הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התניה שונה של פחד לגרימת התנהגויות טיסה בעכברים

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66266

⸱

15 בדצמבר 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

כדי לחקור התנהגויות טיסה בהקשר של פחד, אנו מציגים פרוטוקול התניה שונה של פחד. פרוטוקול זה מבטיח שעכברים יפגינו באופן עקבי התנהגויות טיסה במהלך הצגת רמזים בהתניה של פחד.

תקציר

הביטוי המתאים של התנהגות הגנתית במצב מאיים הוא קריטי להישרדות. התיאוריה הרווחת גורסת כי התנהגות הגנתית אקטיבית, כגון קפיצה או קפיצה מהירה, מתבטאת תחת איום מיידי גבוה או איום ממשי, בעוד שהתנהגות הגנתית פסיבית, כגון קיפאון, מתבטאת כאשר האיום צפוי, אך האיום הממשמש ובא נמוך יחסית. בהתניה קלאסית של פחד, הנבדקים בדרך כלל מפגינים קיפאון כתגובה הגנתית מותנית, עם ביטוי מועט של התנהגות הגנתית פעילה ברוב המקרים. כאן, אנו מציגים הליך התניה שונה של פחד עבור עכברים כדי לצפות במעבר מקיפאון לטיסה ולהיפך, הכולל חמישה זיווגים חוזרים של גירויים מותנים (CS; טון רציף, 8 קילוהרץ, 95 dB SPL (רמות לחץ קול)) וגירויים בלתי מותנים (ארה"ב; שוק רגל, 0.9 mA, 1.0 שניות) במשך יומיים. הליך התניה שונה זה דורש מספר גדול יחסית של מפגשי התניה וימי התניה, אך אינו מחייב שוק רגלי בעוצמה גבוהה לביטוי צנוע של התנהגות טיסה. שימוש באותו הקשר להתניה ולמצגות CS בולטות הוא חיוני כדי לעורר התנהגויות טיסה. הליך התניה שונה זה של פחד הוא שיטה אמינה לצפייה בהתנהגויות הגנתיות אקטיביות בעכברים, ומספק הזדמנות להבהיר את המנגנונים והמאפיינים העדינים של התנהגויות כאלה בהקשר מפחיד.

מבוא

הבחירה הנכונה של התנהגויות הגנתיות בנסיבות מאיימות היא חיונית להישרדותם של כל בעלי החיים. התנהגויות הגנתיות עוברות בהדרגה מאחת לשנייה בהתבסס על קרבת איום, כגון המעבר בין קפיאה להתנהגות טיסה 1,2,3. דיסרגולציה של התנהגויות אלה נצפתה לעתים קרובות בהפרעות נפשיות שונות4. הפרעת דחק פוסט-טראומטית (PTSD) היא הפרעה כזו המאופיינת בהתנהגויות הגנתיות מוגזמות, כמו תגובות פאניקה לגירויים לא מאיימים4.

התניה קלאסית של פחד במכרסמים משמשת בדרך כלל כמודל ל-PTSD 5,6,7, אך מכרסמים אינם מבטאים התנהגויות מעופפות (דמויות פאניקה) במודל זה8. כתוצאה מכך, מודל התניה הפחד הקלאסי, המכונה לעתים קרובות "מודל PTSD מכרסמים", חסר תוקף פנים ל- PTSD בבני אדם, במיוחד בלכידת סימפטומים דמויי טיסה או פאניקה, שלא נחקרו היטב.

לאחרונה, מספר פרוטוקולים מתוקנים להתניה של פחד הוכיחו בהצלחה כי נבדקים מכרסמים מפגינים התנהגות תעופה במהלך הליכים אלה. לדוגמה, אסוציאציות חוזרות ונשנות של גירוי מותנה (CS) וגירוי בלתי מותנה (US) שבע פעמים ביום אפשרו לחולדות להפגין התנהגויות נועזות הדומות להתנהגויות טיסה9. בהתניות פחד שנמשכו יומיים באמצעות גירויים מורכבים סדרתיים (SCS; המורכבים מטון ואחריו רעש), עכברים החלו להראות התנהגויות טיסה במהלך חלק הרעש של מצגות SCS 10,11,12. התיאור המפורט של שיטת SCS מסופק בדוח פרוטוקול13. התניה של שלושה ימים עם SCS פעלה גם עבור חולדות כדי לגרום להתנהגויות טיסה14. עם זאת, לפרוטוקולים חדשים אלה יש כמה מגבלות. לדוגמה, השימוש בהצגת רמזים סדרתיים אינו מאפשר לשלול את השפעת הערכת הקרבה על התנהגות הגנתית. במקרה של קשר של פי שבעה של CS-US בחולדות, רוב תגובות התעופה נצפו בנקבות ולא בזכרים.

לאור שיקולים אלה, אנו מציגים פרוטוקול מותאם להתניה של פחד עבור עכברים כדי לחקור התנהגויות טיסה בהקשר מפחיד. עכברים זכרים מפגינים באופן עקבי התנהגות תעופה במהלך התניה שונה של פחד. בפרוטוקול זה, הטון הבולט משמש כ- CS במקום SCS. בנוסף, נדרש מינימום של חמישה זיווגים של CS-US ביום למשך יומיים לפחות, יחד עם הגברה של פחד על ידי ההקשר המותנה. הפרוטוקול מספק אפשרות נוספת לחקירת התנהגויות טיסה, המשלים פרוטוקולים קודמים, בהתאם למטרת המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה נערך בהתאם לעקרונות המנחים של החברה הפיזיולוגית של יפן וקיבל אישור מוועדת הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של קאנאזאווה (2021-32). כל ההליכים נערכו בהתאם להנחיות ARRIVE. עכברי C57BL/6J זכרים בוגרים (בני 3-6 חודשים) שימשו למחקר, ובעבר אושר כי עכברים אלה הציגו את התנהגויות התעופה המתוארות בכתב ידזה 15.

1. הכנת בעלי חיים

  1. עכברי בית קבוצתיים (3-4 לכלוב; נשמר בטמפרטורה של 23-27 מעלות צלזיוס; במחזור אור/חושך של 12 שעות; סיפק גישה למזון ומים) עד תחילת הניסויים.
  2. יש לשכן כל עכבר בנפרד בכלוב פרספקס (14 ס"מ × 21 ס"מ × 12 ס"מ) למשך 3 ימים לפחות לפני שיעבור את התניית הפחד השונה.

2. הגדרת הכלים/ציוד

  1. קופסת התניה של פחד (איור 1A)
    1. יש להשתמש בתא התניה לפחד (25 ס"מ × 25 ס"מ × 25 ס"מ) הסגור בקופסה מחלישת קול (67 ס"מ × 53 ס"מ × 55 ס"מ) (ראו טבלת חומרים).
    2. נדרשים שני הקשרים (A ו-B). בהקשר A, צרו פסים שחורים ולבנים על הקירות על ידי הצמדת קרטון פלסטיק לבן עם סרטים שחורים (3 ס"מ רוחב, 4 על לוח). השתמשו בלוח פלסטיק לבן וחלק לרצפה.
    3. נגבו את הקירות והרצפה עם הפטנול (1%) לפני כל מפגש.
      הערה: לא נעשה שימוש במערכת אוורור פעילה. ניקוי עם אלכוהול בסוף הפגישה מפחית את ריח הפטנול.
    4. בהקשר B, הפוך את המראה של קירות לשחור לחלוטין על-ידי הסרת הלוח המשמש בהקשר A. הרצפה היא רצפת רשת.
      הערה: לא מוצג ריח ספציפי מלבד ריח אלכוהול קל לניקוי.
    5. האר את קופסת הניסוי באמצעות דיודה פולטת אור לבנה עילית (LED, 240 לוקס) (ראה טבלת חומרים).
  2. שוקר
    1. חברו שוקר ערבול (ראו טבלת חומרים) לרצפת רשת המורכבת ממוטות נירוסטה. זה משמש כדי לספק זעזועים ברגל. עוצמת ההלם בכף הרגל נקבעה על 0.9 מיליאמפר בעקבות השיטות הנפוצות של התניה של פחד 10,11,12,13.
  3. מחולל אודיו
    1. הניחו רמקול (ראו טבלת חומרים) על התקרה. כל הגירויים האקוסטיים מועצמים.
    2. שנה וכייל דיגיטלית את המשרעת הכוללת של כל גירוי כדי להפיק רמות לחץ קול (SPL, re: 20 μ Pa) בחזית 5 ס"מ של הרמקול עם מיקרופון בגודל 1/4 אינץ'. הציגו טון רציף שפרץ דרך הדובר הזה.
      הערה: כיול רמקול הקול חיוני כדי לבחון את ההשפעה העדינה של גירוי קול על התנהגויות הגנתיות במהלך התניה שונה זו של פחד.
  4. מתמר
    1. הניחו את רצפת תא הבדיקה על מתמר (ראו טבלת חומרים) לזיהוי רטט. האות מהמתמר מועבר לכרטיס קול עם תדר דגימה של 8 קילוהרץ כדי להקליט את התנודות ההתנהגותיות.
  5. מצלמת וידאו
    1. מקם מצלמת CMOS (ראה טבלת חומרים) על התקרה כדי לעקוב אחר תנועות הנושא ולהקליט את הצליל בקופסת ההתניה.
  6. מערכת הפעלה
    1. השתמש בתוכנת קול (ראה רשימת חומרים) להפעלת צלילים או זעזועי רגל בתזמונים מתוזמנים.
      הערה: כל ממריץ זמין מסחרית יעבוד עבור זה.

3. ניסוי התנהגותי

  1. תכננו ארבעה ימים של הליכי התניה של פחד: התרגלות (יום אחד, 5 ניסויים), התניה (יומיים, 5 ניסויים כל אחד) ומפגשי בדיקה/הכחדה (יום אחד, 5 או 15 ניסויים). מרווחי הזמן בין הניסויים נעו בין 60 ל-75 שניות (איור 1B).
    הערה: רצוי לכלול עשרה נבדקים או יותר בקבוצה כדי להשיג נטיות התנהגותיות אמינות. שתיים או שלוש קבוצות נדרשות בהתאם למטרת המחקר.
    1. במהלך מפגש ההתניה, הציגו את הגירוי הבלתי מותנה (US) (1 שניות, 0.9 מיליאמפר) מיד לאחר סיום הגירוי המותנה (CS) (פרץ טון רציף, 8 קילוהרץ, 20 שניות, 95 dB SPL) כפי שמוצג באיור 1B. ספק חמישה זוגות CS-US ביום התניה.
    2. לאחר סיום שוק הרגל החמישי, השאירו את הנושא בהקשר למשך דקה אחת לפני החזרתו לכלוב הביתי. נגבו את התא ב-70% אלכוהול לניקוי לאחר כל מבחן התנהגותי.
      הערה: ניתן לשנות את עוצמת מדעי המחשב ואת עוצמת US בהתאם למטרת המחקר. דיווחים קודמים הראו כי עוצמת CS חזקה יותר מפעילה התנהגויות הגנתיות אקטיביות יותר מאשר התנהגויות רכותיותר 15. ניתן גם להאריך את ימי ההתניה.
  2. עודד התנהגויות טיסה במהלך מצגות CS בהתאם ללוח הזמנים המוזכר להלן.
    הערה: CS (95 dB SPL) ו- US (0.9 mA) משמשים בניסוי זה.
    1. ביום הראשון, חשוף את הנבדקים ל-5 ניסויים במדעי המחשב בלבד בהקשר A.
    2. בימים 2 ו-3, התנינו נבדקים עם 5 ניסויי אסוציאציה CS-US בהקשר B.
    3. ביום הרביעי, חשוף את הנבדקים ל-5 ניסויי CS בלבד למפגש ההיזכרות בהקשר B. במקרה של בדיקת הכחדת זיכרון, חשוף את הנבדקים ל-15 ניסויים במדעי המחשב בלבד.
      הערה: כדי לבדוק את יציבות הזיכרון, הארכת מפגשי ההכחדה למשך 2-3 ימים תעזור. כמו כן, בדיקת זיכרון שבוע לאחר מכן במקום ביום 4 יכולה לספק אישור נוסף ליציבות הזיכרון.

4. ניתוח התנהגויות הגנתיות

הערה: תנועת, אחוז הקפיאה ומספר הקפיצות במהלך מצגות CS מנותחים. הפרטים מתוארים להלן. אם אפשר, ניתוח בצורה כפולת סמיות יהיה טוב יותר.

  1. סנכרן את תזמוני האירועים בסרטון ואת תזמוני הגירויים (CS ו- US) באמצעות תחילת הטון שהוקלטה בסרטון.
  2. השתמש בקוד מותאם אישית כדי לחשב הן את התנועה הממוצעת והן את התנועה הכוללת של עכברים בהתבסס על ההבדל במרכז המסה של צללית הנושא בין מסגרות.
    הערה: יחידה שרירותית משמשת למדידה זו מכיוון שמהירות התנועה תלויה בקצב הדגימה של הסרט.
  3. כדי למדוד את אחוז הקיפאון, השתמש באות המתמר בזמן.
    1. אותות מתמר קדם-תהליך באמצעות מסנן מעבר פס של 20-500 הרץ.
    2. חשב את המשרעת הריבועית הממוצעת של השורש של אות המתמר בזמן עבור כל סל של 50 אלפיות השנייה.
    3. הגדר סף עבור משרעת האות כדי לזהות את תקופת חוסר התנועה. משך חוסר התנועה הוא תקופת האות הנמוכה מהסף עבור יותר מ -1 שניות.
    4. מדוד ידנית את משך ההקפאה על ידי צפייה בסרטון.
    5. התאם את סף משרעת האות להקפאה על-ידי השוואת אחוז הקפיאה שנמדד ידנית והאחוז המחושב מאות המתמר.
  4. ספור את מספר הקפיצות באופן ידני מקבצי וידאו.
    הערה: ספירת מספר החיצים תהיה שימושית גם בהערכת תגובת הטיסה.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. הגדר את המובהקות הסטטיסטית על p < 0.05.
  2. להשוואות בין מספר קבוצות ומספר גורמים, ערוך ANOVA רב-כיווני ואחריו בדיקות פוסט-הוק. אם נבדק יום מסוים בלוח הזמנים של ההתניה, בצע בדיקות השוואה מרובות או בדיקות תמורות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות שהתקבלו עם התניה שונה של פחד בעכברים זכרים (C57BL/6J; בני 3-6 חודשים) מוצגות, בהתאם ללוח הזמנים שמוצג באיור 1C. הניסוי נועד לחקור כיצד ההקשר המותנה משפיע על ביטוי התנהגויות טיסה. שתי קבוצות הוקצו: קבוצה 1 (n = 10) וקבוצה 2 (n = 10). CS (95 dB SPL) ו-US (0.9 mA) שימשו בניסוי זה.

ביום הראשון, כל העכברים נחשפו ל-5 ניסויים בגירוי מותנה (CS) בלבד בהקשר A. לאחר מכן, כל העכברים הותנו ב-5 ניסויי גירוי בלתי מותנה (US) בהקשר B בימים 2 ו-3. ביום הרביעי, קבוצה 1 חוותה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול התניה הפחד המתוקן שהוצג במאמר זה הוא שיטה יציבה לחקר התנהגויות טיסה בהקשר מפחיד. על ידי שימוש בפרוטוקול זה, מצאנו כי התנהגויות התעופה של עכברים בהקשר המפחיד מופעלות על ידי גירויים בולטים ותלויות בהקשר. המאפיינים של התנהגות הטיסה לא נחקרו היטב, שכן לא היה פרוטוקול מתאים לצפייה בהתנהגויות טיסה. פרוטוקול זה יהיה אחת השיטות המתאימות לחקר התנהגויות הגנתיות אקטיביות בהקשר מפחיד.

לאחרונה הוכנסו מספר פרוטוקולים בנוסף לפרוטוקול הנוכחי. מספר ימים של התניה עם SCS גורמים ביציבות להתנהגויות טיסה ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי KAKENHI Grants JP22K15795 (ל- T.F.), JP22K09734 (ל- N.K.), JP21K07489 (לר.י.), האוניברסיטה הרפואית של קאנאזאווה (C2022-3, D2021-4, לר.י.) וקרן נאיטו (ל- T.F).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רמקול שמעFostexFT17H
מגברSonyTA-F500
CMOS מצלמהSanwa Supply Inc.CMS-V43BK
תא מיזוג פחדPanlab SLULE116
כדורי מזוןNosanLabo MR סטנדרטי
LEDYamazenLT-B05N
מיקרופוןACOסוג 4156N
שוקר מקושקשPanlab SLULE 100-26
כרטיס קולBehringerUMC202
תוכנת סאונדSyntrillium SoftwareCool Edit 2000
מתמרPanlab S.L.U.LE 111

מקורות

  1. Fanselow, M. S., Lester, L. S. Evolution and learning. , Psychology Press. 185-212 (1988).
  2. Fanselow, M. S. Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear. Psychonomic Bulletin & Review. 1 (4), 429-438 (1994).
  3. Mobbs, D., Headley, D. B., Ding, W., Dayan, P. Space, time, and fear: Survival computations along defensive circuits. Trends in Cognitive Sciences. 24 (3), 228-241 (2020).
  4. Black, D. W., Grant, J. E. Dsm-5 guidebook: The essential companion to the diagnostic and statistical manual of mental disorders. American Psychiatric Pub. , (2014).
  5. Bienvenu, T. C., et al. The advent of fear conditioning as an animal model of post-traumatic stress disorder: Learning from the past to shape the future of ptsd research. Neuron. 109 (15), 2380-2397 (2021).
  6. Johnson, L. R., Mcguire, J., Lazarus, R., Palmer, A. A. Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of ptsd. Neuropharmacology. 62 (2), 638-646 (2012).
  7. Yehuda, R., Ledoux, J. Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding ptsd. Neuron. 56 (1), 19-32 (2007).
  8. Ledoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23 (1), 155-184 (2000).
  9. Gruene, T. M., Flick, K., Stefano, A., Shea, S. D., Shansky, R. M. Sexually divergent expression of active and passive conditioned fear responses in rats. Elife. 4, e11352(2015).
  10. Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-100 (2017).
  11. Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. Elife. 9, e53803(2020).
  12. Trott, J. M., Hoffman, A. N., Zhuravka, I., Fanselow, M. S. Conditional and unconditional components of aversively motivated freezing, flight and darting in mice. Elife. 11, e75663(2022).
  13. Borkar, C. D., Fadok, J. P. A novel pavlovian fear conditioning paradigm to study freezing and flight behavior. Journal of Visualized Experiments. 167, e61536(2021).
  14. Totty, M. S., et al. Behavioral and brain mechanisms mediating conditioned flight behavior in rats. Scientific Reports. 11 (1), 8215(2021).
  15. Furuyama, T., et al. Multiple factors contribute to flight behaviors during fear conditioning. Scientific Reports. 13 (1), 10402(2023).
  16. Cain, C. K. Avoidance problems reconsidered. Current Opinion in Behavioral Sciences. 26, 9-17 (2019).
  17. Ledoux, J. E., Moscarello, J., Sears, R., Campese, V. The birth, death and resurrection of avoidance: A reconceptualization of a troubled paradigm. Molecular Psychiatry. 22 (1), 24-36 (2017).
  18. Bouchekioua, Y., et al. Serotonin 5-ht2c receptor knockout in mice attenuates fear responses in contextual or cued but not compound context-cue fear conditioning. Translational Psychiatry. 12 (1), 58(2022).
  19. Bouchekioua, Y., Nishitani, N., Ohmura, Y. Conditioned lick suppression: Assessing contextual, cued, and context-cue compound fear responses independently of locomotor activity in mice. Bio-Protocol. 12 (23), e4568(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66266

תגיות

PTSD
התניה שונה של פחד לגרימת התנהגויות טיסה בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.