מחקר השוואתי של מטריצות קרום מרתף לתחזוקת תאי גזע אנושיים ויצירת אורגנואידים במעי

Summary

אורגנואידים הפכו לכלים רבי ערך למידול מחלות. המטריצה החוץ תאית (ECM) מנחה את גורל התא במהלך יצירת אורגנואידים, ושימוש במערכת הדומה לרקמה הטבעית יכול לשפר את דיוק המודל. מחקר זה משווה את הדור של אורגנואידי מעיים אנושיים המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע אנושיים ב- ECM שמקורו בבעלי חיים ובהידרוג'לים נטולי קסנו.

Abstract

מטריצה חוץ-תאית (ECM) ממלאת תפקיד קריטי בהתנהגות התא ובהתפתחותו. אורגנואידים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) נמצאים באור הזרקורים של תחומי מחקר רבים. עם זאת, היעדר רמזים פיזיולוגיים בחומרים קלאסיים של תרביות תאים מעכב התמיינות יעילה של iPSC. שילוב ECM זמין מסחרית בתרבית תאי גזע מספק רמזים פיזיים וכימיים מועילים לתחזוקת התא. מוצרי ממברנות מרתף מסחריות שמקורם בבעלי חיים מורכבים מחלבוני ECM וגורמי גדילה התומכים בתחזוקת התא. מכיוון של-ECM יש תכונות ספציפיות לרקמות שיכולות לווסת את גורל התא, משתמשים במטריצות נטולות קסנו כדי להזרים תרגום למחקרים קליניים. בעוד שמטריצות זמינות מסחרית נמצאות בשימוש נרחב בעבודות hiPSC ואורגנואידים, השקילות של מטריצות אלה עדיין לא הוערכה. כאן נערך מחקר השוואתי של תחזוקת hiPSC ויצירת אורגנואידים במעיים אנושיים (hIO) בארבע מטריצות שונות: מטריג'ל (מטריקס 1-AB), גלטרקס (מטריקס 2-AB), קולטרקס (מטריקס 3-AB) וויטרוג'ל (מטריקס 4-XF). למרות שהמושבות חסרו צורה עגולה מושלמת, הייתה התמיינות ספונטנית מינימלית, כאשר מעל 85% מהתאים ביטאו את סמן תאי הגזע SSEA-4. מטריקס 4-XF הוביל להיווצרות גושים עגולים תלת ממדיים. כמו כן, הגדלת ריכוז תוספי התזונה וגורמי הגדילה במדיה המשמשת לייצור תמיסת ההידרוג'ל Matrix 4-XF שיפרה את ביטוי hiPSC של SSEA-4 פי 1.3. התמיינות של hiPSC מתוחזק על ידי מטריקס 2-AB הובילה לפחות שחרור ספרואידים בשלב האמצע/בטן אחורית בהשוואה לקרומי מרתף אחרים שמקורם בבעלי חיים. בהשוואה לאחרים, מטריצת אורגנואידים נטולי קסנו (Matrix 4-O3) מובילה ל-hIO גדול ובשל יותר, מה שמרמז על כך שניתן לרתום את התכונות הפיזיקליות של הידרוג'לים נטולי קסנו כדי לייעל את ייצור האורגנואידים. בסך הכל, התוצאות מצביעות על כך ששינויים בהרכב של מטריצות שונות משפיעים על שלבי התמיינות IO. מחקר זה מעלה את המודעות להבדלים במטריצות הזמינות מסחרית ומספק מדריך לאופטימיזציה של מטריצה במהלך עבודת iPSC וקלט/פלט.

Introduction

המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מרכיב דינמי ורב-תכליתי של רקמות הממלא תפקיד מרכזי בוויסות התנהגות התא והתפתחותו. כרשת מורכבת, היא מספקת תמיכה מבנית, ליגנדות דבק תאים¹, ואחסון של גורמי גדילה וציטוקינים המווסתים את האיתות התאי. לדוגמה, במהלך ריפוי פצעים, ECM משמש כפיגום לתאים נודדים וכמאגר של גורמי גדילה המעורבים בתיקון רקמות². באופן דומה, חוסר ויסות ב- ECM יכול להוביל לעלייה בחומרת מחלות שונות כגון פיברוזיס וסרטן ^3,4. במהלך ההתפתחות העוברית, ה- ECM מנחה מורפוגנזה של רקמות. לדוגמה, בפיתוח הלב, רכיבי ECM ממלאים תפקיד ביצירת הארכיטקטורה והתפקוד הנכונים של רקמת הלב⁵. יותר מעשור של מחקר הראה כי הנוקשות של המיקרו-סביבה לבדה ^6,7 יכולה לשלוט במפרט שושלת תאי הגזע. לכן, אין זה מפתיע שבמהלך התמיינות תאי מבחנה, ECM משפיע על גורל תאי הגזע על ידי מתן אותות להתמיינות.

אורגנואידים יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). החל מקו iPSC מאופיין כראוי נדרש כדי לייצר אורגנואידים בהצלחה. עם זאת, היעדר רמזים פיזיולוגיים בחומרים קלאסיים של תרביות תאים מעכב התמיינות iPSC יעילה ויצירת אורגנואידים. יתר על כן, מחקרים אחרונים הדגישו את המשמעות של הרכב המטריצה החוץ תאית (ECM), אינטראקציות בין תאים לבין ECM⁸, כמו גם רמזים מכניים וגיאומטריים ^9,10,11 בהקשר של התפשטות והתמיינות אורגנואידים¹². קידום טכנולוגיית אורגנואידים על ידי שיפור יכולת השחזור יכלול שילוב רמזים פיזיקליים וכימיים ספציפיים לרקמות.

אורגנואידים שואפים לשחזר את הרקמה הטבעית בתוך מיקרו-סביבה דומה מבחינה פיזיולוגית. בחירת מערכת ECM המחקה באופן הדוק את ECM הרקמה הטבעית היא חיונית להשגת רלוונטיות פיזיולוגית לגבי התנהגות התא, תפקודו ותגובתו לגירויים¹³. הבחירה של רכיבי ECM יכולה להשפיע על התמיינות תאי גזע לסוגי תאים ספציפיים בתוך האורגנואיד. חלבוני ECM שונים והשילובים שלהם יכולים לספק רמזים המנחים את גורל התא¹⁴. לדוגמה, מחקרים הראו כי שימוש ברכיבי ECM ספציפיים יכול לקדם את התמיינות תאי גזע המעי לסוגי תאי מעיים בוגרים, וכתוצאה מכך אורגנואידי מעיים רלוונטיים פיזיולוגית¹⁵. בעוד אורגנואידים הם כלי רב ערך במהלך מידול מחלות ובדיקות סמים, בחירת מערכת ECM מתאימה היא חיונית ליישום זה. מערכת ECM מתאימה יכולה לשפר את הדיוק של מידול מחלות על ידי יצירת מיקרו-סביבה הדומה לרקמה הפגועה¹⁶. יתר על כן, ECM ספציפי לרקמות יכול לסייע ביצירת אורגנואידים המשחזרים טוב יותר פנוטיפים הקשורים למחלות ותגובות תרופתיות¹⁷. אופטימיזציה של מערכת ECM המשמשת להתמיינות אורגנואידים היא קריטית להשגת תוצאות הבידול הרצויות.

מערכות ממברנות מרתף זמינות מסחרית שמקורן במקורות ECM של בעלי חיים (למשל, Matrigel, Cultrex) והידרוג'ל נטול קסנו (למשל, VitroGel) נמצאות בשימוש נרחב במחקר iPSC ואורגנואידים. חברות שממסחרות אותם וחוקרים המשתמשים בהם הציגו הוראות רבות למוצרים וליישומים הספציפיים שלהם לאורך השנים. רבות מהוראות אלה שימשו מדריך ליצירת פרוטוקול זה. יתר על כן, היתרונות והמכשולים הקשורים לתכונות המהותיות שלהם צוינו בנפרד על ידי^רבים 18,19,20,21. עם זאת, אין זרימת עבודה שיטתית שתנחה את הבחירה של מערכות אופטימליות עבור iPSC ואורגנואידים. כאן, זרימת עבודה כדי להעריך באופן שיטתי את השקילות של מערכות ECM ממקורות שונים עבור iPSC ואורגנואידים עבודה מסופק. זהו מחקר השוואתי של תחזוקה של שני קווי iPSC אנושיים שונים (hiPSC) ואורגנואידים במעיים אנושיים (hIO) בארבע מטריצות שונות: Matrigel (מטריקס 1-AB), Geltrex (מטריקס 2-AB), Cultrex (מטריקס 3-AB) ו VitroGel (מטריקס 4-XF). עבור תרבית אורגנואידים, נעשה שימוש בארבע גרסאות של VitroGel מטריצה נטולת קסנו שהותאמו בעבר לתרבית אורגנואידים: אורגנואיד 1 (מטריצה 4-O1), אורגנואיד 2 (מטריצה 4-O2), אורגנואיד 3 (מטריצה 4-O3), אורגנואיד 4 (מטריצה 4-O4). כמו כן, נעשה שימוש במטריצות מן החי המותאמות לאורגנואידים: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) ו-Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). נעשה שימוש במדיה מסחרית לתרבית תאי גזע (mTeSR Plus) ובערכת התמיינות אורגנואידים (ערכת אורגנואיד מעיים STEMdiff). פרוטוקול זה משלב את ההוראות האישיות של יצרני המוצרים עם חוויות מעבדה כדי להנחות את הקורא לקראת אופטימיזציה מוצלחת של ECM עבור עבודת iPSC ואורגנואידים הספציפית שלהם. בסך הכל, פרוטוקול זה ותוצאות מייצגות מדגישים את החשיבות של בחירת המיקרו-סביבה האופטימלית לעבודה של תאי גזע והתמיינות אורגנואידים.

Protocol

1. תחזוקת hiPSC

זהירות: כל העבודה נעשית בארון בטיחות ביולוגית (BSC) בהתאם לטכניקות אספטיות סטנדרטיות. חייב לעמוד בתקני הבטיחות של OSHA למעבדות, כולל שימוש נאות בציוד מגן אישי כגון מעילי מעבדה, כפפות ומשקפי מגן.

1. הכנת מטריצות, aliquots ומדיה תרבית התא
   1. עבור ממברנות מרתף שמקורן בבעלי חיים (BMs; Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB), להכין aliquots של נפחי עבודה בעקבות המלצת היצרן המסוכמת בטבלה 1 ולאחסן אותם ב -20 ° C או -80 ° C לאחסון לטווח ארוך. הימנע היווצרות של בועות. אם נוצרות כמה בועות, לפני האחסון, דגימות צנטריפוגות ב 4 ° C, ב <200 x גרם, במשך ~ 1-2 דקות כדי לאלץ את הבועה לעלות לפני השטח.
      הערה: יצירת aliquots חד-פעמיים מסייעת למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים המשבשים את ארכיטקטורת ECM. מכיוון שריכוז BM משתנה עם מספר הלוט, הקפד לעקוב אחר המלצת היצרן להכין aliquots חד פעמי ולעשות פתרונות ציפוי. BMs מרוכזים במיוחד צמיגים וקשים לפיפטה; השתמש טיפים קרים שאוחסנו בעבר ב -20 ° C.
   2. הכינו מדיום תרבית תאי גזע בהתאם להמלצת היצרן. כדי להכין את המדיה המלאה הספציפית הזמינה מסחרית המשמשת בפרוטוקול זה, הוסף 100 מ"ל של קוקטייל תוסף 5x ל- 400 מ"ל של מדיום בסיסי. לאחר מכן, לערבב את המדיה ביסודיות aliquot לתוך 40 מ"ל נפחים, מאוחסן ב 20 ° C. לשימוש, להפשיר כל aliquot של מדיה מלאה, להשתמש המדיום המלא aliquoted מיד, או לאחסן ב 2 - 8 ° C עד 2 שבועות. אין להקפיא אותו מחדש.
   3. הכינו aliquots של המדיום המלא של תאי הגזע המכיל ריכוז פי 3 של קוקטייל התוסף להכנת הידרוג'ל Matrix 4-XE, כלומר, לדלל תוסף 5x ל 3x.
2. ציפוי פלסטיק תרבית רקמות ב-BMs שמקורם בבעלי חיים (Matrix 1-3AB)
   1. הכינו את הדברים הבאים לפני שמתחילים: שמרו תמיד את המטריצות בקרח בעת ההפשרה והטיפול כדי למנוע מהן להתגלגל. השתמש במדיה קרה כדי להכין את המטריצות המדוללות. הכינו מספיק בארות משוכפלות לכל מצב כדי להעריך תאים לפני תחילת ובכל שלב של תהליך התמיינות hiPSC ויצירת אורגנואידים hIO.
      הערה: כאן, צלחות 24 בארות שימשו למחקר זה. עיין בטבלה 2 לקבלת נפחי ציפוי מומלצים עבור גדלי לוחות אחרים.
   2. עבור כל סוג של מטריצה, להכין 25 מ"ל של מתקדם קר DMEM/F-12 המכיל 15 mM HEPES בצינור חרוטי 50 מ"ל. שמור אותם על קרח.
   3. הוסיפו את המטריצות המופשרות ל-DMEM/F-12 המתקדם הקר שלהן וערבבו היטב. שמרו על מדיה קרה במהלך תהליך הערבוב. בדוק חזותית ערבוב הומוגני על ידי וידוא שאין גושים.
   4. השתמש מיד בתמיסות המטריצות המדוללות כדי לצפות כל באר שנבחרה לשימוש (250 μL / באר אם משתמשים ב -24 צלחות באר).
   5. הטו בעדינות את כלי התרבית כדי לפזר את תמיסת הציפוי באופן שווה על פני השטח. יש לדגור בטמפרטורת החדר (15 - 25 מעלות צלזיוס) לפחות שעה לפני השימוש.
      הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי, ניתן לאחסן את הצלחת בטמפרטורה של 2 - 8 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לאחר הציפוי, אך יש לאטום אותה בסרט שקוף כדי למנוע אידוי. בעת שימוש בצלחות מאוחסנות, תן להם להגיע לטמפרטורת החדר (15 - 25 ° C) במשך 30 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא.
   6. מוציאים בעדינות את התמיסה העודפת באמצעות פיפטה סרולוגית או על ידי שאיפה. ודא שהמשטח המצופה אינו שרוט.
   7. הוסף מיד מדיום תאי גזע שלמים חמים (50% מהנפח הכולל הדרוש לבאר ספציפית, למשל, 250 μL / well אם אתה משתמש בצלחת של 24 בארות).
3. ציפוי פלסטיק תרבית רקמה בהידרוג'ל Matrix 4-XE
   1. הכינו את הדברים הבאים לפני שמתחילים: הוציאו את ההידרוג'ל Matrix 4-XE מהמקרר ותנו לו להתחמם לטמפרטורת החדר (25°C). הכינו מספיק בארות משוכפלות לכל מצב כדי להעריך תאים לפני תחילת ובכל שלב של תהליך התמיינות hiPSC ויצירת אורגנואידים hIO.
      הערה: כאן, צלחות 24 בארות שימשו למחקר זה. עיין בטבלה 3 לקבלת נפחי ציפוי מומלצים עבור גדלי לוחות אחרים.
   2. הכינו מצע שלם של תרבית תאי גזע המכיל ריכוז של פי 3 מגורם גדילה בהשוואה לפורמולציה הסטנדרטית לתרבית תאי גזע (3x מדיום תאי גזע).
   3. יש לערבב הידרוג'ל 4-XE של Matrix ו-3x תאי גזע בינוניים ביחס ערבוב של 2:1 v/v ולערבב בעדינות פיפטה מעלה ומטה 5x-10x כדי לערבב היטב.
   4. מעבירים את תערובת ההידרוג'ל לצלחת היטב ומטים בזהירות את כלי התרבית לפיזור אחיד של התערובת על פני השטח. השתמש 250 μL / באר אם אתה משתמש צלחת 24 באר. ראה טבלה 3 לקבלת אמצעי אחסון מומלצים.
   5. יש להמתין 10-15 דקות בטמפרטורת החדר ליצירת כמוסת ג'ל. במהלך תהליך היווצרות ההידרוג'ל, אין להפריע להידרוג'ל על ידי הטיה או ניעור הצלחת.
4. hiPSC נטול אנזימים גושים עוברים וזורעים
   1. הכינו את הדברים הבאים לפני שמתחילים: לפחות שעה לפני המעבר, צפו את כלי הפלסטיק הרצויים במטריצות. Aliquot מספיק מדיה מלאה תאי גזע חם לטמפרטורת החדר (15 - 25 ° C). הימנע ממחזורי חימום מרובים עבור המדיה המלאה.
      הערה: השלבים הבאים מתארים את המעבר של תרבית מבוססת ו->90% של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים על צלחת בעלת 6 בארות וזריעתם בצלחות של 24 בארות לצורך התמיינות של אורגנואידים במעיים.
   2. לשטוף תאים עם 1 מ"ל של D-PBS (ללא Ca++ ו Mg++) ולשאוף. הוסף 1 מ"ל של מגיב בחירת תאי גזע פלוריפוטנטי אנושי ללא אנזימים, הסתחרר בזהירות כדי להתפשט באופן שווה, ושאפו תוך דקה אחת. מושבות צריכות להיחשף רק לסרט דק של נוזל.
   3. לדגור ב 37 ° C עד מושבות להתחיל להיראות פחות דחוס, אשר ייקח ~ 3-8 דקות.
      הערה: זמן הדגירה האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם לקו התאים שבו נעשה שימוש. זמן הדגירה האופטימלי חייב להיקבע כאשר עוברים כל קו תא עם מגיב בחירת תאי גזע אנושי פלוריפוטנטי ללא אנזים בפעם הראשונה.
   4. הוסף 1 מ"ל של מדיה מלאה של תאי גזע. נתקו את המושבות על ידי הקשה בזהירות על צד הצלחת. הקפידו להחזיק את הצלחת ביד השנייה.
   5. עם פיפטה של 1 מ"ל ומעלה, מעבירים את ההשעיה של גושי התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל. להעריך את גודל הגושים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ולוודא שגודל גוש התא הוא בין 50-200 מיקרומטר; אם הם גדולים יותר, נערו בעדינות את הצינור החרוטי כדי לפרק אותם.
   6. ציירו רשת x-y בתחתית כל באר של צלחת שטוחה בעלת 96 בארות שתשמש לספירת גושים והוסיפו 50 מיקרוליטר של D-PBS לכל אחת מהבארות. מומלץ לחשב ממוצע של הגושים שנספרו מ-3 בארות.
   7. ודא שגושי התאים מפוזרים באופן שווה על ידי ניעור עדין של הצינור ולאחר מכן העבר 5 μL של תרחיף גושי לכל אחת מהבארות של הצלחת בעלת 96 הבארות בעלות התחתית השטוחה.
      הערה: לא מומלץ להשתמש במונה תאים אוטומטי כדי לספור גושים. מומלץ לבצע ספירה ידנית.
   8. לספור את המספר הכולל של גושים בכל באר כי הם 50 - 200 מיקרומטר קוטר. אם רוב גושי התאים הם בקוטר > 200 מיקרומטר (ראו איור 1), חזרו על שלבים 1.4.5 - 1.4.7.
   9. חשב את הנפח (ב- μL) של תרחיף גושי הדרוש לזרע 6,000 גושים באופן הבא:
      
      הערה: צפיפות זריעה אופטימלית חייבת להיות ממוטבת עם כל קו תא. כדי לקבוע צפיפות זריעה אופטימלית, מומלץ לבצע זריעה ראשונית בטווח של צפיפויות גושים (למשל, 4,000, 5,000 ו-6,000 גושים לבאר) ולבדוק 24-48 שעות לאחר הזריעה אם מגיעים למפגש של 85%-90%.
   10. כבקרת איכות, יש להפריד דגימת תאים לבדיקת ציטומטריית זרימה של סמני תאי גזע. עיין בטבלה 4 לקבלת רשימה של סמנים נפוצים.
   11. הפרד את הנפח הנדרש של תרחיף גושי iPSC לזרעים על הבארות המצופות ב- ECM שונה לצינורות נפרדים של 15 מ"ל.
   12. צנטריפוגה את הצינור המכיל את תמיסת גוש iPSC ב 200 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר מדיה המכילה מגיב בחירת תאי גזע אנושי פלוריפוטנטי ללא אנזימים. בזמן ההמתנה לצנטריפוגה, להוסיף 50% מהנפח הרצוי לכל באר לכל באר אם זה לא נעשה כבר.
5. תרבית iPSC בצלחות המכילות מטריצות מן החי
   1. השהה מחדש בעדינות גושי iPSCs בנפח המחושב של 50% של מדיה מלאה של תאי גזע כדי לקבל את הצפיפות הרצויה וצלחת את תערובת צברי התאים על בארות מצופות המכילות 50% של מדיה מלאה מחושבת של תאי גזע.
      הערה: הוספת מעכב ROCK-1 עשויה להיות נחוצה עבור שורות תאים מסוימות או כאשר הגושים הם 50 מיקרומטר או פחות. מומלץ להוסיף <10 מיקרומטר כדי למנוע גסטרולציה מוקדמת.
   2. בזהירות להוסיף בינוני עם תאים על גבי מטריצות, 250 μL / טוב אם באמצעות צלחת 24 באר. לקבלת הנפח המומלץ של מדיום התא עבור לוחות באר בגודל אחר, עיין בטבלה 2.
   3. הטה את הצלחת במספר תנועות קצרות קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר את גושי התא באופן שווה.
      זהירות: התפלגות לא אחידה של אגרגטים גורמת להתמיינות ספונטנית מוגברת של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים. התפשטות מעגלית של תרחיף הגושים גורמת להצטברות גושים בגבול הבארות ולצפיפות נמוכה יותר במרכז.
   4. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C ולבצע שינויים בינוניים באמצעות מדיה מלאה של תאי גזע מדי יום או פעם ביומיים. בעת ביצוע שינויים בינוניים, להעריך חזותית תרביות כדי לפקח על הצמיחה ולקבוע אם התאים דורשים זמן עובר או מוכנים להתמיינות. כדי לדלג על יומיים רצופים של האכלה, הוסיפו פי 2 מנפח המדיום הדרוש ליום אחד.
6. תרבית iPSC בלוחות המכילים Matrix 4-XE
   1. השהה מחדש בעדינות גושי iPSCs לנפח המחושב הכולל של מדיה מלאה פי 3 של תאי גזע כדי לקבל את הצפיפות הרצויה.
   2. בזהירות להוסיף בינוני עם תאים על גבי הידרוג'ל 250 μL / באר אם באמצעות צלחת 24 באר. לקבלת הנפח המומלץ של מדיום התא עבור לוחות באר בגודל אחר, עיין בטבלה 3.
      זהירות: ההידרוג'ל יתנפח ויתפוס נפח גדול יותר מאשר תוצרת טרייה. מושבות iPSC ישובצו חלקית בהידרוג'ל שבתחתית הצלחת, ולכן מומלץ להחליף 50%-80% מהתווך העליון מבלי להפריע להידרוג'ל.
   3. הזיזו את הצלחת בכמה תנועות מהירות, קצרות, קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר את גושי התא באופן שווה.
   4. מניחים את הצלחת באינקובטור של 37°C עם 5%_CO2 ו-95% לחות. שנה את תווך התא באמצעות מדיה מלאה של תאי גזע. לבצע שינויים בינוניים מדי יום או כל יומיים; עבור האחרון, להוסיף 2x נפח של המדיום.
   5. לבחון חזותית את התרבויות כדי לעקוב אחר צמיחתן כאשר הן מגיעות לשלב המתאים לבידול.

איור 1: גודל גושי אופטימלי. תמונות של גושים של קו תאי iPSC SCTi003A המתארות דוגמה לגודל גושי אופטימלי. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. התמיינות hiPSC ויצירת אורגנואידים במעיים

זהירות: כל העבודה נעשית בארון בטיחות ביולוגית (BSC) בהתאם לטכניקות אספטיות סטנדרטיות. חייב לעמוד בתקני הבטיחות של OSHA למעבדות, כולל שימוש נאות בציוד מגן אישי כגון מעילי מעבדה, כפפות ומשקפי מגן.

1. הכינו את הדברים הבאים לפני שמתחילים: הכינו אליציטוטים של מדיום בידול הנדרש לכל שלב. לאחר הפשרת aliquots, להשתמש בהם מיד. אין להקפיא מחדש. עקוב אחר טבלה 5 לקבלת מדריך כללי של כל סוג מדיה שלב ונפחים הדרושים ללוח בן 24 קידוחים.
   הערה: הזמן האופטימלי בכל שלב התמיינות עשוי להשתנות בהתאם לקו התא. מומלץ לבדוק את הביטוי של כל סמן תא שלב כדי לשפר את יעילות ההתמיינות. הערכה תקופתית של ביטוי גנים בתרביות iPSCS לא נכללה במחקר זה מכיוון שמינפנו אצוות מוסמכות ספק במעברים נמוכים, אך היא מומלצת כשלב בקרת איכות עבור קווי iPSC חדשים/עדיין לא מוסמכים במהלך שלבי ההתמיינות הבאים.
2. שלב 1: אנדודרם סופי (DE)
   1. כדי להעריך את המוכנות להתחיל בידול, בדוק את הקריטריונים הבאים.
      1. באמצעות מיקרוסקופ, להעריך את המפגש של מושבות תאי גזע ואת כמות התמיינות ספונטנית בתרבית. אין להסתמך רק על הערכה מורפולוגית בלבד. המפגש האופטימלי צריך להיות בין 85%-90% (מעל ~10⁵ תאים לסמ"ר²), והתמיינות ספונטנית מינימלית שנצפתה צריכה להיות <5% התמיינות.
      2. לאסוף תאים מבאר הקרבה לאפיון ציטומטריית זרימה של סמני hiPSC לפני שתמשיך לשלב הבא. אסטרטגיית פיזור קדימה וצידית שימשה לאפיון ציטומטריית הזרימה המייצגת. אם התאים עומדים בקריטריונים האופטימליים, התחל התמיינות. קריטריוני מעבר תאים הם >85% ביטוי אידיאלי של 3 סמנים (טבלה 4), במיוחד במקרה של קווי iPSC חדשים/עדיין לא מוסמכים במעבדה.
         הערה: תרביות iPSC הגדלות על מטריצות שונות עוברות את אותו תהליך כולל עם גידול iPSC בלבד ב- Matrix 4-XE, הדורש שינויי מדיה עדינים יותר כדי לא להפריע לתאים המשובצים למחצה. מוות תאי משמעותי צפוי במהלך השראת אנדודרם סופי, מכיוון שהתאים רגישים במיוחד בשלב זה. יש לנקוט משנה זהירות במהלך שינויים בינוניים, במטרה למזער ככל האפשר את משך הזמן שבו התאים נחשפים מחוץ לסביבת הדגירה של 37 מעלות צלזיוס.
   2. התחלת התמיינות של מושבות תאים כמתואר להלן.
      1. יום 0: לחמם aliquot של DE בינוני עד 37 °C (77 °F). כדי למנוע דנטורציה של מדיה ממחזורי התחממות-קירור, הקפד לחמם רק את הנפח הדרוש ליום 0 (0.7 מ"ל / באר).
      2. שאפו את התקשורת מ-hiPSCs. בזהירות להוסיף 0.7 מ"ל של DE בינוני לכל באר בצד של הבאר. הימנעו מצנרת קשה שעלולה לנתק או לפגוע במושבות. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 ו-95% לחות למשך 24 שעות.
      3. יום 1: לחמם aliquot של מדיום DE המכיל רק את הנפח הדרוש ליום 1 (0.5 מ"ל / באר) עד 37 ° C. שואפים את מדיום DE מתאים ומוסיפים בזהירות 0.5 מ"ל של מדיום DE לכל באר בצד הבאר. יש לדגור ב-37°C עם 5%_CO2 ו-95% לחות למשך 24 שעות.
      4. יום 3: התאים מוכנים לבדיקה לצורך יצירת אנדודרם סופי. עיין בטבלה 4 לקבלת סמנים מומלצים. לפני שתמשיך לשלב הבא, להקריב באר כדי לבצע אפיון ציטומטריה זרימה של סמנים ספציפיים הקשורים DE. אסטרטגיית פיזור קדימה וצידית שימשה לאפיון ציטומטריית הזרימה המייצגת. מומלץ לבדוק ביטוי של יותר מסמן אחד, במיוחד במקרה של קווי iPSC חדשים/טרם מוסמכים במעבדה.
3. שלב 2: מידגוט/הינדגוט (MH)
   1. יום 3: יש לחמם רק את עוצמת MH הדרושה ליום 3 (0.5 מ"ל/באר) עד 15 - 25 מעלות צלזיוס. לשאוף DE בינוני מתאים ולהחליף עם 0.5 מ"ל של MH Medium. יש לדגור ב-37°C עם 5%_CO2 ו-95% לחות למשך 24 שעות.
   2. ימים 4 - 9: לפני שינויי התווך היומיים, השתמש במיקרוסקופ בהגדלה פי 2 או 4 כדי להעריך היווצרות ספרואידים על ידי בדיקת מבנים תלת ממדיים גלויים (עשוי לקרות מהיום הרביעי); ספרואידים צפים בחופשיות (עשויים להתרחש מהיום החמישי).
   3. ברגע שהספרואידים מתחילים להתנתק, השתמש בפיפטור של 1 מ"ל כדי להעביר בעדינות את התווך מתאים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל כדי להעריך את מספר הספרואידים המנותקים מהתאים.
      הערה: הימנע מכל כוח גזירה שעלול לנתק מבנים תלת-ממדיים מהמונו-שכבה; ברגע שהם מוכנים, הספרואידים יתנתקו מעצמם.
   4. אם פחות מ-50 ספרואידים מנותקים, צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 5 דקות, מוציאים את התווך הישן ומרחפים מחדש על 0.5 מ"ל/באר של תווך ומעבירים לבאר המתאימה עד שמספיק ספרואידים יבשילו.
      הערה: משך החשיפה לתווך המעי האמצעי/אחורי ממלא תפקיד מכריע בקביעת הזהות האזורית של התפתחות אורגנואידים במעי הדק, כגון תריסריון (חשיפה קצרה יותר) או איליאום (חשיפה ארוכה יותר). כדי להשיג תרביות אחידות יותר עם אותה זהות, שאפו לאסוף ספרואידים שנחשפו לתווך המעי האמצעי/אחורי בו זמנית.
   5. חזור על שלב 2.3.3 עד לניתוק מספיק ספרואידים כדי להטמיע וליזום תרבית אורגנואיד מעיים אנושי (hIO).
   6. לפני שממשיכים לשלב הבא, הפרידו דגימה של ספרואידים ובצעו אפיון ציטומטריית זרימה של סמנים ספציפיים הקשורים למידגוט/הינדגוט (MH). אסטרטגיית פיזור קדימה וצידית שימשה לאפיון ציטומטריית הזרימה המייצגת. עיין בטבלה 4 לקבלת רשימה של סמנים נפוצים. מומלץ לבדוק ביטוי של יותר מסמן אחד, במיוחד במקרה של קווי iPSC חדשים/טרם מוסמכים במעבדה.
4. שלב 3: הטבעה ספרואידית
   1. הכינו את הדברים הבאים לפני תחילת ההליך.
      1. הפשירו אליציטוטים של מטריקס 1-ABO ומטריקס 3-ABO על קרח. שקול את מספר הספרואידים שנאספו כדי לקבוע את הכמות הכוללת של מטריצה הדרושה אם 30-40 מיקרוליטר של מטריצה יידרשו לכל כיפה.
      2. הכינו 25 מ"ל של HEPES קר מראש DMEM/F-12 המכיל 15 mM HEPES. ECMs בריכוז גבוה הם צמיגים וקשים לפיפטה. מניחים קופסה של קצוות פיפטה סטריליים של 100 μL בטמפרטורה של -20°C להכנת טיפים קרים שיכולים לעזור לתהליך. הכינו aliquots של Intestinal Organoid Growth Medium (OGM), אשר דורש 4 הזנות (0.5 מ"ל / באר לכל הזנה). ראו טבלה 5 להכנה.
      3. הפשיר aliquot של תוספת OGM על קרח. לאחר הפשרת aliquots, להשתמש בהם מיד. אין להקפיא מחדש. אחסן OGM מלא ב 2-8 ° C למשך עד שבועיים.
      4. הכינו OGM המכיל 3x של התוסף בהשוואה לנוסחה הסטנדרטית עבור (3x OGM). הוציאו את מטריקס 4-XFO1 חשב מטריקס 4-XFO4 מהמקרר ותנו להם להתחמם לטמפרטורת החדר (25°C).
   2. עבור המערכת שמקורה בבעלי חיים, בצע את השלבים המתוארים להלן.
      1. מניחים באינקובטור צלחת סטרילית של תרבית רקמה בת 24 בארות כדי להתחמם ל-37 מעלות צלזיוס בזמן הכנת הספרואידים והמטריצות. תן spheroids שנאספו לשקוע לתחתית של צינור חרוטי 15 מ"ל. בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant.
         הערה: כדי לבצע השוואה מדויקת יותר של השפעת המטריצות, הקפד לשמור את הספרואידים שנאספו מה- hiPSC מובחנים על כל מטריצה בצינורות נפרדים.
      2. הוסף 1 מ"ל של DMEM/F-12 עם HEPES של 15 mM לכדורואידים. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (15 - 25 ° C).
      3. בזהירות להסיר כמה שיותר supernatant. מומלץ להתחיל להסיר עם פיפטור 1 מ"ל ולעבור ל 100 μL ואפילו 10 μL פיפטות כדי להסיר ככל האפשר מבלי להפריע את כדור הספרואידים.
         הערה: ככל שנפח המדיה גדול יותר, כך המטריצות יהיו מדוללות יותר. מטריצות מדוללות עלולות לגרום לבעיות ג'לינג או לכיפות רכות יותר. כיפות רכות יותר מובילות לסיכויים גבוהים יותר להתמוטטות עם מינימום הפרעות.
      4. בעזרת פיפטור עם קצה פיפטה קר של 100 μL, הוסף 40 μL/50 ספרואידים קרים (2 - 8 ° C) Matrix 1-ABO או Matrix 3-ABO לצינור המתאים שלהם. מפזרים בעדינות ספרואידים לתוך המטריצה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה ~ 5x. אין לרוקן לחלוטין את קצה פיפטה, אשר עלול להציג בועות.
      5. הביאו את הצלחת מהאינקובטור, ובעזרת קצה פיפטה קר העבירו בעדינות ספרואידים משובצים למרכז הצלחת בעקבות השלבים באיור 2. הימנעו מהפצת מטריקס 1-ABO ומטריקס 3-ABO מהר מדי לצלחת התרבית, מכיוון שזה ישטח את הכיפה.
      6. מעבירים בזהירות את הצלחת לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ודגרים במשך 30 דקות כדי להבטיח ג'לציה של הכיפה. היזהרו במיוחד מכל טלטול או תנועה קשה במהלך ההובלה ובאינקובטור.
      7. בעת הדגירה על הכיפה לג'לינג, חם ב 37 ° C נפח מספיק של OGM מעיים (0.5 מ"ל / באר) למספר הבארות לשימוש.
         הערה: יש לחמם רק את עוצמת הקול הדרושה. הימנעו ממחזורי חימום-קירור. ודא שהמדיה חמה לפני הוספתה לכיפה; מדיה קרה יכולה להוביל לקריסת הכיפה.
      8. לאחר 30 דקות, בזהירות להוסיף 0.5 מ"ל של OGM המעי לצד הבאר כדי לא להפריע את הכיפה. יש לדגור ב-37°C עם 5%_CO2 ו-95% לחות. בצע שינוי מלא-בינוני כל 3-4 ימים על ידי הסרת המדיום ולאחר מכן הוסף מדיום טרי.
   3. עבור מערכות אורגנואיד Matrix 4-XF, בצע את השלבים המתוארים.
      הערה: מערכת אורגנואיד Matrix 4-XF כוללת ארבע אפשרויות שונות (O1-O4); הנוסחה של כל סוג משתנה בליגנדות ביו-פונקציונליות, נוקשות ומתכלה. כתוצאה מכך, מומלץ לבצע ניסויים ראשוניים כדי לקבוע את הסוג האופטימלי עבור היישום הספציפי. פרוטוקול זה מתאר שימוש בארבע האפשרויות כדי למצוא נוסחה אופטימלית עבור אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC. בנוסף, בעוד שישנם פרוטוקולי תרבית מרובים שניתן להשתמש בהם (למשל, אנקפסולציה תלת ממדית, אנקפסולציה של כיפה), פרוטוקול זה כולל שימוש בשיטת הכיפה כך שניתן להשוות ישירות עם השיטות הנפוצות המשמשות בעבודה עם מערכות קרום מרתף שמקורן בבעלי חיים.
      1. הוסף 1 מ"ל/באר של מתקדם קר DMEM/F-12 המכיל 16 mM HEPES לכדורואידים הנוצרים במערכת Matrix 4-XFO4. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (15 - 25 ° C).
         הערה: כדי למצוא את הנוסחה האופטימלית ליישום, הקפד לפזר ספרואידים ל -4 צינורות נפרדים לפני הצנטריפוגה. ספרואידים הנוצרים על מטריצות שמקורן בבעלי חיים יכולים גם להבשיל לאורגנואידים במעיים באמצעות מערכת זו.
      2. באמצעות פיפטור 1 מ"ל, להסיר את supernatant מבלי להפריע spheroids. הוסף 50 μL של 3x OGM לגלולת הספרואידים (~ 100 ספרואידים). הוסף 100 μL של Matrix 4-XFO שנבחר למתלה הספרואידי 50 μL וערבב בעדינות 5x-10x פעמים. שמור על Matrix 4-XFO ל- 3x OGM ביחס ערבוב של 2:1 v/v כדי לקבל ריכוז סופי של 1x.
      3. הוסף 40 μL של תערובת הידרוג'ל-ספרואיד למרכז צלחת תרבית רקמות 24 באר. מעבירים בזהירות את הצלחות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ודגרים במשך 30 דקות.
         הערה: Matrix 4-XFO אינו דורש דגירה של 37°C עבור ג'לציה; עם זאת, מומלץ לשמור על אורגנואידים חשופים לתנאים דומים בהשוואה למערכות מטריקס 1-ABO ומטריקס 3-ABO הדורשות 37 מעלות צלזיוס לג'לציה טובה יותר של הכיפות.
      4. לאחר 30 דקות, בזהירות להוסיף 0.5 מ"ל של OGM המעי לצד הבאר כדי לא להפריע את הכיפה. יש לדגור ב-37°C עם 5%_CO2 ו-95% לחות. בצע שינוי מלא-בינוני כל 3-4 ימים על ידי הסרת המדיום ולאחר מכן הוספת מדיום טרי.
5. hIO עובר והבשלה
   1. הכינו את אותם כימיקלים, תמיסות וריאגנטים כפי שנעשה בשלב 2.4.1.
   2. הוסף 1-2 מ"ל של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לצינור חרוטי 15 מ"ל (1 לכל מצב) ומערבל כדי לצפות את הצינור.
   3. הסר את הפתרון נגד היצמדות ושטוף את הצינורות עם 5 מ"ל של D-PBS (ללא Ca++ ו- Mg++). מכסים את כל הצינורות המצופים ושומרים אותם בטמפרטורת החדר (15 - 25 מעלות צלזיוס) עד לצורך.
   4. שאפו את המדיום מהכיפות. באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הוסף 1 מ"ל של DMEM/F-12 קר לכיפה ישירות. המטרה היא לנתק את הכיפות מהצלחת.
   5. הוסף 1 מ"ל נוסף של DMEM/F-12 קר לבאר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לקצור אורגנואידים שנותרו. מעבירים לצינורות החרוטי המצופים 15 מ"ל.
      הערה: ודא את הקציר המוצלח של אורגנואידים על ידי בחינה חזותית של הבאר תחת מיקרוסקופ. אם נצפים שאריות אורגנואידים, חזור על שלב 2.5.5.
   6. עם פיפטור 1 מ"ל, בצע פיפטינג מעלה ומטה של המתלה כדי לפרק אורגנואידים עד להשגת תרחיף שבר אחיד בגודל האורגנואיד הרצוי (למשל, 100 - 500 מיקרומטר).
      הערה: השתמש בפיפטור של 200 μL כדי לוודא שהאורגנואידים תואמים לגודל המומלץ. שימוש בפיפטור של 200 מיקרוליטר מאפשר פיצול נוסף לפי הצורך, ומבטיח שהשברים יוכלו לעבור בצורה חלקה דרך קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.
      אזהרה: הימנעו מפירוק מקטעים לתאים בודדים על ידי פיפטינג קשה או ממושך.
   7. קבע את צפיפות האורגנואיד הרצויה על ידי ספירת מקטעים או שימוש ביחס הפיצול. הפרד aliquot ובצע ספירה באמצעות אותו הליך כמו בשלבים 1.4.6-1.4.9 עבור ספירת גושים.
      הערה: צפיפות אורגנואידים אופטימלית צריכה להיות אופטימלית לכל שורה; באופן כללי, צפיפות של 40 - 80 אורגנואידי מעיים לכל כיפה מומלצת.
   8. ודא שהצינור מונח על קרח במהלך תהליך ספירת האורגנואידים. לאחר כ-5 דקות, שברי אורגנואידים יתמקמו בתחתית הצינור עקב כוח הכבידה.
      הערה: ככל שהנפח של תמיסת האורגנואידים גדול יותר, כך ייקח זמן רב יותר לשקוע לתחתית.
   9. סלקו בעדינות כמה שיותר סופרנאטנט ואת השכבה העכורה שנוצרה על גבי האורגנואידים. במעברים המוקדמים כאשר אורגנואידים מבשילים, שלב עכור זה כולל מטריצה ותאים בודדים.
   10. הוסף 2 מ"ל של DMEM/F-12 קר על ידי פיפטציה ישירות על הכדור. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (15 - 25 ° C).
   11. עבור מערכת שמקורה בבעלי חיים, יש להסיר ולהשליך בזהירות סופרנאטנט בהתאם לאותם שלבים המתוארים בשלבים 2.4.2.4-2.4.2.9.
   12. עבור מערכת Matrix 4-XFO, הסר בזהירות והשלך את הסופרנאטנט בהתאם לאותם שלבים המתוארים בשלבים 2.4.3.2-2.4.3.4.
       הערה: בעת עבודה עם מערכת Matrix 4-XFO, מומלץ להשתמש בתמיסת שחזור אורגנואיד הידרוג'ל ללא קסנו להסרה אופטימלית של שאריות הידרוג'ל. פתרון התאוששות זה מומלץ במיוחד בעת מעבר ממערכות הידרוג'ל מבוססות בעלי חיים למערכות הידרוג'ל נטולות קסנו, כדי להבטיח חיסול של כל חומר קסנוגני.

איור 2. סכמטי של טכניקה מומלצת ליצירת כיפה. הסכימה מתארת את התהליך שלב אחר שלב המומלץ ליצירת כיפה מוצלחת לכל המערכות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. אפיון גודל קלט/פלט

הערה: גודל האורגנואידים אופיין בתמונות שדה בהיר שצולמו ברזולוציה של 4x ו-10x. ניתוח עיבוד התמונה נעשה אוטומטי באמצעות MATLAB. השלבים הכוללים של התהליך מתוארים להלן, ודוגמה של הקוד כלולה בקובץ משלים 1.

1. הגדר את הספרייה הכוללת את התמונות ופרט את כל קובצי התמונות בספרייה. אתחל את הטבלה כדי לאחסן את התוצאות. קרא את תמונות brightfield בקובץ.
2. הגדר המרת פיקסל למיקרומטר והגדר את קנה המידה. אם התמונה אינה כוללת סרגל קנה מידה, בקשו מהמשתמש את מקדם ההמרה פיקסל למיקרומטר.
3. המירו את התמונה לגווני אפור. החילו מסנן גאוס להפחתת הרעש בתמונה. סמן את התמונה המסוננת כדי להפריד אורגנואידים מהרקע.
4. מלא חורים קטנים והסר עצמים קטנים כדי לנקות את התמונה הבינארית. בצע ניתוח רכיבים מחוברים כדי לזהות אורגנואידים בודדים ולחשב את תכונותיהם כגון שטח, צנטרויד, אורך ציר ראשי ואורך ציר משני.
5. חשב את גודל האורגנואיד בהתבסס על אורכי הציר הראשי והשני. הצג את האורגנואידים המפולחים בתמונה המקורית ותייג אותם לפי גודלם. הדפס את גדלי האורגנואידים ואחסן תוצאות בקובץ cvs.
   הערה: שתי התמונות הראשונות נותחו ידנית כדי לקבוע את הפרמטרים האופטימליים עבור סטיית התקן של מסנן גאוס ואת השטח לסף. הקוד בקובץ משלים 1 מספק דוגמה למסגרת הבסיסית לניתוח גודל אורגנואיד מתמונות שדה בהיר; עם זאת, יש צורך בחידוד נוסף כדי להתאים לדרישות הספציפיות עבור כל סוג תמונה ואיכות. אותו תהליך יכול להיעשות באמצעות תוכנת קוד פתוח כמו FIJI מתמונה J.
6. בצע את השלבים הבאים כדי להשתמש בתוכנת FIJI.
   1. הגדר המרת פיקסל למיקרומטר והגדר את קנה המידה. אם התמונה אינה כוללת סרגל קנה מידה, בקשו מהמשתמש את מקדם ההמרה פיקסל למיקרומטר בלחיצה על 'נתח' >'קבע קנה מידה'.
   2. המר את התמונה לגווני אפור על-ידי לחיצה על תמונה > הקלד > 8 סיביות. החילו מסנן גאוס כדי להפחית את הרעש בתמונה בלחיצה על 'מסנן תהליך' > > טשטוש גאוס > סיגמא (רדיוס) בשימוש: 2.
   3. סמן את התמונה המסוננת כדי להפריד אורגנואידים מהרקע על-ידי לחיצה על Image > Threshold > MaxEntropy > Apply.
   4. מלא חורים קטנים והסר עצמים קטנים כדי לנקות את התמונה הבינארית על-ידי לחיצה על עבד > רעש > הסר חריגים >- 20 פיקסלים.
   5. בצע ניתוח רכיבים מחוברים כדי לזהות אורגנואידים בודדים ולחשב את תכונותיהם, כגון שטח, צנטרויד, אורך ציר ראשי ואורך ציר משני על-ידי לחיצה על נתח > הגדר > מדידה ודא ששטח, היקף וקוטר כלולים > נתח > נתח חלקיקים > הצג קווי מתאר.
7. ניתוח סטטיסטי
   1. הערך את התפלגות הנתונים לנורמליות באמצעות מבחן Saphiro-Wilk באמצעות תוכנת JMP (SAS). כדי לבחון הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות, בצע ANOVA דו-כיווני, ובצע בדיקות פוסט-הוק באמצעות שיטת Wilcoxon הלא פרמטרית בתוכנת JMP(SAS). מובהקות נקבעה ברמת אלפא של p ≤ 0.05.

Results

בעקבות פרוטוקול זה, ממברנות מרתף זמינות מסחרית ומערכת הידרוג'ל נטולת קסנו נוצלו בהצלחה כדי לטפח תאי hiPSC ולהתמיין אותם ל- hIO. המטרה העיקרית של ניסויים אלה הייתה להעריך באופן שיטתי את השקילות של מטריצות ממקורות שונים עבור עבודת hiPSC ו- hIO. החלק הראשון של פרוטוקול זה התמקד בתחזוקה ואפיון של תרבית iPSC בריאה המניבה ייצור יעיל של אורגנואידים במעי. תהליך ציפוי כלי התרבית במטריצות מן החי Matrix 1-AB, Matrix 2-AB ו-Matrix 3-AB תואר והושווה למערכת הידרוג'ל נטולת קסנו Matrix 4-XF.

כפי שניתן לראות באיור 3A, hiPSCs BXS 0116 (CD34+ נגזר) מראים מורפולוגיה דומה כאשר הם מתורבתים על שלוש מטריצות שמקורן בבעלי חיים. אף על פי כן, השוואת קו התא BXS 0116 עם SCTi003-A (נגזר PBMC) בתרבית על בארות מצופות מטריקס 1-AB מדגישה כי הבדלים מהותיים בין קווי תאים (מוצגים בטבלה 6) יכולים להוביל לשונות לגבי התפשטות תאים, התמיינות ומורפולוגיה. לדוגמה, בעוד שלקח 3 ימים ליצור DE עבור קווי התאים SCTi003-A, לקח 5 ימים עבור קו BXS0116. יתר על כן, כפי שניתן לראות באיור 3B-C, גידול hiPSCs במערכות הידרוג'ל Matrix 4-XF מוביל להיווצרות מושבות במושבה תלת-ממדית משובצת חלקית השונה באופן דרסטי מהמורפולוגיה השטוחה של תרבית hiPSC על לוחות המצופים במטריצה 1-AB או במערכות מקבילות. כמו כן, אחד ההיבטים העיקריים שיש לציין מניסויים אלה הוא שיצירת מערכת הידרוג'ל נטולת קסנו, תוך שימוש בגורמי גדילה פי 3, יכולה לשפר באופן משמעותי את יכולת הקיום של התאים ואת הביטוי של סמנים של תאי גזע. בסך הכל, תרביות hiPSC על מטריצות שמקורן בבעלי חיים ומטריקס 4-XF נטול קסנו, שנעשו עם ריכוז של גורמי גדילה פי 3, הובילו לביטוי שווה ערך של SSEA-4 (סמן תאי גזע)²²; עם זאת, מערכת הידרוג'ל מקדמת היווצרות של מושבות 3D מוטבע חלקית.

החלק השני של פרוטוקול זה מתמקד בהבחנה של hiPSCs ליצירת hIO. כאן, ערכה זמינה מסחרית שפותחה בהתבסס על Spence et ^al.23 שימשה כדי להתמיין לאנדודרם מוגדר (DE), ואז למעי האמצעי/אחורי (MH), ולבסוף לאסוף ספרואיד כדי להבשיל ל-IO (איור 4C). עבור דור יעיל של IO, בדיקה שלתרבות hiPSC יש התמיינות ספונטנית מינימלית לפני תחילת פרוטוקול הבידול היא קריטית. כפי שניתן לראות באיור 4A, ככל שהביטוי נמוך יותר של סמני תאי גזע כגון SSEA-4 בעת התחלת התמיינות DE, כך התהליך יהיה פחות יעיל בכל שלב (כלומר, ביטוי נמוך יותר של סמני MH) ולאחר מכן ייצור גרוע של hIO. שימוש במכשיר ציטומטריית זרימה קומפקטי איפשר גישה מהירה לתוצאות ציטומטריית זרימה והחלטה על איכות הבידול לפני המעבר לשלב הבא. תצפית מוזרה הייתה כי hiPSC מתוחזק על ידי מטריקס 2-AB הביא לפחות שחרור ספרואידים בשלב אמצע המעי האחורי בהשוואה למערכות אחרות שמקורן בבעלי חיים. היבט מרכזי נוסף שיש לציין הוא שמכיוון שמושבות של hiPSC שנשמרו במטריקס 4-XF כבר היו בעלות מבנה תלת-ממדי בתחילת ההתמיינות, מערכות אלה הובילו לספרואידים גדולים יותר.

ספרואידים הוטמעו במטריקס 1-ABO, מטריקס 3-ABO ומטריקס 4-XFO1- מטריקס 4-XFO4 והבשילו ל-hIO באמצעות ערכה. לאחר שהבשילו ספרואידים במשך 7 ימים, הם הועברו והוטמעו במערכות המטריצות שלהם. צמיחת האורגנואיד בכל מערכת הייתה במעקב במשך 7 ימים מתמונות שדה בהיר. בעוד שהתרבית התחילה עם אורגנואידים בגודל דומה יחסית, לאחר 5 ימים, גודל hIO השתנה כפונקציה של המטריצה שבה הם היו מוטמעים (איור 5). מבין ארבעת ה-Matrix 4-XFO, הנוסחה שיצרה אורגנואידים גדולים יותר הייתה Matrix 4-XFO3. מערכות Matrix 4-XFO מנוסחות עם ליגנדות שונות ותכונות מכניות שונות כדי להתאים למגוון יישומים²⁴. באופן ספציפי, קשיחות מטריקס 4-XFO3²⁵ קרובה יותר לנוקשות מעיים אנושית²⁶ מאשר ניסוחים אחרים של מטריקס 4-XFO, מה שתומך בממצאים אחרונים על התפקיד של תכונות מכניות ECM על התפשטות אורגנואידים 12,27,28. התוצאות המייצגות שלנו מצביעות על כך שמטריקס 1-ABO ומטריקס 3-ABO מסייעים באותה מידה לצמיחה והרחבה של אורגנואידי מעיים.

איור 3: בחירת מערכת מטריצה לתחזוקת iPSC. (A) תמונות מייצגות של שני קווי תאים שגדלו על כלי תרבית המצופים בשלוש מערכות מטריצה שונות שמקורן בבעלי חיים. (B) תמונות מייצגות המשווים את השימוש ב-Matrix 4-XF עם תוספת של 1x לעומת 3x גורם גדילה מראות כי הגדלת תוספי גורמי גדילה משפרת את הכדאיות של hiPSC בהידרוג'ל Matrix 4-XF. (C) השוואת ציטומטריית זרימה של ביטוי SSEA-4 של מטריצה 1-AB, מטריצה 3-AB, מטריצה 4-XF (3X) מראה ביטוי שווה ערך בעוד מטריצה 4-XF (1X) הובילה לביטוי נמוך יותר של SSEA-4. עמודות מייצגות ממוצע ± SD של n = 5; בדיקות ANOVA דו-כיווניות, ופוסט-הוק בשיטת Wilcoxon לא פרמטרית שימשו לבדיקת מובהקות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: התמיינות iPSC לאנדודרם מוגדר (DE) ולמעי אמצעי/אחורי (MH). (A) תמונות מייצגות של התמיינות iPSC ל-DE החל מרמות שונות של סמן SSEA4 מדגישות את החשיבות של התחלת התמיינות עם אוכלוסיית hiPSC עם ביטוי גבוה של סמני תאי גזע. החיצים האדומים מצביעים על אזורים של התמיינות ספונטנית לפני תחילת DE. (B) דוגמה לניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי סמן תאי גזע SSEA4 לפני תחילת התמיינות וסמן DE FOXA2 לאחר 3 ימים של התמיינות DE עבור התמיינות DE גרועה (משמאל) והתמיינות טובה (מימין). כל גרף מייצג את ניתוח התאים שחולצו מ-1; לצורך ניתוח סטטיסטי, מומלץ לממוצע את התוצאות מלפחות 3 ריצות ציטומטריית זרימה. (C) תמונות מייצגות של התמיינות iPSC ל-hIO בכל המטריצות שנחקרו. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: בחירת מערכת מטריצה להטמעת ספרואידים ולהבשלת hIO. (A) תמונות לדוגמה של הבשלה של hIO המשובצות במטריצה 4-XFO 1-4. המודולוס האלסטי של מערכות Matrix 4-XFO הוא בסביבות 50-300 Pa, כאשר הגבוה ביותר עבור Matrix 4-XFO3 > Matrix 4-XFO4 > Matrix 4-XFO2 > Matrix 4-XFO1. קשיחות מטריקס 1-ABO ומטריקס 3-ABO נעה בין 440-800 Pa בהתאם לאצווה. (B) תמונות לדוגמה של ההבשלה של hIO הוטמעו במטריקס 1-ABO, מטריקס 3-ABO ומטריקס 4-XFO3 ביום ההטבעה (יום 0) ולאחר שבוע אחד של תרבית (יום 7). (C) נתונים המציגים השוואת גודל של hIO שהבשיל במערכות המטריצות השונות. עמודות מייצגות ממוצע ± SD של n = 7; בדיקות ANOVA דו-כיווניות, ופוסט-הוק בשיטת Wilcoxon לא פרמטרית שימשו לבדיקת מובהקות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של אורגנואידי מעיים שגדלו במטריצות השונות מאשרות את אוכלוסיית תאי האפיתל. אורגנואידים שלמים של המעי שגדלו במטריצות השונות היו קבועים ומוכתמים במולקולת היצמדות תאי אפיתל (EpCAM) (ירוק) ומוכתמים נגד גרעיני התא DAPI (כחול). כל האורגנואידים מראים תאים חיוביים ל- EpCAM, המאשרים את אוכלוסיית תאי האפיתל הממוקמת על פני השטח החיצוניים של האורגנואידים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: סיכום הכנת aliquot, אחסון ודילול של מטריצות המשמשות לציפוי כלי תרבית המשמשים iPSC. * למקדם דילול מדויק יש לבדוק את מקדם הדילול המומלץ ו/או ריכוזי החלבונים בתעודת האנליזה של כל חלקה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: טבלת ייחוס של נפח פתרונות הציפוי לשטח פנים של כלי תרבית ו- mTeSR Plus Medium. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: טבלת ייחוס של נפח תמיסות מבשר מטריקס 4-XF לכל שטח פנים של כלי תרבית ותווך תאי גזע שלם. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: רשימת סמנים נפוצים מומלצים לאפיון hiPSC ו-hIO במהלך התהליך. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 5: סיכום המדיה הדרושה במהלך התמיינות hiPSC לאורגנואידים במעי. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 6: פרטים ספציפיים על שני קווי hiPSC ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

קובץ משלים 1: קוד MATLAB כללי לשינוי בהתאם לסוג תמונה ספציפי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

בחירת המיקרו-סביבה האופטימלית לעבודה של תאי גזע ואורגנואידים היא צעד מוקדם מכריע בעת שימוש בפלטפורמות אלה למגוון רחב של יישומים. התוצאות המייצגות שלנו מראות כי מטריקס 4-XFO3, בשילוב עם ריכוז גבוה יותר של גורמי גדילה, מוביל לאורגנואידים גדולים יותר, דבר המצביע על כך שניתן לרתום את התכונות הפיזיקליות של הידרוג'לים נטולי קסנו כדי לייעל את ייצור האורגנואידים באמצעות מערכות אלה. הוכח בעבר כי המאפיינים הייחודיים של המטריצה החוץ תאית (ECM) קשורים קשר הדוק עם זהות התאים בתוך האיבר¹². מכיוון שתאים חשים כוחות חיצוניים באמצעות אינטגרינים וקולטנים אחרים, המאפיינים המכניים של ECM משפיעים עמוקות על תאי גזע, ובתגובה, תאי גזע יכולים לייצר כוחות פנימיים¹². אינטראקציות בין תאי הגזע לבין המיקרו-סביבה שלהם הן המפתח להתחלת מסלולי איתות מגוונים¹². בנוסף, הוכח כי ECM יכול לשמש כמאגר לאחסון ושחרור גורמי גדילה ומולקולות איתות אחרות המשפיעות על התנהגות התא. לפיכך, התוצאות המייצגות שלנו ועשרות שנים של מחקר מדגישות את החשיבות של התחשבות בהיבטים ביוכימיים ופיזיקליים של מיקרו-סביבה טבעית של התא ותכונות רקמות בעת בחירת מערכות מטריצה לחקירות חוץ גופיות ^29,30.

מספר צעדים קריטיים והמלצות הוסברו באמצעות הפרוטוקול כדי לייעץ למשתמשים על בעיות פוטנציאליות ודרכים להימנע מהן. עם זאת, שני שלבים קריטיים מוצגים בשיטות אלה שהם מרכזיים ליישום מוצלח של פרוטוקול זה. ראשית, בדיקת סמנים ספציפיים הקשורים לאוכלוסיית תאי הגזע חיונית לקביעת מערכת הציפוי האופטימלית כדי לשמור על אוכלוסיית תאי הגזע מוכנה להתמיינות מבוקרת יעילה. באופן דומה, אישור ביטוי הסמנים הקשורים לכל שלב בידול חיוני להחלטה מתי להמשיך לשלב הבא. פרוטוקול זה מספק הנחיה כללית לגבי הזמן המינימלי הנדרש בכל שלב. עם זאת, הזמן האופטימלי בכל שלב ישתנה עבור קווי תאים שונים ותנאי ניסוי שונים (למשל, גנוטיפ, קשיחות). לכן, אפיון סמנים ספציפיים לשלב מרובים הוא הגישה הטובה ביותר לשיפור היעילות של יצירת hIO.

השלב הקריטי השני היה שילוב ריכוז גבוה יותר של גורמי גדילה בעת שימוש במערכת Matrix 4-XF נטולת קסנו, שהיא בעלת חשיבות עליונה. מגבלה אחת המודגשת לעתים קרובות של מערכות ביו-חומרים נטולות קסנו היא היעדר גורמי גדילה³¹. עם זאת, חולשה זו יכולה להפוך לחוזקה: שליטה מלאה בגורמי הצמיחה במערכות כדי לשפר את יכולת השחזור. בעוד שפרוטוקול זה מתאר שימוש במדיה זמינה מסחרית ובערכת תוספי גורמי גדילה, ניתן להשתמש באותו רציונל בעת יצירת המדיה המלאה בתוך החברה עם רכיבים בודדים. היחס הספציפי הידרוג'ל/מדיה מנחה כמה גבוה צריך להיות ריכוז גורמי הגדילה; לדוגמה, יחס של 2:1 עשוי לדרוש ריכוז של פי 3 של גורמי גדילה כדי להגיע לריכוז המייצג את המדיה המלאה הסטנדרטית שבה נעשה שימוש. שליטה מלאה בגורמי הצמיחה הקיימים במערכת מועילה לענות על שאלות מכניסטיות ולהימנע מבעיות רגולטוריות עבור יישומים רבים.

שלבי עיבוד התמונה המתוארים בשלב 3 מוגבלים על-ידי איכות התמונות וסוג התמונות שצולמו. ייתכן שיהיה צורך בליטוש כדי להתאים לדרישות הספציפיות של כל סוג תמונה ואיכות. עם זאת, השלבים הכוללים של התהליך ומדגם של קוד MATLAB של המסגרת הבסיסית לניתוח גודל אורגנואיד מתמונות brightfield עוזרים להגדיר זרימת עבודה שניתן למטב ולהרחיב עוד יותר. יתר על כן, גישה למיקרוסקופ שדה בהיר נפוצה יותר מאשר סוגים אחרים של מיקרוסקופים. בעוד שחוסר גישה והיכרות עם MATLAB עשויים להגביל את השימוש בקוד זה, השלבים הכלליים של התהליך תואמים לתוכנות קוד פתוח כגון פיג'י לפי תמונה J. גודל אורגנואיד לבדו אינו מדד מומלץ להערכת התבגרות; מומלץ לעקוב אחר הערכה של סמנים ספציפיים המייצגים את איבר היעד; חלק מסמנים אלה לרקמת המעי כלולים בטבלה 4. איור 6 מראה דוגמה של צביעה אימונופלואורסצנטית של אורגנואידים שלמים עם מולקולת היצמדות תאי אפיתל (EpCAM), אשר ממוקמת לפני השטח החיצוניים (בזולטרליים) של האורגנואידים. בעוד EpCAM הודגם באורגנואידים שגודלו בתרבית בכל מערכות ECM, היו הבדלים בגודל של אורגנואידים אלה. לכן, מידע על גודל אורגנואיד מסייע לייעל את תנאי הגידול. יתר על כן, במחקרי תגובה לתרופות, גודל האורגנואידים משמש כמדד לתגובה לתרכובת הנבדקת; שינויים בגודל יכולים לשקף את היעילות או הרעילות של התרכובות הנבדקות. חשוב לציין, יצירת קבוצות מרובות של אורגנואידים בגודל סטנדרטי היא אתגר עכשווי בתחום, אך זהו מדד חשוב של יכולת שחזור ניסויים, כך שניתן להשוות תוצאות בין ניסויים או מעבדות שונות. בסך הכל, זרימת עבודה אוטומטית המאפשרת חילוץ של מידע חשוב על אורגנואידים מתמונות שדה בהיר היא כלי מועיל עבור חוקרים רבים.

לשתי המערכות, מטריצות מן החי והידרוג'לים נטולי קסנו, יש יתרונות וחסרונות. מטריצה 2-AB המובילה לפחות שחרור ספרואידים במהלך שלב MH מאשר מטריצות אחרות שמקורן בבעלי חיים יכולה לנבוע משינויים של לוט ללוט, מאפיין ידוע של מטריצות שמקורן בבעלי חיים הזמינים מסחרית. חשוב לציין כי הריכוז של מערכות ECM זמין מסחרית משתנה; לדוגמה, גורמי הדילול ביריעות מפרט המוצר שימשו להכנת תמיסות הציפוי, מה שעשוי להוביל לריכוזים מעט שונים במקרה של המטריצות שמקורן בבעלי חיים. הבדלים אלה בריכוז החלבונים יכולים להשפיע באופן משמעותי על הבידול, מה שמוביל לשונות ביעילות ההתמיינות בעת שימוש באותו מוצר ממגרשים שונים. כדי לבחור בין מערכות אלה, שקול גורמים כגון מטרות ניסוי ספציפיות, שיקולים אתיים ודרישות רגולטוריות. לדוגמה, במקרים של השוואת תוצאות ניסויי מבחנה עם מודל של חיות עכבר כדי לענות על שאלות ביולוגיה של גידולים וסרטן, שימוש במטריצות הנגזרות מעכבר Engelbreth-Holm Swarm EHS יכול להיות בחירה מצוינת. כמו כן, מכיוון שמוצרים כגון Matrigel נמצאים בשימוש במשך עשרות שנים, ישנם פרוטוקולים רבים, נתונים והפניות. עם זאת, שימוש במטריצות מוגדרות היטב ללא קסנו המאפשרות התאמה אישית של תכונות פיזיקליות וכימיות עשוי להיות אפשרות מתאימה יותר כאשר שאלת המחקר קשורה למחלות או טיפולים אנושיים. כמו כן, רוב מערכות ההידרוג'ל נטולות הקסנו מתוכננות לעמוד בתקנים רגולטוריים, מה שהופך אותן לבחירה מתאימה למחקר הדורש עמידה בתנאי ייצור נאותים (GMP) או הנחיות רגולטוריות אחרות.

לסיכום, בעוד שמטריצות שמקורן מן החי נמצאות בשימוש נרחב לתחזוקת iPSC ולייצור אורגנואידים בשל התאימות הביולוגית שלהן, מערכות הידרוג'ל נטולות קסנו מציעות יתרונות במונחים של יכולת שחזור, עלות-תועלת, תאימות לתקנות ושיקולים אתיים. הבחירה בין השניים תלויה בצרכים הספציפיים של המחקר או היישום הקליני. מערכות הידרוג'ל נטולות קסנו צוברות פופולריות כחלופה מגוונת ובת קיימא יותר שיכולה לתמוך בשימוש באורגנואידים ומערכות מיקרופיזיולוגיות לרשימה הקצרה הפרה-קלינית של מועמדים טיפוליים. יישום זה יכול לשפר באופן משמעותי פיתוח תרופות מוקדם ולסייע בהתמודדות עם אתגרי התרגום הקליני הנוכחיים בתעשיית התרופות.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צלחת 24 בארות (מטופלת בתרבית, סטרילית)	פלקון	353504
37 מעלות; אמבט מים	C VWR
96 בארות צלחת	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
שטיפה נגד היצמדות Solutio	STEMCELL Technologies	7010
ארון בטיחות ביולוגי (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
צנטריפוגה עם בקרת טמפרטורה (4 ° יכולות C)	צינורות חרוטיים של ThermoScientific	75002441
, 15 מ"ל,	של Thermo Fisher	Scientific 339650
50 מ"ל, סטרילי	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, סוג 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (ללא Ca++ ו-Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
Geltrexללא LDEV, מוסמך hESC להפחית גורם גדילה	Gibco	A14133-02
תוסף GlutaMAX	תרמו פישר סיינטיפיק	35050-061
מנתח תאי גויאבה מוזה או ציוד זרימה ציטומטרי אחר (אופציונלי)	Luminex	0500-3115
תמיסת חיץ HEPES	תרמו פישר סיינטיפיק	15630-056
חממת תרבית תאים של Heralcell Vios (37 & deg; C, 5% CO2)	Thermo Scientific
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) מטריצת ממברנת מרתף LDEV ללא	קורנינג
מטריצת מטריג'ל בריכוז גבוה (HC), מקדם גדילה מופחת (GFR), קורנינג נטול LDEV
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta משטח מטופל צלחת 24 בארות	Thermo Scientific	144530
PE עכבר אנטי אנושי CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse אנטי אנושי CDX2	BD Pharmingen	563428
PE עכבר אנטי אנושי FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 עכבר אנטי אנושי SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	13-678-11E
פיפטות סרולוגיות (5 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	13-678-11D
STEMdiff גידול אורגנואיד במעי בינוני	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff ערכת אורגנואיד מעיים	STEMCELL Technologies	5140
מטריצת הידרוג'ל ויטרוג'ל	TheWell Bioscience	VHM01
ערכת גילוי אורגנואיד VitroGel	TheWell Bioscience	VHM04-K