הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66436

⸱

1 במרץ 2024

1Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 3Laboratory of Cell and Developmental Signaling, Center for Cancer Research, National Cancer Institute-Frederick

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. הפרוטוקול מתאר שלבים להכנת התאים, קריאת פליטות BRET וניתוח נתונים. מוצגת גם תוצאה לדוגמה עם זיהוי בקרות מתאימות ופתרון בעיות עבור מיטוב מבחן.

תקציר

CRAF הוא גורם משפיע עיקרי על RAS GTPases וממלא תפקיד קריטי בגידולים של מספר סוגי סרטן המונעים על ידי KRAS. בנוסף, CRAF הוא נקודה חמה למוטציות בקו הנבט, אשר הוכחו כגורמות לראסופתיה התפתחותית, תסמונת נונאן. כל הקינאזות של חיל האוויר המלכותי מכילות אתרי קישור מרובים תלויי זרחן עבור 14-3-3 חלבוני רגולציה. הקשירה הדיפרנציאלית של 14-3-3 לאתרים אלה ממלאת תפקיד חיוני ביצירת דימרים פעילים של חיל האוויר המלכותי בקרום הפלזמה בתנאי איתות ובשמירה על עיכוב עצמי של חיל האוויר המלכותי בתנאי שקט. הבנת האופן שבו אינטראקציות אלה מווסתות וכיצד ניתן לווסת אותן היא קריטית לזיהוי גישות טיפוליות חדשות המכוונות לתפקוד חיל האוויר המלכותי. במאמר זה אני מתאר בדיקה מבוססת העברת אנרגיית תהודה ביולומינסנטית (BRET) למדידת האינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. באופן ספציפי, בדיקה זו מודדת את האינטראקציות של CRAF שהתמזגו לתורם ננו לוציפראז ו-14-3-3 התמזגו למקבל תג Halo, כאשר האינטראקציה של RAF ו-14-3-3 גורמת להעברת אנרגיה מתורם למקבל וליצירת אות RET. הפרוטוקול מראה עוד כי אות זה יכול להיות משובש על ידי מוטציות שהוכחו כמונעות קשירה של 14-3-3 לכל אחד מאתרי העגינה של חיל האוויר המלכותי בעל זיקה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר את הליכי הזריעה, ההדבקה והציפוי מחדש של התאים, יחד עם הוראות מפורטות לקריאת פליטות BRE, ביצוע ניתוח נתונים ואישור רמות ביטוי חלבונים. בנוסף, תוצאות בדיקה לדוגמה, יחד עם שלבי מיטוב ופתרון בעיות, מסופקים.

מבוא

קינאזות של חיל האוויר המלכותי (ARAF, BRAF ו-CRAF) הן המשפיעות הישירות של RAS GTPases והחברים היוזמים של מפל הקינאז RAF-MEK-ERK התומך בשגשוג/הישרדות. מחקרים אחרונים הראו כי ביטוי CRAF ממלא תפקיד מפתח בגידולים של מספר סוגי סרטן המונעים על ידי KRAS, כולל סרטן ריאות של תאים לא קטנים ואדנוקרצינומה של צינור הלבלב 1,2,3,4,5. יתר על כן, מוטציות CRAF נבט לגרום צורה חמורה במיוחד של RASopathy, תסמונת Noonan 6,7. הבנת ויסות CRAF היא קריטית לפיתוח גישות טיפוליות מוצלחות המכוונות לתפקודו בתאים.

ניתן לחלק את כל קינאזות חיל האוויר המלכותי לשני תחומים פונקציונליים, תחום C-terminal catalytic (CAT) ותחום N-terminal regulatory (REG), השולט בפעילותו (איור 1A)8. תחום REG כולל את תחום הקישור RAS (RBD), תחום עשיר בציסטאין (CRD) ואזור עשיר בסרין/תראונין (עשיר ב-S/T). יש לציין כי האזור העשיר ב-S/T מכיל את אתר N', הנקשר ל-14-3-3 באופן תלוי זרחן (S259 ב-CRAF; איור 1A) 8. תחום CAT כולל את תחום הקינאז, יחד עם אתר עגינה נוסף בעל זיקה גבוהה 14-3-3, המכונה אתר C (S621 ב-CRAF; איור 1A) 8. הקישור הדיפרנציאלי של חלבונים דימריים 14-3-3 לאתרי N' ו-C', יחד עם CRD, ממלא תפקידים קריטיים הן בהפעלת חיל האוויר המלכותי והן בעיכוב 9,10,11,12,13. בתנאי איתות רגילים, הפעלת RAF מתחילה על ידי גיוסו לקרום הפלזמה על ידי RAS, מה שמאפשר לו ליצור דימרים פעילים, כאשר ההטרודימר BRAF-CRAF הוא הצורה הפעילה השלטת14,15. בדיקות ביוכימיות עם BRAF ו-CRAF, יחד עם מבנים של מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (Cryo-EM) של BRAF דימרי, מצביעים על כך שדימר 14-3-3 מייצב דימרים פעילים של חיל האוויר המלכותי על-ידי קשירה בו זמנית לאתר C של שני הפרוטומרים של חיל האוויר המלכותי (איור 1B)9,13,16,17. לעומת זאת, מחקרים הראו כי בתנאים שקטים, RAF מאמץ אישור ציטוסולי, מעוכב עצמי, שבו תחום REG נקשר לתחום CAT ומעכב את פעילותו 12,18,19,20. מצב סגור זה מיוצב על-ידי דימר 14-3-3 הקשור לאתר CRD ו-N' בתחום REG ולאתר C בתחום CAT (איור 1B)10,13,21. ב- BRAF, מודל זה נתמך על ידי מבני Cryo-EM עדכניים של מונומרים BRAF מעוכבים עצמיים ועל ידי המחקרים הביוכימיים הקודמים שלנו 10,12,13,21,22. עם זאת, בעוד 14-3-3 הוכח כממלא תפקיד מעכב בתקנה23 של CRAF, מצב מעכב עצמי דמוי BRAF עשוי לשחק תפקיד קטן יותר בתקנה12 של CRAF; לכן נדרשים מחקרים נוספים כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם 14-3-3 חלבונים מווסתים את פעילות CRAF. הוויסות בתיווך 14-3-3 של קינאזות RAF דורש שפע של אירועי זרחן ודה-זרחן של חיל האוויר המלכותי, קשירה לחלבוני בקרה שונים ואינטראקציות עם קרום הפלזמה8. לכן, קריטי שאינטראקציות 14-3-3-RAF יימדדו בתנאים פיזיולוגיים רלוונטיים ובנוכחות דו-שכבה שומנית שלמה.

כדי לטפל בבעיה זו, נעשה שימוש בטכנולוגיית NanoBRET (מכאן ואילך המכונה N-BRET; ראו טבלת חומרים לפירוט הערכה) כדי לפתח בדיקה מבוססת קרבה למדידת האינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים (איור 1C). מערכת מבוססת BRET זו מודדת את האינטראקציות של שני חלבונים בעלי עניין (POI), כאשר חלבון אחד מתויג עם תורם ננולוציפראז (ננו) והשני עם תג Halo, לצורך תיוג עם ליגנד מקבל האנרגיה Halo61822,24. אינטראקציה בין החלבונים המעניינים גורמת להעברת אנרגיה מתורם למקבל, שבתורה מייצרת את אות ה-BRET (איור 1C). חלבון תורם ננו בהיר במיוחד (פליטה (em) 460 ננומטר) וליגנד Halo618 (em 618 ננומטר) מספקים הפרדה ספקטרלית ורגישות רבה יותר מאשר BTRE קונבנציונאלי, מה שהופך אותו לפלטפורמה אידיאלית לחקר אינטראקציות חלשות יותר וזיהוי שינויים עדינים בקשירה24. ואכן, פיתחנו בעבר בדיקה מבוססת N-BRET למדידת אינטראקציות אוטואינהיביטוריות של תחומי RAF REG ו- CAT, שהייתה חיונית לאפיון פאנל של מוטציות RASopathy ב- BRAF CRD והדגמנו את החשיבות הקריטית של תחום זה לשמירה על עיכוב עצמי ומניעת הפעלה מכוננת של BRAF12.

הבדיקה המתוארת כאן מודדת את האינטראקציות של CRAF, המאוחה לתג ננו N-terminal (Nano-CRAF), ואת איזופורם הזטה של 14-3-3 המאוחה לתג Halo מסוף C (14-3-3ζ-Halo; איור 1C). אנו מראים כי האינטראקציות של ננו-CRAF עם 14-3-3ζ-Halo מייצרות אות BRET חזק, אשר בתורו יכול להיות משובש על ידי מוטציות המונעות קישור 14-3-3 לאתר N' (S259A) ו / או לאתר C (S621A). הפרוטוקול הבא מספק שלבים מפורטים לביצוע, מיטוב ופתרון בעיות בבדיקה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: בדיקה זו מבוצעת בתאים של 293FT. קו אפיתל מאופיין היטב וניתן להעברה בקלות הנגזר מתאי כליה עובריים אנושיים. צלחת תרבית אחת בקוטר 10 ס"מ של תאים אלה מספקת בדרך כלל מספיק תאים לזריעת 20 בארות של לוחות תרבית רקמה של 6 בארות. שלבים 1-3 חייבים להתבצע בטכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגי.

1. זריעת תאים (יום 1)

הערה: בשלב הזה, התאים מנותקים מצלחת תרבית הרקמה, נספרים ונזרעים בצלחות תרבית רקמה של 6 בארות לצורך טרנספקציה בשלב 2 (איור 2).

  1. שאפו את המדיה מהתאים בצלחת בקוטר 10 ס"מ. לשטוף תאים עם 5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS) ולשאוף.
  2. הוסף 1 מ"ל של חומצה טריפסין-אתילאנדיאמין טטראצטי (EDTA) ודגר במשך 3-5 דקות ב 37 ° C כדי לנתק תאים מהמנה.
  3. הוסף 9 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) לתאים כדי לנטרל טריפסין ופיפטה למעלה ולמטה שוב ושוב כדי ליצור תרחיף הומוגני של תא יחיד.
  4. מיד להעביר 20 μL של תאים צינור 1.7 מ"ל ומערבבים עם 20 μL של כתם כחול טריפאן. ספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (רשימת חומרים) או המוציטומטר.
  5. לדלל תאים ל 2 x 105 תאים / מ"ל במדיה DMEM מלאה ולהוסיף 2 מ"ל לכל באר של צלחת תרבית רקמה 6 באר (4 x 105 תאים / באר). לדגור על תאים בטמפרטורה של 37°C ו-10%CO2 למשך הלילה.
    הערה: מומלץ להשתמש בתאי 293FT שעברו פחות מפי 20. מצאנו בעבר כי שימוש בתאים עם מספרי מעבר גדולים יותר יכול לגרום ליחסי BRET מופחתים ולשונות אות גבוהה יותר.

2. טרנספקציה של תאים (יום 2)

הערה: כאן, התאים נגועים במבני הביטוי pCMV5-NanoLuc-CRAF ו-pCMV5-14-3-3ζ-Halo, יחד עם וקטור ריק pCDNA3.1 (איור 2).

  1. לפני ההדבקה, יש לדלל את פלסמידים N-BRET ל-5 ננוגרם/μL ו-pCDNA3.1 עד 100 ננוגרם/μL, ומספר קבוצה של צינורות סטריליים בנפח 1.7 מ"ל.
  2. הוסף 100 μL של אמצעי טרנספקציה (ראה טבלת חומרים לפרטים) לכל צינור, יחד עם 5 ng של pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng של pCMV5-14-3-3ζ ו- 200 ng של PCDNA3.1.
  3. מוסיפים 2 μL של מגיב טרנספקציה (ראו טבלת חומרים לפרטים) ומערבלים בעדינות כדי לערבב. סובבו את הצינורות לזמן קצר במיקרו-צנטריפוגה כדי להבטיח שכל הנוזלים נאספים בתחתית הצינורות ולאחר מכן דגרו בסביבות 25°C למשך 15 דקות.
  4. הוסף קומפלקסים של טרנספקציה לתאים ודגור ב-37°C/10%CO2 למשך 16-20 שעות כדי לאפשר לחלבונים המתויגים בהילה ובננו לבוא לידי ביטוי.
    הערה: הוספת DNA נשא וקטור ריק (pCDNA3.1) חיונית להשגת יעילות טרנספקציה גבוהה של מבני הביטוי N-BRET. אי הוספת וקטור ריק גורמת לרמות ביטוי מופחתות של חלבוני 14-3-3ζ-Halo ו-Nano-CRAF וכתוצאה מכך ליחסי BRET חלשים ולא עקביים, כפי שנדון קודם לכן22.

3. ציפוי מחדש של תאים (יום 3)

הערה: בשלב זה, התאים מועברים ללוח של 384 בארות ולליגנד Halo 618 (+ליגנד; טבלת חומרים) או DMSO (+רכב) נוסף לקריאת פליטות BRET בשלב 4. התאים הנותרים מועברים ללוחות תרבית טריים בני 6 בארות לצורך ניתוח כתמים מערביים בשלב 5 (איור 2).

  1. אספו את החומרים הבאים והכינו את אזור העבודה כמתואר להלן.
    1. שימוש באמבט מים בטמפרטורה של 37°C, טריפסין-EDTA טרום-חם, יחד עם Assay Media ללא סרום ו-Assay Media עם תוספת FBS של 10% (ראו טבלת חומרים לפרטים).
    2. בהתבסס על מספר הדגימות שיש למדוד, תייגו מראש שלוש קבוצות של צינורות סטריליים של 1.7 מ"ל (סט 1-3), וסט אחד של צינורות תחתונים חרוטיים סטריליים של 15 מ"ל. ציידו צנטריפוגה עם דלי נדנדה עם תוספות צינור 15 מ"ל וקירור מראש ל -4 מעלות צלזיוס.
    3. הניחו את הפריטים הבאים במכסה המנוע של תרבית הרקמה: מאגרי ריאגנטים, לוחות תרבית רקמה 384 בארות, לוחות תרבית רקמה 6 בארות, פיפטה רב ערוצית וקצוות, שקופיות/תאים לספירת תאים וכתם כחול טריפאן (טבלת חומרים), יחד עם שפופרת 1.7 מ"ל סטים 1-3.
  2. קצור וספור את התאים כמתואר להלן.
    1. שאפו את המדיה מלוחות 6 בארות והוסיפו 250 μL של טריפסין-EDTA לתאים. לדגור על לוחות 6 בארות ב 37 ° C עד התאים מתחילים להתנתק (3-5 דקות).
    2. הוסף 1 מ"ל של 10% מדיית בדיקה בתוספת FBS לכל באר כדי לנטרל את הטריפסין והפיפטה למעלה ולמטה במרץ כדי ליצור תרחיף חד-תאי.
    3. העבר 1 מ"ל של תרחיף התא לצינורות 15 מ"ל המסומנים מראש. הוסף עוד 1 מ"ל של 10% מדיית בדיקה בתוספת FBS לכל אחד מצינורות 15 מ"ל.
    4. הפוך את הצינורות 5x כדי לערבב ומיד להעביר 20 μL של תרחיף התא לצינור סט 1.
    5. צנטריפוגה בצנטריפוגת דלי הנדנדה המקוררת מראש למשך 5 דקות ב~ 250 x גרם. במהלך שלב הצנטריפוגה, ערבבו 20 μL של כתם תאים כחול טריפאן עם התאים בצינור סט 1 ולאחר מכן ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר. תפוקה של 6-8 x 105 תאים/מ"ל אופיינית.
    6. הסר את צינורות 15 מ"ל מהצנטריפוגה ושאפו את המדיה מכדורי התא. השהה מחדש את כדורי התא ל 2 x 105 תאים/מ"ל במדיית בדיקה ללא סרום ופיפטה במרץ כדי ליצור תרחיף תא יחיד.
      הערה: השימוש במדיית Assay נטולת סרום משמש להרגעת מסלולי איתות תאים רגילים.
  3. תאים חוזרים בלוחות 384 באר ו -6 בארות כמתואר להלן.
    1. הפוך את צינורות 15 מ"ל מספר פעמים כדי להבטיח תרחיף תאים הומוגני ולהעביר 500 μL ל 1.7 מ"ל צינורות להגדיר 2 ולהגדיר 3.
    2. הוסף 0.5 μL של DMSO (+רכב) לסט 2 ו- 0.5 μL של ליגנד Halo 618 (+ליגנד) לסט צינור 3 ופיפטה לערבוב.
    3. העבר את מתלי תאי +רכב ו +ליגנד לבארות נפרדות של מאגרים מגיבים. באמצעות פיפטה רב ערוצית (טבלה של חומרים), להעביר 40 μL של תרחיף תא הרכב + ממאגרי מגיב כדי לרבע בארות של צלחת תרבית 384 בארות. חזור על שלב זה עבור +ligand cell suspensions.
    4. מעבירים את התאים הנותרים לצלחות תרבית טריות בנות 6 בארות. דגרו על צלחות 384 בארות ו-6 בארות למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.

4. קריאת פליטות BRET (יום 4)

הערה: בשלב זה, מצע הננולוציפרז (ראו טבלת חומרים לפרטים) מתווסף לתאים בלוח התרבית של 384 בארות, וקולט N-BRET (618 ננומטר) והתורם (460 ננומטר) נקראים (איור 2). לאחר מכן מחושבים יחסי BRET המתוקנים.

  1. מדיית בדיקה ללא סרום חם מראש באמבט מים בטמפרטורה של 37°C והפשירו את מצע הננולוציפרז בטמפרטורה של 25°C. לדלל את מצע nanoluciferase 1:100 במדיה בדיקה ללא סרום ולהעביר למאגר מגיב. הכינו מספיק מתערובת זו להוספת 10 μL לכל באר של צלחת 384 בארות, בתוספת 10%-15% נפח נוסף.
  2. באמצעות פיפטה רב-ערוצית (טבלת חומרים), מעבירים 10 מיקרוליטר מתערובת המצע לכל אחת מהבארות המכילות תאים בלוח התרבית בן 384 הקידוחים. סובבו את הצלחת בעדינות למשך דקה אחת, ידנית או באמצעות שייקר מסלולי.
  3. הכנס את לוח 384 הקידוחים לקורא הלוחות הרב-מצבי ורשום את פליטות 460 ננומטר ו- 618 ננומטר עבור כל הבארות המכילות תאים.
    הערה: עבור קורא הלוחות הרב-מצבי המשמש לשלב זה (ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים), נעשה שימוש בגובה קריאה של 6.5 מ"מ, עם מדידת זמן קריאה של 0.1 שניות, אולם ייתכן שיהיה צורך במיטוב נוסף אם משתמשים בקוראי לוחות אחרים.
  4. חשב את יחסי BRET הגולמיים עבור +vehicle ו- +ligand ביחידות מילי-BRET (mBU) בנפרד, באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
  5. חשב את יחס ה- BRET המתוקן על ידי הפחתת יחס +BRET רכב מזה של +ליגנד (טבלה משלימה 1).
    הערה: כאשר משווים את התוצאות של ניסויים מרובים, ניתן לאגד ולנרמל את יחסי BRET המתוקנים לממוצע של זוג Wildtype (WT) N-BRET, המורכב מ-Nano-CRAF WT ו- 14-3-3ζWT-Halo (טבלה משלימה 1).

5. אישור רמות ביטוי חלבון (ימים 4 ו-5)

הערה: בשלב זה התאים בלוחות 6 הקידוחים עוברים ליזה ורמות ביטוי החלבונים של חלבוני Nano-CRAF ו-14-3-3ζ-Halo נקבעות על ידי ניתוח כתמים מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים לתגי Halo ו-Nano. (איור 2).

  1. הוסף מעכבי פרוטאז ופוספטאז למאגר הליזיס NP40 (טבלה של חומרים), המאפשר 200 מיקרוליטר של חיץ ליזיס לדגימה.
  2. שאפו מדיה מלוחות 6 בארות המכילים תאים. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS קר ולשאוף.
  3. הוסף 125 μL של חיץ ליזיס NP40 לכל באר ודגר על לוחות 6 בארות ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות כדי lyse את התאים.
  4. מעבירים ליזטים לצינורות של 1.7 מ"ל על קרח וצנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C. הניחו את הליזטים שסולקו בחזרה על קרח וקבעו את ריכוז החלבונים באמצעות בדיקות זמינות מסחריות, כגון בדיקות ברדפורד או חומצה ביכנכונינית (BCA).
  5. נרמל את ריכוז החלבון בכל הדגימות על ידי העברת נפח מתאים של ליזט וחיץ ליזיס NP40 לצינורות טריים של 1.7 מ"ל לנפח כולל של 100 μL.
  6. מרתיחים מאגר דגימת חלבון 5x (טבלה של חומרים) למשך דקה אחת ומוסיפים 25 μL לכל דגימה. מרתיחים דגימות במשך 5-6 דקות ולאחר מכן פולס צנטריפוגה את הצינורות לזמן קצר כדי להבטיח שכל הדגימה נאספת בבסיס הצינור.
  7. טען 25 μL של דגימה לתוך כל באר של ג'ל חלבון כפול (ג'ל 1 וג'ל 2) ולאחר מכן להעביר חלבונים לממברנות ניטרוצלולוז או PVDF באמצעות הליכי הכתמה מערביים סטנדרטיים, כפי שתואר קודם לכן22.
  8. לחסום ממברנות ב-3% BSA-PBS ב-25°C למשך 30 דקות ולאחר מכן לדגור על קרומים למשך הלילה עם נוגדן Halo (דילול 1:1,000; ג'ל 1) או nanoluciferase או נוגדן CRAF (דילול 1:500; ג'ל 2) במי מלח חוצצים בתריס, בתוספת 0.2% Tween-20 (TBST; טבלת חומרים).
  9. יש לשטוף את הממברנות פעם אחת למשך 5 דקות ב-10 מ"ל TBST ולאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם נוגדן משני HRP נגד עכבר, מדולל בקנ"מ 1:10,000 ב-TBST.
  10. יש לשטוף את הממברנות 3x על משטח נדנדה ב-10 מ"ל TBST ב-25°C למשך 5 דקות כל אחת. הסר TBST והצג באופן חזותי רצועות חלבון באמצעות ריאגנטים ECL ומעבד סרטי רנטגן או מערכת הדמיה מתאימה אחרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאשר היא מבוצעת כמתואר בפרוטוקול זה (איור 2), האינטראקציה של Nano-CRAFWT ו-14-3-3ζ-Halo אמורה לייצר יחסי BRET מתוקנים של 50-60 mBU (איור 3A; טבלה משלימה 1). CRAF מכיל שני אתרי עגינה תלויי זרחן 14-3-3, אתר N' ואתר C (איור 1)8. לכן, בקרות מתאימות להפחתת קשירת CRAF:14-3-3ζ כוללות את S259A ו-S621A, המונעות זרחון, ובתורם 14-3-3 קשירה, לאתרים N' ו-C', בהתאמה25. כפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים קודמים הראו כי 14-3-3 חלבונים ממלאים תפקידים קריטיים הן בהפעלה והן בעיכוב של קינאזות RAF. הבנת האופן שבו אירועים קושרים אלה מוסדרים וההשפעות של אפנון אינטראקציות אלה על איתות RAF ואונקוגנזה מונעת על ידי חיל האוויר המלכותי עשויה לחשוף פגיעויות טיפוליות חדשות המכוונות לתפקוד CRAF. עם זאת, מחזור ההפעלה של חיל האוויר המלכותי נתמך על ידי שפע של חלבונים קשורים, שינויים לאחר תרגום, ושינויים בלוקליזציה תת-תאית8, ולכן כדי לשחזר תנאים אלה במלואם, יש למדוד את האינטראקציות של חיל האוויר המלכותי עם הרגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין מה לחשוף.

תודות

פרויקט זה מומן בחלקו במימון פדרלי מהמכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת מספר הפרויקט ZIA BC 010329.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<נוגדנים חזקים>
HaloTag® נוגדן חד שבטי לעכברPromegaG9211 נוגדן לגילוי חלבוני HaloTag מתויג  על ידי אימונובלוט
NanoLuc® נוגדן חד שבטי לעכברR& D SystemsMAB10026נוגדן לגילוי חלבונים מתויגים ננו על ידי
נוגדן חד שבטי של עכבר CRAF (E10) Santa Crus Biotechnologysc-7267נוגדן המזהה ישירות חלבוני CRAF על ידי אימונובלוט
ECL נוגדן משני HRP נגד עכבראמרשםNA931-1ML נוגדן עכבר מצומד HRP משני (מכבשים)
<חזק>ריאגנטים
X-tremeGENE™ 9Roche/Sigma6365809001
NanoBRET™ ערכה פרומגהN1661 ערכת NanoBRET המכילה ליגנד Halo 618 ומצע NanoGlo (nanoluciferase)  
DPBS, ללא Ca++ ו-Mg++ ביולוגיים איכותיים 114-057-101
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום Life Technologies25300120
אמצעי תרבית תאים DMEMLife Technologies11995073גלוקוז גבוה, L-גלוטמין, פנול אדום, נתרן  פירובט; ללא HEPES, חומרי אספקה עם 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-100U פניצילין-סטרפטומיצין
L-גלוטמין (200 מ"מ)   Life Technologies25030164
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) טכנולוגיות חיים   
אופטי-מם וסחר; הפחתתי את המדיה בסרום Gibco31985062לטרנספקציה של תאים 
מדיית סרום מופחתת של Opti-MEM, ללא 11058021 Gibco אדום פנוללציפוי מחדש של תאים ביום השלישי. תוסף תזונה עם 2 מ"מ L-גלוטמין ו-100U פניצילין-סטרפטומיצין, יחד עם 10% FBS (היכן שמצוין). 
Invitrogen Trypan Blue Stain תרמו סיינטיפיק T10282 
מאגר ליזה NP40 N/A N/A20 מ"מ טריס (pH 8.0), 137 מ"מ NaCl, 10% גליצרול,  חלופה NP40 (Milipore, Cat# 492016). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להוסיף את הפרוטאז והפוספטאז הבאים מיד לפני השימוש: 20 ומיקרו; M לאופפטין, 0.5 מ"מ נתרן אורתובנידאט, 0.15 U/mL, 1 מ"מ PMSF.
5x מאגר דגימת ג'לN/A N/A240 מ"מ טריס (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% גליצרול, 500 מ"מ DTT, 3 מ"מ ברומופנול כחול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס& 
<קווי תאים חזקים>
293FT תאים (אנושי)תרמו סיינטיפיק ₪70007 
<וקטורי DNA חזקים>
pCMV5-Nano-CRAF WT ומוטציה N/AN/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo   N/A N/A
<חזק>ציוד
EnVision 2104 קורא צלחות רב-מצביPerkinElmer 21042104-0010 600LP NanoBRET & מסנני פליטות M460/50 ננומטר NanoBRET,  מראה זוהר 404, גובה מדידה של 6.5 מ"מ וזמן מדידה של 0.1 שניות
Invitrogen Countess™ II מונה תאים אוטומטי תרמו סיינטיפיקAMQAX1000 
ThermoFisher E1-ClipTip™   רב ערוצי  פיפטור תרמו סיינטיפיק   4672070
Software
GraphPad Prism (גרסה 10.0.3) GraphPad www.graphpad.com
<חזק>אחר 
ThermoFisher ClipTip טיפים לפיפטה רב-ערוצית תרמו סיינטיפיק 
94410153 מאגר ריאגנטים, 25 מ"ל מחולק, סטרילי תומאס סיינטיפיק1228K16
פרקין אלמר 384-באר CulturPlate ומסחר;פרקיןאלמר6007680לבן, פוליסטירן, תרבית רקמה מטופלת 
שקופיות תא ספירת תאים של הרוזנתThermo Scientific C10228
15140163

מקורות

  1. Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
  2. Blasco, M. T., et al. Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF. Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).
  3. Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D). Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).
  4. Lito, P., et al. Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors. Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).
  5. Sanclemente, M., et al. c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling. Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).
  6. Razzaque, M. A., et al. Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).
  7. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).
  8. Terrell, E. M., Morrison, D. K. Ras-mediated activation of the Raf family kinases. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746(2019).
  9. Kondo, Y., et al. Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases. Science. 366, 109-115 (2019).
  10. Park, E., et al. Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes. Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).
  11. Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394, 88-92 (1998).
  12. Spencer-Smith, R., et al. RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation. Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).
  13. Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding. Nat Commun. 13, 486(2022).
  14. Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. The importance of Raf dimerization in cell signaling. Small GTPases. 4, 180-185 (2013).
  15. Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling. Mol Cell. 49, 751-758 (2013).
  16. Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O'Neill, E., Kolch, W. Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization. Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).
  17. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Mol Cell. 20, 963-969 (2005).
  18. Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms. J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).
  19. Chong, H., Guan, K. L. Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction. J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).
  20. Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).
  21. Park, E., et al. Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex. Nat Commun. 14, 4580(2023).
  22. Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay. STAR Protoc. 4, 102461(2023).
  23. Clark, G. J., et al. 14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain. J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).
  24. Machleidt, T., et al. NanoBRET--A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).
  25. Hekman, M., et al. Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites. J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).
  26. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464, 431-435 (2010).
  27. Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity. Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).
  28. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).
  29. Roy, S., et al. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo. Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).
  30. Durrant, D. E., et al. Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction. Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת BRETאינטראקציית CRAF 14-3-3בדיקה בתאים חייםויסות קינאז RAFRAS MAP קינאזאינטראקציה בין חלבוניםתג Nano Luciferaseהיתוך Halo Tagवेस्टרן בלוט (Western Blot)
Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.