אנו מתארים שיטה לחקור כיצד pH מגיב לרמזים סביבתיים בגליקוזיומים של צורת זרם הדם של טריפנוזומים אפריקאים. גישה זו כוללת חיישן חלבון תורשתי רגיש ל- pH בשילוב עם ציטומטריית זרימה למדידת דינמיקת pH, הן כבדיקת מסלול זמן והן בפורמט מסך בתפוקה גבוהה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת שינויי pH גליקוזומליים דינמיים בטריפנוזומה ברוסי חי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי עבור טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei, כתהליך מטבולי חיוני ומווסת של התפתחות טפילים. מעט ידוע על התגובות התאיות שנוצרות כאשר רמות הגלוקוז בסביבה משתנות. הן בטפילים של זרם הדם והן בצורה פרוציקלית (שלב החרקים), גליקוזים מאכלסים את רוב הגליקוליזה. אברונים אלה חומציים במהירות בתגובה למחסור בגלוקוז, מה שככל הנראה גורם לוויסות אלוסטרי של אנזימים גליקוליטיים כגון הקסוקינז. בעבודה קודמת, לוקליזציה של הגשושית הכימית המשמשת לביצוע מדידות pH הייתה מאתגרת, והגבילה את התועלת שלה ביישומים אחרים.
מאמר זה מתאר את התפתחותם והשימוש בטפילים המבטאים pHluorin2 מקומי גליקוסומלי, חלבון תורשתי pH biosensor. pHluorin2 הוא וריאנט pHluorin יחסימטרי המציג ירידה תלוית pH (חומצה) בעירור ב 395 ננומטר ובו זמנית מניב עלייה בעירור ב 475 ננומטר. טפילים טרנסגניים נוצרו על ידי שיבוט מסגרת הקריאה הפתוחה pHluorin2 לתוך וקטור ביטוי טריפנוזום pLEW100v5, המאפשר ביטוי חלבון מושרה בכל אחד משלבי מחזור החיים. Immunofluorescence שימש כדי לאשר את הלוקליזציה הגליקוזומלית של biosensor pHluorin2, השוואת לוקליזציה של biosensor לחלבון תושב glycosomal aldolase. תגובתיות החיישן כוילה ברמות pH שונות על ידי דגירה של תאים בסדרה של מאגרים שנעו ב-pH בין 4 ל-8, גישה בה השתמשנו בעבר כדי לכייל חיישן pH מבוסס פלואורסצאין. לאחר מכן מדדנו פלואורסצנטיות pHluorin2 ב-405 ננומטר וב-488 ננומטר באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע pH גליקזומלי. תיקפנו את הביצועים של הטפילים החיים המבטאים pHluorin2 מהונדס, תוך ניטור pH לאורך זמן בתגובה למחסור בגלוקוז, גורם ידוע להחמצה גליקוזומלית בטפילי PF. לכלי זה יש מגוון יישומים פוטנציאליים, כולל שימוש פוטנציאלי בסינון תרופות בתפוקה גבוהה. מעבר ל-pH גליקזומלי, ניתן להתאים את החיישן לאברונים אחרים או להשתמש בו בטריפנוזומטים אחרים כדי להבין את דינמיקת ה-pH בסביבת התא החי.
מבוא
קינטופלסטים טפיליים, כמו רוב האורגניזמים החיים, מסתמכים על גלוקוז כמרכיב בסיסי במטבוליזם המרכזי של פחמן. קבוצה זו כוללת אורגניזמים חשובים מבחינה רפואית, כגון טריפנוזום אפריקאי, Trypanosoma brucei; הטריפנוזום האמריקאי, T. cruzi; וטפילים מהסוג לישמניה. מטבוליזם של גלוקוז הוא קריטי לצמיחת הטפילים בשלבי מחזור החיים הפתוגניים. לדוגמה, כאשר נמנע גלוקוז, צורת זרם הדם (BSF) של טריפנוזום אפריקאי מת במהירות. יש לציין כי גליקוליזה משמשת כמקור היחיד ל-ATP בשלב זה של זיהום1. טפילי לישמניה תלויים גם הם בגלוקוז בפונדקאי האנושי, כאשר שלב מחזור החיים של האמסטיגוט השוכן במקרופאגים של הפונדקאי מסתמך על מקור פחמן זה לגדילה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
שימוש ב- T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomes, קו טפיל מונומורפי, דורש התחשבות בבטיחות מכיוון שהם נחשבים לאורגניזמים מקבוצת סיכון 2 שיש לטפל בהם במתקני בטיחות ביולוגית ברמה 2.
1. תרבות טריפנוזום וטרנספקציה
- תרבית T. brucei brucei 90-13 BSF טריפנוזומים במדיום HMI-9 בתוספת 10% FBS מומת חום ו-10% Nu-Serum ב-37°C ב-5% CO210.
הערה: כדי לשמור על תרבית בריאה, לשמור על צפיפות התאים בין 2 × 104 ו 5 × 106 תאים / מ"ל. - שיבוט pHluorin2-PTS1 לתוך pLEW100v5
- סנתז את מסגרת הקריאה הפתוחה pHluorin2 באופן מסחרי כדי להניב את הגן עם סיומת 3....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
pHLuorin2-PTS1 לוקליזציה לגליקוזים ב- BSF T. brucei
כדי להעריך את הלוקליזציה התת-תאית של pHluorin2-PTS1, טפילים היו נתונים לבדיקות immunofluorescence. אות מהטרנסגן שעבר לוקליזציה עם אנטי-סרה שהועלה כנגד חלבון תושב גליקוזיום, אלדולאז (TbAldolase) (איור 2A). מקדם המתאם הממוצע של פירסון בין אנטי-TbAldolase ו-pHluorin2-PTS1 היה 0.895, מה שמצביע על כך ש-pHluorin2-PTS1 היה מקומי בעיקר לגליקוזים. עם pHluorin2-PTS1 מקומי לגליקוזום, המשכנו לחקור את רמת החומציות של גליקוזי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התפיסה הסביבתית ומנגנוני התגובה בטריפנוזום האפריקאי אינם מובנים היטב. ידוע כי שינויים בזמינות החומרים המזינים מעוררים תגובות מגוונות בטפיל, כולל החמצה של גליקוזים. במאמר זה תיארנו שיטה לחקר תגובת pH גליקוזומלית להפרעות סביבתיות בתאים חיים באמצעות חיישן חלבון תורשתי, pHluorin2 וציטומטריית זרימה.
ישנם מספר שלבים קריטיים בשימוש בחיישן. ראשית, אפיון הטפילים הנגועים המבטאים את הטרנסגן חשוב, שכן יכולה להיות שונות בין תא לתא בביטוי. רמות הביטוי של טרנסגנים מסוימים יכולות לרדת עם הזמן. אמנם זה לא נצפה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
תודות
pHluorin2-PTS1 שוכפל לתוך pLEW100v5 על ידי Twist Bioscience שסיפקה את המבנה בווקטור שיבוט עתיר עותקים; pLEW100v5 היה מתנה מד"ר ג'ורג' קרוס. אנטי-סרום שהועלה נגד T. brucei aldolase זמין מד"ר מרדית ט. מוריס, אוניברסיטת קלמסון, על פי בקשה. העבודה ממעבדות JCM ו- KAC נתמכה חלקית על ידי פרס מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01AI156382). SSP נתמך על ידי NIH 3R01AI156382.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 50 מ"ל צלוחיות תרבית רקמות (לא מטופלות, סטריליות) | VWR | 10861-572 | |
| 75 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות (לא מטופל, סטרילי) | קורנינג | 431464U | |
| 80 ומיקרו; L צלחת 384 בארות שטוחה | BrandTech | 781620 | |
| נוקלאופקטור תאי T אנושיים של Amaxa ערכת | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT זרימה ציטומטר | invitrogen מאת Thermo Fisher Scientific | A24858 | תוכנת FlowJo |
| BRANDplates 96-Well, צלחת תחתונה שטוחה | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 תוסף של ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen מאת Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX זרימה ציטומטר | בקמן-קולטר | ||
| מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית 16% תמיסה מימית פרפורמלדהיד, דרגת EM, 10 מ"ל אמפולה | פישר סיינטיפיק | 50-980-487 | |
| GraphPad פריזמה | תוכנה סטטיסטית | ||
| ניגריצין (מלח נתרן) | קיימן כימי | 11437 | |
| נוקלאופקטור 2b | Lonza Discontinued Product | ||
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) ב-H2O | Sigma Life | Science CAS:25988-63-0 | רובוט צנרת לבדיקת HTS |
| תיאזול אדום (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | עשינו מעמד צלחת אקרילי מותאם אישית כך שניתן יהיה לזהות את מותג הצלחת הזה ולהשתמש בו ב-CytKick Max Auto שלנו סמפלר |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | רובוט צנרת לבדיקת HTS |
| לכיול pH | |||
| לכיול pH |
מקורות
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
