שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל

שינויים פנוטיפיים בתאים הקשורים להתפתחות סרטן באמצעות קבוצה משותפת של יכולות ביולוגיות משתנות מכונים כיום בדרך כלל סימני ההיכר של סרטן. ביניהם שינויים הנובעים מתכנות מחדש של מטבוליזם של אנרגיה, הנפוצים בביולוגיה של התא הסרטני¹. תכנות מחדש מטבולי כזה כולל דרישה מוגברת לברזל לתמיכה בהתרבות מהירה ובצמיחת הגידול². צמא זה לברזל מוביל למטבוליזם ברזל לא מווסת, אשר כשלעצמו נחשב סימן ההיכר של סרטן ^3,4, עם חוסר ויסות המתרחש בכל השלבים⁵. סימני ההיכר של גרורות, שהוצעו לאחרונה על ידי וולש והרסט, כוללים תפקיד לברזל⁶ מכיוון שברזל יכול לגרום לעקה חמצונית, וזה יכול, בתורו, לתווך שינויים בגנום, באפיגנום ובפרוטאום, מה שמגביר את האפשרות של גרורות⁷. קשר בין רמות ברזל להופעה מוגברת של סרטן הוכח באמצעות מחקרים אפידמיולוגיים⁸.

מאז תאים סרטניים דורשים כמויות גדולות של ברזל, הם רגישים למחסור בברזל, ולכן, קלציה ברזל. לאחרונה פרסמנו מאמר סקירה המדגיש את הפוטנציאל של כלציה ברזל בהיפוך מספר סימני היכר של סרטן באמצעות NDRG1 המשבש מסלולי איתות אונקוגניים⁹. עם זאת, השימוש בקלאציה של ברזל כטיפול עצמאי בסרטן לא הניב תוצאות חיוביות בניסויים קליניים בשל רעילותם, מחצית החיים הקצרה, חילוף החומרים המהיר ומנגנוני ההתנגדות המתפתחים. עם זאת, כלטורי ברזל הראו הבטחה במחקרי in vitro ו-in vivo , מה שמצביע על כך שנדרשת עבודה נוספת כדי לפתח כלטורי ברזל יעילים לטיפול בסרטן. כלציה ספציפית של ברזל היא אסטרטגיה מתוקפת בגילוי תרופות נגד סרטן, אך רק כמה סוגים דווחו עד כה¹⁰.

זיהוי ואפיון של כלטורי ברזל חדשניים דורש יכולת למדוד את השפעתם על מספר נקודות קצה. רבים מאלה (כגון התפשטות, אפופטוזיס, היווצרות מיני חמצן תגובתי) נמדדים באופן שגרתי ותוארו ונסקרו בספרות כשיטות להערכת סימני ההיכר של סרטן¹¹. כאשר מעריכים כלטור ברזל חדש, קבוצות רבות בוחנות באופן שגרתי את ההשפעה על פעילויות נוגדות שגשוג וחמצון-חיזור, כמו גם השפעות על זרימת ברזל או אפלוקס. בטכניקות חיזוי סיליקו,¹² מגדילות עוד יותר את המאגר ההולך וגדל של כלטורי ברזל הניתנים לבדיקה.

Screening של chelators ברזל דורש את היכולת למדוד את השפעתם על רמות ברזל כאמצעי להוכיח הוכחה יעילה של עיקרון. נכון לעכשיו, השיטה הנפוצה ביותר לעשות זאת היא ציטומטריית זרימה¹³ שהיא יקרה, גוזלת זמן וניתנת לכימות גרוע. הבחירה של הבדיקה מבוססת לעתים קרובות על הזמינות של ציוד ניסיוני, מהירות, ואת העלות של הבדיקה. לכן, היכולת לכלאט ברזל יכולה להיות מדד נקודת קצה שמתעלמים ממנו בשל העלויות הגבוהות של הציוד והאתגר לכמת במהירות ובאופן משכפל את חוזק הקלציה. במאמר זה אנו מתארים שיטה פלואורסצנטית נטולת תאים הניתנת לכימות וזולה כדי לאשר את יכולתן של תרכובות חדשות לכלאט ברזל.

1. הכנת פתרון מלאי

1. בעת הכנת פתרונות מלאי Calcein, למנוע השפלת תמונה על ידי שמירה על פתרונות בחושך. הכינו תמיסה של 1 mM של Calcein ב- PBS של Dulbecco, ללא מגנזיום או סידן¹⁴. עבור 5 מ"ל של 1 מ"מ תמיסת Calcein, להוסיף 3.1 מ"ג של Calcein (622.5 גרם / M) ל 5 מ"ל של PBS של Dulbecco. באמצעות גרב 1 mM של Calcein, להכין 1 מ"ל aliquots של תמיסות מלאי משני בצינור microfuge כמפורט בטבלה 1.
2. הכינו מלאי ברזל של אמוניום סולפט הקסהידראט על ידי המסת 19 מ"ג של הקסהידראט FAS (392.1 גרם/מ"ר) ב-5 מ"ל של PBS של דולבקו כדי לקבל תמיסת ברזל אמוניום סולפט (FAS) של 10 מילימול. הכינו מלאי משני של FAS על ידי דילול. כדי להכין מלאי של 2 mM FAS (fA), לדלל 200 μL של מלאי FAS 10 mM עם PBS עם 800 μL של PBS של Dulbecco. כדי להכין מלאי של 100 מיקרומטר FAS (fB) לדלל 50 μL של מלאי fA עם 950 μL של PBS של Dulbecco.
3. להכנת 10 מ"מ של ציר Deferiprone, יש להמיס 2.8 מ"ג (139.15 גרם/מ"ר) ב-2 מ"ל של PBS של Dulbecco. הכינו מלאי משני של 2mM ברזל chelator על ידי דילול 200 μL של מלאי 10 mM עם 800 μL של PBS של Dulbecco.
   הערה: בבדיקה זו יש להמיס את כלטור הברזל המועדף ב- PBS של Dulbecco ללא מגנזיום או סידן. כדוגמה עובדת, השתמשנו בכלטור הברזל Deferiprone.

2. אימות בדיקה על ידי קביעת הטווח הליניארי של פלואורסצנטיות Calcein

1. הכן מגוון של מלאי Calcein 1 mM עד 1 μM כמתואר בטבלת פתרונות מלאי (ראה טבלה 1). שמור על תמיסות מלאי בחושך כדי למנוע התפרקות פוטוכימית.
2. פיפטה 90 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) לבארות A עד H ו-1 עד 12 של צלחת באר 96 באמצעות פיפטה ידנית חד-ערוצית או פיפטה ידנית רב-ערוצית.
3. הוסף 10 μL של 1 mM מלאי Calcein לעמודה 12, שורות A עד H, של צלחת באר 96 באמצעות פיפטה ידנית ערוץ יחיד.
4. הוסף 10 μL של מלאי Calcein 800 מיקרומטר מוכן מראש (טבלה 1) לצלחת באר 96 בטור 11, שורות A עד H, באמצעות פיפטה ידנית חד-ערוצית.
5. חזור על הליך ההוספה עם המניות מטבלה 1 כך שעמודה 10 תכיל 10 μL ממלאי 400 מיקרומטר, ועמודה 9 תכיל 10 μL ממלאי 200 מיקרומטר וכו'. המשך בהליך הדרגתי זה לאורך העמודות עד שעמודה 2 תכיל 10 μL של מלאי 1 מיקרומטר.
   הערה: הריכוז הסופי של קלצאין בכל באר נמוך פי 10 מתמיסות המלאי עקב דילול של 1:10.
6. הוסף 10 μL של PBS לעמודה 1, שורה A עד E.
7. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ומכוונים את המנתח על קורא מיקרו-צלחות לעירור של 490 ננומטר וזיהוי של 530 ננומטר (או מסנן מתאים לפלואורסצנטיות Calcien).

3. אימות בדיקה על ידי Fe²⁺ מרווה יונים כדי להפחית פלואורסצנטיות Calcein

1. הכינו מלאי קלצין (cB) של 10 מיקרומטר ומלאי FAS (fA) של 2 מילימטר (ראו טבלת חומרים). שמור את מלאי Calcein בחושך כדי למנוע השפלה photodegradation.
2. באמצעות פיפטה ידנית חד-ערוצית או פיפטה ידנית רב-ערוצית, הוסף 50 μL של PBS לעמודות 2 עד 10, שורות A עד E. אל תוסיף PBS לעמודה 11.
3. הוסף 100 μL של מלאי FAS (fA) של 2 mM ללוח באר 96 בעמודה 11 (שורות A עד E) באמצעות פיפטה ידנית חד-ערוצית.
4. באמצעות פיפטה ידנית רב ערוצית להסיר 50 μL של fA מעמודה 11 ו pipette אותו לתוך PBS כבר בטור 10, לערבב היטב על ידי pipetting.
5. ממשיכים בהליך דילול כפול מדורג זה על פני העמודות 9-2, שורות A עד E של צלחת הבאר 96, ומערבבים על ידי פיפטינג.
6. הסר 50 μL של תמיסה על ידי צנרת מעמודה 2 והשליך את התמיסה לפסולת.
7. הוסף 40 μL של PBS לכל הבארות עם פתרון בהם, עמודות 2-12, שורות A עד E.
8. הוסף 90 μL של PBS לעמודה בארות 1, שורות A-E. בארות אלה פועלות כבקרה חיובית של 1 μM Calcein ו- 0 μM FAS.
9. הוסף 10 μL של 10 מיקרומטר מלאי Calcein (cB) לתוך כל באר עם תמיסה בתוכה (עמודות 1 עד 12, שורות A עד E). התוצאה היא ריכוז עליון של 1000 מיקרומטר FAS בעמודה 11, כאשר ריכוז FAS יורד בחצי עבור עמודות 10, 9, 8 לרוחב לעמודה 2. כל אחת מהבארות המתקבלות מהעמודים מכילה 1 מיקרומטר קלצין ודילול של FAS.
10. הוסף 100 μL של PBS לשורה F של עמודות 1 עד 5 עבור פקד PBS בלבד. הוסף 100 μL של 2 mM של FAS לשורה F של עמודות 6 עד 10 עבור בקרת FAS בלבד. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך.
11. נתח על קורא microplate להגדיר עירור של 490 ננומטר וזיהוי של 530 ננומטר (או מסנן מתאים להגדיר Calcein fluorescence).

4. מבחן לכימות היכולת של כלטורי ברזל להתחרות בכלטור הקלצין החלש עבור יוני Fe²⁺

1. הכינו מלאי קלצאין (cB) של 10 מיקרומטר, מלאי FAS (fB) של 100 מיקרומטר ומלאי כלטור ברזל של 2 מילימטר כמתואר בטבלה 1. שמור על מלאי Calcein בחושך כדי למנוע השפלה photodegradation.
2. באמצעות פיפטה ידנית חד-ערוצית או פיפטה ידנית רב-ערוצית, הוסף 50 μL של PBS לעמודות 2 עד 10, שורות A עד E, של צלחת באר 96. אל תוסיף PBS לעמודה 11.
3. הוסף 100 μL של מלאי 2 mM (fA) של chelators ברזל, לתוך צלחת באר 96 בטור 11, שורות A עד E באמצעות פיפטה ידנית ערוץ יחיד.
4. באמצעות פיפטה ידנית רב ערוצית להסיר 50 μL של fA מעמודה 11 ו pipette אותו לתוך PBS בעמודה 10, שורות A עד E, ערבוב היטב על ידי pipetting.
5. ממשיכים בהליך דילול כפול זה על פני שאר העמודות 9-2, שורות A עד E של הצלחת, מערבבים כל באר על ידי פיפטינג. הסר 50 μL מעמודה 2 והשליך. זה מבטיח דילול כפול של 2 mM של chelator ברזל (Deferiprone) על פני 96 עמודות צלחת באר 11 עד 2, שורות A עד E.
6. פיפטה 30 μL של PBS לכל הבארות עם תמיסה בתוכם (למשל, עמודות 2-11 שורות A עד E).
7. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסף 10 μL של מלאי FAS של 100 מיקרומטר (fB) לעמודות 2-12, שורות A עד E. התוצאה היא ריכוז של 1 מיקרומטר קלצאין ו-10 מיקרומטר FAS בכל באר, ודילול כפול של הכלטורים, כאשר הריכוז חותך בחצי כל עמוד לרוחב הצלחת, עמודות 11-2, כאשר הריכוז הגבוה ביותר של כלטור ברזל הוא 1000 מיקרומטר בטור 11 בארות A עד E.
8. באמצעות פיפטה רב ערוצית להוסיף 10 μL של 10 μM מלאי Calcein (cB) לתוך עמודות 2-12, שורות A עד E.
9. פיפטה 80 μL של PBS ו 10 μL של מלאי Calcein (cB) ו 10 μL של מלאי FAS (fB) לעמודה 1, שורות A-E באמצעות פיפטה. מערבבים דוגמאות על ידי pipetting. זה מספק את השליטה של 1 מיקרומטר Calcein עם 10 מיקרומטר FAS וללא chelator.
10. פיפטה 100 μL של PBS בשורה F עמודות 1 עד 5. זה מספק שליטה שלילית PBS.
11. הוסף 100 μL של 2 mM של כלטור ברזל (Deferiprone) לשורה F, עמודות 6 עד 10. זה מספק שליטה chelator לבד.
12. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בחושך. נתח על קורא microplate multimodal מוגדר עירור ב 490 ננומטר וזיהוי ב 530 ננומטר (או מסנן מתאים להגדיר עבור Calcien fluorescence).

5. ניתוח נתונים

1. ניתוח עבור אימות הבדיקה על ידי קביעת הטווח הליניארי של פלואורסצנטיות Calcein.
   1. חשב את ממוצע יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות (RFU) של שורות A-H עבור כל ריכוז של קלצאין בעמודות של לוח באר 96 משלב 1 והתווה כנגד הריכוז. התווה את הגרף הקווי של ריכוז קלצין על ציר x כנגד RFU ממוצע על ציר y והשתמש ברגרסיה ליניארית כדי לספק קו של התאמה מיטבית.
   2. כמת מובהקות סטטיסטית על ידי השוואת ריכוזי קלצאין בכל עמודה (2-11) לבקרה של PBS בעמודות 1 שורות A עד E. בצע ניתוח שונות (ANOVA) ויישם ניתוח פוסט-הוק באמצעות הבדל הכי פחות משמעותי (LSD) עם סף של p <0.001 כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית, (מסומן על ידי ** באיור 1).
2. ניתוח עבור אימות הבדיקה על ידי Fe²⁺ מרווה יונים כדי להפחית פלואורסצנטיות Calcein.
   1. חשב את ממוצע יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות (RFU) של שורות A עד E עבור כל ריכוז של FAS בעמודות 2-11. משמעות התוויית RFU עבור כל ריכוז FAS על ציר Y. בהתוויית ציר x ריכוזי FAS באמצעות סולם Log2 כפי שהוא מפיץ את הנתוניםטוב יותר. התווה קו המתאים ביותר באמצעות רגרסיה ליניארית.
   2. כמת מובהקות סטטיסטית על ידי השוואת ממוצע כל עמודה לממוצע RFU של הבקרה של PBS, 1 μM Calcein, 0 μM FAS (עמודה 1 שורה A עד E). בצע ANOVA עם ניתוח LSD פוסט הוק עם סף של p <0.001 כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית.
3. ניתוח לבדיקה: כימות היכולת של כלטורי ברזל להתחרות בכלטור החלש קלצאין עבור יוני Fe²⁺ .
   1. חשב את ממוצע יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות (RFU) של שורות A עד E עבור כל ריכוז של כלטור בעמודות 2-11. משמעות העלילה היא RFU עבור כל ריכוז כלטור על ציר y. על ציר x ריכוזים של chelator באמצעות סולם Log2 כפי שהוא מפיץ טוב יותר את הנתונים.
   2. כמת מובהקות סטטיסטית על ידי השוואת ממוצע כל עמודה לממוצע RFU של הבקרה של PBS 1 μM Calcein ו- 10 μM FAS (עמודה 1 שורה A עד E). בצע ANOVA עם ניתוח LSD פוסט הוק עם סף של p <0.001 כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית.

עבור השיטה שמוצגת בשלב 2, הניסוי הראשון הזה (איור 1) קבע את הטווח הליניארי של קורא הלוחות הפלואורסצנטיים של מיקרוטיטר בעת זיהוי פליטות פלואורסצנטיות של קלצאין. התוצאות המייצגות שלנו מראות טווח ליניארי רחב של פלואורסצנטיות Calcein בין 0-100 μM. ANOVA עם ניתוח LSD לאחר הוק מראה כי יש הבדלים מובהקים סטטיסטית RFU הממוצע עבור כל ריכוזי Calcein בהשוואה לבקרה של 0 מיקרומטר של Calcein. בניסויים נוספים, נעשה שימוש בקלצין 1 מיקרומטר (שלבים 3 ו-4) מכיוון שהוא מייצר הבדלים מובהקים סטטיסטית מבקרת 0 מיקרומטר ונופל בטווח שהוא מיושם בדרך כלל על תאים בצורה של Calcein AM בציטומטריית זרימה13.

עבור השיטה המוצגת בשלב 3, אנו מראים שכאשר מוסיפים ברזל בצורת Fe2+ בטווח של 0-1000 מיקרומטר (כ-FAS) ל-1 מיקרומטר קלצאין, יוני Fe2+ גורמים לירידה ליניארית בפלואורסצנטיות של קלצאין (RFU). זה מאפשר תצפית של Fe2+ מבוסס מרווה של פלואורסצנטיות Calcein. קלצין ככלטור ברזל חלש קושר ברזל וזה מפחית את התפוקה הפלואורסצנטית. באיור 2, ריכוזים של 8.9 מיקרומטר FAS ומעלה הראו ירידה משמעותית, p<0.001, בפלואורסצנטיות של Calcein בהשוואה ל-1 μM Calcein בלבד. השימוש ב-8.9 מיקרומטר של FAS התאים לירידה של 33% בפלואורסצנטיות Calcein (ממוצע RFU). עבור ניסויים נוספים (שלב 4) 10 מיקרומטר FAS שימש כפי שהוא נופל בטווח של מרווה פלואורסצנטית של Calcein.

עבור השיטה שמוצגת בשלב 4, ניתן לראות את התחרות של קלצאין עבור יוני Fe2+ על-ידי כלטור ברזל באיור 3. ברזל בצורה של Fe2+ מקטין את פלואורסצנטיות הקלצין מבקרת 1 מיקרומטר והדפריפרון של כלטור הברזל מגביר פלואורסצנטיות זו עד לשיא, משחרר את מרווה הברזל של קלצין ומגביר את הפלואורסצנטיות (ממוצע RFU). Deferiprone (המשמש כדוגמה) בריכוזים הנעים בין 0.97-512 מיקרומטר הביא לעלייה מובהקת סטטיסטית בפלואורסצנטיות כפי שנצפה בניתוח ANOVA ו- LSD לאחר הוק (p<0.001). השינוי הגדול ביותר בקיפול היה שינוי של פי 3 ב-RFU הממוצע ב-62.5 מיקרומטר של כלטור בהשוואה לבקרה של 1 מיקרומטר calcein AM ו-10 μM FAS. מעל 512 מיקרומטר של דפיריפרון לא היה הבדל מובהק סטטיסטית בין הכלטור לבין הבקרה של 1 מיקרומטר של קלצין ו -10 מיקרומטר של FAS.

איור 1: ריכוזי קלצאין ופלואורסצנטיות (RFU) נקבעים באמצעות קורא לוחות מיקרוטיטר פלואורסצנטי. ריכוזי הקלצין של 0-100 מיקרומטר מודגרים במשך 30 דקות ופלואורסצנטיות (RFU) שנקבעו מוצגים כאן. הנתונים מראים ממוצע של 8 משכפלים לניסוי ושלושה ניסויים בלתי תלויים, פסי שגיאה מראים רווח בר-סמך של 95% בממוצע. מובהקות סטטיסטית מסומנת על ידי ** כאשר p<0.001 כפי שנקבע באמצעות ANOVA וניתוח LSD פוסט הוק (מחושב באמצעות מנסרת לוח גרף). ממוצע Calcein RFU של כל ריכוז מושווה לבקרה של PBS ו 0 מיקרומטר Calcein. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ריכוז מוגבר של FAS גורם לירידה ליניארית בפלואורסצנטיות של קלצאין. ריכוז FAS עלה מ-0-1000 מיקרומטר מה שהביא לירידה ליניארית בפלואורסצנטיות של 1 מיקרומטר קלצאין לאחר דגירה של 30 דקות ב-PBS הנתונים המוצגים הם ממוצע של 5 משכפלים לניסוי ושלושה ניסויים בלתי תלויים, פסי שגיאה מראים רווח בר-סמך של 95% בממוצע. מובהקות סטטיסטית מסומנת על ידי ** כאשר p<0.001 כפי שנקבע באמצעות ANOVA וניתוח LSD פוסט הוק (מחושב באמצעות מנסרת לוח גרף). ממוצע Calcein RFU של כל ריכוז של FAS ו 1 מיקרומטר של Calcein מושווה לבקרה של 1 μM Calcein 0 מיקרומטר של FAS ב PBS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: עלייה בריכוזים של דפריפרון. ריכוז הדפריפרון הוגדל מ-0-1000 מיקרומטר עם דגירה של 1 מיקרומטר קלצאין, 10 מיקרומטר FAS ב-PBS. פלואורסצנטיות נמדדה בקורא מיקרו-לוחות רב-מודאלי. הנתונים המוצגים הם ממוצע של 5 עותקים משוכפלים לניסוי ושלושה ניסויים בלתי תלויים, פסי שגיאה מראים רווח בר-סמך של 95% בממוצע. מובהקות סטטיסטית מסומנת על ידי ** כאשר p<0.001 כפי שנקבע באמצעות ANOVA וניתוח פוסט-הוק LSD (מחושב באמצעות מנסרת כרית גרף). ממוצע RFU שבו לעומת 1 מיקרומטר Calcein ב PBS עם 10 μM FAS ו 0 μM של Deferiprone. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הכנת מלאי משני של קלציין.

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.