פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.
במאמר זה
סיכום
תקציר
דג זברה הוא אורגניזם מודל מסקרן הידוע ביכולת התחדשות הלב המרשימה שלו. חקר הלב המתכווץ in vivo חיוני להשגת תובנות לגבי שינויים מבניים ותפקודיים בתגובה לפציעות. עם זאת, השגת תמונות 4 ממדיות ברזולוציה גבוהה ובמהירות גבוהה (4D, 3D מרחבי + 1D טמפורלי) של לב דג הזברה כדי להעריך את ארכיטקטורת הלב ואת התכווצות נותר מאתגר. בהקשר זה, מיקרוסקופ אור פנימי (LSM) וניתוח חישובי מותאם אישית משמשים כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה. אסטרטגיה זו, הכוללת בניית מערכת LSM, סנכרון רטרוספקטיבי, מעקב אחר תא בודד וניתוח מכוון משתמש, מאפשרת לחקור את מבנה המיקרו ואת תפקוד ההתכווצות על פני הלב כולו ברזולוציה של תא בודד בזחלי דגי הזברה Tg (myl7:nucGFP) הטרנסגניים. בנוסף, אנו מסוגלים לשלב מיקרו-הזרקה של תרכובות מולקולות קטנות כדי לגרום לפגיעה לבבית באופן מדויק ומבוקר. בסך הכל, מסגרת זו מאפשרת לעקוב אחר שינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, כמו גם אחר המכניקה האזורית ברמת התא הבודד במהלך מורפוגנזה והתחדשות לבבית.
מבוא
דג הזברה (Danio rerio) הוא אורגניזם מודל נפוץ לחקר התפתחות הלב, הפיזיולוגיה והתיקון שלו בשל השקיפות האופטית שלו, יכולת הגמישות הגנטית שלו ויכולת ההתחדשות שלו 1,2,3,4. עם אוטם שריר הלב, בעוד שינויים מבניים ותפקודיים משפיעים על פליטת הלב והמודינמיקה, מגבלות טכניות ממשיכות לעכב את היכולת לחקור את התהליך הדינמי במהלך התחדשות הלב ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. לדוגמה, לשיטות הדמיה קונבנציונליות, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי, יש מגבלות במונחים של עומק הדמיה, רזולוציה טמפורלית או פוטוטוקסיות ללכידת השינויים הדינמיים ולהערכת תפקוד התכווצות הלב במהלך מחזורי לב מרובים5.
מיקרוסקופ יריעות אור מייצג שיטת הדמיה חדישה המטפלת בהצלחה בבעיות אלה על ידי טאטוא מהיר של הלייזר על פני חדר הלב והאטריום, השגת תמונות מפורטות עם רזולוציה מרחבית-זמנית משופרת והשפעות הלבנת אור ופוטו-רעילותזניחות 6,7,8,9,10,11.
פרוטוקול זה מציג אסטרטגיית הדמיה מקיפה הכוללת בניית מערכת LSM, שחזור תמונה 4D, מעקב אחר תאים תלת-ממדיים וניתוח אינטראקטיבי כדי ללכוד ולנתח את הדינמיקה של קרדיומיוציטים על פני הלב כולו במהלך מחזורי לב מרובים12. מערכת ההדמיה המותאמת אישית והמתודולוגיה החישובית מאפשרות לעקוב אחר מיקרו-מבנה שריר הלב ותפקוד ההתכווצות ברמת התא הבודד בזחלי זברה Tg (myl7:nucGFP) טרנסגניים. יתר על כן, תרכובות מולקולות קטנות הועברו לעוברים באמצעות מיקרו-הזרקה כדי להעריך פגיעה לבבית הנגרמת על ידי תרופות והתחדשות לאחר מכן. אסטרטגיה הוליסטית זו מספקת נקודת כניסה לחקר התכונות המבניות, התפקודיות והמכניות של שריר הלב ברמת התא הבודד במהלך התפתחות הלב והתחדשותו.
פרוטוקול
אישור למחקר זה ניתן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת טקסס בדאלאס, תחת פרוטוקול מספר #20-07. Tg(myl7:nucGFP) זחלי זברה טרנסגניים12 שימשו במחקר הנוכחי. כל איסוף הנתונים ועיבוד התמונה לאחר מכן בוצעו באמצעות תוכנות קוד פתוח או פלטפורמות עם רישיונות מחקר או חינוך. המשאבים זמינים מהמחברים על פי בקשה סבירה.
1. גידול דגי זברה ומיקרו-הזרקה של עוברים
תזמון: יומיים
- לשמור ולגדל דגי זברה בוגרים באמצעות טיפול סטנדרטי ונהלי גזע. לקבלת שיטות מפורטות, עיין בדוח הקודם13.
- בצע מיקרו-הזרקה בהתאם לפרוטוקולשנקבע 14. במחקר הנוכחי, מיקרו-הזרקה בוצעה בשלב 1-2 תאים (זיגוטה).
הערה: חיוני לזהות במדויק שלב זה למיקרו-הזרקה יעילה ולהבטיח עקביות התפתחותית. בשלב החד-תאי נוצרת כיפה קטנה על גבי החלמון, ושלב זה נמשך בדרך כלל כ-12 דקות. עם ההתקדמות לשלב הדו-תאי נראות שתי כיפות סמוכות, ושלב זה נמשך כ-45 דקות לאחר ההפריה15. מידע מפורט יותר על בניית המערכת ניתן למצוא בדוחות או פרוטוקולים אחרים 12,16,17.
2. הכנה והרכבה של עוברי דגי זברה/זחלים
תזמון: 7 ימים
- החזרת עוברים יום אחד לאחר ההפריה (dpf) למים E3 עם 0.2 mM 1-Phenyl-2-thiourea (PTU) (ראה טבלת חומרים) כדי למנוע היווצרות פיגמנטים.
- החלף את המדיום במי E3 טריים ב-PTU מדי יום עד להדמיית LSM.
- צלם עוברים או זחלים במיקרוסקופ סטריאו כדי לתעד את התפתחותם בנקודות הזמן הרצויות בין 0 ל -7 dpf.
- הכינו צינורות אתילן פרופילן פלואורי מקוטע (FEP) בקוטר פנימי של 2 מ"מ להטמעת זחלי דגי זברה תחת מערכת LSM12.
הערה: צינור FEP משמש לאבטחת הדגימה באמצעות חומרים התואמים לאינדקס השבירה הדומים מאוד למדיום שמסביב, כגון מים. - החל מ-3 dpf, העבירו דגים לתמיסת טריקאין (MS-222) במינון 150 מ"ג/ליטר (ראו טבלת חומרים) כדי לשתק דגים לפני ההדמיה.
- הכינו אגרוז בעל המסה נמוכה 0.8% עם טריקאין במינון 150 מ"ג/ליטר והשתמשו בפיפטת העברה כדי להעביר דגים מורדמים לאגרוז לאחר שהתקרר לטמפרטורת החדר18.
- השתמשו בפיפטת העברה נוספת כדי להרכיב את הדג עם אגרוז בצינורות FEP (איור 1).
הערה: כדי לוודא את הלחץ המינימלי בעוברים המתפתחים, נערכו בדיקות לפני ואחרי קיבוע של פעילות הלב, כגון קצב הלב, תחת תצפית מיקרוסקופית. הערכות אלה נועדו לזהות הבדלים משמעותיים לפני ואחרי הרדמת טריקאין. בדיקה נוספת של העור והשרירים לאיתור אי סדירות במבנה הלב, כגון בצקת, יכולה להתבצע גם לאחר הקיבוע. ריכוז הטריקאין ממלא תפקיד מכריע גם בדימות לב19, ולכן תמיסת טריקאין בריכוז 150 מ"ג/ליטר נוצלה להדמיית התכווצות בזחלי דגי זברה בפרויקט זה. בעוד שהסנכרון הרטרוספקטיבי הנוכחי מאפשר לנו לטפל בפעימות לב לא סדירות20, פתרון מקיף להדמיה 4D של הפרעות קצב לב והדמיה ארוכת טווח בדגי זברה עדיין נמצא בפיתוח.
3. הגדרה ותצורה של מערכת הדמיה של גיליון אור
תזמון: 3-14 ימים
- בנה מערכת LSM פנימית המבוססת על עדשה גלילית באמצעות מערכות לייזר במצב מוצק שאוב דיודה רציפה (DPSS) באורכי גל ספציפיים כגון 473 ננומטר ו-532 ננומטר כמקורות הארה (איור 2A).
- התאם אישית קודי בקרה של LabVIEW (ראה רשימת חומרים) לסנכרון של שלב דגימה תרגומית, תאורת גיליון אור וחשיפה של מצלמת sCMOS כדי ללכוד רצפי תמונות.
הערה: מידע מפורט יותר על בניית המערכת ניתן למצוא בדוחות או פרוטוקולים אחרים 12,16,17. אנו מעודדים קבוצות מחקר לחפש הזדמנויות לשיתוף פעולה עם מעבדות בעלות מומחיות מבוססת בדימות אופטי במהלך בניית המערכת.
4. הכנת הדמיה של דגי זברה ואיסוף נתונים
תזמון: יום 1
- כיול הרזולוציה המרחבית של מערכת LSM ומזעור שונות האטימות בעומקים משתנים על ידי מדידת חרוזים פלואורסצנטיים.
- ראשית, לדלל חרוזים פלואורסצנטיים (ראה טבלת חומרים) בקוטר של 0.53 מיקרומטר לריכוז של 1: 1.5 x 105 באמצעות אגרוז 0.8% נמס נמוך ולהעביר את התמיסה לצינור FEP מקוטע.
- שנית, השתמש במערכת LSM כדי לצלם את החרוזים ולמדוד את פונקציית פיזור הנקודות (PSF) על פני הדגימה כולה, תוך אימות הרזולוציה המרחבית ויישור המערכת12.
הערה: במערכת זו, ניתוח התוצאות המייצגות עבור רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) מציין רזולוציות רוחביות וציריות של 1.26 ± 0.15 ו- 2.48 ± 0.15 מיקרומטר (n = 60 חרוזים), בהתאמה. הדבר מצביע על רזולוציה מרחבית עקבית לאורך כל עומק ההדמיה.
- חברו היטב את צינור ה-FEP עם זחלי דגי הזברה הרכובים היטב לשלב הדגימה הממונע בעל 6 הצירים (x, y, z, pitch, yaw ו-roll), והטביעו את הצינורות בתא הדגימה המלא במים E3. כדי למנוע פיזור אור על-ידי שק החלמון ולאתר טוב יותר את מיקום הלב, סובבו את זחל דג הזברה כדי לצלם תמונה מהצד הגחוני (איור 2B). במקרה הזה, רוב התמונות שצולמו כללו גם את החדר וגם את האטריום (איור 2C).
הערה: בהתחשב בכך שהליכי ההדמיה הנוכחיים נמשכו בדרך כלל פחות משעה לכל דג ונערכו בסביבה מבוקרת של טמפרטורת החדר, בקרת טמפרטורת התא וויסות רמת החמצן נחשבים אופציונליים עבור פרויקט זה. עם זאת, עבור מחקרי הדמיה ארוכי טווח בהילוך מהיר, במיוחד אלה המתמקדים בתהליכים התפתחותיים, מומלץ ניטור טמפרטורה מתמשך וויסות ב -27 מעלות צלזיוס בתוך תא הדגימה כדי להבטיח את הסביבה הפיזיולוגית של דגי הזברה ולמנוע הפרעות התפתחותיות פוטנציאליות. - חבר את שלב הדגימה הממונע לתחנת העבודה והגדר את כל הפרמטרים הדרושים, כולל מצב התנועה הרצוי.
- צור חיבור בין מצלמת sCMOS לתחנת העבודה. התאם את כל ההגדרות החיוניות, כגון זמן חשיפה של 5 אלפיות השנייה ואזור העניין הרצוי.
- הגדר את מספר רצפי התמונות והמסגרות בתוכנית הבקרה LabVIEW המותאמת אישית.
- הפעל את הלייזר והתחל הדמיית LSM של הדגימה. שמרו על התהליך עד שכל רצפי התמונות יוקלטו בהצלחה.
- הקלט 300 פריימים כרצף תמונות דו-ממדי כדי לכסות 3-5 מחזורי לב של הזחל עם קצב פריימים של 200 פריימים לשנייה. ההקלטה לוכדת את התכווצות הלב במישור הסלקטיבי המואר על ידי יריעת האור.
- הזיזו את הזחל בגודל צעד של 1 מיקרומטר על פני תאורת גיליון האור כדי לחתוך את הדגימה באופן וירטואלי.
הערה: יש להגדיר את גודל השלב של שלב הדגימה בהתבסס על הרזולוציה הצירית של מערכת יריעות האור, בהתאם למשפט הדגימה של ניקוויסט-שאנון12. - חזור על שלב 7 כדי להקליט רצף תמונות נוסף של פרוסת הדגימה החדשה עד שכל הלב יכסה. באופן כללי, 100-200 רצפי תמונות בגודל צעד אחד מבטיחים כיסוי של כל הלב של זחל דג זברה (איור 2D).
הערה: שלבים 4.7-4.9 נשלטים על-ידי תוכנית LabVIEW ומבוצעים באופן אוטומטי על-ידי מערכת LSM (איור 3). בהתחשב בנפח הגדול של נתוני התמונה שנוצרו, מוסכמה סטנדרטית למתן שמות מומלצת עבור רצפי תמונות. לדוגמה, הקצו תיקיות עם שמות כגון "z-1", "z-2" וכו', כדי לסווג נתונים בין רצפי תמונות שונים. בתוך כל רצף, התמונות צריכות להיקרא ברצף (למשל, "1", "2", ...) כדי לציין נקודות זמן נפרדות. הזמן הכולל להרכבת דגים, התאמת זווית ההדמיה ואיסוף כל הנתונים עבור זחל דג זברה אחד הוא כשעה.
5. שחזור תמונה 4D עם חישוב מקבילי
תזמון: יום 1
הערה: אלגוריתם השחזור ה-4D שפותח על-ידי הקבוצה שלנו ונתוני המדגם נגישים לציבור21. שיטה זו מאפשרת לשחזר את תמונת הלב הארבע-ממדית מתוך רצפי התמונות שנאספו בשלבים קודמים (טבלה 1).
- פתחו את הקובץ test_Parallel.מ ב-MATLAB (ראו טבלת חומרים). ציין את מיקום התיקייה שבה מאוחסנים רצפי התמונות הגולמיים במשתנה "baseDir".
- הקצה את המשתנה "numOfSlice" עם המספר הכולל של רצפי תמונות (בדרך כלל 100-150) ואת המשתנה "numOfImage" עם מספר התמונות (בדרך כלל 300-500) בכל רצף.
- בדוק את רצף התמונות המציג את המישור האמצעי של לב דג הזברה (לדוגמה, רצף51 st מתוך 101 רצפים בסך הכל). זהה את מספרי המסגרות של הסיסטולים הראשון והרביעי ברצף זה והקצה אותם למשתנים systolicPoint_1st ו- systolicPoint_4th.
- לחץ על הפעל כדי להתחיל בתהליך.
הערה: אורך מחזור הלב בכל רצף תמונות יזוהה תחילה על ידי תוכנית MATLAB באמצעות השוואה של הדמיון (סכום ההבדלים בריבוע) בין תמונות בנקודות זמן שונות. לאחר מכן, מחזור הלב יוערך באמצעות הממוצע של אורכי המחזור מכל רצפי התמונות. לאחר מכן, נקודות ההתחלה של רצפי תמונות במיקומים ציריים שונים ייושרו על ידי התוכנית באמצעות השוואה איטרטיבית של דמיון התמונה מרצף התמונות הראשון לרצף התמונה האחרון. - בדוק את התוצאות בתיקיית הפלט. התוכנית תשמור את התמונות כמו ".tif" קבצים עם חותמות זמן. כל קובץ ".tif" הוא תמונת לב תלת-ממדית בנקודת זמן מסוימת. מרווח הזמן בין שתי תמונות תלת-ממדיות שווה לזמן החשיפה שנקבע.
הערה: שחזר את התמונות שנרכשו מהשלבים הקודמים כדי לתאר את התכווצויות הלב הארבע-ממדיות (3D מרחביות + 1D טמפורליות). כדי לשפר את המיומנות בחקירות בעלות תפוקה גבוהה במהלך הסנכרון הרטרוספקטיבי, גישה זו מאפשרת פעולות חישוביות בו-זמניות על GPU על ידי מינוף ליבות CPU מרובות דרך ארגז הכלים של המחשוב המקבילי MATLAB והפיכת תמונות לפורמט gpuArray.
6. 3D פילוח תאים ומעקב אחר תאים
תזמון: יום 1
- הורד את חבילת 3DeeCellTracker (ראה טבלת חומרים) והגדר את סביבת Python22.
- הורד את תוכנת הביאור ITK-SNAP23 (ראה טבלת חומרים) והשתמש בה כדי לתייג ידנית את תמונת הלב התלת-ממדית בשתי נקודות זמן נבחרות, האחת בדיאסטולה החדרית והשנייה בסיסטולה החדרית, כדי ליצור את ערכות נתוני האימון והתיקוף.
הערה: ייתכן שתוכנות אחרות לעיצוב תוויות ישימות גם כן. - ב- Python, הפעל את תוכנית האימונים 3DeeCellTracker ואתחל את פרמטרי noise_level(100 במקרה זה), folder_path והמודל בפונקציה TrainingUNet3D כדי להגדיר את מודל U-Net התלת-ממדי שהוגדר מראש.
- ב- MATLAB, השתמש בתוכנית imageDimConverter.m כדי להמיר ולשנות את שם ערכת נתוני ההדרכה והאימות לתבנית המתאימה לטעינה.
- ב- Python, טען את ערכות נתוני האימון והאימות באמצעות פונקציות trainer.load_dataset() ו- trainer.draw_dataset().
- ב- Python, הפעל את החלק הראשון של תוכנית המעקב 3DeeCellTracker ואתחל את הפרמטרים.
הערה: זה כולל הגדרת פרמטרים של תמונה כדי לאפיין את ממדי התמונה, פרמטרי סגמנטציה לבחירת מודל למידת המכונה המיושם עבור פילוח תאים, ופרמטרי מעקב לבחירת מודלים של רשתות עצביות עמוקות שהוכשרו מראש המשמשים לרישום תאים. לראשונה מומלץ להשתמש במודל U-Net לסגמנטציה של תאים ובמודל FFN+ PR-GLS לרישום תאים. יש צורך לאחסן נתונים, מודלים ותוצאות בתיקיות שייווצרו באופן אוטומטי בשלב זה. - ב- MATLAB, השתמש בתוכנית imageDimConverter.m כדי להמיר ולשנות את כל תמונות הלב התלת-ממדיות לפורמט הנכון ולהעביר אותן לתיקיית הנתונים שנוצרה בשלב האחרון.
- ב- Python, הפעל את החלק השני של תוכנית 3DeeCellTracker כדי להתחיל סגמנטציה.
- לאחר פילוח התמונה התלת-ממדית הראשונה, השוו את תוצאת הפילוח לתמונה הגולמית, ובצעו תיקון ידני אם נמצא פילוח שגוי. העבר את הפילוח המתוקן לתיקייה "/manual_vol1" שנוצרה.
- ב- Python, הפעל את החלק השלישי של תוכנית 3DeeCellTracker כדי לפלח את כל התמונות.
- השתמש ב- Amira (ראה רשימת חומרים) כדי לבצע הערכה חזותית של תוצאות מעקב על-ידי השוואת המיקומים של תאים במעקב עם התמונות הגולמיות התואמות שלהם. אם תוצאות הבדיקה אינן מספקות, התחל מחדש את ההליך משלב 6.6, השתמש במודל חלופי של למידת מכונה עבור סגמנטציה או רישום תאים, ולאחר מכן התחל מחדש את תהליך המעקב.
הערה: לאחר הפילוח, הנתונים של תוויות תאים מאוחסנים כתמונה של 8 סיביות (0 עד 255) כברירת מחדל, כלומר רק 256 קני מידה מסופקים כתוויות לסיווג תאים. ישנם שני פתרונות לטיפול בבעיה זו כאשר יש צורך בכיתות נוספות. פתרון אחד הוא להגדיר את פורמט הנתונים של תוויות תאים כתמונה של 16 סיביות בתוכנית המעקב, מה שיגרום לעלייה אקספוננציאלית בזמן העיבוד, יותר מיומיים במקרה הנוכחי. הפתרון השני הוא להשתמש בתוכנית "separateTrackingResults.py" כדי לעבד את תוויות התא לאחר מכן, אשר יפריד תאים עם אותן תוויות בהתבסס על מיקומם הפיזי ויקצה לכל תא תווית שונה. תהליך זה לוקח בערך 10 דקות במקרה זה.
7. ניתוח התכווצות הלב במצב מציאות מדומה
תזמון: יום 1
- השג את תוצאת המעקב אחר תאים משלבים קודמים.
- אמת ידנית את הנתונים ובחר תאים בעלי עוצמת תמונה עקבית בכל אמצעי האחסון (כ- 500 תאים מתוך כ- 600).
- השתמש בקובץ script21 של cellLabelsToObj.ipynb כדי ליצור רשת שינוי של פני השטח עבור כל תא בודד באמצעות תוכנת 3D Slicer24 (ראה רשימת חומרים) והקצה קוד צבע ייחודי לכל תא.
- יצא כל מודל תלת-ממדי, המורכב מכל התאים בנקודת זמן אחת, כקובץ .obj יחיד המורכב מתתי אובייקטים מרובים המלווים בקובץ .mtl כדי לתאר את תווית התא.
- לייבא את המודלים ליוניטי באמצעות הרישיון החינוכי, מנוע פיתוח המשמש למציאות מורחבת.
- החל את הסקריפטים המותאמים אישית המורכבים מפונקציות שנכתבו ב- C# על המודלים ורכיבי ממשק המשתמש כדי לאפשר הדמיה 4D וניתוח אינטראקטיבי. בצע אינטראקציית VR לאחר שלב 7.7.
- אינטראקציה עם מודלים במציאות מדומה (VR) באמצעות הפונקציות הבאות (איור 4):
- בחירת תא: בחר עד שני תאים בכל פעם והצג את המסלולים, המהירויות, אמצעי האחסון, שטחי הפנים והמרחקים היחסיים שלהם.
- בחירת נקודת זמן: בחר נקודת זמן ספציפית בנתונים כדי לנתח את הפלט של התאים שנבחרו, כגון ב- t = 0 אלפיות השנייה במהלך הדיאסטולה, או ב- t = 200 אלפיות השנייה במהלך הסיסטולה.
- השהיית זמן: הקפא את המודל הדינמי כדי להתמקד בתאים שנבחרו ובפלט שלהם.
- ניגודיות: מווסת את הניגודיות בין התאים שנבחרו לבין התאים הסובבים אותם במודל.
תוצאות
הפרוטוקול הנוכחי מורכב משלושה שלבים עיקריים: הכנה ומיקרו-הזרקה של דגי זברה, הדמיה של יריעות אור ושחזור תמונה 4D, ומעקב אחר תאים ואינטראקציית VR. דגי זברה בוגרים הורשו להזדווג, הביציות המופרות נאספו וביצעו מיקרו-הזרקה לפי הצורך עבור הניסויים המוצעים (איור 1). שלב זה מספק נקודת כניסה לחקור יישומים של דגי זברה בחקירת התפתחות והתחדשות הלב, והוא גם ממלא תפקיד מכריע בהדמיה ובניתוח הבאים. הלב המתכווץ צולם בשלבים שונים (מ-3 dpf עד 7 dpf) באמצעות מערכת LSM שנבנתה בהתאמה אישית, ויישר את רצפי התמונות לאורך ציר z כדי לשחזר את מודל הלב של דג הזברה ה-4D (איור 2 ואיור 3). מודלים אלה מספקים בסיס לאפיונים פנוטיפיים עמוקים והם מרכזיים בחשיפת הדינמיקה של המורפולוגיה והתפקוד של הלב על פני צירי זמן התפתחותיים. התאים הבודדים בלב דג הזברה היו במעקב והתנועה והאינטראקציה שלהם כומתו באמצעות פלטפורמת VR מותאמת אישית. שינויי המהירות והמרחק היחסי של תאים נבחרים הושוו גם במהלך מחזור לב אחד באטריום ובחדר כדי להעריך התכווצות אזורית ולחקור מאמץ מקומי (איור 4). הזן האזורי נקבע על סמך השונות בתזוזה בין שני תאי שריר לב סמוכים באזור המעניין. קיצור השברים (FS) ושבר הפליטה (EF) נאמדו באמצעות מתודולוגיות המתוארות בספרות שפורסמה25. המשוואות עבור FS ו- EF הן כדלקמן:
כאשר Dd ו-Ds הם קוטר החדר (ציר קצר, הנמדד על ידי מרחקים בין תאי חדר שונים) בשלב הדיאסטולי הסופי ובשלב הסיסטולי הקצה, בהתאמה, ו-Vd ו-Vs הם נפחי החדרים (המחושבים לפי קוטר ציר ארוך וקצר של החדר) בשלב הדיאסטולי הסופי והקצה הסיסטולי, בהתאמה.
יחד, תוצאות אלה מציגות אסטרטגיה חדשה המשלבת הן פיזיולוגיה והן הנדסה כדי להקל על הדמיה נפחית ופענוח נתונים במודלים של דגי זברה, וטומנת בחובה הבטחה גדולה לקידום חקר מורפוגנזה ומכניקה של הלב.
איור 1: איסוף ביצי זברה ותהליך מיקרו-הזרקה. התהליך כולל הזדווגות של דגי זברה בוגרים, איסוף ביציות מופרות וביצוע מיקרו-הזרקה אופציונלית. במהלך מיקרו-הזרקה, פיפטת הזכוכית שנמשכה מראש עמוסה בחומרים הרצויים. ביצים מופרות מיושרות בשורות ישרות בתוך חרכי תבנית אגרוז וממוקמות בניצב למחט. המיקרו-הזרקה מתבצעת תחת התבוננות מיקרוסקופית מתמדת הן של הביצים והן של קצה המחט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליך הדמיה של גיליון אור ושחזור תמונה 4D. (A) סכמה של מבנה מערכת ההדמיה הפנימית של יריעות אור. CL: עדשה גלילית. EO: מטרת עירור. עשה: מטרת זיהוי. TL: עדשת צינור. FL: מסנן. CAM: מצלמת sCMOS. (B) סכמטי של דג זברה המותקן בצינור FEP ומוטבע על ידי אגרוז. (C) רצף תמונות דו-ממדי גולמי שצולם מזחל של 4 דגי זברה dpf. השעון בפינה השמאלית העליונה של כל מסגרת מציין את השלב הלבבי החל מסיסטולה סופית. (D) איור של סנכרון רטרוספקטיבי לרישום תמונה של דגי זברה 4D. רצף תמונות מציין הקלטה רציפה בעומק מסוים לאורך ציר z. כל מסגרת ברצף התמונות מיוצגת על-ידי נקודה אדומה, ושלבי ההתחלה והסיום מדיאסטולה סופית לסיסטולת קצה מסומנים בתיבה הצהובה. (E) מודלים משוחזרים של לב ב-4D מתוך רצפי התמונות הדו-ממדיים. Dpf: ימים לאחר ההפריה. נתון זה נלקח מ- Zhang et al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: לוח הבקרה LabVIEW. (A) ההגדרות המשמשות בלוח הבקרה מקיפות את תצורת הלייזר, המצלמה, נתיב התמונה ותבנית המנוע. (B) דוגמה לתמונת לב של דג זברה גולמי שצולמה על-ידי תוכנית LabVIEW. סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מעקב אחר תאים ואינטראקציה עם מציאות מדומה מסייעים בחשיפת התכווצות הלב של דגי הזברה. (A) תאים במעקב של Tg (myl7:nucGFP) לב דג זברה ב 3 dpf. (B) פלטפורמת המציאות המדומה מספקת למשתמשים צפייה סוחפת וחוויה אינטראקטיבית של מודל לב דג זברה 4D, המאפשר לדמיין את תפקוד הלב לאורך זמן באמצעות ניתוח המוגדר על ידי המשתמש. (C) לאחר איסוף מדידות מפלטפורמת VR, הושוו שינויי מהירות ומרחק יחסי במהלך מחזור לב אחד בין תאים נבחרים ב- 3 dpf ו- 7 dpf. שני האיורים הראשונים מציגים את שינויי המהירות הממוצעת בחמישה תאים חדריים ובחמישה תאי פרוזדורים, והאחרים ממחישים את שינויי המרחק היחסי בין שלוש קבוצות תאים, כלומר שני תאי חדר, תא חדרי, תא פרוזדורי ושני תאי פרוזדורים. (D) הערכות תפקודי לב של 3 dpf ו-7 dpf לבבות דגי זברה. בסך הכל 370 תאים היו במעקב בלבבות דגי זברה ב 3 dpf, ו 580 תאים היו במעקב ב 7 dpf. נתון זה נלקח מ- Zhang et al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | שימוש | המזהה | |
| תוכניות ואלגוריתמים מותאמים אישית | |||
| PSF.m | כדי לחשב PSF ממדידות FWHM תוצאות של חרוזים פלואורסצנטיים. | תוכנית MATLAB | |
| דג זברה 4D Imaging.vi | כדי לשלוט ולסנכרן את החומרה במערכת LSM. | תוכנית LabVIEW | |
| test_Parallel.מ וכו'. | כדי לבנות מחדש תמונות 4D מרצפי תמונות דו-ממדיים. | תוכנית MATLAB | |
| imageDimConverter.m | כדי להסתיר נתוני תמונה לתבנית שצוינה למעקב אחר תאים. | תוכנית MATLAB | |
| separateTrackingResults.py | כדי לפרסם תוצאות מעקב אחר תאי תהליך להפרדת תאים באמצעות אותן תוויות. | תוכנית Python | |
| cellTracking_All.py | כדי לבחור תאים בעלי עוצמת תמונה עקבית בכל אמצעי האחסון. | תוכנית Python | |
| cellLabelsToObj.ipynb | ליצירת רשת שינוי של פני השטח לכל תא בודד באמצעות כלי פריסה תלת-ממדי. | תוכנית Python | |
| DynamicHeartModel.cs וכו'. | כדי ליצור סביבת VR ולקיים אינטראקציה עם אובייקטים. | תוכנית C# | |
| תכנון חומרה מותאם אישית | |||
| תא מדגם מודפס בתלת-ממד | לשימוש עם מטרות טבילה במים. | עיצוב SolidWorks | |
| מחזיק לדוגמה מודפס בתלת-ממד | כדי להתאים לשלב הדגימה ולהחזיק את הדגימה. | עיצוב SolidWorks | |
טבלה 1: טבלת משאבים מותאמת אישית. הקודים והנתונים לדוגמה מועלים ל-Zenodo21.
דיון
השילוב של מודל דג הזברה עם שיטות הנדסיות טומן בחובו פוטנציאל עצום לחקר in vivo של אוטם שריר הלב, הפרעות קצב ומומי לב מולדים. תוך מינוף השקיפות האופטית, יכולת ההתחדשות והדמיון הגנטי והפיזיולוגי לבני אדם, עוברים וזחלים של דגי זברה הפכו בשימוש נרחב במחקר 1,2,4. הרזולוציה המרחבית-טמפורלית המעולה, נזקי האור המינימליים ויכולות החתך האופטי של דימות יריעות אור מייחדים אותו לחקירה 4D של מורפולוגיה לבבית ותפקוד התכווצות בזחלי זברה 12,26,27,28. פרוטוקול זה מציג גישה מקיפה המשלבת הדמיה של יריעות אור, סנכרון רטרוספקטיבי, מעקב אחר תאים תלת-ממדיים ופלטפורמת מציאות מדומה אינטראקטיבית (VR) להערכות כמותיות. הוא מספק נקודת כניסה ללכוד ולשחזר את התכווצות הלב, לעקוב ולכמת את הדינמיקה התאית, ולהעריך את השינויים המבניים, התפקודיים והמכניים במהלך התפתחות הלב והתחדשותו. שיטה זו יכולה גם להיות מועצמת על ידי הדמיה פלואורסצנטית רב-ערוצית כדי לעקוב אחר סוגי תאים שונים ושושלות לחקר הטרוגניות תאית ואינטראקציה בין-תאית. בעוד הדיכוטומיה של מודל דגי הזברה ממערכות יונקים והגבלתו כמודל אקוטי מצדיקות בחינה זהירה, התקדמות בהנדסה גנטית עשויה לאפשר פיתוח קווי דגי זברה טרנסגניים הדומים יותר למצבי מחלה אנושיים, ובכך לשפר את הערך התרגומי של ממצאים הנגזרים ממחקרי דגי זברה29.
סנכרון רטרוספקטיבי זה, המבוסס על ההנחה של מחזור לב מחזורי, משמש לשחזור תמונות יריעת האור של לב דג הזברה המתכווץ. יישום שיטה זו בהדמיה של יריעות אור מאפשר לדמיין ולנתח את הלב המתכווץ ביותר מ-200 נפחים בשנייה. כדי להתמודד עם האתגר שמציב נפח הנתונים הגדול בניתוח הנוכחי, נעשה שימוש בחישוב מקבילי עם מעבד מרובה ליבות ומעבד גרפי, וכתוצאה מכך שיפור של יותר מפי עשרה ביעילות שחזור התמונה. במהלך הסנכרון הרטרוספקטיבי, ההנחה הייתה שהקרדיומיוציטים חוזרים למיקומם הבסיסי עם כל פעימת לב. בעוד שההנחה הזו בטוחה יחסית בהתחשב בשונות הנמוכה בפעימות הלב שנצפתה בדגי זברה26 כפי שהיא מודגמת באיור 4C, היא עדיין פישוט שעשוי שלא להסביר את כל הניואנסים הביולוגיים. חידושים בהדמיה, כגון פלואורסצנטיות דחוסה ומיקרוסקופ שדה אור, יכולים למתן את ההשפעות הנובעות מהנחה זו על ידי הפחתת יתירות הפרוסה.
כדי לאפשר ניתוח מעמיק במודל הלב המורכב של 4D, פותחה מסגרת חישובית הכוללת הן פילוח תאים מבוסס 3DeeCellTracker והן פלטפורמת VR לחקירות מכוונות משתמש. היכולות הטבועות במסגרת זו, כולל יעילות גבוהה ומניפולציה אינטראקטיבית, מאפשרות לכמת את השינוי במהירות התא, לחקור את האינטראקציות בין התא ולהעריך את מכניקת שריר הלב האזורית והעולמית כגון קיצור שברים, מקטע פליטה וזןאזורי 30 (איור 4). היעדר הערכות קודמות של תפקוד הלב של דגי זברה ב 7 dpf בספרות הקיימת הוא ציין. עם זאת, בהשוואה לנתונים ב 3 dpf שסופקו על ידי חוקרים אחרים, התוצאות הנוכחיות עקביות עם אינדיקציות קודמות של ירידה הן במקטע פליטה (EF) והן בקיצור שברים (FS) במהלך המרווח מ 3 dpf ל 7 dpf25,31. שיטות אנליטיות אלה הן בעלות פוטנציאל משמעותי להבהרת דינמיקה לבבית בדגי זברה מודלים של פגיעה לבבית12,25.
מכיוון שטכנולוגיית VR ותוכנה מכילות תכונות ייחודיות כגון ראייה סטריאוסקופית ורישום אוטומטי של מיקומי תאים, פלטפורמה זו מאפשרת שיטה מקיפה ויעילה לבחירת תאים ספציפיים וניתוח מסלולם לאורך מחזור הלב. השימוש במציאות מדומה מספק דרך אינטואיטיבית לביצוע משימות מורכבות כגון פילוח תאים וביאור, ביעילות ודיוק גדולים יותר 32,33,34. הוא גם תומך במספר משתמשים לשימוש בכלים ייחודיים בעת עבודה משותפת על מערכי נתונים גדולים ומסובכים34. למרות ששימוש ממושך במציאות מדומה עלול לגרום לתופעות לוואי כמו סחרחורת, ניתן למתן זאת על ידי עיצובים ארגונומיים משופרים ואוזניות לא קשורות. יתר על כן, כדי להתמודד עם הכוח החישובי הרב הנדרש לעיבוד מבנים ביולוגיים מורכבים בזמן אמת, אופטימיזציה של תוכנה לעיבוד מיידי ומינוף פתרונות מחשוב מבוססי ענן יכולה לשפר את יכולתה של המערכת לנהל הדמיות מורכבות.
עם התקדמות התקני חומרה וכוח חישוב, ניתן להרחיב אסטרטגיה זו כדי לחקור הפרעות קצב לב בשריר הלב הן ברמה התאית והן ברמת הרקמות, ובסופו של דבר להחזיק את הפוטנציאל לפענח את המנגנון הבסיסי של מורפוגנזה לבבית ולקדם את הפיתוח של התערבויות טיפוליות.
גילויים
למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.
תודות
אנו מביעים את תודתנו לד"ר קרוליין ברנס מבית החולים לילדים בבוסטון על כך שחלקה בנדיבות את דג הזברה המהונדס. אנו מודים לגב' אליזבת איבנז על עזרתה בגידול דגי זברה ביוטה דאלאס. אנו מעריכים גם את כל ההערות הבונות המסופקות על ידי חברי החממה D ב- UT Dallas. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) ותוכנית UT Dallas STARS (Y.D).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) דג זברה טרנסגני | Burns Lab בבית החולים לילדים בבוסטון | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| תוכנה ו אלגוריתמים | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| יוניטי | יוניטי תוכנה בע"מ | 2020.3.2f1 | |
| אמירה | תרמו פישר סיינטיפיק | 2021.2 | |
| פורס תלת מימד | אנדריי פדורוב ואח'17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | פול א יושקביץ 'ואחרים 16 | 4 | |
| light-sheet system | |||
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X מטרת תאורה | Nikon | MRH00045 | |
| 20X אובייקט זיהוי | אולימפוס | 1-U2M585 | |
| מצלמת sCMOS | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| שלב XYZ ממונע | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| שלב הטיה דו-צירי | Thorlabs | GN2/M | |
| מנוע צעד סיבוב | Pololu | 1474 | |
| חרוזי פלורסנט | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS | לייזר זוהר | R471003GX | |
| 532nm DPSS | לייזר זוהר | R531003FX | |
| <חזק>מיקרו-מזרק ומשאבת ואקום | |||
| מיקרו-מזרק | WPI | PV850 | |
| משאבת ואקום | Welch | 2522B-01 | |
| פיפטות זכוכית משוכות מראש | WPI | TIP10LT | |
| קצה נימי להעמסת ג'ל | Bio-Rad | 2239912 | |
| <חזק>חומרת מציאות מדומה | |||
| VR אוזניות | Meta | Quest 2 | |
| <חזק>30 מ"ג/ליטר פתרון PTU | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 פתרון עבודה | - | ||
| <חזק>1% אגרוז< / חזק> | |||
| - אגרוז נמס נמוך | תרמו פישר | 16520050 | |
| מים נטולי יונים | - | ||
| <חזק>10 גרם / ליטר תמיסת מלאי טריקאין< / חזק> | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| מים נטולי יונים | - | ||
| נתרן ביקרבונט | S6014 | ||
| <חזק>150 מ"ג/ליטר תמיסת עבודה טריקאין | |||
| 10 גרם/ליטר תמיסת מלאי טריקאין | - | ||
| נטול יונים מים | - | -< | |
| חזק>60X E3 תמיסת מלאי | |||
| נתרן כלורי | מרכז משאבי בעלי חיים (LARC), אוניברסיטת טקסס בדאלאס | NaCl | |
| אשלגן כלורי-KCL | |||
| סידן כלוריד דיהידרט-CaCL | sub>2 x 2H2O | ||
| מגנזיום גופרתי Heptahydrate-MgSO | sub>4 x 7H2O | ||
| RO מים | - | -< | |
| חזק>1X E3 פתרון עבודה | |||
| 60X E3 פתרון מלאי | מעבדה מרכז משאבי בעלי חיים (LARC), אוניברסיטת טקסס בדאלאס | - | |
| RO מים | - | 1 | |
| % מתילן כחול (אופציונלי) | - | C16H18ClN3S |
מקורות
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244(2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15(2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227(2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828(2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278(2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112(2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , University of Oregon Press. (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115(2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J. Opt. 20 (5), 053002(2018).
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763(2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187(2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565(2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396(2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225(2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291(2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180(2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854(2022).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).
הדפסות חוזרות והרשאות
