הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת למידה אסוציאטיבית בכימוטקסיס של הנמטודה Caenorhabditis elegans

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66311

⸱

17 ביוני 2025

 ,  , 
1Institute for Mind Brain and Behavior, Faculty of Medicine, HMU Health and Medical University Potsdam

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת למידה אסוציאטיבית על ידי ביצוע התניה קלאסית באורגניזם המודל C. elegans. הפרדיגמה מבוססת על זיווג ריכוז המלח בסביבה עם נוכחות או היעדר מזון, מה שמשנה את הכימוטקסיס שלהם לכיוון המלח או הרחק ממנו.

תקציר

כדי להתאים את התנהגותם, בעלי חיים מקצים ערכיות למידע חושי באמצעות למידה אסוציאטיבית, ומעדכנים את הקשר הזה כאשר תנאי הסביבה משתנים. התגובות ההתנהגותיות של Caenorhabditis elegans לנתרן כלורי מציעות פרדיגמה מוגדרת היטב לחקירת המנגנונים השולטים בלמידה אסוציאטיבית. חשיפת תולעים לרמות NaCl ספציפיות בשילוב עם נוכחות או היעדר מזון מעוררת כימוטקסיס לכיוון או הרחק מריכוז NaCl זה, בהתאמה. הזיכרון האסוציאטיבי נוצר תוך מספר שעות וניתן לשינוי באותה מסגרת זמן עם חשיפת בעלי החיים לריכוז NaCl שונה.

כאן, אנו מתארים כיצד לבחון פלסטיות התנהגותית ולמידה על סמך כימוטקסיס מלח C. elegans . זני הבדיקה גדלים בקבוצות מסונכרנות עד שהם מגיעים לבגרות ולאחר מכן מותנים למשך מספר שעות על צלחות עם ריכוזי NaCl שונים, בנוכחות או בהיעדר מזון. לאחר מכן מועברים בעלי חיים ללוחות בדיקה המכילים אזורים עם ריכוזי NaCl נמוכים, בינוניים או גבוהים ומאפשרים להם לזחול במשך 30 דקות לפני ספירת מספר התולעים בכל אזור. לאחר מכן מחושב אינדקס כימוטקסיס מהתפלגות התולעים על הצלחת. ניתן להשתמש בבדיקה כדי לבחון את ההשפעה של מגוון גורמים המשפיעים על הלמידה.

מבוא

כדי לקיים אינטראקציה משמעותית עם סביבתם ולייצר התנהגות אדפטיבית, בעלי חיים צריכים לפרש את המידע החושי שהם מקבלים: האם רמז חושי נתון מועיל או מזיק להישרדותם כמעט תמיד אינו נקבע מראש אלא תלוי בהקשר. משימה מרכזית של מערכות החישה והעצבים היא, אם כן, לייחס ערכיות למידע סביבתי באמצעות למידה אסוציאטיבית. חלק מהגירויים הם מעוררי תיאבון מטבעם, כמו מזון, ואחרים הם מרתיעים מטבעם, כמו רמזים נוסיספטיביים. גירויים בלתי מותנים כאלה (US) יכולים לשנות את התגובות לגירויים אחרים המוצגים יחד איתם; כתוצאה מכך, בעלי חיים יכולים לפתח משיכה או סלידה מהגירוי המותנה האחר (CS). זה מתפרש בצורה כזו ש-CS מאותת או חוזה את ארה"ב 1,2,3. חקר מודלים של למידה אסוציאטיבית הכרחי כדי להבהיר את המנגנונים הגנטיים, התאיים והפיזיולוגיים הבסיסיים. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר בשל הצורך בשימוש במודלים in vivo, שונות ההתנהגות, הרישוי הנדרש לטיפול בבעלי חיים, או לוחות הזמנים הארוכים לעתים קרובות של הכשרת החוקר ובעלי החיים, וזה בדרך כלל מונע את ביצועו על ידי סטודנטים לתואר ראשון במסגרת מחקרית, ועוד יותר במסגרת הוראה.

לכן, מודלים של חסרי חוליות מציעים את ההזדמנות לבצע מבחני למידה אסוציאטיביים עם סטודנטים לתואר ראשון או שני. חסרי חוליות אינם דורשים רישוי בעלי חיים כדי לטפל בהם ויכולים להיות חסכוניים. פרדיגמה נפוצה ללמידה אסוציאטיבית היא למידת כימוטקסיס מלח ב- C. elegans 4,5,6,7,8,9. C. elegans חשים את ריכוז הנתרן הכלורי (NaCl) בסביבתם ולומדים לקשר [NaCl] מסוים לנוכחות או היעדר מזון, בהתאמה. באופן כללי, בעלי חיים לומדים לנדוד לעבר ריכוזי מלח שהוצגו בעבר עם מזון חיידקי בשפע, ולומדים לנדוד הרחק מאלה שהוצגו בהיעדר מזון חיידקי. מלח הוא אפוא הגירוי המותנה, ומזון או רעב הם הגירוי הבלתי מותנה3. אסוציאציה זו נוצרת תוך פחות משעה ומהווה דוגמה לזיכרון אסוציאטיבי לטווח קצר. למידה אסוציאטיבית של כימוטקסיס NaCl מווסתת, בין היתר, על ידי איתות קינאז תלוי סידן/קלמודולין (CaMK), איתות דופמינרגי ואינסולין/פוספטידילינוזיטול (PI) 3-קינאז 5,9,10, מה שמצביע על כך שהוא מערב מערכות מוטיבציה ופלסטיות סינפטית תלויה ב-CaMK ועשוי לפעול באופן דומה למסלולי האיתות השולטים בלמידה אסוציאטיבית בבעלי חוליות.

בפרוטוקול מבוסס ללימוד כימוטקסיס מלח, בעלי חיים נודדים בשיפוע מרחבי של מלח על צלחת אגר שנוצרה על ידי הנחת שני פקקי אגר ללא מלח או עם מלח גבוה, בהתאמה, על לוח7. בדיקות אלו קשות לביצוע כמותי על ידי סטודנטים לתואר ראשון בשל השינוי הדינמי בריכוז ה-NaCl על לוחית הבדיקה הכימוטקסיס לאורך זמן ומרחב, מכיוון שה-NaCl מהתקעים מתפזר ברציפות לתוך צלחת האגר. בדיקה קלה יותר לביצוע היא השימוש בלוחות רבעים, שבהם מוצגים שני ריכוזי מלח שונים (למשל, 25 מ"מ NaCl ו-0 מ"מ NaCl) ומופרדים על ידי מחסומי פלסטיק11. עם זאת, בגלל הצגתם של שני ריכוזי NaCl שונים בלבד, לא ניתן להשתמש בו בו זמנית כדי לבחון משיכה ו/או הימנעות מ-NaCl נמוך או מוגבר ביחס למצב הבסיסי. C. elegans גדל בדרך כלל על צלחות NGM (Nematode Growth Media) בנוכחות 50 מ"מ NaCl וחיידק E. coli OP5012, ולכן יוצר קשר חיובי של ריכוז NaCl זה עם מזון כברירת מחדל.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למידה מותאם לכימוטקסיס מלח שיכול להתבצע הן על ידי חוקרים והן על ידי סטודנטים לתואר ראשון. בעלי חיים מותנים תחילה לסביבות NaCl שונות המוצגות בנוכחות או בהיעדר מזון. לאחר מכן הם מועברים ללוחות בדיקה עם בחירה של ריכוזי מלח נמוכים, בינוניים וגבוהים בלוחות אגר עם תא Y. ניתן להשתמש בלמידת הכימוטקסיס שלהם בסביבה זו כדי לחקור את ההשפעה של גורמים שונים המווסתים אותה, כגון גנוטיפ, הקשרים סביבתיים או גיל בעלי החיים.

פרוטוקול זה מותאם לכיתת מעבדה מעשית לתואר ראשון המחולקת לשמונה קבוצות סטודנטים, כאשר כל קבוצת סטודנטים מבצעת קבוצה של שש מדידות בכל נקודת זמן ניסויית (מדידה אחת לכל תנאי ניסוי). עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לעבודה עבור נסיין יחיד או עבור כל מספר של קבוצות/אנשים, עם שינויים מתאימים בכמויות המגיבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת לוחות גידול (GP) לסנכרון C. elegans לפני מבחן למידה אסוציאטיבי, וצלחות התניה (CP) לגרימת אסוציאציה [NaCl]-מזון ביום המבחן

הערה: צלחות פטרי לצמיחה והתניה זהות לצלחות מצע גידול הנמטודות הסטנדרטיות (NGM)12, אלא שריכוז ה-NaCl השתנה בלוחות NaCl CP של 0 מ"מ ו-NaCl CP של 100 מ"מ.

  1. הכינו ארבעה בקבוקי זכוכית נקיים של 500 מ"ל והוסיפו את הדברים הבאים:
    1. הוסף 1.25 גרם פפטון, 8.5 גרם אגר, 487.5 מ"ל מים מזוקקים ומערבל מגנטי לבקבוק אחד (עבור 0 מ"מ NaCl CP);
    2. הוסף 1.5 גרם NaCl, 1.25 גרם פפטון, 8.5 גרם אגר, 487.5 מ"ל מים מזוקקים ובוחש מגנטי לכל אחד משני בקבוקים (עבור 50 מ"מ NaCl CP ו-GP, בהתאמה);
    3. הוסף 3 גרם NaCl, 1.25 גרם פפטון, 8.5 גרם אגר, 487.5 מ"ל מים מזוקקים ובוחש מגנטי לבקבוק אחד (עבור 100 מ"מ NaCl CP).
  2. יש לבצע חיטוי של ארבעת הבקבוקים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לתת לבקבוקים להתקרר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  3. הניחו את הבקבוקים (אחד בכל פעם) על מערבל מגנטי מחומם. יש להוסיף לכל בקבוק 12.5 מ"ל של 1 M KPO4 (pH = 6.0 בטמפרטורת החדר [RT]). מערבבים היטב במשך 2 דקות, ואז מוסיפים 0.5 מ"ל של 1 M CaCl2, 0.5 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול באתנול, ו-0.5 מ"ל של 1 M MgSO4 (כל התמיסות חייבות להיות סטריליות). מערבבים על ידי ערבוב מגנטי.
    הערה: ערבוב יסודי לאחר הוספת KPO4 מונע משקעים של סידן פוספט בתוספת CaCl2.
  4. עבור כל סוג צלחת (0 מ"מ CP, 50 מ"מ CP, 100 מ"מ CP, GP), יש להקצות 8 מ"ל מהמדיום המתאים לכל צלחת פטרי בגודל 55 מ"מ על 10 מ"מ בתנאים כמעט סטריליים (במכסה המנוע או ליד מבער בונסן ).
    הערה: ניתן להכין כ-62 לוחות NGM מכל סוג משלב זה.
  5. מצננים את הצלחות על ידי השארתן ב-RT למשך כ-3 שעות, ולאחר מכן מאחסנים אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים עד לשימוש.
  6. הוסף 200 מיקרוליטר של תרחיף E. coli OP50 לכל NGM GP והניח לייבוש למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס בחממה.
    הערה: ניתן לאחסן את הלוחות ב-RT עד שבוע לפני השימוש.

2. תחזוקת C. elegans והכנה למבחן למידה אסוציאטיבי באמצעות הטלת ביצים מתוזמנת 13 (3 ימים לפני הבדיקה)

הערה: סיבוב אחד של בדיקת הכימוטקסיס בפורמט המוצע דורש לפחות 24 לוחות לצמיחה (GP), 48 לוחות לבדיקה (Assay Plates, AP) ו-8 לוחות לכל קבוצת מיזוג (Conditioning Plates, CP). עבור כיתה המחולקת לשמונה קבוצות תלמידים, המשמעות היא שכל קבוצת תלמידים מקבלת 3 GP, 6 CP ו-6 AP - כלומר, 1 CP ו-1 AP עבור כל תנאי ניסוי.

  1. שמור על C. elegans N2 (var. Bristol) על צלחות אגר NGM המוזנות ב-E. coli OP50 חי ב-20 מעלות צלזיוס. אחסן את הצלחות הפוכות לאורך כל התחזוקה כדי למזער את אובדן הלחות מהצלחות.
  2. העבירו 30 מבוגרים צעירים (יום 2) לכל רופא משפחה.
  3. אפשר לבעלי חיים להטיל ביצים במשך כ-8 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
  4. מוציאים את כל המבוגרים מהצלחות והתרבית הפוכה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.

3. הכנת בדיקה (יום אחד לפני הבדיקה)

  1. הכן CP זרוע (+) ולא זרוע (-).
    1. מחצית זרעים של האצווה של כל אחד מ-0 מ"מ NaCl CP, 50 מ"מ NaCl CP ו-100 מ"מ NaCl CP עם 200 מיקרוליטר OP50 לצלחת (CP0+, CP50+ ו-CP100+, בהתאמה).
      הערה: הוספת תרחיף OP50 ל-CP0+ עלולה לגרום לנשיאת כמות קטנה של NaCl (<2 מ"מ NaCl), אשר לא סביר שתשפיע באופן מהותי על התנהגות הכימוטקסיס. במצבים שבהם ריכוזים קטנים של NaCl רלוונטיים, ניתן להתאים זאת על ידי הוספת 2 מ"מ NaCl ללוחות CP0 ולמגזר 'ללא מלח' על לוחות הבדיקה.
    2. הניחו לצלחות להתייבש למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס באינקובטור לצד המחצית הלא זרועה של ה-CP (CP0-, CP50-, ו-CP100-, בהתאמה)
  2. הכן לוחות בדיקה (AP).
    1. הכינו שלושה בקבוקי זכוכית נקיים בנפח 1 ליטר והוסיפו את הדברים הבאים:
      1. הוסף 2.5 גרם פפטון, 17 גרם אגר, 975 מ"ל מים מזוקקים ומערבל מגנטי לבקבוק אחד (עבור 0 מ"מ NaCl)
      2. הוסף 3 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, 17 גרם אגר, 975 מ"ל מים מזוקקים ומערבל מגנטי לבקבוק אחד (עבור 50 מ"מ NaCl)
      3. הוסף 6 גרם NaCl, 2.5 גרם פפטון, 17 גרם אגר, 975 מ"ל מים מזוקקים ומערבל מגנטי לבקבוק אחד (עבור 100 מ"מ NaCl)
    2. יש לבצע חיטוי של שלושת הבקבוקים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לתת לבקבוקים להתקרר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    3. בינתיים, סמן את החלק התחתון של כל חלק בצלחת Y-Petri (צלחת פטרי בגודל 90 מ"מ על 10 מ"מ המחולקת לשלושה תאים על ידי דופן פנימית) עם ריכוז ה-NaCl המתאים של המדיום שיש לשפוך לתוכה. ציירו עיגול ברדיוס של 5 מ"מ סביב מרכז הצלחת, היכן ששלושת הקירות נפגשים (איור 1).
      הערה: השטח בתוך המעגל, יחד עם הקירות עצמם, ייצגו את אזור ההדרה למטרות ספירה: תולעים שנמצאות באזורים אלה במהלך הספירה לא ייחשבו לסך הכל של אף מגזר.
    4. הניחו את הבקבוקים (אחד בכל פעם) על מערבל מגנטי מחומם. יש להוסיף לכל בקבוק 25 מ"ל של 1 M KPO4 (pH = 6.0 ב-RT). מערבבים היטב במשך 2 דקות, ואז מוסיפים 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול באתנול, ו-1 מ"ל של 1 M MgSO4 (כל התמיסות חייבות להיות סטריליות). מערבבים על ידי ערבוב מגנטי.
    5. הכניסו את המדיום 0 מ"מ לתא אחד של צלחת Y-Petri בגודל 90 מ"מ על 10 מ"מ עד שהמדיום מגיע לחלק העליון של הדופן הפנימית, ואז אפשר כ-5 דקות להתמצק.
    6. הכניסו את המדיום של 100 מ"מ לתא השני של צלחת ה-Y-Petri עד שהמדיום נוגע בקטע ה-NaCl המוצק של 0 מ"מ הסמוך אליו. כדי למנוע זליגה לקטע הריק הסמוך, מלא את קטע ה-100 מ"מ עד שולי קיר ה-Y הפנימי, ולאחר מכן השתמש בקצה פיפטה סטרילי של 10 מיקרוליטר כדי לשבור את מתח הפנים של המדיום לאורך קיר ה-Y ולחבר אותו לקטע NaCl של 0 מ"מ. לאחר מכן, אפשר כ -5 דקות להתמצקות.
    7. יש לשים את המדיום של 50 מ"מ לתא הריק שנותר של צלחת ה-Y-Petri עד שהמדיום נוגע בחלקים הסמוכים של 0 מ"מ NaCl ו-100 מ"מ NaCl. הקפד שהמדיום לא יישפך לחלקים הסמוכים. לאחר מכן, אפשר כ -5 דקות להתמצקות.
    8. אחסן את הצלחות למשך הלילה בחום של 20 מעלות צלזיוס בחממה.
      הערה: ניתן לייצר כ-50 AP משיטה זו.
  3. הכן 1 ליטר של מאגר M9 סטרילי14.

4. מבחן למידה אסוציאטיבי של C. elegans (מבוצע כאן על ידי 8 קבוצות במקביל)

  1. פיפטה 1 מ"ל של מאגר M9 סטרילי על רופא משפחה וסובב את הצלחת בעדינות כדי לעקור את התולעים (בעיקר בוגרות של יום אחד) מה-OP50 והאגר, ויוצרות תרחיף.
  2. הטה את הצלחת, אסוף את מתלה התולעת במאגר M9 עם קצה פיפטה מפלסטיק של 1 מ"ל, והעביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    הערה: ניתן לקצץ את החלק העליון של קצה הפיפטה באמצעות מספריים כדי להגדיל את קוטר הפתח; זה מפחית את מתח הגזירה והנזק הפיזי כאשר התולעים עוברות דרך הקצה ויכול להיות שימושי במיוחד בעבודה עם קצות פיפטה של 200 מיקרוליטר. לפני שמתחילים בניסויים, חשוב לוודא שהתולעים לא נדבקות לסוג הצינור בו משתמשים; ניתן לעשות זאת על ידי התבוננות בצינור תחת מיקרוסקופ מנתח לאחר הסרת תרחיף התולעת.
  3. חזור על התהליך עבור כל רופאי המשפחה, ואז תן לתולעים להתיישב בתחתית צינורות המיקרו-צנטריפוגה למשך כ-60 שניות, וליצור גלולה.
  4. הסר את מאגר ה-M9 העודף/עודף באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הקפד לא להפריע לגלולה.
  5. שטפו את הגלולה עם 1 מ"ל של מאגר M9 סטרילי פעמיים נוספות כדי להסיר שאריות OP50. הניחו לגלולה להתיישב כ-60 שניות בין כביסות. השעו מחדש את הגלולה לאחר שטיפתה ל-300 מיקרוליטר עם M9 Buffer.
  6. העבירו לאט לאט 50 מיקרוליטר מתרחיף התולעת (כ-200-300 בעלי חיים) לכל לוחית מיזוג (CP0-, CP0+, CP50-, CP50+, CP100- ו-CP100+). סובב את התרחיף בכל פעם לפני ההצעה כדי לשמור על התולעים תלויות באופן שווה. עבור צלחות שנזרעו עם OP50, הניחו את טיפת התולעת הרחק ממדשאת המזון החיידקי. הניחו למתלה להיספג באגר.
  7. אחסן את הצלחות הפוכות ב-20 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך כ-4 שעות, ואפשר לתולעים לשוטט.
    הערה: ניתן לקצר את שלב ההתניה לשעתיים כדי להתאים ללוחות הזמנים של הקורסים לתואר ראשון.
  8. פיפטה 1 מ"ל של מאגר M9 סטרילי על CP וסובב את הצלחת בעדינות כדי לעקור את התולעים, וליצור תרחיף.
  9. הטה את הצלחת, אסוף את מתלה התולעת M9 עם קצה פיפטה מפלסטיק של 1 מ"ל והעביר אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  10. אפשר לתולעים להתיישב בתחתית צינור המיקרו-צנטריפוגה למשך כ-60 שניות.
  11. הסר את מאגר ה-M9 העודף באמצעות פיפטה של 1 מ"ל מבלי להפריע לכדור התולעת.
  12. שטפו את התולעים פעמיים נוספות עם 1 מ"ל של מאגר M9 סטרילי. הניחו לגלולה להתיישב כ-60 שניות בין כביסות.
  13. מלאו את צינור המיקרו-צנטריפוגה במאגר M9 עד לסימון של 1 מ"ל ואפשרו לכדור התולעת להתיישב במשך כ-60 שניות.
  14. הסר 960 מיקרוליטר של הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הקפד לא להפריע לגלולה.
  15. סובבו או נערו את צינור המיקרו-צנטריפוגה בעדינות כדי להשעות מחדש את התולעים, ואז השתמשו בפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להעביר 20 מיקרוליטר של כדור התולעת (המכיל כ-100-150 חיות) למרכז AP, שם כל המקטעים של דופן ה-Y נפגשים. חזור/י על שלב זה עבור נקודות הגישה האחרות.
  16. אפשרו לתולעים לשוטט במשך 30 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, ואז ספרו את מספר התולעים הקיימות בכל אחד מחלקי ה-AP (0 מ"מ NaCl, 50 מ"מ NaCl ו-100 מ"מ NaCl, בהתאמה) תחת מיקרוסקופ סטריאו. אל תכלול תולעים הנמצאות בטווח של 5 מ"מ ממרכז הצלחת בכל קטע או על הגבול בין החלקים (איור 1).
  17. אפשרו לתולעים לשוטט במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, ואז ספרו שוב את מספר התולעים בכל חלק של ה-AP. אל תכלול תולעים הנמצאות בטווח של 5 מ"מ ממרכז הצלחת בכל קטע.
  18. חשב את מדד הכימוטקסיס (CI) לכל צלחת לנקודת זמן באמצעות הנוסחה15,16:
    figure-protocol-1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התניה במשך 4 שעות על צלחות עם כמויות שונות של NaCl (0 מ"מ, 50 מ"מ, 100 מ"מ), עם או בלי מזון, השפיעה באופן משמעותי על התנהגותם של C. elegans מסוג בר (N2). לאחר 30 דקות על צלחת הבדיקה, תולעים שהושנו על צלחות עם ריכוזי NaCl גבוהים ומזון (CP100+) ותולעים שהושנו על צלחות ללא NaCl וללא מזון (CP0-) היו בעלי CI חיובי, מה שמצביע על העדפה לריכוזי NaCl גבוהים יותר (איור 2, טבלה 1, טבלה 2 וטבלה משלימה 1). לעומת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, אנו מתארים את הערכת הלמידה האסוציאטיבית בנמטודה C. elegans באמצעות כימוטקסיס כפרדיגמה ניסויית. בדוגמה שלנו, השתמשנו בשישה תנאי ניסוי. באופן ספציפי, C. elegans מסוג N2 הותנו על צלחות עם ריכוזי NaCl נמוכים (0 מ"מ), בינוניים (50 מ"מ) או גבוהים (100 מ"מ) שנזרעו עם מזון הנמטודה הסטנדרטי (זן חיידקי E. coli OP50) או נותרו ללא זרעים. לאחר מכן, הותר ל-C. elegans לשוטט בלוחית בדיקה לא זרועה המכילה קטעי אגר עם כל אחד משלושת ריכוזי ה-NaCl. חישבנו אינדקס ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

תודות

אנו מקדישים מאמר זה לזכרו של יוהנס ברטולד. חלק מהזנים סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של ה-NIH (P40 OD010440). E.I.B. מודה בתודה על תמיכתה הכספית של Studienstiftung des deutschen Volkes.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרChemsolute9972-2KG
Bacto-פפטוןGibco211677
CaCl2 תמיסת 1M Merck2389
Caenorhabditis elegans זניםCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
כולסטרול Roth8866.1
E. coli OP50 תרבית נוזליתN/AN/A
אתנולChemsolute22731000
KH2PO4 Roth P018.2
KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) תמיסת 1 M Chemsolute16341000
MgSO4 תמיסת 1 M RothT888.2
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לEppendorfN/A
Na2HPO4 RothT877.1
NaClChemsolute13671000
צלחות פטרי Y 90 x 10 מ"מMoonlab4-0033

מקורות

  1. Ardiel, E. L., Rankin, C. H. An elegant mind: Learning and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 17, 191-201 (2010).
  2. Rescorla, R. A., Holland, P. C. Behavioral studies of associative learning in animals. Ann Rev Psychol. 33, 265-308 (1982).
  3. Schleyer, M., Fendt, M., Schuller, S., Gerber, B. Associative learning of stimuli paired and unpaired with reinforcement: Evaluating evidence from maggots, flies, bees, and rats. Front Psychol. 9, 1494(2018).
  4. Dekkers, M. P. J., Salfelder, F., Sanders, T., Umuerri, O., Cohen, N. Plasticity in gustatory and nociceptive neurons controls decision making in C. elegans salt navigation. Comm Biol. 4, 1053(2021).
  5. Lim, J. P., et al. Loss of CaMKI function disrupts salt-aversive learning in C. elegans. J Neurosci. 38 (27), 6114-6129 (2018).
  6. Iino, Y. Chapter 13 - Salt Chemotaxis Learning in Caenorhabditis elegans. Handb Behav Neurosci. 22, 151-159 (2013).
  7. Kunitomo, H., et al. Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans. Nat Comm. 4, 2210(2013).
  8. Hiroki, S., et al. Molecular encoding and synaptic decoding of context during salt chemotaxis in C. elegans. Nat Comm. 13, 2928(2022).
  9. Hukema, R. K., Rademakers, S., Jansen, G. Gustatory plasticity in C. elegans involves integration of negative cues and NaCl taste mediated by serotonin, dopamine, and glutamate. Learn Mem. 15, 829-836 (2008).
  10. Tomioka, M., et al. The insulin/PI 3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
  11. Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. The G-protein gamma subunit gpc-1 of the nematode C.elegans is involved in taste adaptation. EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Pasadena, CA. (2006).
  13. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J Vis Exp. 27, e1152(2009).
  14. Cold Spring Harbor Laboratory. M9 Buffer for Worms. Cold Spring Harb Protocol. , (2014).
  15. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
  16. Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: Sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
  17. Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 18 (10), 654-665 (2011).
  18. Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Front Behav Neurosci. 11, 80(2017).
  19. Park, C., et al. Roles of the ClC chloride channel CLH-1 in food-associated salt chemotaxis behavior of C. elegans. eLife. 10, e55701(2021).
  20. Zhang, C., et al. The signaling pathway of Caenorhabditis elegans mediates chemotaxis response to the attractant 2-heptanone in a Trojan horse-like pathogenesis. J Biol Chem. 291 (45), 23614-23627 (2016).
  21. Jeong, J., Cho, N. J. Isolation of Caenorhabditis elegans mutants defective in chemotaxis toward cAMP. Integ Biosci. 10 (4), 237-241 (2006).
  22. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  23. Ikeda, D. D., Duan, Y., Matsuki, M., Iino, Y. CASY-1, an ortholog of calsyntenins/alcadeins, is essential for learning in Caenorhabditis elegans. Proc Nat Acad Sci. 105 (13), 5260-5265 (2008).
  24. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
  25. Iino, Y., Yoshida, K. Parallel use of two behavioral mechanisms for chemotaxis in Caenorhabditis elegans. J Neurosci. 29 (17), 5370-5380 (2009).
  26. Rabinowitch, I., et al. Circumventing neural damage in a C. elegans chemosensory circuit using genetically engineered synapses. Cell Syst. 12, 263-271 (2021).
  27. Luo, L., et al. Dynamic encoding of perception, memory, and movement in a C. elegans chemotaxis circuit. Neuron. 82 (5), 1115-1128 (2014).
  28. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מדידת למידה אסוציאטיבית בכימוטקסיס של הנמטודה Caenorhabditis elegans
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.