Method Article

מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

DOI:

10.3791/66310

⸱

July 19th, 2024

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פענוח יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנד בקומפלקס מקרומולקולרי חיוני להבנת המנגנון המולקולרי, התהליכים הביולוגיים העומדים בבסיסו ופיתוח תרופות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ אלקטרונים בדגימה קריוגנית (cryoEM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לקביעת מבנים של מקרומולקולות ולחקור את אופן קשירת הליגנד ברזולוציה כמעט אטומית. זיהוי ומידול מולקולות שאינן חלבונים במפות cryoEM הוא לעתים קרובות מאתגר בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המולקולה המעניינת והרעש המובנה בנתונים. במאמר זה, הקוראים נחשפים לתוכנות ושיטות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדים, בניית מודלים ושכלול קואורדינטות אטומיות באמצעות מקרומולקולות נבחרות. אחת הדרכים הפשוטות ביותר לזהות נוכחות של ליגנד, כפי שמודגם עם אנזים האנולז, היא להחסיר את שתי המפות המתקבלות עם ובלי הליגנד. הצפיפות הנוספת של הליגנד עשויה לבלוט במפת ההפרשים גם בסף גבוה יותר. ישנם מקרים, כפי שמוצג במקרה של קולטן גלוטמט מטבולי mGlu5, כאשר מפות הבדל פשוטות כאלה לא ניתן ליצור. השיטה שהוצגה לאחרונה לגזירת מפת ההשמטה Fo-Fc יכולה לשמש ככלי לאימות והדגמת נוכחות הליגנד. לבסוף, תוך שימוש בגלקטוזידאז β שנחקר היטב כדוגמה, מנותחת השפעת הרזולוציה על מידול הליגנדות ומולקולות הממס במפות cryoEM, ומוצגת השקפה על האופן שבו ניתן להשתמש ב- cryoEM בגילוי תרופות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים משיגים את תפקידיהם על ידי ביצוע אינספור תגובות כימיות בו זמנית ובאופן עצמאי, כל אחת מווסתת בקפידה כדי להבטיח את הישרדותם ואת יכולת ההסתגלות שלהם בתגובה לרמזים סביבתיים. זה מושג על ידי זיהוי מולקולרי, המאפשר ביומולקולות, במיוחד חלבונים, ליצור קומפלקסים חולפים או יציבים עם מקרומולקולות אחרות, כמו גם מולקולות קטנות או ליגנדות1. לפיכך, אינטראקציות חלבון-ליגנד הן בסיסיות לכל התהליכים בביולוגיה, הכוללים את ויסות ביטוי ופעילות החלבון, זיהוי מצעים וקו-פקטורים על ידי אנזימים, כמו גם כיצד תאים תופסים ומעבירים אותות 1,2. הבנה טובה יותר של התכונות הקינטיות, התרמודינמיות והמבניות של קומפלקס החלבון-ליגנד חושפת את הבסיס המולקולרי של אינטראקציית ליגנד וגם מאפשרת תכנון רציונלי של תרופות על ידי אופטימיזציה של אינטראקציה וספציפיות של תרופות. גישה חסכונית ומהירה יותר לחקר אינטראקציה בין חלבונים לליגנדים היא שימוש בעגינה מולקולרית, שהיא שיטה חישובית שלמעשה סורקת מגוון רחב של מולקולות קטנות וחוזה את מצב הקישור והזיקה של ליגנדות אלה לחלבוני מטרה3. עם זאת, ראיות ניסיוניות ממבנים ברזולוציה גבוהה שנקבעו על ידי עקיפה של קרני רנטגן (XRD), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או קריומיקרוסקופ אלקטרונים (cryoEM) מספקות את ההוכחה החיונית לתחזיות כאלה ומסייעות בפיתוח מפעילים או מעכבים חדשים ויעילים יותר למטרה נתונה. מאמר זה משתמש בקיצור 'cryoEM' כפי שנהוג להתייחס לטכניקה. עם זאת, קיים ויכוח מתמשך על בחירת המינוח הנכון, ולאחרונה הוצע המונח cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM) כדי לציין שהדגימה נמצאת בטמפרטורה קריוגנית ומצולמת עם אלקטרונים4. באופן דומה, המפות הנגזרות מ- cryoEM נקראו פוטנציאל אלקטרונים, פוטנציאל אלקטרוסטטי או פוטנציאל קולומב, ולשם הפשטות, כאן אנו משתמשים במפות cryoEM 5,6,7,8,9,10.

למרות ש-XRD הייתה טכניקת תקן הזהב בקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים של ליגנד חלבונים, לאחר מהפכת הרזולוציה11 cryoEM צברה תאוצה, כפי שעולה מהנחשול של מפות פוטנציאליות קולומב או מפות cryoEM שהופקדו במסד הנתונים של מיקרוסקופ אלקטרונים (EMDB)12,13 במהלך השנים האחרונות14. הודות להתקדמות בהכנת דגימות, הדמיה ושיטות עיבוד נתונים, מספר תצהירי בנק נתוני החלבונים (PDB)14 המשתמשים ב- cryoEM גדל מ- 0.7% ל- 17% בין 2010 ל- 2020, כאשר כ- 50% מהמבנים שדווחו בשנת 2020 נקבעו ברזולוציה של 3.5 Å או טוב יותר15,16. CryoEM אומץ במהירות על ידי קהילת הביולוגיה המבנית, כולל תעשיית התרופות, מכיוון שהוא מאפשר לחקור מקרומולקולות ביולוגיות גמישות ולא גבישיות, במיוחד חלבוני ממברנה וקומפלקסים מרובי חלבונים, ברזולוציה כמעט אטומית, להתגבר על תהליך ההתגבשות ולקבל גבישים דיפרקציה היטב הדרושים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי XRD.

מידול מדויק של הליגנד במפת cryoEM הוא בעל חשיבות עליונה, מכיוון שהוא משמש כשרטוט של קומפלקס ליגנד החלבונים ברמה המולקולרית. ישנם מספר כלים אוטומטיים לבניית ליגנדים המשמשים בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן התלויים בצורה ובטופולוגיה של צפיפות הליגנד על מנת להתאים או לבנות את הליגנד לצפיפות אלקטרונים 17,18,19,20. עם זאת, אם הרזולוציה נמוכה מ- 3 Å, גישות אלה נוטות לייצר תוצאות פחות רצויות מכיוון שהתכונות הטופולוגיות שבהן הן תלויות לצורך הכרה ובנייה הופכות פחות מוגדרות. במקרים רבים, שיטות אלה הוכחו כלא יעילות במידול מדויק של ליגנדות למפות cryoEM, מכיוון שמפות אלה נקבעו בטווח הרזולוציה הנמוכה עד בינונית, בדרך כלל בין 3.5 Å-5 Å17.

השלב הראשון בקביעת מבנה תלת-ממדי של קומפלקס ליגנד חלבוני על ידי cryoEM כולל טיהור משותף של הליגנד עם החלבון (כאשר לליגנד יש זיקה גבוהה לחלבון) או דגירה של תמיסת החלבון עם הליגנד למשך זמן מסוים לפני הכנת הרשת. לאחר מכן, נפח דגימה קטן מונח על רשת TEM חורית מנוקה פלזמה, ואחריו הקפאת הבזק באתאן נוזלי ובסופו של דבר הדמיה עם cryo-TEM. תמונות ההקרנה הדו-ממדיות ממאות אלפי עד מיליוני חלקיקים בודדים ממוצעות כדי לשחזר מפה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של פוטנציאל קולומב של המקרומולקולה. זיהוי ומידול ליגנדות ומולקולות ממס במפות אלה מציבים אתגרים משמעותיים במקרים רבים בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המפה (כלומר, הרזולוציה אינה אחידה על פני המקרומולקולה), גמישות באזור שבו הליגנד קשור והרעש בנתונים. רבים מכלי המידול, העידון וההדמיה שפותחו עבור XRD מותאמים כעת לשימוש ב- cryoEM לאותן מטרות 18,19,20,21. במאמר זה מוצגת סקירה כללית של שיטות ותוכנות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדות, בניית מודלים וחידוד הקואורדינטות הנגזרות מ- cryoEM. פרוטוקול שלב אחר שלב סופק כדי להמחיש את התהליכים המעורבים במידול ליגנדות באמצעות קומפלקסים ספציפיים של ליגנדים חלבוניים ברזולוציה ומורכבות משתנות.

השלב הראשון במידול ליגנדות במפות cryoEM כולל זיהוי צפיפות הליגנד (שאינו חלבון) במפה. אם קשירת ליגנד אינה גורמת לשינוי קונפורמטיבי כלשהו בחלבון, אזי חישוב מפת הפרשים פשוטה בין קומפלקס החלבון-ליגנד לבין חלבון האפו-חלבון מדגיש למעשה את האזורים בעלי צפיפות יתרה, מה שמרמז על נוכחות הליגנד. הבדלים כאלה ניתן לראות מיד, כפי שהוא דורש רק שתי מפות, ואפילו מפות ביניים במהלך תהליך של עידון 3D ניתן להשתמש כדי לבדוק אם הליגנד קיים. בנוסף, אם הרזולוציה גבוהה מספיק (<3.0 Å), מפת ההפרשים יכולה גם לספק תובנות לגבי המיקום של מולקולות מים, כמו גם יונים המקיימים אינטראקציה עם הליגנד ושאריות החלבון.

בהיעדר מפת חלבון אפו, ניתן כעת להשתמש ב- Servalcat22, הזמין ככלי עצמאי ושולב גם בחבילת התוכנה CCP-EM23,24 כחלק מעידון Refmac ובשחרור CCP4 8.025,26. Servalcat מאפשר חישוב של מפת הפרש משוקלל FSC (Fo-Fc) באמצעות חצאי מפות לא מחודדות ומודל אפופרוטאין כקלט. מפת השמיטה Fo-Fc מייצגת את הפער בין המפה הניסויית (Fo) לבין המפה הנגזרת מהמודל (Fc). בהיעדר ליגנד במודל, צפיפות חיובית במפת Fo-Fc החופפת למפת EM ניסיונית בדרך כלל מרמזת על נוכחות הליגנד. ההנחה כאן היא ששרשרת החלבונים מותאמת היטב במפה, והצפיפות החיובית הנותרת מצביעה על מיקום הליגנד. עם זאת, חשוב לבחון היטב האם הצפיפות החיובית נובעת מאי דיוקים במידול, כגון רוטמר שגוי של שרשרת צדדית של חלבון.

השלב השני כרוך בהשגה או יצירה של קובץ קואורדינטות קרטזי של הליגנד עם גאומטריה מוגדרת היטב מהמידע הכימי הזמין. ליגנדות סטנדרטיות (לדוגמה, ATP ו-NADP+) שכבר זמינות בספריית המונומרים CCP4 יכולות לשמש לעידון על-ידי אחזור קובצי הקואורדינטות והגיאומטריה באמצעות קוד ההצטרפות המונומרי שלהם. עם זאת, עבור ליגנדות לא ידועות או לא סטנדרטיות, כלים שונים זמינים ליצירת קובצי הגיאומטריה. חלק מהדוגמאות כוללות את eLBOW27 - (בונה ליגנדים אלקטרוניים ושולחן עבודה אופטימיזציה) בפניקס28, לידיה - כלי מובנה ב- Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-מודול של Glide בתוך חבילת שרדינגר. לאחר מכן קובץ קואורדינטות הליגנד מותאם בצפיפות, מונחה הן על ידי מפת ה- cryoEM הניסיונית והן על ידי מפת ההפרשים ב- Coot. זה ואחריו עידון החלל האמיתי בפניקס28 או עידון הדדי ב Refmac33. תחנת עבודה לינוקס או מחשב נייד מצויד כרטיס גרפי טוב ואת התוכנה הנ"ל נדרש. רוב התוכניות הללו כלולות בסוויטות שונות. CCP-EM24 ו- Phenix28 זמינים באופן חופשי למשתמשים אקדמיים וכוללים מגוון כלים המשמשים במאמר זה, כולל Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine וכו '. באופן דומה, Chimera37, ו- ChimeraX38 מספקים רישיונות בחינם למשתמשים אקדמיים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מידול phosphoenolpyruvate (PEP) ב enolase מ Mycobacterium tuberculosis

  1. זיהוי צפיפות ליגנד במפת cryoEM של קומפלקס PEP-enolase
    1. הורד את חצאי המפות הלא מחודדות (emd_30988_additional_1.map ו- emd_30988_additional_2.map) של apo-enolase מהנתונים הנוספים ב- EMDB (ראה טבלת חומרים).
    2. פתח את ChimeraX (ראה טבלת חומרים). פתח את חצאי המפות של apo-enolase על ידי לחיצה על פתח מסרגל הכלים ובחירת שמות הקבצים. הקלד vop הוסף #1 #2 בשורת הפקודה כדי לשלב את שתי חצאי המפות כדי לקבל את המפה apo-enolase unsharpened.
      הערה: #1 ו- #2 מציינים את שני חצאי המפות עבור האנזים apo-enolase, כפי שהוזכר בשלב 1.1.1.
    3. שנה את שם המפה המשולבת (מזהה מפת ChimeraX: #3) על ידי הקלדת שינוי שם #3 Apo-enolase-unsharpened-map. צבעו את המפה באפור מהחלונית 'דגם'. המפה מציינת כי אנולאז הוא אוקטמרי בתמיסה עם סימטריה D4.
    4. חזור על שלבים 1.1.1-1.1.3 באמצעות חצאי המפות הבאים emd_30989_additional_1.map (מזהה מפה: 4) ו- emd_30989_additional_2.map (מזהה מפה:5) כדי להשיג PEP-enolase-unsharpened-map (מזהה מפה: #6).
    5. על מנת לחשב מפת הבדלים, תחילה התאימו את שתי המפות (PEP-enolase ו- apo-enolase מפות לא מחודדות משלב 1.1.3 ושלב 1.1.4) זו לזו על ידי לחיצה על Fit (מפה במפה) בחלונית Map (סרגל כלים) ב- ChimeraX.
      הערה: לא מתבצעת נורמליזציה בין שתי המפות. במקרים מסוימים, ייתכן שתידרש נורמליזציה כדי להביא את המפות לאותו קנה מידה.
    6. החסר את מפת PEP-enolase ממפת apo-enolase על-ידי הקלדת vop subtract #6 #3 בשורת הפקודה.
      הערה: #6 = מפה לא מחודדת PEP-enolase, #3 = מפה לא מחודדת Apo-enolase.
    7. צבעו את המפה שהוחסרה (מפה ID:7) בירוק, תוך ציון צפיפות חיובית (לפי המוסכמה בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן)39.
    8. הורד את הקואורדינטות של M. tuberculosis octameric enolase (PDB: 7e4x) מבנק נתוני החלבונים (PDB), לחץ על פתח מסרגל הכלים ובחר את שם הקובץ.
    9. שנה את שם הדגם 7e4x.pdb על-ידי הקלדת שנה שם #8 Apo_enolase.pdb בשורת הפקודה. #8 מציין את Apo_enolase.pdb ב- ChimeraX.
    10. בחרו בדגם מהחלונית 'דגם'. לחץ על העכבר הימני מסרגל הכלים. לחץ על מולקולת Move כדי למקם את המודל בקרבת מפת PEP-enolase (# 3) וליישר את המודל ביחס למפה. התאם מודל זה למפה PEP-enolase-unsharpened-על-ידי הקלדת fit #8 in #6 בשורת הפקודה. כאן, המפה ממוספרת 6, והדגם ממוספר 8.
      הערה: במקרים מסוימים, ההתאמה המקומית ב- ChimeraX עשויה שלא להספיק כדי ליישר את הדגם. במקרים אלה, שלב נוסף של התאמה גלובלית (DockinMap, ראה טבלת חומרים) עשוי להתבצע בפניקס.
    11. שמור את הדגם המותאם על ידי הקלדת שמור Apo-enolase.pdb #8 בשורת הפקודה.
  2. מידול וחידוד של PEP במפת cryoEM מושחזת של גורם B של קומפלקס PEP-enolase
    1. פתח את "coot" (ראה טבלת חומרים) מהמסוף על ידי הקלדת ./Coot &.
    2. הצג "Apo-enolase.pdb" על ידי לחיצה על קובץ > פתח קואורדינטות Apo-enolase.pdb. קובץ הקואורדינטות מוצג על ידי קשרים (צבע לפי אטום).
    3. הורד את המפה המחודדת Enolase הקשורה ל- PEP, כלומר, emd_30989.map מ- EMDB. הצג אותו על ידי לחיצה על קובץ > פתח מפה > emd_30989.map . הגדר את הסף ל- 7.00 σ על-ידי גלילה בלחצן העכבר האמצעי.
    4. מצא כתמים ללא דגם על ידי לחיצה על Validate > Unmodeled blobs > Find Blobs.
    5. אתר את צפיפות הליגנד ללא מודל ליד שאריות האתר הפעיל, Ser 42, Lys-386 ו- Arg-364 של מודל האנולז.
    6. קבל את קובץ מודל מונומר PEP מספריית מונומר Coot על ידי לחיצה על קובץ > קבל מונומר והזנת PEP כקוד 3 אותיות.
    7. הזיזו את מולקולת PEP לצפיפות בעזרת האפשרות 'סובב/תרגם- אזור/שרשרת/מולקולה בתפריט סרגל הצד'. השתמשו בעידון החלל האמיתי ב-Coot כדי להתאים את מולקולת ה-PEP לצפיפות על ידי לחיצה על Real Space Refine Zone בתפריט סרגל הצד. מזג את הליגנד המותאם עם Apo-enolase.pdb באמצעות האפשרות Merge Molecule בכרטיסייה עריכה . שמור את המודל כ - PEP-Enolase.pdb.
      הערה: ניתן גם להשתמש באפשרות ליגנד> Jiggle-Fit Ligand כדי להתאים גם לליגנד.
    8. כדי להוסיף ליגנדות לשאר המונומרים בקובץ הקואורדינטות, לחץ על חישוב > NCS Tools > ליגנדות NCS. יופיע חלון נפרד בשם Find NCS-Related Ligands. עבור האפשרות חלבון עם NCS, בחר את קובץ הקואורדינטות Apo-enolase.pdb ואת מזהה שרשרת A כשרשרת ראשית NCS.
      1. עבור המולקולה המכילה ליגנד, בחר את Apo-enolase.pdb כקובץ הקואורדינטות ואת מזהה שרשרת, J ושאריות מספר 1 עד 1. לחץ על מצא משרות מועמדים. יופיע חלון בשם Fitted Ligands עם רשימת משרות מועמדים. הערך את ההתאמה על ידי לחיצה על ליגנדות המועמדים הבודדים ונתח את ההתאמה באופן חזותי.
        הערה: ב- Servalcat/Refmac ניתן לספק רק מודל מונומר, וניתן לתת את הסימטריה המשמשת בשחזור לקבלת מודל מורחב.
    9. צפיפות נוספת עבור מולקולות הממס נצפתה גם ליד הליגנד. מבנים גבישיים ברזולוציה גבוהה של אנולאז מהומולוגים שונים מצביעים על נוכחות של שני יוני Mg2+ 40,41, מה שכנראה מייצב את המטען השלילי של ביניים התגובה. דגם שני יוני Mg2+ בצפיפות האתר הפעיל על-ידי לחיצה על מקם אטום במצביע ובחירה ב- MG מהרשימה סוג אטום מצביע.
      הערה: ניתן להשתמש בגיאומטריית הקשר והמרחק כקו מנחה לבחירת יון המתכת. במקרה של Mg2+ הקשור לאטומי חמצן בשאריות חלבון, מרחק הקשר משתנה בין 2.1 Å -2.4 Å, עם גאומטריה אוקטהדרלית. עם זאת, במקרה של מפות ברזולוציה נמוכה, תחום הקואורדינציה לעתים קרובות אינו שלם, והמרחק עשוי להשתנות גם בגלל מגבלות ברזולוציה.
    10. חזור על שלב 1.2.8 כדי להוסיף את יוני Mg2+ במונומרים, הקשורים לסימטריה.
    11. שמור את המודל על ידי לחיצה על קואורדינטות File > Save > Select Filename > והקלדת Enolase+PEP+Mg.pdb.
    12. פתח את ממשק המשתמש הגרפי של פניקס (ראה טבלת חומרים). הפעל משימת עידון שטח אמיתית עם Enolase+PEP+Mg.pdb ו- emd_30989.map כמודל הקלט והמפה, בהתאמה, באמצעות פרמטרי ברירת מחדל. שלב זה נעשה באופן איטרטיבי עם Coot כדי להשיג התאמה טובה למודל המפה וגיאומטריה.
      הערה: מפת ההפרשים הלא מחודדת משמשת להדגמת נוכחות ליגנד, כגון באיור. למטרות מידול, נעשה שימוש במפה מחודדת של גורם B והיא מומלצת. המפה המחודדת של גורם B יכולה לשמש גם לחישוב מפת ההפרשים למטרות הדגמה לעומת המפה הלא מחודדת. עם זאת, אם הרזולוציה נמוכה יותר באזור שבו הליגנד קשור, גורם B היחיד המשמש לחידוד המפה כולה עשוי שלא לחשוף בבירור את צפיפות הליגנד.
  3. ויזואליזציה ויצירת דמויות של ליגנד מודל
    1. פתח את מודל Enolase + PEP+Mg המעודן ממשימת העידון הסופית של Phenix ב- PyMOL42 (ראה טבלת חומרים) על ידי לחיצה על קובץ > פתח ובחירת שם הקובץ.
    2. טען את emd-30989.map (מפה מחודדת המאוגדת PEP) על ידי לחיצה על קובץ > פתח ובחירת שם הקובץ.
    3. שנה את שם המפה ל - PEP מחודד על-ידי לחיצה על פעולות > שינוי שם כנגד אובייקט emd_30989 והקלדת PEP מחודד.
      הערה: ברוב המקרים, לדוגמה enolase, המפות כאשר הן נפתחות בפימול מנורמלות כאשר האפשרות לנרמל מפה מסומנת כברירת מחדל בפימול. מכיוון שמפות cryoEM מרוכזות בקופסה גדולה יותר, הנורמליזציה תכלול את כל מה שיש בקופסה. לכן, נורמליזציה ניתן לכבות לפני פתיחת pymol.
    4. בחר את הליגנדות על ידי לחיצה על הצג רצף >.
    5. הקלד isomesh mesh_ligands, PEP-מחודד, 6.0, sele, carve=3.0 בשורת הפקודה והקש Enter.
    6. צבעו את mesh_ligand בכחול על ידי לחיצה על התיבה האחרונה, C, לצד האובייקט mesh_ligand.
    7. הצג את שאריות האתר הפעילות, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 ו- Lys-386 באינטראקציה עם PEP ו- Mg2+ בייצוג מקל וכדורה, בהתאמה, ואת האנזים אנולאז בייצוג קריקטורות.
    8. מעקב קרניים על ידי הקלדת ray 3600, 3600 כדי ליצור תמונות באיכות פרסום ולשמור כקובץ png על ידי לחיצה על קובץ > שמירה ובחירת PEP.png כשם הקובץ.

2. מידול ליגנדות בקולטן גלוטמט מטבולי mGlu5

  1. זיהוי ומידול צפיפות הליגנד במפת cryoEM של mGlu אגוניסט ואנטגוניסט5
    1. הורד את שתי חצאי המפות יחד עם קבצי הקואורדינטות המתאימים שלהן עבור כל אחד ממתחמי האגוניסט (EMD-31536, 7fd8.pdb) והאנטגוניסט הכרוך (EMD-31537,7fd9.pdb) mGlu5 .
    2. פתח את ChimeraX
      1. פתח את קובץ הקואורדינטות 7fd8.pdb על-ידי לחיצה על פתח ובחירה באפשרות 7fd8.pdb.
      2. הקלד delete ligand בשורת הפקודה והקש Enter.
      3. באופן דומה, השתמש בפקודה delete/B כדי למחוק את השרשרת B.
        הערה: ניתן למחוק ליגנדות ושרשראות באמצעות התפריט הנפתח בחלק העליון באמצעות בחירה ופעולות > אטומים/קשרים > למחוק.
      4. שמור את pdb unliganded על ידי הקלדת הטקסט הבא בשורת הפקודה: שמור 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 מציין את מזהה הדגם.
      5. חזור על השלבים 2.1.2.1-2.1.2.4 עבור 7fd9.pdb.
    3. פתח את CCP-EM. צור פרויקט חדש בשם mGlu5 וציין את ספריית הפרויקט ואת שם המשתמש.
      1. פתחו את Relion מהאפשרויות בחלונית השמאלית.
        1. עברו אל הכרטיסיה 'יצירת מסיכה '.
        2. ספק אחת מחצאי המפות עבור EMD-31536 כקלט.
          הערה: Relion מקבלת מפות עם הסיומת .mrc, ומפות EMD כוללות סיומת map. ניתן לפתוח את קבצי המפה ב- ChimeraX לבדיקה ולשמור אותם בפורמט .mrc.
        3. בכרטיסיית המסיכה , ספק גודל פיקסלים כ- 0.89 Å וסף בינאריזציה התחלתי כ - 0.007.
        4. הפעל את העבודה עם הכינוי 31536 (או כל שם אחר שקל לעקוב אחריו).
        5. באופן דומה, ליצור מסיכה עבור EMD - 31537 חצי מפה.
      2. פתח את תוכנית Refmac Servalcat מהאפשרויות בחלונית השמאלית ב- CCPEM.
        1. ספק את השם כ- mGlu5_agonist.
        2. יבא את קובץ ה- .pdb 7fd8_noligand_chainA כמתואר בסעיף הדגם 2.1.2.4. ספק את המיקום של שני חצאי המפות ואת המסיכה המתאימה שנוצרה ב- Relion.
        3. ציין את הרזולוציה כ - 3.8 Å.
        4. עבור אל הגדרות העידון > סימטריה קפדנית והזכר את C2 כסימטריה של קבוצת נקודות Relion.
        5. הפעל את התוכנית על ידי לחיצה על לחצן התחל בחלק העליון.
    4. לאחר סיום העבודה, פתח את התוצאה ב - Coot (אפשרות זמינה בחלק העליון במקטע התוצאות). פעולה זו תציג diffmap.mtz ב- Coot כברירת מחדל, כאשר הצבעים אדום וירוק מציינים צפיפויות שליליות וחיוביות, בהתאמה.
      1. עבור אל מנהל התצוגה > המאפיינים של מפת ההפרשים שכותרתה DELFWT PHDELWT ושנה את רמת קווי המתאר ל- 4.0 (ערך מוחלט).
        הערה: בחירת הסף תלויה במפה וברזולוציה.
      2. הסתר את המפה שכותרתה FWT PHWT ואת המולקולה המסומנת refined.pdb.
      3. הזז את המפה באמצעות העכבר כדי להציג באופן חזותי את הצפיפות החיובית (בצבע ירוק) ולהביא את הגוש הגדול יותר למרכז.
      4. עבור אל קובץ > קבל מונומר, הקלד QUS ולחץ על Enter.
      5. עבור אל חישוב מידול > > מולקולת Rigid Body Fit ולחץ פעמיים על מונומר QUS כדי להתאים את המולקולה כך שתתאים לצפיפות Fo-Fc.
      6. השתמש באפשרות מיזוג מולקולת בכרטיסיה עריכה כדי להוסיף את מולקולת QUS לקובץ הקואורדינטות, refined.pdb.
      7. חזור על שלבים 2.1.4.3-2.1.4.6 כדי להתאים את הליגנד עם קוד מונומר NAG ו- CHS בגוש הקטן יותר בתחום החוץ תאי ובחלק העליון של תחום הטרנסממברנה, בהתאמה.
      8. שמור את הקואורדינטה כ- refined_ligands.pdb.
        הערה: הרזולוציה של תחום הטרנסממברנה (TM) נמוכה יותר, ולכן היא אינה נידונה כאן.
  2. עידון המבנה הליגנד mGlu5
    1. פתח CCPEM ושכפול משימת המיקוד הקודמת (שלב 2.1.3.2) והפעל אותה עם refined_ligands.pdb ומפה מחודדת (emd. 31536.mrc) כקלט, תוך שימוש בפרמטרי ברירת מחדל וסימטריה C2.
      הערה: אם התוכנית אינה מזהה את הליגנד, יש לספק את קבצי ה-CIF. ניתן להוריד קבצי CIF אלה מה-PDB או ליצור אותם באמצעות תוכניות שונות (ראה שלב 3.1.1 לקבלת פרטים).
  3. ויזואליזציה ויצירת דמויות ב- PyMOL
    1. פתח את דגם refined_expanded.pdb ממשימת המיקוד האחרונה של Refmac ב- PyMOL.
    2. עבור אל קובץ > פתח ואתר את ספריית המשימות Refmac כדי לטעון את הקובץ diffmap_normalised_fofc.mrc (מפת הפרשים ממשימת Servalcat בשלב 2.1.3.2).
      הערה: אם קבצי הסיומת .mrc אינם גלויים במהלך הגלישה, שנה את סוג הקובץ לכל הקבצים ועיין.
    3. בחר את הליגנדות באמצעות הצג > רצף.
    4. עבור אל לחצן פעולות ושנה את שם הבחירה לליגנדות.
    5. הקלד את הטקסט הבא בשורת הפקודה ולחץ על Enter: isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      הערה: ניתן לכוונן את רוחב רשת השינוי. כאן, נעשה שימוש ברוחב רשת שינוי 0.2, והוא מוגדר באמצעות הפקודה הבאה: הגדר mesh_width=0.2.
    6. לחץ לחיצה ימנית על אחד המונומרים ועבור לשרשרת > צבע כדי לציין את הצבע של כל מונומר. צבעו את הליגנד ואת רשת השינוי בתיבה האחרונה המסומנת c בליגנד ובעצמים mesh_ligands. דימר הקולטן mGlu5 מוצג בייצוג קריקטורות, והמונומרים צבועים בצבע כחול וחיטה. ליגנדות מוצגות במקל, והרשת המקיפה את קווי המתאר של הליגנדות צבועה בירוק.
    7. השתמש באפשרות הפעולות > כיוון/מרכז/זום כנגד האובייקטים והתאם ידנית כדי להמחיש את רשת השינוי בצורה ברורה. בחר את השאריות הסמוכות שיכולות לקיים אינטראקציה עם הליגנד, לדוגמה, Tyr64, Trp100 עבור QUS, ולפי הצורך, הצג את השרשרת הצדדית או השרשרת הראשית שלהן או את שתיהן כייצוג מקל.
    8. מעקב קרניים כדי ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה ולשמור אותן כקובץ png.
      הערה: השלבים לעיל חוזרים על עצמם עבור המפה המאוגדת של האנטגוניסט EMD-31537 וקובץ הקואורדינטות המתאים PDB-7fd9.

3. מידול מולקולות המעכב, deoxygalacto-nojirimycin (DGN) וממס במפה מחודדת ברזולוציה גבוהה של β-galactosidase

  1. זיהוי הליגנד, DGN, באמצעות חצאי מפות מ-cryoEM
    1. הכנת מילון ליגנד לא ידוע למידול [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      הערה: קובץ המילון Deoxygalacto-nojirimycin כלול בספריית המונומרים CCP4 כ-DGJ (מזהה ליגנד בן 3 אותיות). עם זאת, כאן הוא נחשב ליגנד חדש ולא ידוע כדי להמחיש את התהליך של יצירת קבצי מילון עבור ליגנדות לא ידועות, DGN משמש כקוד 3 אותיות.
      1. פתח את סיכום המתחם עבור deoxygalacto-nojirimycin (DGN) בדף האינטרנט PubChem והעתק את מחרוזת החיוכים עבור התרכובת deoxygalacto-nojirimycin.
      2. פתח את Phenix > Ligands >- eLBOW.
      3. ציין את מחרוזת החיוכים כקלט.
      4. ציין שיטת אופטימיזציה מתאימה לבניית ליגנדים. כאן, אופטימיזציה פשוטה משמש.
      5. הדבק את מחרוזת החיוכים הכימיים בסעיף הגדרת ליגנד.
      6. ספק כותרת משימה, קידומת קובץ פלט ומזהה ליגנד כראוי ולחץ על הפעל.
        הערה: פלט המשימה מכיל קובץ קואורדינטות, DGN.pdb, וקובץ מילון, DGN.cif. Jligand29 יכול לשמש גם כדי להפוך את הקובץ cif.
    2. הורד את קובץ הקואורדינטות β-גלקטוזידאז (6tsh.pdb) מה-PDB והסר את הקואורדינטות עבור שרשראות החלבונים (B, C, D), ליגנד, DGN ומולקולות ממס אחרות באמצעות עורך טקסט או האפשרות מחק שרשרת/אזור ב-Coot. שמור את קובץ הקואורדינטות כ- apo-betaGal_chainA.pdb.
      הערה: ניתן להשתמש ב-ChimeraX או Pymol גם כדי להסיר את מולקולת הליגנד/ממס.
    3. הורד את חצאי המפות (emd_10563_half_map_1.map ו- emd_10563_half_map_2.map) מנתונים נוספים של הערך EMD-10563 מ- EMDB.
    4. פתח את CCPEM והשתמש ב- Relion כדי ליצור את המסיכה עבור המפה בסף של 0.01 (כמתואר בשלבים 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. הפעל את Servalcat (בתוך חבילת CCPEM כמתואר בשלב 2) עם חצאי המפות שהתקבלו בשלב 3.1.3 ומודל apo בשלב 3.1.2 וסימטריה D2.
      הערה: יש ליישר את המודל לאחת מחצאי המפות או למפות מלאות לצורך איתור צפיפות הליגנד. ניתן לעשות זאת על ידי התאמת המודל למפה באמצעות ChimeraX ולאחר מכן שמירת הקואורדינטות ביחס לחצי המפה. בדוגמה זו, חצאי מפות והמפה הראשית ב- EMDB כוללים גדלים/רשתות תיבה שונים, ויש למקם את המודל בחצי המפה.
    6. פתח קוט.
      1. פתח את DGN.cif עבור מילון הליגנד כפי שנוצר בשלב 3.1.1 עם Phenix eLBOW. זה נעשה על ידי מעבר אל קובץ > ייבוא מילון CIF וגלישה בספריית המשימות eLBOW.
      2. פתח את קבצי קואורדינטות החלבונים והליגנדים, apo-betaGal_chainA.pdb משלב 3.1.2 ו- DGN.pdb משלב 3.1.6 בהתאמה.
      3. פתח אוטומטית את הקובץ diffmap.mtz ממשימת Servalcat (שלב 3.1.5) והצג באופן חזותי את המפה שכותרתה DELFWT PHDELWT ב- Coot. קונטור המפה בסף של ~ 4 ערך מוחלט.
        הערה: חשוב לבדוק את סטטיסטיקת המפה על ידי הקלדת כותרת map.mrc או שימוש בכלים בכימרה. ניתן לקבל את כל המידע הדרוש על גודל הפיקסל, גודל התיבה, הצפיפות המינימלית, הממוצעת והמקסימלית וסטיית rms מהצפיפות הממוצעת. חיוני לבדוק את גודל הפיקסלים וגודל התיבה של מפות cryoEM. המפה התלת-ממדית מייצגת את נפח מפת ליגנד החלבונים ברשת של ווקסלים תלת-ממדיים. בכל ווקסל מאוחסן הערך הפוטנציאלי של האלקטרונים או ההסתברות למצוא את האלקטרון באותו מקום. כאשר נבחר סף מסוים, אז הווקסלים, שיש להם צפיפות נמוכה מהערך שצוין, מוגדרים לאפס. זה עוזר למזער את הרעש הניסיוני במפה ולדמיין את תכונות המפה טוב יותר43. לכן, המפה צריכה להיות קווי מתאר בסף שבו תכונות המפה גלויות בקלות והרעש במפה הוא מינימלי.
      4. עבור אל Ligand > למצוא Ligands. בחלון החדש שמופיע, בחר ליגנד, מפת הפרשים ומודל apo-betaGal_chainA.pdb. השאר את האפשרויות האחרות בהגדרות ברירת המחדל שלהן ולחץ על חפש ליגנדים כדי להתחיל בחיפוש.
      5. רשימה של להיטים עליונים המציגים צפיפות ליגנדים פוטנציאלית מוצגת עם עותק הממוקם בכל אחת מהצפיפות. בדוק ידנית את כל הפגיעות שבהן הונחה הליגנד. שמור את הלהיטים הסבירים ביותר והסר את הדו-משמעיים.
        הערה: ההבדל בצפיפות המפה בסף גבוה מצביע בבירור על נוכחות הליגנד באתר הפעיל.
  2. מידול מולקולות ליגנד DGN וממס
    1. בצע עידון שטח אמיתי ב- Coot כדי להתאים את הליגנד (DGN.pdb) למפת צפיפות ההפרש, ולאחר מכן מזג את קואורדינטות הליגנד עם apo-betaGal_chainA.pdb ושמור אותו כ- betaGal_chainA+ligand.pdb.
      הערה: ניתן להסיר את הליגנדות שמוקמו באזורים של שרשראות אחרות ולא למזג אותן בעת שמירת קובץ הקואורדינטות הממוזג. הליגנדות בשרשראות אחרות יכולות להיווצר על ידי ליגנדות NCS כפי שמוצג בדוגמה 1, שלב 1.2.8, או ב- Refmac/Servalcat באמצעות הרחבת סימטריה.
    2. הפעל משימת Servalcat נוספת כמתואר לעיל (שלב 3.1.5) עם betaGal_chainA+ligand.pdb כמודל קלט וחצאי מפות (משלב 3.1.3) עם סימטריה D2.
    3. צפיפות ההפרש (מעבודת Servalcat בשלב 3.2.2) סביב הליגנד הממודל מרמזת על נוכחות מולקולות הממס המתואמות עם מולקולת הליגנד. הצפיפות המרכזית הקרובה לליגנד נראית גדולה מדי עבור מולקולות מים.
    4. בהתבסס על נתונים ביוכימיים ומבניים קודמים המצביעים על נוכחות של Mg2+ במיקום זה, יון Mg2+ מעוצב כאן על ידי לחיצה על אפשרות אטום המקום וציון האטום כ - MG.
    5. מודל מולקולות מים בצפיפות ההבדל באתר הפעיל המציינות נוכחות של מולקולת ממס על ידי לחיצה על אטום המקום במצביע ובחירת מים.
      הערה: Coot יש גם אפשרות לבחור מולקולות מים באופן אוטומטי. כאן, מכיוון שהמיקוד הוא רק באתר הפעיל, מולקולות מים מתווספות באופן ידני.
    6. מיזגו את הקואורדינטות עבור Mg2+ ומים עם הקובץ betaGal+ligand.pdb ושמרו אותו כ- betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
    7. עם betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb, לבצע עידון Refmac ב Servalcat עם סימטריה D2.
      הערה: מפת הפרשי הפלט ממשימה זו יכולה לשמש כאמצעי לאמת אם הליגנד עוצב במדויק, מכיוון שמפת ההפרשים צריכה להציג צפיפות חיובית או שלילית שיורית מינימלית.
  3. ויזואליזציה ויצירת דמויות עם PyMOL
    הערה: השלבים המתוארים להלן מספקים כמה דוגמאות ליצירת דמויות באמצעות מודלים ומפות שניתן להשתמש בהם להמחשת נוכחותם של ליגנדות וממסים.
    1. פתח את refined_expanded.pdb ממשימת Servalcat האחרונה (שלב 3.2.6) עם הליגנד והממס מודלים.
    2. בחר שרשראות שונות בנפרד כדי לצבוע אותן מגנטה, צהוב, ירוק וכחול, כמתואר בדוגמה 2.
    3. עבור אל הצג רצף >, בצע בחירות נפרדות עבור מולקולות המים, מגנזיום ו- DGN, ושנה את שמות האובייקטים למים, MG ו- DGN, בהתאמה.
    4. הצג MG ומולקולות מים ככדורים על ידי בחירת האובייקטים, לחיצה ימנית והצגת כדור >. באופן דומה, הציגו את הליגנד בייצוג מקל וצבעו את הליגנדות והממסים בהתאם. במקרה זה, הליגנד נצבע בצהוב על ידי הטרואטום, יון המגנזיום צבוע בסגול, ומולקולות המים צבועות באדום.
    5. בחר מולקולות DGN, MG ומים. לחץ לחיצה ימנית ובחר פעולות > להעתיק לאובייקט ולתת לו שם כליגנדות.
    6. פתח את diffmap_normalised_fo.mrc מהמשימה Servalcat בשלב 3.2.6 ושנה את השם ל- ligand_fo.mrc. הקלד את הפקודה הבאה: isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      הערה: אפשרות הגילוף של 2 Å מיושמת סביב האטומים, ובהתאם לרזולוציה ולאיכות המפות, ניתן להשתמש בערכים של 3-5. יתר על כן, בעת פתיחת מפות cryoEM ב- PyMOL, מומלץ להגדיר normalize_ccp4_maps לכבוי.
    7. השתמש בפעולות > אפשרויות כיוון/שינוי גודל תצוגה והתאם ידנית כדי להציג באופן חזותי את הליגנדות ואת שאריות האינטראקציה הסמוכות (היכן שרלוונטי) כפי שמוצג בשלב 2.3.7.
    8. הקרן עוקבת אחר סצנות אלה כדי לשמור תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות קרן הפקודה 3600, 3600.
    9. שמור את הסצינה כקובץ .png.
      הערה: השלבים הבאים הם אופציונליים ומתארים את התהליך כדי להמחיש (1) את צפיפות ההפרש (Fo-Fc) עבור הליגנד הלא מודל, DGN, (2) את הצפיפות (Fo) של הליגנד המודל, DGN וכן את צפיפות ההפרש (Fo-Fc) עבור ממיסים לא מדגמים ולבסוף עבור (3) הצפיפות (Fo) עבור הליגנד המודל, DGN ומולקולות הממס באתר הפעיל.
    10. כדי להדגים את נוכחותם של הליגנד, ה-DGN ומולקולות הממס הסובבות אותם באמצעות מפת ההפרשים, פתח את diffmap_normalised_fofc.mrc ממשימת Servalcat בשלב 3.1.5. שנה את שם קובץ המפה ל- unliganded_fofc.mrc על-ידי לחיצה על פעולות > שינוי שם לצד אובייקט המפה. הקלד את הטקסט הבא בשורת הפקודה: isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
    11. כדי להדגים את צפיפות הליגנד המודל, DGN, ואת צפיפות הממס הלא מדגמי שמסביב, פתח את diffmap_normalised_fo.mrc וכן את diffmap_normalised_fofc.mrc ממשימת servalcat בשלב 3.2.2. שנה את השם diffmap_normalised_fo.mrc כ- DGN_fo ואת diffmap_normalised_fofc.mrc כ - DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. בחר MG ומים מתוך Display > Sequence, לחץ לחיצה ימנית ובחר פעולות > להעתיק לאובייקט, ותן להן שם כממסים.
    13. הקלד את הטקסט הבא בשורת הפקודה: isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, ממסים, level=6, carve=2.
      הערה: mesh_DGN_fo יציג את צפיפות הליגנד, וה mesh_solvent_fofc יציג את צפיפות ההשמטה עבור MG ומים.
    14. לבסוף, כדי להמחיש את הליגנדות המעוצבות כמו גם את מולקולות הממס הסובבות באתר הפעיל, פתח את diffmap_normalised_fo.mrc ממשימת Servalcat בשלב 3.2.6 ושנה את שמו ל- ligand_fo.mrc.
    15. הקלד את הטקסט הבא בשורת הפקודה: isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
      הערה: כאן, השתמשנו ב- diffmap_normalised_fo.mrc, אך ניתן להשתמש במפה המחודדת הסופית כדי להראות את צפיפות הליגנדות והשאריות שמסביב. מומלץ לציין את סוג המפה בה נעשה שימוש, ערכי חידוד גורם B במקרא האיור.
    16. ניתן להגדיר את רוחב רשת השינוי ואת גודל הכדור על-ידי הקלדת הפקודות הבאות: הגדר mesh_width=0.2 והגדר sphere_scale=0.25 כדי להקטין את גודל הכדור.
    17. צבעו את רשת ה-fo בכחול ואת רשת ה-fofc בירוק.
    18. השתמש בפעולות > אפשרויות כיוון/זום והתאם ידנית כדי להציג באופן חזותי את הליגנדות ושאריות האינטראקציה הסמוכות (היכן שרלוונטי), כפי שמוצג בשלב 2.3.7.
    19. הקרן עוקבת אחר סצנות אלה כדי לשמור תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות קרן הפקודה 3600, 3600.
    20. שמור את הסצינות הבודדות כקבצי .png.

4. השפעת הרזולוציה על מידול ליגנדים בגלקטוזידאז β

  1. פתח את Terminal ועבור לספרייה המכילה את שתי חצאי המפות.
  2. פתח את שתי חצאי המפות (שלב 3.1.3) בתבנית .map ב- ChimeraX, הצג אותן באופן חזותי ושמור אותן כ- emd10563_half1_1_unfil.mrc ו- emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. ניתן להשתמש במסיכה שנוצרה בשלב 3.1.4 כקלט.
  4. הפעל משימת PostProcessing ב- Relion באמצעות חצאי מפות ומסיכות משלבים 4.2-4.3, עם פרמטרי ברירת המחדל.
  5. חזור על שלב 4.4, כעת כאשר שקילת Skip FSC מופעלת וציון מסנן אד-הוק במעבר נמוך של 3 Å.
  6. חזור על שלב 4.4 עם מסנן אד-הוק במעבר נמוך של 3.5 Å.
  7. פתח את המפות (postprocess.mrc) משלבים 4.4-4.6, סנן ברזולוציות שונות, ואת קובץ קואורדינטת הדגם, 6tsh.pdb (מיושר לחצאי המפות ב- ChimeraX) משלב 3.1.2 ב- PyMOL. שנה את שמות המפות השונות ל- 3.0, 3.5 ו- 2.3 כפי שהוגדרו ברזולוציות שלהן.
    הערה: ניתן לאשר את סינון המעבר הנמוך של המפות על ידי הדמיה שלהן ב- ChimeraX או Coot.
  8. דמיינו את השפעת הרזולוציה על צפיפות מולקולות ליגנד וממס על ידי יצירת רשת של 2 Å סביב מולקולות הליגנד והממס בסף של 6σ כמתואר בשלב 3.3.6 עם מפות מסוננות לרזולוציות שונות.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמה 1
האנזים אנולאז משחפת מזרז את השלב הלפני אחרון של גליקוליזה וממיר 2-פוספוגליצראט לפוספונולפירובט (PEP), שהוא מתווך חיוני למספר מסלולים מטבוליים44,45. נתוני CryoEM עבור דגימות apo-enolase ו-PEP enolase נאספו באותו גודל פיקסלים של 1.07 Å, ועיבוד התמונה בוצע עם Relion 3.146,47. מבני אפו-אנולאז ו-PEP-אנולאז נקבעו ב-3.1 Å ו-3.2 Å, בהתאמה48. המפות והדגמים הופקדו ב-EMDB וב-PDB49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x ו-PDB-7e51). מפת cryoEM של האנזים מראה שהוא אוקטמר בתמיסה (איור 1A). על מנת לזהות את צפיפות הליגנד במפת PEP-enolase, נבחרו המפות הלא מחודדות של האפואנזים והאנזים הקשור ל-PEP, ומפת הפרש חושבה ב-ChimeraX, על ידי חיסור מפת PEP-enolase ממפת האפואנזים. נצפתה צפיפות ברורה (ירוקה) בסף גבוה, מה שמרמז על נוכחות הליגנד (איור 1B). מידול שרשרת החלבונים במפה הלא מחודדת הראה בבירור שהצפיפות הנוספת קיימת באתר הפעיל של החלבון (איור 1C). הליגנד, PEP, עוצב אז במפה מחודדת של גורם B באמצעות Coot, ומודל החלבון+ליגנד שוכלל בחלל האמיתי עם פניקס. שני יוני Mg2+ מודלו בצפיפות שנצפתה בקרבת הליגנד (איור 1D). הליגנד, PEP, מאמץ אוריינטציה דומה לזו שנצפתה בהומולוגים אנולזיים אחרים, וכמה שאריות אתר פעילות, כגון Lys-386, Arg-364, יוצרות אינטראקציות קשר מימן עם הליגנד PEP. יוני Mg2+ יוצרים קשרי תיאום מתכתיים עם Asp-241, Glu-283, Asp-310 והפוספט של PEP (איור 1D).

דוגמה 2
בהיעדר מבנה אפו-חלבוני זמין או אם החלבון עובר שינוי קונפורמטיבי גדול, חישוב מפות ההפרשים כמתואר לעיל אינו אפשרי. בשנת 2021, הקבוצה של גאריב מורשודוב במעבדה לביולוגיה מולקולרית, קיימברידג', הציגה את Servalcat22, המיישמת זרימת עבודה של עידון באמצעות Refmac וגם מחשבת מפת הפרשי Fo-Fc לאחר עידון. צפיפות הפרש Fo-Fc חיובית מצביעה על נוכחות של מולקולות/ליגנדות שלא נכללו במודל במהלך העידון, למעשה מפת השמטה. עם זאת, מומלץ להעריך תחילה את התאמת המודל למפה באופן כללי ולאחר מכן להעריך את מפת צפיפות ההפרש.

כדי להמחיש את השימוש ב-Servalcat/Refmac, mGlu5, קולטן דימרי מצומד לחלבון G שנקשר למוליך העצבי, נבחר L-גלוטמט. עם קשירת האגוניסט, L-quisqualate, התחום החוץ-תאי משנה את כיוונו, מה שמפעיל את סיבוב ה-7TM, ומקרב אותם לייצוב המצב המופעל. לפיכך, נצפה שינוי קונפורמטיבי גדול בין האפו/אנטגוניסט לעומת . מצבי חסימה אגוניסטיים51 (איור 2A ואיור 2E). שתי חצאי המפות הן עבור האגוניסט (EMD-31536) והן עבור האנטגוניסט (EMD-31537) התקבלו מ-EMDB, ומפות ה-cryoEM מראות רזולוציה מגוונת על פני המולקולה ותחום חוץ-תאי פתור טוב יותר. לאחר מכן, אלה שימשו כתשומות ב- Servalcat יחד עם חלבון apo כמודל לחישוב ההבדל או מפת Fo-Fc עבור כל מערך נתונים. מפה זו הראתה בבירור נוכחות של מולקולות ליגנד שונות (שאינן חלבון). הרזולוציה שהוערכה על ידי FSC (מתאם מעטפת פורייה) עבור קומפלקסים הקשורים אגוניסט ואנטגוניסט היו 3.8 Å ו 4.0 Å, בהתאמה. במקרה של mGlu5 הקשור לאגוניסט, מפת ההבדל של Servalcat Fo-Fc הראתה נוכחות של אגוניסט (L-quisqualate) (איור 2B) ו-N-אצטילגלוקוזאמין (NAG) (איור 2C) ב-ECD של הקולטן (עקב רזולוציה נמוכה יותר של TMD, כאן אנו מתמקדים רק ב-ECD ובחלק העליון של ה-TMD). שאריות חלבון, כולל Tyr-64, Trp-100, Ser-151 ו-Thr-175, נראות כמתקשרות עם האגוניסט. צפיפות ליד שאריות Asn-210 הצביעה על נוכחות של גלוקוזאמין N-אצטיל (איור 2C). צפיפות התואמת את כולסטריל המיסוקצינאט, שנוספה במהלך הטיהור של mGlu5, נצפתה ליד החלק העליון של סליל טרנסממברנה 1 (איור 2D). מכיוון שהרזולוציה מתונה וניתן למקם את הליגנד, L-quisqualate, בכיוונים שונים, המבנה הקודם של התחום החוץ-תאי עם הליגנד (PDB-6N50) שימש כמדריך למדל את הליגנד. קשירה אנטגוניסטית מייצבת את המצב הפתוח או המנוחה של הקולטן (איור 2E). צפיפות התואמת את LY341495 האנטגוניסט נצפתה בציר האונה I והאונה II של תחום מלכודת הזבובים של ונוס ב-ECD. האנטגוניסט מקיים אינטראקציה עם שאריות דומות לאלה של האגוניסט. אינטראקציה בין Tyr-223 באונה II לבין האנטגוניסט מייצבת את הקולטן במצב פתוח (איור 2F). בדומה למבנה האגוניסט, גליקוזילציה או נוכחות של N-אצטילגלוקוזאמין moiety נצפתה ליד Asn-210 (איור 2G).

דוגמה 3
הדוגמה השלישית מבהירה את הפרוטוקול למדל ליגנדות ומולקולות ממס בגודל מקטע או קטן במפות CryoEM ברזולוציה גבוהה. גילוי תרופות מבוסס פרגמנטים (FBDD) התגלה כשיטה רבת עוצמה וחדשנית בפיתוח טיפולים חדשניים מבוססי מטרה בתחומי מחלה שונים, מה שהופך אותו לאפיק מבטיח במו"פ פארמה52,53. FBDD מתחיל בסינון ובחירה זהירה של מקטעים קטנים, מסיסים מאוד ובעלי משקל מולקולרי נמוך של מולקולות הנקשרים לחלבוני מטרה ספציפיים או לביומולקולות מעניינות. קביעת המבנים של קומפלקסים אלה של מקטעי חלבון חושפת את אופן הקישור של מקטעים אלה, המשמש כמדריך לתכנון מולקולות גדולות ומורכבות יותר דמויות תרופה, בעלות זיקה וספציפיות הולכות וגדלות כלפי חלבון היעד54. עם זאת, שיטה זו דורשת צפיפות ליגנד ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע במדויק את התנוחה ולמקם נכון את הקבוצות הפונקציונליות של ליגנד15.

β-גלקטוזידאז, אחד המבנים הראשונים ברזולוציה גבוהה שנקבעו מההתקדמות בטכנולוגיית cryoEM, הוא אנזים הומוטטרמרי 450kDa שנחקר היטב ומזרז הידרוליזה של לקטוז לגלוקוז וגלקטוז55. כדי להדגים את השימוש ב- cryoEM ב- FBDD, Astex, בריטניה, קבעה את המבנה של β-גלקטוזידאז עם מעכב בגודל מקטע, deoxygalacto-nojirimycin (DGN) קשור באתר הפעיל (EMDB-10563, PDB:6tsh)56. מערך נתונים זה משמש להמחשת הפרוטוקול למדל ליגנדות וממסים באופן חד משמעי במפות ברזולוציה גבוהה. כדי להציג את השפעת הרזולוציה על מידול וויזואליזציה של ליגנדים, המפות סוננו ל- 3.0 Å ו- 3.5 Å בשלב שלאחר העיבוד ב- Relion. הדבר מדגיש את איכות צפיפות המפה ברזולוציות שונות ומדגיש את הצורך ברזולוציה גבוהה יותר עבור מידול ליגנדות וממסים.

האנזים הוא טטרמר עם סימטריה D2 בתמיסה (איור 3A). מפת הפרשים (בין מפה לדגם), כפי שחושבה על-ידי Servalcat, הצביעה על נוכחות של DGN וכמה מולקולות ממס באתר הפעיל של האנזים (איור 3B). ברזולוציה משוערת של 2.3 Å, הצפיפות הראתה תכונות ברזולוציה גבוהה, אשר סייעו במידול מדויק של המעכב באתר החלבון הפעיל. נצפו אינטראקציות בין DGN לבין Tyr-503 ו-His-540 (איור 3C). צפיפות ההבדל הצביעה גם על נוכחותן של מולקולות ממס המקיימות אינטראקציה עם DGN, כמו גם על שאריות החלבון. Mg2+ וכמה מולקולות מים מודלו בצפיפות (איור 3D). נצפו קשרי תיאום מתכות בין Mg2+ ו-Glu-416, Glu-461, וכמה מולקולות מים (איור 3D). Mg2+ נצפה כמתקשר עם DGN באמצעות מולקולת מים.

ברזולוציה נמוכה יותר של 3.5 Å ו-3.0 Å, צפיפות הליגנד דומה לכתם וחסרות תכונות ברזולוציה גבוהה החיוניות למידול מדויק של הליגנד (איור 4A,B). צפיפות מולקולות המים כמעט ולא הייתה קיימת ברזולוציות אלה. לסיכום, עם רזולוציה הולכת וגדלה, במיוחד גבוהה מ-3.0 Å, הצפיפות אפשרה מידול של מספר גדול יותר של מולקולות מים (איור 4C,D). המיקום הנכון של המרכז הכיראלי של הליגנד נעשה בר השגה ב~2.3 Å (איור 4C,D) בשל נוכחותם של מאפיינים ברורים במפה שהנחו את המיקום, כמו גם מידול של מולקולות מים ו-Mg2+. לשם השוואה, הצפיפות עבור Mg2+ נותרה ניכרת בכל טווח הרזולוציות (איור 4A-C).

figure-results-1
איור 1: מידול הליגנד פוספונולפירובט ב-M. tuberculosis enolase. (A) מראה את המפה המחודדת של גורם B של אנזים האנולאז הקשור ל-PEP. המפה מציעה כי אנולאז הוא אוקטמרי בתמיסה, וכל מונומר במפה צבוע אחרת. (B) מציג מפת cryoEM לא מחודדת של אנזים אפו-אנולאז באפור עם מפת ההבדל (בין מפות הקשורות ל-PEP למפות לא מחודדות של אפו-אנולאז) מכוסה בירוק, מה שמרמז על נוכחות ליגנד, PEP. זוהי מפת הדגמה כדי להראות את נוכחותם של ליגנדות. (C) מציג את ההתאמה של מודל האנולאז במפת ה-cryoEM הלא מחודדת, תוך הדגשת מיקום צפיפות ההבדל ביחס לחלבון. מודל החלבון מוצג בייצוג מצויר וצבוע בקשת. איור זה מראה כי הצפיפות הנוספת (ירוק) קיימת באתר הפעיל של כל מונומר. (D) מראה את הליגנד, PEP, עטוף במפה מחודדת של גורם B, בצבע כחול. בנוסף, נצפתה צפיפות עבור שני יוני Mg2+, היוצרים קשרי תיאום מתכתיים עם מספר שאריות אתר פעילות, כולל Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 ואטומי ליגנד. הליגנד יוצר אינטראקציות של קשרי מימן עם Lys-386, Lys-335 ו-Arg-364. שאריות החלבון מוצגות בייצוג מקלות, ויונים Mg2+ מוצגים ככדורים סגולים. הדמויות בלוחות (A-D) נוצרו באמצעות Pymol. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: זיהוי, מידול והדמיה של ליגנדות שונות בקולטן mGlu5 . מפות ההשמטה של Fo-Fc הושגו באמצעות Servalcat. (A) מראה מבנה דימר של קולטן mGlu5 (PDB-7fd8) בייצוג קריקטורות, כאשר כל מונומר צבוע בצבע כחול וחיטה, בהתאמה, וקשור לאגוניסט L-quisqualate. כל הליגנדות שזוהו בתת-תאי ובחלק העליון של התחום הטרנסממברנלי של הקולטן עטופות במפת ההשמטה של Fo-Fc, צבועות בירוק ומסומנות בקווי מתאר של 6σ. (B) מדגיש את ההתאמה של האגוניסט, L-quisqualate עטוף במפת ההפרשים. L-quisqualate אינטראקציה עם מספר שאריות mGlu5 כולל Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 ו- Gly-280. אינטראקציות קשר H מיוצגות על ידי מקפים אדומים. ב-(C) ניכרת צפיפות נוספת ליד Asn-210, הקיימת בתחום החוץ תאי של הקולטן, ומולקולת N-אצטילגלוקוזאמין (NAG) עוצבה בצפיפות זו. לשם הבהרה, ה- NAG אינו קשור ל- Asn באיור הנוכחי. (D) מראה את ההבדל בצפיפות של כולסטרול המיסוקצינאט (CHS) בירוק ליד פני השטח החשופים לשומנים של הקולטן. מולקולת CHS, המיוצגת במקלות, עוצבה בצפיפות זו. (E) מראה מבנה קולטן mGlu5 (PDB-7fd9) הקשור לאנטגוניסט LY341495 בייצוג קריקטורה. ב-(F), צפיפות נוספת במפת הפרשי Fo-Fc הממוקמת בציר שבין אונה I לאונה II של התחום החוץ-תאי מצביעה על נוכחות האנטגוניסט. שאריות מפתח (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 ו-Tyr-223) סביב האנטגוניסט מוצגות בייצוגי מקלות, ואינטראקציות פוטנציאליות של קשרי מימן עם האנטגוניסט מוצגות במקפים אדומים. (G) מראה את ההבדל בצפיפות המרמז על נוכחות מולקולת NAG ליד Asn-210 במבנה הקשור לאנטגוניסט (שימו לב, NAG אינו מקושר עם Asn לשם בהירות). הדמויות נוצרו באמצעות Pymol. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: זיהוי, מידול ושכלול של מולקולות מעכבות וממסים קטנות במפה ברזולוציה גבוהה של β-גלקטוזידאז (EMD-10563). (A) מראה את מודל β-גלקטוזידאז שנפתר ל-2.3 Å (PDB: 6tsh) בייצוג קריקטורה, כאשר כל מונומר צבוע באופן ייחודי. התיבה האפורה מסמנת את אתר כריכת הליגנד. (B) מציג את צפיפות הפרשי Fo-Fc (מ-Servalcat) ברשת ירוקה באתר הפעיל של האנזים. ההבדל בצפיפות מצביע על נוכחות המעכב (DGN) וכמה מולקולות ממס באתר הפעיל. (C) מדגים כי מונחה על ידי מפת Fo-Fc, המעכב deoxygalacto-nojirimycin (DGN) מעוצב באתר הפעיל. ליגנד מעוצב זה מתואר בפורמט מקל ועטוף בצפיפות Fo (על ידי Servalcat), אשר צבוע blue_mesh. אינטראקציות קשר מימן בין DGN לבין מספר שאריות חלבון, כולל Tyr-503 ו- His-540, נצפות. צפיפות הפרשי Fo-Fc הנוספת סביב הליגנד (ירוק) מעידה על מולקולות הממס. (D) המפה מראה שמספר מולקולות ממס, כולל מים ו-Mg2+, המיוצגות ככדורים אדומים וסגולים, בהתאמה, מודלו באתר הפעיל לאחר שווידא שכל מולקולת ממס קשורה לחלבון (Glu-416, His-418 ו-Glu-461) או לשאריות ליגנד. מולקולות המים ו-Mg2+ עטופות בצפיפות Fo (רשת כחולה). Mg2+ נראה אינטראקציה עם ליגנד, DGN באמצעות מולקולת מים. מפת Fo-Fc (רשת שינוי ירוקה) בלוחות (B,C) מסומנת ב- 6σ, ואילו צפיפות Fo - רשת כחולה ב- C ו- D (מעידון Servalcat לאחר מידול) מעוצבת ב- 3σ. הדמויות בלוחות (A-D) נוצרו באמצעות Pymol. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: השפעת הרזולוציה על מידול ליגנדים ב-β-גלקטוזידאז. חצאי מפות מ-EMD-10563 שימשו כקלט בשלב Relion שלאחר התהליך, והמפות המשולבות שלאחר התהליך סוננו לרזולוציות 2.3 Å, 3.0 Å ו-3.5 Å עם גורמי B שונים. המפה המוצגת בכל הלוחות מסומנת בקווי מתאר של 6σ. לשם הבהירות, רק עמוד השדרה של החלבון מוצג ללא שרשראות צד, ליגנד או מולקולות ממס בלוחות A, B ו-C. (A) המפה מסוננת ל-3.5 Å, והאתר הפעיל של β-גלקטוזידאז מוצג. ברזולוציה זו נראה גוש הדומה לליגנד, DGN, מלווה בכמה כתמים קטנים יותר בסביבה. מידול הליגנד בכיוון הנכון מתגלה כמאתגר בשל היעדר מאפיינים ברורים במפה. (B) המפה המסוננת לרזולוציה של 3.0 Å מוצגת. כאן, כתם הליגנד הופך להיות מעט מוגדר יותר אך עדיין חסר תכונות באופן כללי. נצפים עוד כמה כתמים קטנים המרמזים על מולקולות ממס. (C) המפה המסוננת לרזולוציה של 2.3 Å חושפת את צפיפות הליגנד עם תכונות ברורות, ובמיוחד חושפת את קונפורמציית הכיסא של האימינוסוכר. מספר משמעותי של כתמים קטנים המתאימים למולקולות מים נצפים ברזולוציה זו. האומדן/חידוד האוטומטי של גורם B בתהליך שלאחר Relion נותן ערך של -18 Å2 עבור המפות המסוננות ל- 3 Å ו- 3.5 Å, בעוד שהערך הוא -52 Å2 עבור המפה המסוננת ל- 2.3 Å. חידוד גורם B שונה של מפות EM יכול להתבצע גם עם Coot ושימושי בבניית מודלים. (D) הפאנל ממחיש שהליגנד DGN (ייצוג מקל), Mg2+ ומולקולות המים (ככדורים) כפי שהן מעוצבות באתר הפעיל והמפה המחודדת ב-2.3 Å, מוצגות ברשת כחולה המקיפה אטומים אלה. הדמויות בלוחות (A-D) נוצרו באמצעות Pymol. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיפורים בחומרה ובתוכנה של המיקרוסקופ הביאו לעלייה במספר מבני ה-cryoEM בשנים האחרונות. למרות שהרזולוציה הגבוהה ביותר שהושגה כרגע ב- cryoEM של חלקיק יחיד היא 1.2 Å 57,58,59, רוב המבנים נקבעים סביב רזולוציית 3-4 Å. מידול ליגנדות במפות ברזולוציה בינונית עד נמוכה יכול להיות מסובך ולעתים קרובות כרוך בעמימות. בהתחשב בשימוש הנרחב ב- cryoEM הן באקדמיה והן בתעשיית הפארמה למחקר תרגומי וגילוי תרופות, הבטחת מודלים נכונים וללא עמימות היא חיונית. לכן, זה נבון לכמת את יכולת הפתרון של אטומי ליגנד על ידי חישוב Q-scores60, אשר זמין כעת EMDB כמדד להערכת איכות המפות ואת ההתאמה של המודל, כמו גם בכימרה.

בדוגמה הראשונה, ChimeraX שימש לחישוב מפת ההבדל במרחב האמיתי בין ה-apo לבין המפות הקשורות לליגנד באנזים M. tuberculosis enolase. הצפיפות הנוספת בסף גבוה מצביעה על נוכחות הליגנד, פוספונולפירובט, באתר הפעיל ו- Mg2+ קשור לליגנד. חשוב לציין שבמקרה הזה, המפה היא ברזולוציה בינונית (3.2 Å), ולא ניתן למדל מולקולות מים בביטחון (איור 1). המגבלה הקשורה לשיטה זו היא שניתן ליישם אותה רק כאשר קשירת ליגנד אינה גורמת לשינויים קונפורמטיביים משמעותיים בחלבון. נורמליזציה של המפה לא בוצעה במקרה זה מכיוון שגם מערכי הנתונים APO וגם מערכי הנתונים הקשורים לליגנד נרכשו באותו גודל פיקסלים ועובדו עם פרמטרים זהים ב- Relion. עם זאת, ראוי לציין כי כאשר משווים מפות שנוצרו על ידי תוכניות שחזור שונות, כגון Relion46,47 ו- CryoSparc61, או באיכות שונה, נורמליזציה של המפות הופכת חיונית לפני שניתן לבצע השוואות משמעותיות.

הדוגמה הבאה היא mGlu5, אשר עובר ארגון מחדש מולקולרי גדול עם קשירה אגוניסטית, כפי שניתן לראות ממבני cryoEM51,62 (איור 2). בתרחיש זה, לא ניתן לחשב מפת הפרשים פשוטה בין קולטנים לא מאוגדים (apo) וקולטנים הקשורים לליגנד בגלל הבדלים מהותיים בין המפות. כאן נעשה שימוש ב-Servalcat, המשתמש בחצאי מפות לא מחודדות ולא משוקללות כקלט לצורך עידון במרחב הדדי ולאחר מכן מחשב מפת הפרש בין מפת הניסוי לבין המפה הנגזרת מהמודל. בסף גבוה, ניתן לדמיין הבדלים ולשמש כמדריך לתיקון ושיפור המודל. כמה כתמים לא מדגמים בתחום החוץ-תאי וליד התחום הטרנסממברנלי של mGlu5 נצפו ושימשו כמדריך לליגנדות מודל (איור 2).

הדוגמה השלישית מראה כיצד רזולוציה (2.3 Å) ממלאת תפקיד מכריע בפענוח מפה ובמידול של מעכב בגודל שבר בגלקטוזידאז β. כאן, האתגר היה לזהות ליגנד קטן מאוד (<200 Da) במפת ההבדלים של Servalcat בתוך הרעש המובנה בנתונים ולמדל אותו במדויק. בנוסף לרזולוציה הגלובלית הגבוהה שנקבעה באמצעות מתאם מעטפת פורייה (FSC), הרזולוציה המקומית הספציפית לליגנד הייתה גם גבוהה מספיק כדי להבטיח מיקום מדויק של המרכזים הכיראליים של הליגנדות (איור 3). צפיפות מולקולות הממס נצפתה במפת ההבדלים לאורך כל האנזים ובמיוחד סביב הליגנד. הודגמה גם השפעת הרזולוציה על מידול ליגנדות ואטומי ממס (איור 4). חשוב לנקוט משנה זהירות בעת מידול מולקולות מים או ממס מכיוון שלעיתים, רעש בסף נמוך עשוי להידמות למים או למולקולות ממס, מה שמוביל לפרשנויות שגויות פוטנציאליות.

שיקול חשוב נוסף הוא שמפות cryoEM לבדן עשויות שלא להספיק כדי לזהות במדויק יון מתכת בפני עצמו. שיטות ביופיזיקליות נוספות כמו Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) או ספקטרוסקופיית קרני רנטגן מפזרת אנרגיה (EDX) נחוצות לעתים קרובות כדי לאשר את נוכחותו וזהותו של יון המתכת. הן באנזימי אנולאז והן באנזימי β-גלקטוזידאז, Mg2+ עוצב בשל שפע המידע הזמין כבר על חלבונים אלה, המאשר את זהותו של יון המתכת. כמו כן, התיאום של יוני המתכת במקרים אלה, שהודגם על ידי הגיאומטריה האוקטהדרלית הקלאסית ומרחקי הקואורדינציה הכמעט אידיאליים של Mg2+, סיפק הוכחה משמעותית לזהותם.

באופן כללי, יש לקחת בחשבון מספר שיקולים חשובים בעת מידול ליגנדות במפות cryoEM. ראשית, בחירת המפה הנכונה לזיהוי ליגנדים ומידול חשובה. בכל המקרים, מפה או חצי מפה לא מחודדת ולא משוקללת מומלצת מומלצת על פני מפה מחודדת ומשוקללת כדי להמחיש את צפיפות הליגנד, שכן חידוד ושקלול עלולים לגרום לאזורים לא מחודדים או מחודדים יתר על המידה (רעש עקב סיום סדרה) במפה. זה עלול לגרום לצפיפות ליגנד תת-אופטימלית, וניתן להשתמש בחידוד גורמי B שונים כדי להעריך את הצפיפות במהלך בניית מודל בקוט. למרות שקיים סיכון בשימוש במפה המושחזת לזיהוי ליגנדות במפת קריוEM, המפה הלא מחודדת עשויה שלא להציג את הפירוט המלא של צפיפות הליגנד, אך ניתן להשתמש בה למטרות הדגמה, כפי שמוצג באיור 1B,C.

יש לאמת את תנוחת הליגנד המודל, במיוחד במקרים בהם הנתונים חלשים. כפי שמוצג כאן עבור mGlu5, הרזולוציה המקומית משתנה על פני מפת cryoEM, ומידול בלתי משוחד של הליגנד יכול להיות מאתגר. Servalcat יכול לשמש ככלי רב ערך לאיתור אי דיוקים פוטנציאליים במידול חלבונים וליגנד22.

הטרוגניות קומפוזיציונית יכולה להיות נוכחת בקומפלקס חלבונים-ליגנדים שבו רק אוכלוסייה מסוימת עשויה להכיל את הליגנד (אם הליגנד הוא בעל משקל מולקולרי נמוך, אז שלב הסיווג עשוי שלא להסיר את ההטרוגניות). עם זאת, חשוב לבצע את שלבסיווג 63 התלת-ממדי באופן איטרטיבי במהלך עיבוד התמונה לפני מידול הליגנד ולוודא אם צפיפות הליגנד משתפרת. אם קיימים עותקים מרובים של חלבון, יש לנקוט משנה זהירות בעת החלת סימטריה על פני המפה במהלך יצירת המודל הראשוני והעידון, מכיוון שהדבר עשוי לחשב את צפיפות הליגנד בכל המולקולות הקשורות לסימטריה. סימטריה צריכה להיות מוטלת רק לאחר שהמפה נבדקה ביסודיות כדי לאשר את נוכחות צפיפות הליגנד בכל שרשראות החלבון.

בהתאם למצב (גביש או תמיסה) ולמיקום (קבור או פני שטח), האטומים יכולים להיות דינמיים, ובעידון המודל, זה נקרא פרמטר התזוזה האטומית (ADP). יחד עם מפת ההפרשים, המספקת רמזים חזותיים לאי דיוקים אפשריים במודל, ניתן להשתמש בערכי ADP כדי להעריך את דיוק הליגנדות לאחר עידון 64,65,66,67. בדרך כלל, לליגנד צריכים להיות ערכי ADP דומים לשאריות הסובבות אותו, כלומר, אם הם קשורים ביציבות ומעוצבים בצורה מדויקת. עם זאת, ליגנדות בפריפריה או אטומים של ליגנד (כמו ליפידים) הרחוקים ממקרומולקולות יכולים להיות בעלי ערכי ADP גבוהים יותר. בנוסף לליטוש הקואורדינטות, הן Refmac33,34 והן Phenix מאפשרים חידוד של ערכי ADP 28,68. ב- Refmac, קירוב Mott-Bethe משמש לחישוב גורם פיזור האלקטרונים של אטומים בודדים במהלך חישוב המפות. בגרסה האחרונה של פניקס, עידון גורם B אינדיבידואלי, בדומה לקריסטלוגרפיה, הוצג כדי להסביר הפרעת אטום. לעתים קרובות, במודלים המעודנים הנגזרים מ- cryoEM, נצפים מגוון רחב של ערכי ADP (לפעמים ערכים קרובים לאפס), ואפילו ציון Q המשמש ב- EMDB להערכת התאמת המודל למפה תלוי במפה הראשית שהופקדה ובאופי חידוד גורם B60. בבניית מודל cryoEM, מפות מרובות משמשות לעתים קרובות, ולכן, המפות המשמשות במידול ועידון צריכות להיות מוזכרות בבירור בשיטות, שכן בשל רזולוציה אנאיזוטרופית במקרומולקולות רבות, מפה אחת בודדת עשויה שלא להספיק כדי להסביר את כל הפרטים. 

במידול ליגנדות במקרומולקולות, אחת המגבלות העיקריות של מפות cryoEM (כמו בקריסטלוגרפיה) היא שאם אתר קשירת הליגנד הוא ברזולוציה נמוכה או אם הליגנד הכבול הוא דינמי, אז בירור הקונפורמציה הנכונה עשוי להיות קשה. בנוסף, לרוב מבני ה-cryoEM יש רזולוציות נמוכות מ-3 Å, והייצוג של מולקולות מים במפות מוגבל, מה שמקשה על הערכת תפקיד ההידרציה בקשירת ליגנד או תרופה (כפי שמוצג כאן עם הדוגמאות של אנולאז ו-mGluR). ניתן להשתמש בשיטות חישוביות בשילוב עם נתוני cryoEM כדי להתמודד עם מגבלות אלה69. בניגוד לקריסטלוגרפיה, רק המודל עובר עידון, לא המפה. כיום, השיטה היחידה לציין נוכחות של ליגנד או להבטיח מידול מדויק היא על ידי יצירת מפות השמטה (באמצעות כלים כמו Servalcat). לפיכך, ישנם מספר כלים המסייעים לחוקרים לבנות ולהעריך את המודל, אך ישנם מספר תחומים בחידוד המודל שבהם ניתן לצפות לגישות חדשות יותר או שינויים בגישות הנוכחיות בעתיד הקרוב.

במאמר זה, התמקדנו בגישות הנוכחיות למידול ליגנדות, הכוללות בדיקה ידנית של צפיפות הליגנד, יצירת קובץ הגיאומטריה של הליגנד, ולאחר מכן מידול הליגנד במפת cryoEM. זוהי תקופה מרגשת בביולוגיה מבנית ובגילוי תרופות, שכן גלאי אלקטרונים ישירים עם קצב פריימים מהיר יותר ושימוש באיסוף נתונים מהיר יותר70 הביאו להשגת מפות ברזולוציה גבוהה (<2.8 Å) של מספר מקרומולקולות הקשורות לעתים קרובות לליגנדות של מולקולות קטנות בזמן קצר יחסית. ההשקה האחרונה של כלי מידול ליגנדים אוטומטיים כגון GEMspot69 בסוויטת שרדינגר ואמרלד17 בסוויטת רוזטה, המנסה למצוא את תנוחת הכריכה הסבירה ביותר של הליגנד תוך שקלול נתוני ה- cryoEM הניסיוניים, מבטיחה לייעל ולהפוך תהליך זה לאוטומטי. בדומה לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, החזון הוא שזיהוי מצבי הקישור של ליגנדות של מולקולות קטנות על ידי cryoEM, אולי שניים או יותר ביום אחד, יהפוך לאפשרות מציאותית.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ש"י הוא מקבל את מלגת הדוקטורט מ- DAE-TIFR, והמימון מוכר. KRV מכירה במענק DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 ובתמיכת המחלקה לאנרגיה אטומית, ממשלת הודו, תחת פרויקט זיהוי מס'. RTI4006.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CCP4-8.0של מספר מכוניםhttps://www.ccp4.ac.uk חינם למשתמשים אקדמיים וכולל Coot ורשימת כלים שפותחו עבור קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן
CCP-EMשל מספר מכוניםhttps://www.ccpem.ac.uk/download.php חינם למשתמשים אקדמיים וכולל Coot, Relion ורבים אחרים
Coot פול אמסלי, LMB, קיימברידג'https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/תוכנה כללית לבניית מודלים אך זמינה גם עם חבילות אחרות שתוארו לעיל
DockinMap (Phoenix)קונסורציום של מספר מכוניםhttps://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.htmlתוכנה בתוך חבילת Phenix לעגינת מודל למפות cryoEM
בנק נתונים של מיקרוסקופיה אלקטרונית קונסורציום של מספר מכוניםhttps://www.ebi.ac.uk/emdb/מאגר ציבורי למפות מיקרוסקופ אלקטרונים
FalconThermo Fisher Scientific https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdfפרסומת, מצלמה מבית Thermo Fisher 
פניקס קונסורציום של מספר מכוניםhttps://phenix-online.org/download בחינם למשתמשים אקדמיים וכולל
Coot Protein Data Bankקונסורציום של מספר מכוניםhttps://rcsb.orgמאגר נתונים ציבורי של מבנים מקרומולקולריים
PymolSchrodingerhttps://pymol.org/2/כלי ויוזליזציה מולקולרי. הגרסה החינוכית היא חינמית אך מגיעה עם מגבלה. ניתן להשיג את הגרסה המלאה בתשלום סמלי.
RelionMRC-LMB, קיימברידג'https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.htmlתוכנה לעיבוד תמונה cryoEM, זמינה גם עם CCP-EM
Titan KriosThermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		מסחרי, cryoTEM מבית Thermo Fisher
UCSF ChimeraUCSF, ארה"בhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.htmlתוכנה לשימוש כללי לתצוגה, ניתוח ועוד
UCSF Chimera XUCSF, ארה"בhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/תוכנה לשימוש כללי לתצוגה, ניתוח ועוד
קונסורציום קונסורציוםאת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514(2018).
  3. Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
  4. Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM': electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
  5. Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
  6. Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
  7. Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
  8. Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
  9. Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
  10. Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
  11. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  12. EMDB (the Electron Microscopy Data Bank. , Available from: www.ebi.ac.uk/emdb/ (2023).
  13. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
  14. RCSB.org. , Available from: http://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2024).
  15. Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
  16. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  17. Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164(2023).
  18. Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
  19. Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
  20. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
  21. Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
  22. Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
  23. Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
  24. Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
  25. Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
  26. Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
  27. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
  28. Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
  29. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
  30. Debreczeni, J. É, Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
  31. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
  32. Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , Schrödinger, LLC. New York, NY. (2022).
  33. Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
  34. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
  35. Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
  36. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
  37. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera - A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  39. Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
  40. Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
  41. Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochemistry. 62 (3), 735-746 (2023).
  42. DeLano, W. L. The PyMOL molecular graphics system. Schrödinger LLC wwwpymolorg. Version 1. , Available from: http://www.pymol.org (2002).
  43. Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
  44. Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
  45. Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
  46. Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
  47. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  48. Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
  49. RCSB Protein Data Bank (RCSB PDB). , Available from: http://www.rcsb.org (2023).
  50. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
  51. Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648(2021).
  52. Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
  53. Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
  54. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309(2019).
  55. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  56. Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
  57. Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98(2023).
  58. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  59. Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  60. Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
  61. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  62. Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
  63. Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
  64. Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
  65. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  66. Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
  67. Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
  68. Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
  69. Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
  70. Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CryoEM MapsLigand ModelingProtein Ligand InteractionsElectron CryomicroscopyMacromolecular ComplexesDifference MapReal Space RefinementActive Site ResiduesPhosphoenolpyruvate BindingMagnesium Coordination

Related Articles