מאמר זה מציג טכניקה ייחודית של חזה סגור לגרימת פגיעה באיסכמיה של שריר הלב (IRI) בעכברים. השיטה המוצגת מאפשרת לעכברים לנשום באופן ספונטני תוך גרימת איסכמיה מרחוק של שריר הלב. זה מספק גישה לבעל החיים לחקר התהליכים הדינמיים של איסכמיה ורפרפוזיה באתרם ובזמן אמת באמצעות הדמיה לא פולשנית.
מאמר שיטה
חסימת LAD מופעלת מרחוק באמצעות קטטר בלון בעכברים נושמים באופן ספונטני
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוטם שריר הלב החריף (AMI) הוא מצב קרדיווסקולרי שכיח ותמותה גבוהה. למרות ההתקדמות באסטרטגיות רה-וסקולריזציה עבור AMI, היא מובילה לעתים קרובות לפגיעה באיסכמיה של שריר הלב (IRI), מה שמגביר את הנזק הלבבי. מודלים של מורין משמשים ככלים חיוניים לחקירת פציעות אקוטיות ותכנון מחדש כרוני של שריר הלב in vivo. מחקר זה מציג טכניקה ייחודית של חזה סגור להשראת IRI מרחוק של שריר הלב בעכברים, המאפשרת לחקור את השלב המוקדם מאוד של חסימה ורפרפוזיה באמצעות הדמיה in-vivo כגון MRI או PET. הפרוטוקול משתמש בשיטת חסימה מרחוק, המאפשרת שליטה מדויקת על התחלת איסכמיה לאחר סגירת החזה. הוא מפחית טראומה כירורגית, מאפשר נשימה ספונטנית ומשפר את עקביות הניסוי. מה שמייחד טכניקה זו הוא הפוטנציאל שלה לדימות לא פולשני בו זמנית, כולל אולטרסאונד והדמיית תהודה מגנטית (MRI), במהלך אירועי חסימה ורפרפוזיה. הוא מציע הזדמנות ייחודית לנתח תגובות רקמות כמעט בזמן אמת, ומספק תובנות קריטיות על תהליכים במהלך איסכמיה ורפרפוזיה. נערכו בדיקות שיטתיות מקיפות של גישה חדשנית זו, מדידת סמני נמק לבבי לאוטם, הערכת האזור בסיכון באמצעות MRI משופר בניגוד, והכתמת אוטם בשלב הבשלת הצלקת. באמצעות חקירות אלה הושם דגש על ערכו של הכלי המוצע בקידום גישות מחקריות לפגיעה באיסכמיה של שריר הלב ובהאצת הפיתוח של התערבויות ממוקדות. מוצגים כאן ממצאים ראשוניים המדגימים את ההיתכנות של שילוב פרוטוקול הניסוי החדשני המוצע עם טכניקות הדמיה לא פולשניות. תוצאות ראשוניות אלה מדגישות את היתרון של ניצול עריסת בעלי החיים הייעודית לגרימת איסכמיה מרחוק של שריר הלב תוך ביצוע סריקות MRI בו זמנית.
מבוא
אוטם חריף של שריר הלב (AMI), מצב קרדיווסקולרי עולמי נפוץ, קשור לשיעורי תמותה ותחלואה גבוהים1. למרות ההתקדמות הטכנולוגית שאפשרה אסטרטגיות רה-וסקולריזציה מוקדמות ויעילות עבור חולי AMI, חולים עדיין חווים פגיעה באיסכמיה של שריר הלב (IRI) בעקבות התערבויות אלה2. לכן, הבנת המנגנונים הבסיסיים וגיבוש גישות להפחתת IRI היא חיונית. IRI מייצג מצב פתופיזיולוגי מורכב המערב מספר רב של תהליכים ביולוגיים מורכבים. אלה כוללים מוות תאי מוסדר, תגובות עקה חמצונית, דלקת, ריפוי פצעים, פיברוזיס ועיצוב מחדש של החדרים. מודלים של בעלי חיים, כגון עכברים, היו בעלי חשיבות רבה למחקר IRI והם נמצאים בשימוש נרחב בשל עלות-תועלתם, הרבייה המהירה שלהם, ושפע המידע המכניסטי ממודלים טרנסגניים3.
פרוטוקול זה מציג טכניקה חדשנית להשראת IRI מרחוק בעכברים נושמים באופן ספונטני עם חזה סגור, המחקה באופן הדוק יותר את הפתולוגיה האנושית. חסימה מרחוק הושגה על ידי שימוש בצנתר בלון הממוקם במרחק משריר הלב כדי לחסום את העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD). גישה זו מציעה גישה מתמשכת ללב הפועם ברגעים המדויקים של חסימה ורפרפוזיה, ומקלה על שיטות הדמיה סימולטניות, כולל אולטרסאונד או דימות תהודה מגנטית (MRI). שיטות לא פולשניות אלה יכולות לספק תובנות חיוניות לגבי תגובות רקמות לפני, במהלך ואחרי אירועי חסימה ורפרפוזיה.
קיימות טכניקות כירורגיות שונות להשראת IRI במודלים מורינים. טראומה כירורגית הנובעת מבית החזה במודלים של קשירה כלילית בחזה פתוח מעוררת תגובה חיסונית המשפיעה על מנגנונים מגוונים הקשורים לאיסכמיה ורפרפוזיה. הפעלת מערכת החיסון המולדת טומנת בחובה פוטנציאל להשפיע על מידת אוטם שריר הלב4. הטכניקה המותאמת המוצעת מספקת גישה פוטנציאלית לחקר שריר הלב לפני ואחרי ההתניה ואולי להפחית את ההשפעה של התגובה החיסונית המולדת לטראומה כירורגית במחקרי IRI על ידי מזעור מסגרת הזמן של בית החזה הפתוח למקסימום של 5 דקות. יתר על כן, הטכניקה החדשה שפותחה עשויה גם לתרום להפחתת sequelae פרו דלקתי הנגרם על ידי פגיעה ריאות הנגרמת על ידי הנשמה5. עם זאת, ההשפעות המשולבות של שיטת החזה הסגור החדשה תדרוש חקירה מעמיקה נוספת.
תיקוף יסודי של הטכניקה המוצעת בוצע על ידי השוואתה לשיטה המסורתית, הכוללת חשיפת LAD באמצעות דיסקציה כירורגית של החזה וחסימה הנגרמת על ידי ליגטורה למשך 30 דקות. הושוו תוצאות משתי הטכניקות, שכללו מדידות טרופונין המשקפות את גודל אוטם הלב, הערכות של האזור בסיכון באמצעות MRI עם שיפור ניגודיות גדוליניום, צביעה היסטולוגית של טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC), וקביעת גודל צלקת סופי באמצעות צביעת סיריוס אדום (SR). התוצאה מדגימה את החוסן והיעילות של הגישה המוצעת לחקר פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה במודלים של מורין.
פרוטוקול
פרוטוקול זה של בעלי חיים אושר על ידי והוא בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים (ECD) באוניברסיטה הקתולית של לוון. כל המדיניות שפותחה על ידי ECD המקומי עוקבת אחר תקנות האיחוד האירופי בנוגע לרווחתן של חיות מעבדה כפי שהוכרז בדירקטיבה 2010/63/EU. כל הבדיקות המתוארות להלן בוצעו בעכברים זכרים C57BL/6 בני 8-12 שבועות (משקל גוף = 20-23 גרם). הניסויים החריפים מייצגים בעלי חיים שהוקרבו מיד לאחר הניתוח. ניסויי ההישרדות ייצגו מעקב של ארבעה שבועות, כולל מדידת טרופונין, MRI וצביעת SR.
1. הרדמה ואינטובציה אנדוטרכאלית
- מתן תרופות טרום הרדמה באמצעות תערובת של קטמין (7.5 מ"ג/ק"ג; Nimatek 100 מ"ג / מ"ל), xylazine (1 מ"ג / ק"ג; רומפון, 20 מ"ג/מ"ל), ואצפרומזין (0.1 מ"ג/ק"ג; Placivet, 10 מ"ג / מ"ל) (KXA) (ראה טבלה של חומרים) עם 0.9% מלח מדלל intraperitoneally. זה מאפשר אינטובציה חלקה יותר ופחות פולשנית.
- הניחו את העכבר בתא אינדוקציה (ראו טבלת חומרים) והפעילו הרדמה באמצעות איזופלורן 2.5% בחמצן טהור עם קצב זרימה של 1 ליטר/דקה עד לאיבוד רפלקס הישרה וצביטת הבוהן.
- מעבירים את בעל החיים לפד מחומם (±38 מעלות צלזיוס) ומניחים אותו בשכיבה עם הראש לכיוון המנתח. תקן את הזנב ואת הכפות הקדמיות עם סרט על הכרית. ודא כי הגפיים הקדמיות אינן מתוחות יתר על המידה, שכן זה יכול לפגוע בנשימה.
- הניחו תפר משי 2-0 (ראו טבלת חומרים) סביב החותכות העליונות והדביקו את התפר על גבול הפד כדי למשוך את העכבר. במידת הצורך, חבר מחזיק מחט כדי לשמור על מתח על התפר. יש לשמור על בעל החיים מורדם באמצעות 2% איזופלורן ב-100% חמצן עם זרימה של 1 ליטר/דקה באמצעות חרוט אף.
- הניחו מקור אור רק רוסטרלי של עצם החזה, הסירו את חרוט האף, והניחו את אספקת האיזופלורן על מכונת ההנשמה. בצע אינטובציה של העכבר באמצעות מלקחיים על ידי הרמת הלשון כלפי מעלה והחזקת לרינגוסקופ מתוצרת עצמית כדי להרים את החלק הבסיסי של הלשון עוד יותר ולדמיין את מיתרי הקול.
- הניחו צינור קנה נשימה מתוצרת עצמית באמצעות קטטר 18G על מחט עמומה בין מיתרי הקול. הזיזו את הצנתר, הוציאו את המחט העמומה וחברו את הצינור למאוורר העכבר (ראו טבלת חומרים).
- השתמש במחבר בצורת Y שונה (ראה רשימת חומרים) כדי לחבר את צינור האינטובציה למכונת ההנשמה. המיקום הנכון של צינור קנה הנשימה יכול להיות מאושר על ידי שיפוט הרחבת החזה סימטרי.
- הגדר את נפח הגאות (מ"ל) על משקל הגוף (BW) (g) x 7 ואת קצב האוורור על 53.5 x (BW (g)-0.26) משיכות לדקה, והתאם אותו למשקל הגוף של עכבר מסוים במידת הצורך6 (לדוגמה, עבור עכבר של 25 גרם נפח הגאות הוא 175 מ"ל ב 140 פעימות לדקה).
- להפחית את isoflurane ל 1% ב 100% חמצן, כמו החיה יישאר מורדם עקב premedication. עם זאת, להעריך באופן קבוע את עומק ההרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן. התאמת ריכוז איזופלורן בהתאם לעומק ההרדמה.
- יש למרוח טיפה של משחת עיניים למניעת יובש בזמן ההרדמה.
2. התקנת כלי IRI
הערה: הסר את כל ההדבקות והנח את בעל החיים על לוח הבסיס של כלי ה-IRI הייעודי. פרטים על מאפייני הכלי IRI מוזכרים בקובץ משלים 1.
- קבע את לוחית הבסיס של כלי ה-IRI המרוחק שנבנה במיוחד במיקום צדדי מול המנתח. תקן את הזנב והכפות באמצעות סרט הדבקה. תקנו את הראש באמצעות תפר משי 2-0 סביב החותכות העליונות כדי למנוע תזוזה מקרית (איור 1).
- הכנס את הבדיקה התרמית הרקטלית (ראה טבלת חומרים) כדי לפקח על טמפרטורת הגוף והשתמש במנורת חימום אינפרא אדום מעל החיה כדי לשמור על הטמפרטורה סביב 37 מעלות צלזיוס. שימו לב למרחק מספיק בין החיה למנורה כדי למנוע התחממות יתר.
- מקם את אלקטרודות מחט האק"ג בכל ארבע הכפות כדי לצפות ולרשום את קצב הלב ואת צורת הגל של האק"ג. אבטח את הבדיקה הרקטלית ואת אלקטרודות האק"ג לפלטפורמה באמצעות קלטת.
- יש למרוח קרם להסרת שיער בצד שמאל של בית החזה כדי להסיר שיער וליצור שדה ניתוחי ברור.
הערה: יש להגביל את זמן המריחה ולשים לב להסרה מלאה של הקרם למניעת כוויות כימיות.
3. Thoracotomy
- בצע הכנה אספטית של העור באמצעות תמיסת בטדין, לאחר מכן הנח וילון כירורגי על בית החזה השמאלי כדי להבטיח סביבה סטרילית. השתמש בציוד מעוקר כדי לבצע את ההליך. בצע חתך עור אנכי בחלק האמצעי של שריר החזה באורך של כ -1 ס"מ ובמרחק של כ -2 מ"מ מגבול עצם החזה השמאלית.
- לירוק את שריר החזה כדי לחשוף את הצלעות מתחת. הימנע מפגיעה בשוגג בכלי השיט. אם מתרחש דימום, השתמש אפליקטורים כותנה כדי לעצור כל דימום.
- דמיינו את הצלעות וזהו את החללים הבין-קוסטליים על ידי התבוננות בריאה המתנפחת דרך קיר החזה הדק והשקוף למחצה. פתח את חלל החזה באמצעות מספריים כירורגיים על ידי ביצוע חתך 6-8 מ"מ בחלל הבין-קוסטלי השלישי. יש לוודא שהחתך נמצא במרחק של לפחות 2 מ"מ מגבול עצם החזה שבו נמצא עורק החזה הפנימי.
- הכניסו ספקולום קטן של עין חולדה (ראו טבלת חומרים) בחלל הבין-קוסטלי. זה יתפקד כמסיר צלעות (איור 1A).
- הרימו בעדינות את קרום הלב עם מלקחיים מעוקלים ומשכו אותו בנפרד.
- מניחים חתיכת כותנה קטנה על גבי הריאה ודוחפים בעדינות כלפי מטה.
4. הכנת LAD
- ה-LAD נראה אדום בוהק ויוצא מאבי העורקים מתחת לאאוריקל השמאלי לכיוון הקודקוד. המיקום האידיאלי עבור הרצועה נמוך בכ -2 מ"מ מקצה האוריקל השמאלי. השתמשו בגזע הריאתי כסמן כדי לעזור לזהות את האוריקל השמאלי ולמטב את הדמיית LAD באמצעות זרם אור (איור 2).
- השתמש במחט מחודדת כדי להעביר תפר פוליפרופילן 7-0 סביב ה- LAD. אין להניח את המחט עמוק מדי, כפי שהוא יכול להיכנס לחדר השמאלי, ולא רדוד מדי, כפי שהוא יכול להזיק LAD.
- הסר את חתיכת הכותנה הקטנה ובדוק אם הריאה השמאלית עדיין מאווררת.
- הסר את מסיר הצלעות.
- יש לוודא שהתפר הוא באורך מינימלי של 15 ס"מ משני קצותיו. חותכים את המחט.
- הניחו חתיכה של צינור PE-50 בקוטר 1 מ"מ מעל חתיכה של צינורות PE-10 בקוטר 15 מ"מ (ראו טבלת חומרים). יש להנחות את שני קצוות התפר דרך צינור PE-10 ולהעביר את צינור ה-PE עם קצהו העבה כנגד הלב.
5. סגירת חזה ו extubating
- החל קצת ג'ל חומצה fusidic על החלל intercostal פתוח בעדינות לאפשר את האוויר intrathoracic הנותר לברוח על ידי חסימה קצרה של זרימת המאוורר. ניתן להוסיף ג'ל חומצה פוסידית נוסף לחלק החיצוני של צינור PE כדי למנוע כניסת אוויר לבית החזה.
- סגור את שריר החזה עם תפר 5-0 פוליפרופילן X מעל ומתחת לרמה של צינור PE, וודא שהחלק המעובה של צינור PE נמצא מתחת לרמה של השריר.
- סגור את העור עם שני תפרים של 5-0 פוליפרופילן X מעל ושניים מתחת לצינור PE (איור 1B ואיור 3).
- עם חזה סגור, החיה יכולה לנשום באופן ספונטני שוב. לגמול את בעל החיים ממכונת ההנשמה על ידי הפחתה איטית של נפח הגאות וקצב הנשימה. כאשר בעל החיים מתחיל לנשום, נתק בזהירות ספונטנית את צינור ההנשמה, אך שמור אותו במקומו עד שנצפה דפוס נשימה יציב.
- חבר את אספקת האיזופלורן עם חרוט אף המונחת מעל אפו של בעל החיים ומקובעת על צלחת הבסיס.
6. הרכבה של כלי IR מרחוק
- מקם את החלק הצדדי האנכי בלוח הבסיס על-ידי הכנסתו לחריצים.
- השתמש בוו דק כדי לשלוף את שני קצוות התפרים ומשוך אותם דרך החור המרכזי בחלק הצדדי מאחורי הבלון (ראה טבלת חומרים).
- מדריך אחד מהתפרים מסתיים מעל ומסביב לבלון. המשך עם קצה התפר השני מתחת ומסביב לבלון. יש למרוח ג'ל חומצה פוסידית להנחיה חלקה יותר של התפר.
- יש להנחות את קצה התפר דרך החרכים שעל גבי החלק הצדדי. על החלק הדיסטלי של התפר, הפעילו משקל של 2.1 גרם כדי לשמור על כל קצה תפר במקומו (איור 1C ואיור 4).
הערה: תצורת המשקולות המתאימות כפופה לשינויים ויש לבדוק אותה מראש. ראו תרשים משלים 1 וקובץ משלים 1 לפרטים. עיצוב כלי IRI מרחוק מסופק באיור משלים 2.
7. אינדוקציה של איסכמיה ורפרפוזיה
- לגרום לאיסכמיה על ידי ניפוח מיידי של הבלון באמצעות משאבת הבלון כלי הדם עד 2 בר. נעל את המשאבה. בדקו ויזואלית אם הבלון מנופח והמשקולות מורמות (איור 4).
- אשר את האיסכמיה על ידי התבוננות בשינוי בעקבות א.ק.ג.
- השאירו את הבלון מנופח לזמן שנקבע בהתאם לפרוטוקול המחקר הספציפי (30 דקות בניסויים המוצגים).
- עצור את החסימה פשוט על ידי פתיחת המשאבה. מנפחים את הבלון בזהירות. בדקו ויזואלית אם הבלון מנופח ומורידים משקולות.
8. פירוק כלי ה-IR המרוחק
- חותכים את התפר והצינור בין החיה לחלק הצדדי ומסירים בזהירות את החלק הצדדי.
- יש למרוח ג'ל חומצה פוסידית באתר החדרת הצינורית לבית החזה. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לדחוף בעדינות את העור כנגד הצינור והשתמש במלקחיים נוספים כדי לחלץ את הצינור. יש לחתוך כל תפר שנותר קרוב לעור.
- מניחים תפר נוסף של 5-0 פוליפרופילן כדי לסגור את אתר היציאה של הצינור ולמזער את הסיכון לכניסת אוויר לבית החזה.
9. סוף נרקוזיס והתאוששות
- עצור את אספקת האיזופלורן ואפשר לבעל החיים להתעורר בסביבה שקטה, חמה ועשירה בחמצן.
- ודא שהעכבר אינו נמצא במצוקה נשימתית כלשהי על ידי התבוננות בו עד להחלמה מלאה. לספק 0.3 מ"ל של מלוחים סטריליים (בטמפרטורת הגוף) על ידי הזרקה intraperitoneal כדי למנוע התייבשות.
- עבור שיכוך כאבים לאחר הניתוח, לנהל משכך כאבים אופיואידי (buprenorphine, 0.1 מ"ג / ק"ג) תת עורית לפני החיה הוא אמבולטורי. בדוק את העכברים כל 4-6 שעות במשך 24-48 השעות הבאות כאשר buprenorphine מסופק כדי להבטיח כי העכברים מגיבים לתרופות כאב כדי לקבוע אם תרופות כאב נוספות נדרשים. תמיכה נוספת צריכה לכלול ג'ל דיאטה סטנדרטי מומלץ לטיפול תומך או מחית המונחת על רצפת הכלוב לאחר הניתוח.
תוצאות
אימות היכולת לגרום לאיסכמיה בוצע על ידי ארבע בדיקות: צביעת טריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC) וסיריוס אדום (SR), מדידת טרופונין I לבבי והדמיית MR לשיפור גדוליניום מאוחר (LGE). מובהקות סטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן מאן-ויטני לא פרמטרי, בהתחשב בגודל המדגם המצומצם. מובהקות סטטיסטית יוחסה ל-p < 0.05.
בניסויים חריפים (צביעת TTC, n = 15) לא היו כשל טכני, וכל בעלי החיים נכללו. ניסויים חריפים אלה כללו ניסויי מעקב מיידיים (טרופונין לב I, LGE MRI, צביעה אדומה של סיריוס, n = 12) והיו בעלי שיעור הישרדות של 85% ו -80% עבור טכניקות חסימה מרחוק וסטנדרטיות, בהתאמה, במהלך תקופה של 4 שבועות.
צביעת טריפניל טטרזוליום כלוריד
צביעת TTC (Triphenyl tetrazolium chloride) במודל עכברי של פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה בלב מודדת באופן מקרוסקופי את תופעת הכדאיות של שריר הלב על ידי הצגת אובדן תפקוד של אנזים דהידרוגנאז. שיטת צביעה זו מסייעת להבחין בין אזורי הלב שעדיין קיימים (חיים) לבין אלה שהפכו ללא קיימא עקב איסכמיה. שריר הלב הקיים מוכתם אדום עם TTC, בעוד האזור האיסכמי נשאר חיוור או לא מוכתם מכיוון שהאנזים דהידרוגנאז אינו מתפקד יותר. זה מספק מידע קריטי על היקף הנזק לרקמות מוקדם לאחר הופעת איסכמיה. הצביעה בוצעה לקבוצות IRI סטנדרטיות (n = 7) וקבוצות IRI מרוחקות (n = 8) מיד לאחר 30 דקות של איסכמיה. איור 5 מראה פרוסות מוכתמות מייצגות עבור חיה אחת, עם פרוסות רקמה שעוברות מהבסיס לכיוון הקודקוד. תוצאות צביעת TTC מוצגות באיור 6 ולא מראות הבדל משמעותי בין שתי טכניקות IRI. צביעת TTC בוצעה כמתואר על ידי Fishbein et al.7.
MRI שיפור גדוליניום מאוחר
כדי למדוד באופן לא פולשני את היקף השטח האיסכמי, נעשה שימוש ב- LGE MRI 24 שעות לאחר החסימה עבור קבוצות IRI סטנדרטיות (n = 5) ו- IRI מרוחק (n = 5). פרטי רכישה מפורטים מופיעים בקובץ משלים 1. השטח בסיכון נמדד כאחוז הרקמה של החדר השמאלי בשלוש פרוסות אפיקליות ביותר החורג מקריטריוני הסף המפורטים בקובץ משלים 1. הייצוג הגרפי באיור 7 מראה כי לא נצפו הבדלים משמעותיים בין טכניקת החסימה מרחוק שהוצעה לאחרונה לבין השיטה המקובלת של "חזה פתוח" בעת הערכת מדידות האזור בסיכון.
סיריוס מכתים אדום
אוטם שריר הלב, תוצאה של איסכמיה שריר הלב, מהווה בעיה רצינית עבור אנשים החווים איסכמיה מכיוון שהיא גורמת להפחתה במסת התכווצות הלב, ופוגעת ביכולתו לשאוב דם ביעילות. איור 8 מסביר עוד יותר את הממצאים על-ידי שימוש בצביעת סיריוס אדום 4 שבועות לאחר החסימה כדי לאשר את מיקום היווצרות הצלקת בהתבסס על האזור בסיכון המתואר על-ידי LGE MRI ולמדוד את היקף רקמת הצלקת. הצביעה בוצעה עבור קבוצות IRI סטנדרטיות (n = 5) ו- IRI מרוחק (n = 5). אזורים אדומים בהירים מסמנים את הליבה הנמקית של האינפרקט, ואילו החלקים הכתומים מסמנים את הרקמה בת קיימא. לבסוף, איור 9 מדווח על גודל הצלקות הסופי שנמדד באמצעות צביעה אדומה של סיריוס בשתי הטכניקות. גודל הצלקת מחושב כשטח האוטם המוכתם חלקי השטח הכולל של דופן החדר השמאלי החופשי בלוח קטע הרקמה האפיקלית בעובי של 2.4 מ"מ. סיריוס צביעה אדומה בוצעה על פי ריטיה8.
טרופונין לב I
בנוסף לטכניקות הדמיה וצביעה, המחקר העריך גם נזק לבבי באמצעות טרופונין I לבבי כסמן. דגימות הדם נאספו לאחר 24 שעות לאחר הניתוח עבור קבוצות IRI סטנדרטיות (n = 8) ו- IRI מרוחק (n = 8). איור 10 מציג את הערך של טרופונין I לבבי, ולא מדגים הבדלים משמעותיים כאשר משווים את טכניקת החסימה מרחוק החדשה לטכניקת IRI הסטנדרטית.
כהדגמה להיתכנות הרעיון המוצע, ניתנות גם תוצאות ראשוניות של גרימת איסכמיה ממקום מרוחק עם הדמיה לא פולשנית בו זמנית. זה הושג על ידי שימוש בכלי החסימה מרחוק שנבנה בהתאמה אישית, אשר הוצב בתוך עריסת בעלי החיים MRI והוצב במרכז סורק MR. התוצאות המוצגות באיור 11 מדגימות הבדלים בניגודיות התמונה (רמות הבהירות) בין האזורים שעברו אוטם לבין אזורים שאינם אוטמים. מעקב אק"ג המראה גובה ST טיפוסי כסמן המאשר חסימה מוצלחת של LAD בזמן שהחיה ממוקמת בתוך סורק MR מוצג באיור 12B, בעוד איור 12A מראה את עקבות האק"ג לפני החסימה.
גישה מקיפה זו מספקת הבנה מפורטת של ההשפעות של טכניקת החסימה מרחוק שהוצעה לאחרונה על איסכמיה, נמק ונזק לבבי במודל הניסויי בהשוואה לשיטת החזה הפתוח הקונבנציונלית.
איור 1: תמונות מייצגות המדגימות את הכנת החיה כפי שהיא מתוארת בפרוטוקול. (A) כריתת בית החזה עם החדרת מחזיר צלעות. (B) סגירת בית החזה עם צינור PE-10 היוצא מבית החזה ומנחה את התפר סביב ה-LAD. (C) מיקום בעל החיים בתוך כלי ה-IRI המרוחק שהורכב. שימו לב לשתי המשקולות במשקל 2.1 גרם המהדקות כל קצה של התפר ונשענות על החלק הצדדי של עריסת ה-IRI המרוחקת. החלק הצדדי ממוקם ומוחזק במקומו על ידי המגזרות בלוח הבסיס של הכלי. צנתר הבלון הווסקולרי מנופח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תצוגה חזותית Ex vivo של LAD (חץ לבן) ואוריקל שמאלי (חץ שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תצוגה סכמטית מלמעלה למטה של מערך הניסוי, הממחישה את מיקום הכלי המשמש לחסימה מרחוק. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סכמטי הממחיש את השימוש בכלי לחסימה מרחוק ממבט מהצד. (A) מתחילת הניתוח מניחים את בעל החיים על חלקו התחתון. לאחר סגירת החזה, החלק הצדדי מותקן במקום. בשלב זה, הבלון עדיין מנופח, והמשקולות מונחות על החלק התחתון. (B) ניפוח קטטר הבלון ירים את המשקולות (המסומנות בחצים) ויגרום לחסימה של LAD עם איסכמיה עוקבת לשריר הלב. חסימה מוצלחת נראית בשינויים בעקבות האק"ג. ניפוח הבלון יחזיר את זרימת הדם דרך ה-LAD. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות מייצגות של פרוסות לב עכבר מוכתמות בטריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC). פרוסות עוברות מהבסיס לקודקוד משמאל לימין, החל מהשורה העליונה. (א) תקן IRI. (B) IRI מרוחק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תוצאות צביעת TTC. צביעת TTC בוצעה 24 שעות לאחר החסימה כדי למדוד את גודל האוטם. נקודות נתונים מוצגות כאמצעים עם SEM של קבוצות IRI סטנדרטיות (n = 7) ו- IRI מרוחק (n = 8). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: MRI מאוחר לשיפור גדוליניום. אזור בסיכון ב 24 שעות לאחר חסימה כפי שסומן על שלוש פרוסות אפיקליות ביותר (לא כולל קודקוד עצמו) המתקבל עם LGE MRI. נקודות נתונים מוצגות כאמצעים עם SEM של קבוצות IRI סטנדרטיות (n = 5) ו- IRI מרוחק (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: תיקוף מכשיר החסימה מרחוק על ידי MRI לאחר הליך איסכמיה/רפרפוזיה. השוואה מייצגת בין האזור בסיכון כפי שמתואר בתמונות LGE MR ביום אחד לאחר החסימה, לבין רקמת צלקת סופית מוכתמת באדום סיריוס לאחר 4 שבועות לאחר החסימה. (א-ב) פרוסות ציר קצרות של בעל חיים עם חסימה מרחוק וספסל בהתאמה. החץ מסמן את האזור המסומן בסיכון. (ג-ד) פרוסות היסטולוגיות מוכתמות באדום סיריוס של אותן חיות מאשרות שהיווצרות הצלקת הסופית תואמת את תיחום האזור בסיכון עם MRI 24 שעות לאחר החסימה. LV = החדר השמאלי. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: תוצאות צביעה אדומה של סיריוס. הצביעה האדומה של סיריוס בוצעה 4 שבועות לאחר החסימה כדי למדוד את מידת היווצרות הצלקת. נקודות נתונים מוצגות כאמצעים עם SEM של קבוצות IRI סטנדרטיות (n = 5) ו- IRI מרוחק (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: כימות ריכוז טרופונין I לבבי בסרום עכברים שהתקבל 24 שעות לאחר החסימה. נקודות נתונים של cTnI מוצגות כאמצעים עם SEM של קבוצות IRI סטנדרטיות (n = 8) ו- IRI מרוחק (n = 8). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: מוצגות תוצאות ראשוניות שהתקבלו על ידי שימוש בכלי החסימה מרחוק המוצע בשילוב עם רכישת MRI בו זמנית. אותה פרוסה באמצע החדר בכיוון הציר הקצר של בעל חיים אחד לפני, בזמן וזמן קצר לאחר החסימה מוצגת. משמאל, פרוסת התמונה המייצגת מציגה את גבולות שריר הלב בתחילת הניסוי (לפני הפעלת IRI). באמצע, אותה פרוסה קצרת ציר מוצגת לאחר 30 דקות של איסכמיה המושרה מרחוק. כלוריד מנגן (MnCl) שימש כחומר ניגוד להדגשת האזור האוטם (מסומן בצהוב). הבהירות הותאמה ורוותה באופן ידני כדי להדגיש את אזורי הרקמה השונים. שימו לב להפרש הבהירות בין המחיצה לבין הקיר החופשי הצידי (מסומן בצהוב). מימין, תוך שימוש באותן הגדרות בהירות כמו קודם, אותה פרוסה בעלת ציר קצר מוצגת 20 דקות לאחר החסימה (שלב הרפרפוזיה). החץ מציין את האזור עם בהירות מוגברת בהשוואה לזמן החסימה, וקובע את קליטת חומר הניגוד בשלב הרפרפוזיה והתכווצות האזור ההיפואינטנסיבי הראשוני כפי שהוגדר בזמן החסימה. LV = החדר השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: עקבות אק"ג שנלכדו באמצעות מערכת ניטור MRI כדי לאשר את הופעת האיסכמיה. (A) עקבות אק"ג רגילות שנלכדו לפני החסימה מרחוק. (B) עקבות א.ק.ג. שנלכדו מיד לאחר ניפוח הבלון באותה חיה. החץ מצביע על הגובה בקטע ST, הנחשב בדרך כלל לסמן של הופעת איסכמיה מוצלחת. עלייה בקצב הלב והנשימה, בנוסף לירידה באמפליטודת האות, נצפתה גם. בעל החיים ממוקם במרכז סורק ה-MR בשלבי החסימה והרפרפוזיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרשים משלים 1: תצורת משקולות. העלילה של כל המשקולות בפונקציה של תזוזת דינמומטר באמצעות מערכת השלט הרחוק של הבלון (כחול) לעומת מערכת הגלגלות המקורית (כתום). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: עיצוב כלי IRI מרחוק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: פרטים על מאפייני כלי IRI וטכניקות רכישה וניתוח תמונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
דיון
טכניקת החסימה מרחוק החדשנית שהוצגה במחקר זה מציעה פלטפורמה ייחודית לקידום המחקר בתחום מידול פציעות איסכמיה-רפרפוזיה על ידי הימנעות מהצורך במניפולציה ישירה של כלי הדם במהלך הניתוח הראשוני ומאפשרת הדמיה רב-מודאלית סימולטנית של שריר הלב הרפרפוזי המוקדם. אפיון מקיף, כולל מדידות טרופונין-I, ניגודיות LGE MRI, TTC וצביעת SR, מראה כי הטכניקה המוצעת שקולה לתקן הזהב הנוכחי (כלומר, קשירת LAD פתוחה בחזה)9.
לטכניקה המוצעת יתרונות רבים על פני גישת קשירת LAD המסורתית 'הפתוחה'. בראש ובראשונה, הוא מקצר את זמן החזה הפתוח במהלך הניתוח ל-15 דקות בלבד, בניגוד לזמן החסימה (30-60 דקות) בתוספת זמן הניתוח (15 דקות) הנדרש בגישה המסורתית. ניתוח לב פתוח ממוזער זה עשוי להפחית נזק לרקמות ודלקת, אך ידרוש חקירה נוספת. יתר על כן, סגירה מוקדמת של בית החזה מאפשרת גמילה ממכונות הנשמה, ובכך מאפשרת נשימה ספונטנית תחת איזופלורן במהלך ניסויי איסכמיה-רפרפוזיה. יש לכך פוטנציאל להפחית את הפגיעה הריאתית הנגרמת על ידי מכונת הנשמה ואת הדלקת הנלווית אליה, תוך מתן אפשרות לתגובה מדויקת יותר מבחינה פיזיולוגית לאיסכמיה של שריר הלב ורפרפוזיה10.
יתר על כן, טכניקת החסימה מרחוק מציעה שליטה משופרת על העיתוי המדויק של השראת איסכמיה. כהוכחת היתכנות, הודגמו ההיתכנות והתוצאות הראשוניות של גרימת איסכמיה שריר הלב ושליטה בה מרחוק, כאשר בעל החיים הוצב במרכז סורק ה-MR. היכולת ליזום איסכמיה במדויק לאחר סגירת החזה מאפשרת לחוקרים לתזמן התערבויות טיפוליות או חקירות נוספות ולסנכרן את העלבון האיסכמי בין נבדקי הניסוי. שליטה מוגברת זו יכולה להוביל לאינדוקציה מדויקת ועקבית יותר של IRI, שהיא קריטית למחקרים מכניסטיים וטיפוליים. עם זאת, ההרחבה השולית של שאיפת איזופלורן במהלך מערך MRI הלב עשויה להוות מגבלה למחקר זה. כלומר, חשיפה ממושכת לאיזופלורן עשויה להיות בעלת השפעות נוספות להגנה על הלב, כפי שהודגם במחקרי מורין, ותצריך חקירה נוספת עבור מודל11 המוצע.
שונות בהיקף הפציעה המושרה היא אתגר נפוץ במודלים של IRI, הנובע לעתים קרובות מהבדלים בביצוע ניתוח או באנטומיה משתנה12. חשוב לציין כי הכשרה נאותה של המנתח תשפיע על שיעורי התמותה במודל זה מעבר למשתנים מוכרים אחרים כגון מיקום LAD, משך הניסוי, זני עכברים ורקע גנטי13. הבחירה של חומרי הרדמה ומשככי כאבים יכולה גם להשפיע על התוצאות. על פי ניסיון, מודל זה מציג שיעור תמותה כולל קרוב ל -15%. יישום ניהול כאב קפדני וניטור ערני של בעלי חיים יכולים להפחית את התמותה עוד יותר.
אחד הכיוונים המשכנעים המצוינים בעבודה זו הוא היישום הפוטנציאלי של טכניקת החסימה מרחוק בהערכת התערבויות טיפוליות בשלבים המוקדמים של חסימה או רפרפוזיה.
לסיכום, טכניקת החסימה מרחוק מייצגת התקדמות מבטיחה במידול IRI, מה שעשוי לשכלל מחקרים מכניסטיים ולהאיץ טיפולים ממוקדים. יכולתו להפחית טראומה כירורגית, לשפר את השליטה על תזמון האיסכמיה ולשפר את עקביות הניסוי מדגישה את חשיבותה. על ידי חקירה נוספת של יכולת ההסתגלות של הטכניקה, חוקרים יכולים לשחרר את מלוא הפוטנציאל שלה ולתרום להבנה מדויקת יותר של השלבים המוקדמים של השראת איסכמיה, רפרפוזיה, והפגיעה הנלווית לאיסכמיה-רפרפוזיה. כמו כן, ניתן לראות כעת את ההשפעה של אסטרטגיות טיפול שונות בשלבים ראשוניים אלה.
גילויים
למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.
תודות
הניסויים בוצעו במתקן הליבה של KU Leuven 'מרכז הדמיה מולקולרית של בעלי חיים קטנים' (MoSAIC). המחברים מבקשים להביע את תודתם לקטרז'ינה בלז'ייצ'יק על הסיוע הטכני. המחקר נתמך על ידי מענקי מחקר של KU Leuven (C14/20/095) וקרן המחקר - פלנדריה (FWO G0A7722N). M. Algoet נתמך על ידי קרן המחקר - מענק מלגת פלנדריה (FWO 11A2423N).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-0 תפר משי | Sharpoint Products | DC-2515N | |
| 5-0 תפר פוליפרופילן | Ethicon | 8710H | |
| 7-0 תפר פוליפרופילן | Ethicon | 8206H | |
| ACCLARENT מכשיר ניפוח בלונים | Johnson& ג'ונסון מדטק | BID30 | |
| אצפרומזין | קלה | ||
| BD ויאלון 18 גרם | BD | 381347 | |
| BD ויאלון 20 גרם | BD | 381334 | |
| תמיסת בטדין | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| בופרנורפין (הזרקת בופרנקס) | רקיט בנקיזר הלת' | NDC 12496-0757-1 | |
| קרפיון זום סטייל Knijplood 2.1 גרם (משקולות דיג עופרת)Visdeal.nl | |||
| Dumont #3 מלקחיים | כלי מדע עדינים | 11231-30 | |
| Dumont #5 מלקחיים | כלי מדע עדינים | 11251-30 | |
| מספריים עדינים | כלי מדע עדינים | 14040-10 | |
| ג'ל פוסידין | Leo Pharma | ||
| Isoflurane | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| KD עכבר/ספקולום עין חולדה | מכשירי דיוק עולמיים | 501897 | |
| KD ספקולום עכבר/עין חולדה | מכשירים מדויקים עולמיים | 501897 | |
| קטמין | דקרה | ||
| מקור אור | Zeiss | KL 1500 LCD | |
| מערכת MRI | Bruker BioSpin, Ettlingen, גרמניה | BioSpec 70/30 | |
| NatriumChloride 0.9% | Baxter | ||
| מנורת חום אינפרא אדום לילית | Zoo Med Laboratories, Inc. | תוכנת RS-75 | |
| ParaVision | Bruker BioSpin | גרסה 6.0.1 | |
| צינורות פוליאתילן PE-10 | SAI טכנולוגיות עירוי | PE-10 | |
| צינורות פוליאתילן PE-50 | SAI טכנולוגיות עירוי | PE-50 | |
| כלי IRI מרחוק (PMMA) | תוצרת בית | ||
| מכרסמים כירורגיים | מכשירי | ||
| Segment v4.0 | Medviso, segment.heiberg.se | R12067 | |
| רצף הד שיפוע מגודר עצמי | Bruker BioSpin, Ettlingen, גרמניה | IntraGate, ParaVision 6.0.1 | |
| מחזיק מחט מוארך דק | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| אינדוקציה עכבר/חולדה Sure-Seal | World Precision Instruments EZ-178 | ||
| מחברי צינורות, פולי, צורת Y | Westlab | 072025-0001 | |
| צנתר הרחבה Ultraverse 035 PTA: 5 מ"מ x 40 מ"מ, בלון RBP 17 כספומט על קטטר באורך 130 ס"מ | Bard Peripheral Vascular, Inc. | ||
| Veet (קרם אפילטורי) | Reckitt Benkiser Healthcare | ||
| Ventilator, MiniVent דגם 845 | הוגו סאקס | 73-0043 | |
| Vidisic | BAUSCH & LOMB PHARMA | 685313 | |
| קסילזין | באייר |
מקורות
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101 (5), 593-600 (1981).
- Ibáñez, B., et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Dąbrowska, A. M., et al. The immune response to surgery and infection. Cent Eur J Immunol. 39 (4), 532-537 (2014).
- Muthuramu, I., et al. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. J Vis Exp. (94), e52206(2014).
- Nickles, H. T., et al. Mechanical ventilation causes airway distension with proinflammatory sequelae in mice. Am J Physiol-Lung C. 307 (1), L27-L37 (2014).
- Reed, G. W., et al. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Rittié, L. Method for picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
- Schwarte, L. A., et al. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Vaneker, M., et al. Mechanical ventilation induces a Toll/Interleukin-1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β-dependent inflammatory response in healthy mice. Anesthesiology. 111, 836-843 (2009).
- Van Allen, N. R., et al. The role of volatile anesthetics in cardioprotection: A systematic review. Med Gas Res. 2, 22(2012).
- Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16 (1), 41-44 (2005).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Res Cardiol. 97 (3), 206-213 (2002).
הדפסות חוזרות והרשאות
