x 2 דקות עם 70% אתנול. לאחר מכן, יש לשטוף במים נטולי יונים.
  3. הכתימו את המגלשה עם המטוקסילין למשך 2-4 דקות, ולאחר מכן שטפו במים נטולי יונים, במשך 5 דקות או עד שהיא צלולה. משך הזמן המדויק של צביעת המטוקסילין יצטרך להיות מותאם לרקמה ולעוצמת הצביעה הגרעינית הרצויה.
  4. יש לשטוף בתמיסה מוגדרת למשך 30 שניות כדי להבדיל בין כתמים, ולאחר מכן לשטוף במים למשך 2 דקות. יש לשטוף בתמיסת יצירת צבע כחול למשך 30 שניות, ולאחר מכן לשטוף במים למשך 2 דקות.
  5. יש לייבש עוד יותר על ידי טבילה באתנול 95% פי 15. מכתים באאוזין למשך דקה.
  6. יש לייבש עם שטיפות אתנול של 2 דקות (2x), ולאחר מכן שטיפות קסילן של 2 דקות (2x). החל מדיית הרכבה והחלקת כיסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר הידוק הילארי שמאלי, לחץ חלקי של חמצון בדם העורקי (PaO2) המיוחס לריאה השמאלית הוא ~100 מ"מ כספית, נמוך משמעותית בהשוואה ל~500 מ"מ כספית לאחר כריתת בית חזה דמה (איור 7A, n=6-7). יש לציין כי תראקוטומיות דמה בוצעו בעכברי B6 כאשר מדידת ABG נלקחה לאחר 4 דקות של הידוק הילארי ימני, המייצג ערכים המיוחסים לריאה השמאלית בלבד. צביעת H&E של הריאה השמאלית המהודקת-הילאר הדגימה חדירה של תאי דלקת הממלאים את דרכי הנשימה ואת גודש כלי הדם באריתרוציטים, בעוד שממצאים אלה נעדרים בריאה השמאלית ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מתארים טכניקת מהדק הילארי הכוללת יישום של slipknot על הילום שמאל אשר חוסם את עורק הריאה וורידים ואת הסימפונות כדי לגרום איסכמיה חמה ואחריו reperfusion. לאחר הידוק הילארי, ניתן לקצור את הריאה השמאלית למגוון טכניקות ניסיוניות כגון היסטולוגיה, ציטומטריית זרימה, ריצוף בתפזורת או בתא בודד, ותגובת שרשרת כמותית של פולימראז. בנוסף, הדם והטחול עשויים לשמש לחקר השפעות מערכתיות, בעוד הריאה הימנית הלא איסכמית עשויה לשמש כבקרה פנימית. בפרוטוקול זה, אנו גם מתארים שיטות מפורטות להשגת מדידות ABG ו / או קביעת אקסטרווסציה של תאים.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על גילויים רלוונטיים.

תודות

עבודה זו לא קיבלה מענק ספציפי מגוף מימון כלשהו במגזר הציבורי, המסחרי או ללא כוונת רווח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>תרופות
10% תמיסת פובידון-יודAplicareNDC 52380-0126-2לחיטוי
בופרנורפין 1.3 מ"ג/מ"לפידליס בריאות בעלי חייםNDC 86084-100-30לשליטה בכאב
קרפרופןקרונוס פארמהNDC 69043-027-18לשליטה
בכאב הפרין 1000 יחידות/מ"לSagentNDC 25021-404-01להשגת דם עורקי
איזופלורן 1%-1.5%סיגמא אולדריץ'26675-46-7להרדמה
קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"לVedcoNDC 50989-996-06להרדמה
משחת עיניים Puralube VetMedi-Vet.com11897למניעת ייבוש עיניים
קסילזין 20 מ"ג/מ"לAkornNDC 59399-110-20לשליטה בכאב
<חזק>כלים ומכשירים
Argent טמפ' גבוהה עדין קצה עטMcKesson231לקרישת כלי דם
מהדק יתושים מעוקלכלים מדעיים עדינים13009-12להליך כירורגי
מלקחיים מעוקלים עדיניםכלי מדעעדין 11274-20לכירורגי נוהל
מספריים עדיניםכלי מדע עדינים15040-11להליך כירורגי
הגדרת מהדק אינטובציהFine Science Tools18374-44, 18144-30להחזקת עכבר אנכית על ידי הלשון במהלך אינטובציה. ראה איור משלים 1A. 
מחזירי צלעות מגנטייםFine Science Tools18200-01, 18200-10לנסיגה של בית החזה. יש לחבר מקבע מגנטי ומחזיר באמצעות צינורות מיקרו לטקס למטה.
סיבים אופטיים מפלסטיק בדרגה אופטית ללא מעיל, 500μ mEdmund Optics02-532כדי ליצור את המכניס לצינור האנדוטרכאלי. ראה איור משלים 1B. באורך של 1.5 אינץ' של סיב אופטי זה צריכה להיות חתיכת סרט משי מאובטחת לקצה אחד. לאחר מכן הוא יכול לשמש כמבוא לצינור האנדוטרכאלי. קצה המציג צריך להיות מעוקל מעט.
Power Pro Ultra קוצץאוסטר078400-020-001כדי לקצץ מספריים לשיער
כלים מדעיים עדינים14370-22להליך כירורגי
כרית חימום לבעלי חיים קטניםK& H Pet Productsכרית מחוממת Thermo-Peepלשמירה על נורמותרמיה
מאוורר בעלי חיים קטניםמכשיר הרווארד55-0000לאוורור (טלוויזיה 0.35 סמ"ק, PEEP 1 ס"מ H2O, RR 100-105 / min, FiO2 100%)
צינורות גומי מיקרו לטקס Spearit (1/8 בקוטר חיצוני, 1/16 בקוטר פנימי)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1לנסיגה של כריתת בית החזה
פרופיל סטטיסטי פריים טיפול קריטי מנתח גזי דםנובה ביומדיקלhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB   		לנסיגה של כריתת בית החזה
מהדק ישרFine Science Tools13008-12להליך כירורגי
מלקחיים ישריםFine Science Tools91113-10להליך כירורגי
מיקרוסקופ כירורגיWild Heerbruggכבר לא מיוצרעבור אינטובציה והליך כירורגי; ממליץ על החלפה במיקרוסקופים כירורגיים של Leica
<חזק>אספקה
½ מזרק סמ"ק עם ½ מחט אינץ' 29GMcKesson942665להזרקת קטמין/קסילזין תוך צפקית
½ מחט אינץ' 31G על מזרק טוברקולין 1 סמ"קMcKesson16-SNT1C2705לשאיבת דם עורקי מהחדר השמאלי
קטטר 1 אינץ' 20G IVTerumoSROX2025CAלצינור אנדוטרכיאלי (ETT)
משי 1 אינץ' קלטתDurapore3M ID 7100057168להדביק ETT לאף ולאבטחת גפיים
מזרק 3/10 סמ"ק עם מחט 5/16 אינץ' 31GMcKesson102-SN310C31516Pלהזרקת נוגדנים לתוך הווריד הנבוב התחתון
6-0 תפר מונופילמנט על מחט P-10McKessonS697GXלסגירת בית החזה, שכבת השריר והעור
6-0 עניבת משימראה התמחויות כירורגיותSP102ליצירת קשר למהדק הילר
אפליקטורים עם קצה כותנה מחודדSolon56225למניפולציה של ריאות ולדיסקציה קהה

מקורות

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).
  3. Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition. Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).
  4. Warnecke, G., et al. Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference . Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).
  5. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  6. Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  7. Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. Donation after circulatory death and lung transplantation. J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369(2022).
  8. Moskowitzova, K., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).
  9. Nakata, K., et al. Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung. Bioengineering (Basel). 9 (11), 673(2022).
  10. Nakata, K., et al. Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice. Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).
  11. Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse. Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).
  12. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).
  13. Zhang, X., et al. Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).
  14. Sharma, A. K., et al. Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).
  15. Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).
  16. Sayah, D. M., et al. Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).
  17. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).
  18. Hsiao, H. M. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).
  20. Zanotti, G., et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).
  21. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  22. Saito, M., et al. Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model. J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).
  23. Tanaka, S., et al. Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung. Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).
  24. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  25. Koletsis, E., et al. In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).
  26. Hermsen, R., et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation. BMC Genomics. 16 (1), 357(2015).
  27. Beck, J. A., et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).
  28. Liao, W. I., et al. A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery. J Vis Exp. (187), 64383(2022).
  29. Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis. Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).
  30. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), 62694(2021).
  31. Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. J Vis Exp. (147), 59431(2019).
  32. Welbourn, C. R., et al. Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

גלה מאמרים נוספים

סגירת השער הריאתיפגיעה בריאת עכברמעבר נויטרופילים אל מחוץ לכלי הדםגיוס תאי Bציטומטריה של זרימההליך תורקוטומיהגזים בדם העורקימודל להשתתלה בריאות
מודל מהדק הילארי ריאתי שמאלי של פגיעה באיסכמיה ריאתית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.