פגיעה כרונית בהיצרות של העצב האינפרא-אורביטלי הדיסטלי בעכברים גורמת לשינויים בהתנהגות ספונטנית (פעילות טיפוח פנים מוגברת) ובהתנהגות נוציפנסיבית בתגובה לגירוי מישושי (תגובתיות יתר לגירוי שיער פון פריי) המהווים סימנים לכאב מתמשך ולאלודיניה ומשמשים מודל לכאב נוירופתי טריגמינלי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פגיעה כרונית בהיצרות של העצב האינפרא-אורביטלי הדיסטלי (DIoN-CCI) בעכברים לחקר כאב נוירופתי טריגמינלי
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים של בעלי חיים נותרו כלים הכרחיים לחקר כאב נוירופתי. כתב יד זה מתאר את מודל הפגיעה הכרונית בעצב אינפרא-אורביטלי דיסטלי (DIoN-CCI) לחקר כאב נוירופתי טריגמינלי בעכברים. זה כולל את ההליכים הכירורגיים לביצוע פציעת ההתכווצות הכרונית ואת הבדיקות ההתנהגותיות שלאחר הניתוח כדי להעריך את השינויים בהתנהגות ספונטנית ומעוררת שהם סימנים לכאב מתמשך ואלודיניה מכנית. השיטות והקריאות ההתנהגותיות דומות למודל פגיעת התכווצות כרונית של עצב אינפרא-אורביטלי (IoN-CCI) בחולדות. עם זאת, שינויים חשובים נחוצים להתאמת מודל IoN-CCI לעכברים. ראשית, הגישה התוך-מסלולית מוחלפת בגישה רוסטרלית יותר עם חתך בין העין לכרית השפם. לפיכך, ה-IoN קשור באופן מרוחק מחוץ לחלל המסלול. שנית, בשל הפעילות המוטורית הגבוהה יותר בעכברים, מתן אפשרות לחולדות לנוע בחופשיות בכלובים קטנים מוחלף על ידי הצבת עכברים במתקני ריסון שתוכננו ונבנו בהתאמה אישית. לאחר קשירת DIoN, עכברים מפגינים שינויים בהתנהגות ספונטנית ובתגובה לגירוי שיער פון פריי הדומים לאלה שבחולדות IoN-CCI, כלומר, טיפוח פנים מכוון מוגבר ותגובתיות יתר לגירוי שיער פון פריי בטריטוריית ה-IoN.
מבוא
כאב נוירופתי נובע מנזק למערכת העצבים הסומטוסנסורית, המוביל להעברה לא תקינה של אותות חושיים למוח. נזק עצבי סומטוסנסורי לא תמיד מוביל לכאב נוירופתי, אך השכיחות עולה עם חומרת הנוירופתיה הקלינית 1,2. חולי כאב נוירופתי חווים תסמינים ספציפיים כגון תחושות ספונטניות (צריבה, סיכות ומחטים, תחושות חשמליות) וכאב עז או ממושך באופן חריג לגירוי תמים או מזיק הנוטים להפוך לכרוניים ועמידים לטיפול בתרופות כאב קונבנציונליות3. התקדמות משמעותית בתחום חקר הכאב הנוירופתי נובעת מהגילוי כי כיווץ רופף של ליגטורות סביב העצב הסיאטי בחולדות מוביל להתנהגויות המזכירות מצבי כאב נוירופתיים אנושיים4. בעלי החיים מפגינים סף מופחת לחום, קור וגירוי מכני, ומפגינים התנהגויות נוסיפנסיביות. למרות ההבדלים הביולוגיים המובנים בעיבוד כאב בין בני אדם למכרסמים, מודלים של בעלי חיים הם כלי רב ערך לחקר המנגנונים הבסיסיים בהתפתחות כאב נוירופתי ולבחינת אסטרטגיות טיפול חדשות שהוצעו.
פרדיגמות בדיקת כאב מבוססות רפלקס חושי היו בשימוש נרחב במודלים של כאב נוירופתי, אך מדידת כאב מתמשך או הפרעות אחרות המלוות בתדירות גבוהה (הפרעת שינה, דיכאון, חרדה) לא קיבלה תשומת לב מספקת בהתחשב בכך שמדובר בתסמינים קליניים נפוצים המשפיעים על איכות החיים 5,6,7,8 . התנהגות טיפוח הפנים בחולדות תועדה כמדד לכאב נוירופתי ספונטני בעקבות פגיעה כרונית בהיצרות (CCI) של העצב האינפרא-אורביטלי (IoN)9,10. בנוסף, חולדות מפתחות גם תגובתיות יתר לגירוי מישוש קל של טריטוריית ה- IoN, המעידה על אלודיניה מכנית.
בהשוואה לעכברים, בגלל גודלם הגדול יותר, חולדות מתאימות יותר לפציעות כירורגיות. עם זאת, עכברים מציעים יעילות עלות ומקום ודורשים כמויות תרופות קטנות יותר. כמו כן, הופעת הטכנולוגיה המהונדסת הגבירה עוד יותר את השימוש בעכברים11,12. לכן, המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע פגיעה עצבית אינפרא-אורביטלית כירורגית בעכברים, בדומה לזו שבחולדות, הגורמת לשינויים בהתנהגות ספונטנית ומעוררת לחקר כאב נוירופתי טריגמינלי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בעלי חיים מטופלים ומטופלים בהתאם להנחיות לחקר כאב בבעלי חיים מודעים של האגודה הבינלאומית לחקר הכאב ובהתאם לתקנות הפלמיות והאירופאיות לחקר בעלי חיים והנחיות ARRIVE. הפרוטוקול מאושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית.
1. בעלי חיים
- השתמש בעכברי C57BL/6J זכרים ונקבות (Janvier, בן 10 שבועות בעת ההגעה).
- לשכן עכברים זכרים ונקבות בנפרד בכלובי עכברים סטנדרטיים בעלי תחתית מוצקה בחדר מושבה עם לחות של 40%-60% וטמפרטורת חדר (RT) של 21 ± 1 מעלות צלזיוס.
- לספק מים ומזון עד ליביטום.
- שמור על עכברים תחת מחזור רגיל של 12:12 שעות חושך/אור (אורות דולקים בשעה 08:00).
2. ניתוח
- בכל עכבר, הכינו חתיכה אחת של רצועת מעיים כרומית (6-0) באורך של כ-6 ס"מ והניחו אותה במי מלח סטריליים כדי למנוע התייבשות ולהיות נוקשה ושבירה.
- להרדים את העכבר עם קטמין/קסילזין (75/15 מ"ג/ק"ג, תוך צפקי, נפח הזרקה 10 מ"ל/ק"ג). בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת העור בין אצבעות הרגליים. ודא שהעכבר אינו מכופף את רגלו. במידת הצורך, יש להמתין עד שבעל החיים מורדם לחלוטין ו/או לתת קטמין/קסילזין נוספים.
הערה: משככי כאבים משלימים לא צריכים להינתן כדי למנוע השפעות משככי כאבים מונעים שעלולים להפריע להתפתחות של כאב נוירופתי טריגמינלי. - יש לגלח בעדינות את השיער הבוקאלי בין כרית השפם לעין כדי לבצע חתך של כ-4 מ"מ רק רוסטרלי לפתח האינפרא-אורביטלי. היזהר לא לפגוע בשפם, שכן זה עלול להשפיע על בדיקות התנהגותיות.
- תקן את ראש העכבר במסגרת סטריאוטקסית או קבע את הראש בדרך אחרת. הניחו את העכבר על פד מחומם או דאגו לשמור על טמפרטורת הגוף אחרת.
- יש למרוח משחה על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש. לשפשף את אזור הראש המגולח עם אלכוהול, ולאחר מכן עם betadine. מניחים וילון כירורגי החושף את אזור הראש המגולח.
- השתמש במיקרוסקופ עבור שלבים 2.7 עד 2.14.
- בצע חתך עור בקוטר 4 מ"מ בניצב לקו האמצע בערך באמצע הדרך בין קצה כרית השפם לעין, רק רוסטרלי לפתח האינפרא-אורביטלי, ומרוכז סביב הקו שבין מרכז העין למרכז כרית השפם.
- חשוף את ה- IoN על ידי הפרדה בוטה של רקמת החיבור השטחית. דאגו למזער את הנזק לשרירים ולהימנע מסיבי העצבים המוטוריים. ודאו שתא המטען של ה-IoN (קוטר 1-1.5 מ"מ) נגיש בעומק של כ-3 מ"מ בין המקום שבו הוא יוצא מהגולגולת לבין המקום שבו הוא מסתעף אל כרית השפם (איור 1).
- באמצעות תנועה סיבובית, החליקו את ראשו של עזר קשירה מחובר מתחת ל- IoN, תוך הקפדה שלא לפגוע בעצב.
- הניחו את ליגטורת המעיים הכרומית דרך החור בקצה עזר הקשירה ומשכו את עזר הקשירה כך שהליגטורה תישאר מתחת ל-IoN ושני קצוות הרצועה יהיו פחות או יותר שווים מה-IoN.
- קשרו "קשר החלקה" משני קצוות הרצועה והחליקו את הקשר כנגד ה-IoN. ודא שקשר ההחלקה מאפשר פעולה חלקה, כך שניתן יהיה לשלוט במדויק במידת ההתכווצות. החלק את הקשר עוד יותר וכווץ את ה- IoN. להקטין את קוטר העצב רק על ידי כמות ניכרת4. הניחו קשר רגיל על גבי קשר החריץ כדי למנוע ממנו להחליק.
- חותכים את קצות הרצועה ומשאירים כ-1.5 מ"מ של קצוות חופשיים כדי למנוע את פירוק הקשר.
- בצע את ניתוח הדמה לפי שלבים 2.2-2.8.
- סגרו את חתך העור באמצעות תפרים סינתטיים נספגים (6-0) ואפשרו לבעל החיים להתאושש על פד מחומם או מתחת למנורת חימום אינפרא אדומה.
3. בדיקה התנהגותית
- להרגיל את העכבר לתנאי הדיור לפחות 8 ימים לפני הבדיקה לפני הניתוח.
- לפני הבדיקה לפני הניתוח, להרגיל את העכבר להליך הבדיקה לפחות פעם ביום במשך 3 ימים.
- יש לבצע בדיקות בתנאי תאורה רגילים. במידת הצורך, ספקו רעשי רקע כדי למזער הפרעות מרעשים חיצוניים.
- התבוננות בהתנהגות טיפוח הפנים
- יש לשאת עכבר בודד מהמארז לחדר הבדיקה בכלוב פלסטיק מכוסה ללא כל חומר מצעים. הימנע גירוי חיצוני בעת הובלת בעלי החיים.
- הניחו את העכבר בכלוב פלסטיק מכוסה ושקוף ללא מצעים (l x w x h: 12 cm x 12 cm x 17 cm) מול מצלמת וידאו. הציבו מראה כדי לראות את פני החיה כאשר גבה מופנה לכיוון המצלמה.
- הקלט את התנהגות העכבר במשך 10 דקות. במהלך ההקלטה, ודא כי הנסיין אינו נוכח בחדר.
- לאחר הקלטת החיה הבאה, נקו את כלוב התצפית.
- בקש מצופה עיוור לתנאי הניסוי של העכבר לנתח את ההתנהגות המוקלטת.
- שימו לב לכל פרק טיפוח פנים תוך ניתוח ההקלטה בת 10 הדקות. טיפוח פנים הוא דפוסי תנועה שבהם בעל החיים מביא את כפותיו הקדמיות במגע עם אזורי הפנים.
- יש להבחין בין טיפוח פנים מבודד לבין התנהגויות טיפוח פנים במהלך טיפוח הגוף9. אם רצף אינו מקדים או מלווה בטיפוח הגוף, הפרק מסומן כטיפוח פנים מבודד. טיפוח הגוף מוגדר כדפוסי תנועה המביאים כפות, לשון או חותכות במגע עם אזור גוף שאינו הפנים או הכפות הקדמיות. אם טיפוח הגוף קיים לפני או אחרי רצף טיפוח פנים, הפרק מתויג כטיפוח פנים במהלך טיפוח הגוף.
- קבע את מספר פרקי טיפוח הפנים על ידי החלת קריטריון חיתוך של 4 שניות. פרק זמן בין פעולות טיפוח של פחות מ-4 שניות מוגדר כהפסקה בתוך אפיזודה אחת. פרק זמן גדול מ-4 שניות מוגדר כהפסקה מלאה של פעולות הטיפוח בין שני פרקים.
- בדיקת גירוי מכני
- יש לשאת עכברים בקבוצות של עד 6 בעלי חיים מהדיור לחדר הבדיקה בכלוב מכוסה עם מצעים. שוב, יש להקפיד להימנע מגירוי חיצוני.
- הניחו את העכברים אחד בכל פעם על שולחן.
- מניחים את זנב העכבר במהדק סיליקון רך ומחברים את המהדק באופן מגנטי לצלחת מתכת על השולחן. חומר הסיליקון מונע מהזנב להחליק מהמהדק תוך מזעור הלחץ על הזנב.
- הניחו מחזיק פלסטיק בעל שלושה קירות (65 מ"מ x 25 מ"מ x 23 מ"מ) מעל החיה, כך שרק ראש העכבר יבלוט מהמיכל. גודל המחזיק מאפשר תנועות ראש וכף קדמית אך מונע מהחיה להסתובב בתוכו. לבסוף, הניחו משקולת על גבי המחזיק כדי לשמור על המחזיק במקומו (איור 2).
- השתמש בסדרה מדורגת של ארבע שערות פון פריי. הכוח הדרוש לכיפוף השערות הוא 0.02 גרם, 0.16 גרם, 0.4 גרם ו-1.0 גרם.
- הרגילו את העכברים לרסן והגיעו לתנועות במשך 10 דקות. כל 30 שניות, לעשות תנועה להגיע לכל חיה.
- כאשר בעל החיים נמצא במצב רגוע, מרחו לאט את שיער פון פריי הבהיר ביותר בתוך שטח ה-IoN ליד מרכז הוויבריסה עד ששיער פון פריי יתכופף. ודא כי הגירוי לוקח לא יותר מ 1 שניות.
- דרג את תגובת בעל החיים לגירוי כך שתתאים לאחת מקטגוריות התגובה הבאות.
- תן ציון 0 כאשר אין תגובה.
- תן ציון של 1 לזיהוי, כלומר, העכבר מסובב את ראשו לעבר האובייקט המגרה ולאחר מכן חוקר את אובייקט הגירוי.
- תן ציון של 2 עבור תגובת נסיגה, כלומר, העכבר מסובב את הראש בעדינות או מושך אותו במהירות לאחור כאשר הגירוי מוחל; לעיתים, מתרחשת ניגוב פנים בודד לאזור המגורה.
- תן ציון 3 עבור תקיפה, כלומר, העכבר תוקף את אובייקט הגירוי, ביצוע תנועות נשיכה ו / או תפיסה.
- תן ציון 4 עבור טיפוח פנים א-סימטרי, כלומר, העכבר מציג סדרה רצופה של לפחות שלוש משיכות שטיפת פנים המכוונות לאזור הפנים המגורה.
- עבור כל עכבר, להחיל שערות פון פריי בסדר עולה של אינטנסיביות ולעורר באופן אקראי את הצדדים ipsilateral ו contralateral. יש להפעיל כל עוצמת גירוי פעם אחת בכל צד.
- חשב את הציון הממוצע מהתגובות לארבע שערות פון פריי בתוך כל חיה. חישוב ציונים נפרדים עבור הצדדים האיפסילטרליים והנגדיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עכברי DIoN-CCI מראים עלייה חזקה לאחר הניתוח בזמן שהוקדש לטיפוח פנים מבודד ובמספר אפיזודות טיפוח הפנים המבודדות (איור 3). העלייה החזקה ביותר מתרחשת במהלך השבוע הראשון שלאחר הניתוח ולאחר מכן הופכת קטנה יותר במהלך השבועות הבאים, אך היא גדלה באופן משמעותי במשך 6 שבועות לפחות. טיפוח הפנים במהלך טיפוח הגוף פחות או יותר אינו מושפע.
עכברי DIoN-CCI אינם מגיבים כמעט לחלוטין לגירוי מכני איפסילטרלי של טריטוריית ה-IoN האיפסילטרלית במהלך השבוע הראשון לאחר DioN-CCI (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בחולדות, נטען בעבר כי גישה תוך-מסלולית ל-IoN עדיפה, בהתחשב בחשיבות של שליטה בשרירים עדינים שלמים בדפוסי הקצפה מורכבים בהבחנה ויבריסוטקטילית והמרחק היחסי של החתך בקו האמצע לטריטוריית העצב האינפרא-אורביטלי העורי10. אחרים טענו כי גישה דיסטלית דרך חתך לתוך העור השעיר caudal אל כרית vibrissal יש מספר יתרונות13,14. מבחינה כירורגית, זוהי טכניקה קלה יותר שהיא זעיר פולשנית. ניתן לבצע זאת ללא שימוש במסגרת סטריאוטקסי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
למחברים אין הכרות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חתול כרומי (6-0) | Dynek | CG602D | ליגטורות |
| כותנה מוליך | בית מרקחת | ||
| מצלמת וידאו דיגיטלית | Sony | HDR-CX330E | |
| Dumont #5 מלקחיים | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont - טיפים מיקרו-קהים (#5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Duratears | Alcon | 0037-820 | משחת עיניים |
| עזר קשירה מכור | Fine Science | Tools 18062-12 | |
| קטמין | קטלר פייזר | (50 מ"ג/מ"ל) | |
| מיקרוסקופ פעולה | Kaps | SOM 62 | |
| ספוגית כותנה מדויקת | Qosina | 10225 | |
| גוזם דיוק | פיליפס | HP6392/00 | |
| Rompun | Bayer | קסילזין (2%) | |
| מספריים - טיפים קהים | Fine Science Tools | 14574-09 | |
| ערכת אסתזיומטר Semmes-Weinstein Von Frey | Stoelting | 58011 | |
| Vicryl Rapide | Ethicon | MPVR489H | תפרים |
מקורות
- Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu Rev Neurosci. 32, 1-32 (2009).
- Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. J Pain. 7, 281-289 (2006).
- Jensen, T. S., Gottrup, H., Sindrup, S. H., Bach, F. W. The clinical picture of neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 429 (1-3), 1-11 (2001).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Backonja, M. M., Stacey, B. Neuropathic pain symptoms relative to overall pain rating. J Pain. 5, 491-497 (2004).
- Basbaum, A. I., et al. Measurrement and New Technologies. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. N. , IASP Press. Seattle, WA. (2006).
- Mogil, J. S., Crager, S. E. What should we be measuring in behavioral studies of chronic pain in animals. Pain. 112, 12-15 (2004).
- Vierck, C. J., et al. Animal Studies of Pain: Lessons for Drug Development. Emerging Strategies for the Treatment of Neuropathic Pain. Campbell, J. N. , IASP Press. Seattle, WA. (2006).
- Deseure, K., Adriaensen, H. Nonevoked facial pain in rats following infraorbital nerve injury a parametric analysis. Physiol Behav. 81 (4), 595-604 (2004).
- Deseure, K., Hans, G. H. Chronic constriction injury of the rat's infraorbital nerve (IoN-CCI) to study trigeminal neuropathic pain. J Vis Exp. (103), e53167(2015).
- Mogil, J. S. Animal models of pain: progress and challenges. Nat Rev Neurosci. 10 (4), 283-294 (2009).
- Wilson, S. G., Mogil, J. S. Measuring pain in the (knockout) mouse: big challenges in a small mammal. Behav Brain Res. 125 (1-2), 65-73 (2001).
- Ding, W., et al. An improved rodent model of trigeminal neuropathic pain by unilateral chronic constriction injury of distal infraorbital nerve. J Pain. 18 (8), 899-907 (2017).
- Hardt, S., Fischer, C., Vogel, A., Wilken-Schmitz, A., Tegeder, I. Distal infraorbital nerve injury: a model for persistent facial pain in mice. Pain. 160 (6), 1431-1447 (2019).
- Krzyzanowska, A., Avendaño, C. Behavioral testing in rodent models of orofacial neuropathic and inflammatory pain. Brain Behav. 2 (5), 678-697 (2012).
- Martin, Y. B., Malmierca, E., Avendaño, C., Nuñez, A. Neuronal disinhibition in the trigeminal nucleus caudalis in a model of chronic neuropathic pain. Eur J Neurosci. 32 (3), 399-408 (2010).
- Deseure, K., Hans, G. Behavioral study of non evoked orofacial pain following different types of infraorbital nerve injury in rats. Physiol Behav. 138, 292-296 (2015).
- Vuralli, D., Wattiez, A. S., Russo, A. F., Bolay, H. Behavioral and cognitive animal models in headache research. J Headache Pain. 20 (1), 11(2019).
- Krzyzanowska, A., et al. Assessing nociceptive sensitivity in mouse models of inflammatory and neuropathic trigeminal pain. J Neurosci Methods. 201 (1), 46-54 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
