מאמר שיטה

מודל מכרסם של אובדן שרירים נפחי Masseter לחקר חומרים ביו-הנדסיים

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66450

⸱

31 במאי 2024

 ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of California San Francisco (UCSF)

במאמר זה

סיכום

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול ליצירה כירורגית של פגיעה באיבוד שריר נפחי (VML) במעסה החולדות, ומספקים מודל נגיש ושניתן לשחזור לחקר פציעות שריר גולגולתי והטיפול בהן באמצעות ביו-חומרים כגון ההידרוג'ל החדש.

תקציר

פציעות אובדן שרירים נפחי קרניופציאלי (VML) יכולות להתרחש כתוצאה מטראומה חמורה, כריתה כירורגית, דלקת ומצבים מולדים או נרכשים אחרים. הטיפול ב-VML גולגולתי כרוך בהעברת שרירים כירורגית ותפקודית. עם זאת, הליכים אלה אינם מסוגלים להחזיר תפקוד תקין, תחושה או ביטוי, ובדרך כלל, תנאים אלה אינם מטופלים. מעט מאוד מחקר נערך על התחדשות שרירי השלד במודלים של בעלי חיים של VML גולגולתי. כתב יד זה מתאר מודל חולדה לחקר פגיעות VML גולגולתיות ופרוטוקול להערכה היסטולוגית של ביו-חומרים בטיפול בפציעות אלה. הידרוג'ל נוזלי ופיגומים מיובשים בהקפאה מוחלים בזמן יצירת VML כירורגי, ומסים נכרתים בנקודות זמן סופניות עד 12 שבועות עם שיעורי שימור גבוהים וסיבוכים זניחים. Hematoxylin ו eosin (HE), Trichrome של Masson, וניתוח immunohistochemical משמשים להערכת פרמטרים של התחדשות שרירי השלד, כמו גם תאימות ביולוגית ואימונומודולציה. בעוד אנו מדגימים את המחקר של הידרוג'ל מבוסס חומצה היאלורונית, מודל זה מספק אמצעי להערכת איטרציות עוקבות של חומרים בפציעות VML.

מבוא

טראומה חמורה, כריתה כירורגית, דלקת ומצבים נרכשים אחרים עלולים לגרום לאובדן רקמות שמכריע את מנגנוני תיקון שרירי השלד האנדוגניים. אובדן של תאים ומבנים המקדמים את תהליך ההתחדשות הראשוני עלול לגרום לעיצוב מחדש פתולוגי ופיברוזיס רקמות, וכתוצאה מכך לליקויים ארוכי טווח של תפקוד ותחושה ומכונים אובדן שרירים נפחי (VML)1,2,3. התגובה הדלקתית לפציעות VML כוללת מנגנון מתועד היטב ומורכב המערב מקרופאגים, ציטוקינים ותאים מיוגניים, המציג מטרות תיאורטיות רבות ברפואה רגנרטיבית4. בעוד שמחקרים רבים במבחנה השתמשו במטרות אלה במודלים של בעלי חיים לטיפול VML בגפיים, קיים מחסור במחקר על התחדשות שרירי השלד במודלים של בעלי חיים של VMLגולגולתי 5,6,7.

אובדן רקמה קרניופציאלית יכול לנבוע ממצבים כפי שתואר קודם לכן, ורקמת גולגולת חסרה יכולה להתרחש גם במצבים מולדים כגון שסע, אשר במקרים מסוימים כרוך בחסר נפחי אמיתי של רקמת שריר 8,9. מכיוון שהשרירים באזור הגולגולת חשובים לתפקוד כמו גם למראה אסתטי, השפעות ארוכות טווח של VML עשויות להיות בעלות סבל פסיכולוגי משמעותי. מספר היבטים של שרירי השלד הגולגולתיים שונים משרירי השלד שמקורם בסומיט הנמצאים בגפיים, כולל שינויים בביטוי גנים, מוצא עוברי, פנוטיפ תאי לוויין, כמות תאי לוויין, הרכב סיבים וארכיטקטורה 10,11,12,13. שינויים אלה עלולים לגרום לפציעות VML המשפיעות על שריר הגולגולת באופן שונה מאשר שריר14,15 שמקורו בסומיט. עד כה, גישות של הנדסת רקמות שהוכחו כמגבירות התחדשות במודלים של בעלי חיים של VML בגפיים לא תורגמו באופן שווה למודלים של VML קרניופציאליבבעלי חיים 16. זה מדגיש את הצורך למטב גישות in vivo למודלים של VML קרניופציאלי של בעלי חיים.

בעוד שמספר מחקרי in vivo של VML גולגולתי נערכו, המחקרים קטנים ויצירת פגם חזק בשריר הגולגולת במודלים של בעלי חיים מאתגרת 8,13. קים ואחרים דיווחו על פיתוח מודל VML למעסה עכבר. עם זאת, מחקר זה העריך את ההיסטולוגיה רק עד 28 ימים לאחר הפציעה והיה לו כוח לא ברור לזהות הבדלים בתוצאות היסטולוגיות בין נקודות זמן17. רודריגז ועמיתיו דיווחו על פיתוח מודל VML גולגולתי לכבשים. עם זאת, הם דיווחו על שונות גבוהה בתוך קבוצות הניסוי, מה שמרמז על הטרוגניות בחומרת הפגיעה הכירורגית הראשונית16. כאן, אנו מדווחים על הפרוטוקול של מודל VML שלנו למסה חולדות ומדגימים את התועלת שלו בהערכת גישות של הנדסת רקמות.

פרוטוקול

מחקר זה נערך בהתאם לכל התקנות הרלוונטיות, לרבות עמידה בהמלצות המפורטות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UCSF אישרה את כל ההליכים והטיפול בבעלי חיים לאחר הניתוח (פרוטוקול IACUC #AN195944-01).

1. ניתוח VML

  1. יש להרדים חולדות ספראג-דולי זכרים בגיל 12 שבועות במשקל 276-300 גרם במיכל אטום באמצעות הרדמה כללית איזופלואורנית בשיעור של 1%-5% לפני העברתם לשדה כירורגי סטרילי.
    1. מקמו את המכרסמים בצדם השמאלי כך שהצוואר מורחב בתנוחה ניטרלית והאף מותאם לקונוס ההרדמה, מה שמאפשר חשיפה לצד ימין של הפנים.
    2. קצב זרימה איזופלואורני מתחדד מהאינדוקציה ועד לקצב זרימת התחזוקה (כ-2%).
  2. החל משחה אופתלמית על העיניים של מכרסמים.
  3. נקה את אתר הניתוח, הגובל בקו בין הפינה הימנית של הפה, בסיס אוזן ימין עליון, וזווית הלסת התחתונה, של פרווה באמצעות קרם depilatory.
    1. יש לחטא את אתר הניתוח מספר פעמים בתנועה מעגלית באמצעות אתנול וקרצוף בטאדין.
      הערה: נשפך סטרילי אינו משמש בפרוטוקול זה, בהתחשב בגודל ובמיקום הגישה. ההליך מתבצע בטכניקה אספטית בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים.
  4. יוצרים חתך אורכי באורך 3-4 ס"מ המשתרע מכרית השפם הימנית התחתונה ועד לאוזן ימין.
    1. הרימו דש עור, מה שמאפשר הדמיה של המעסה הימני, כמו גם של הענפים הבוקליים והמנדיבולריים של עצב הפנים (איור 1A).
    2. נקו את העור מהפאשיה שמתחתיה באמצעות הפרדה קהה והחזיקו את קצוות העור בתנוחה נסוגה באמצעות מלחציים כירורגיים להדמיה אופטימלית של השריר שמתחתיו.
  5. בצע חתך רוחבי באורך 1-2 ס"מ בפאשיה שמעל החלק הקדמי של המעסה. השתמשו בהפרדה קהה כדי להרחיב את המרווח בין הפאשיה למעסה תוך הקפדה על השלמות הכללית של הפאשיה הנותרת.
  6. שימוש בחתך הפשיאלי כחלון למסה השטחית, יוצרים פגיעה מעגלית בשריר בגודל 5 מ"מ לרוחב ועומק 5 מ"מ באמצעות ביופסיית אגרוף חד פעמית מעוקרת. ודאו שהפגם ממורכז בין הענפים הבוקליים והמנדיבולריים של עצב הפנים, תוך הקפדה על מניעת טראומה לעצבים (איור 1B).
  7. הוסיפו את החומר הביולוגי לפציעת המסה המעגלית (איור 1C).
  8. ברגע שהסוכן נמצא במקומו כראוי, תפרו את החלון הפאשיאלי השקיע שרירים באמצעות תפר מונופילמנט יחיד של 5-0 כדי למנוע נדידה.
    הערה: חומרים מוצקים ממוקמים ישירות בפצע, והרקמה יכולה להיות מופרעת כדי לקדם רוויה עם דם, בעוד חומרים נוזליים מתווספים ומותר gelate במידת הצורך או סגור מיד במקום באמצעות fascia כדי למנוע תנועה לא רצויה. בניסוי שהודגם כאן, ניתן קריוגל מבוסס חומצה היאלורונית אקריליאטית.
  9. סגור את העור באמצעות טכניקה תת עורית פשוטה קטועה או ריצה עם מונופילמנט 5-0.
    1. יש למרוח דבק עור על התפרים כדי לסייע במניעת חתך לאחר הניתוח.
  10. אפשרו לחולדות להתאושש בכלוב עם מקור חימום חיצוני (כרית חימום מתחת לכלוב או מחממי ידיים סטריליים בכלוב) והתבוננו במשך 30 דקות לאחר הניתוח.
  11. לדלל אנטיביוטיקה trimethoprim-sulfamethoxazole (200 מ"ג של trimethoprim ו 40 מ"ג של sulfamethoxazole ב 5 מ"ל) במי שתייה (5 מ"ל / 200 מ"ל מים) ולתת אותו מכרסמים מי שתייה במשך 7 ימים לאחר הניתוח. ודא ששיכוך כאבים פריאופרטיבי מתבצע על פי פרוטוקולים מוסדיים.
    הערה: במחקר זה, 0.25% SC bupivacaine ניתן לפני חתך ניתוחי, 0.05 מ"ג / ק"ג SC buprenorphine ניתן לפני התאוששות מהרדמה, ו 2 מ"ג / ק"ג IP meloxicam ניתן לפני התאוששות מהרדמה ושוב למחרת בבוקר.

2. קציר, הקפאה וניתוח של Masseter

  1. בנקודות זמן קבועות מראש, הקריבו את החולדות על ידי גרימת מנת יתר של חומר כימי (למשל,CO2 או חומר הרדמה) בתא השראת ההרדמה.
  2. לאשר הקרבת מכרסמים על ידי ביצוע בית החזה דו צדדי באמצעות חתך אזמל יחידדרך צלע 4 גחון כדי לנקב את הריאות (דו צדדי thoracotomy).
  3. פתח מחדש את החתך הניתוחי כדי לאפשר הדמיה של המעסה, והסר את העור שמעל המעסה כדי להקל על הגישה.
  4. לנתח ולהסיר את המעסה מן הלסת התחתונה, החל הפרדה בזווית mandibular. ודא שהדיסקציה מתרחשת לאורך פני העצם כדי ללכוד את כל עובי המסה.
    1. חותכים קדמית לאורך הלסת התחתונה, ומנתקים את נקודת החיבור של הגיד. לאחר מכן, נתחו לאורך הקשת הזיגומטית מאחור (איור 1D). לבסוף, לנתח את החיבור האחורי כמו קיים סיכון מוגבר לדימום.
  5. שטפו את המעסה שנכרת ב-1x PBS בטמפרטורת החדר (RT) והסירו לחות מוגזמת על ידי ניקוי יסודי של הדגימה במגבת נייר.
  6. הניחו את השריר בקריומולד והטביעו אותו בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) במדיית הטבעה, כאשר הקצה הקדמי פונה כלפי מטה והקצה האחורי פונה כלפי מעלה.
  7. הוסיפו איזופנטאן לכוס מתכת וקררו אותה על ידי טבילתה בחנקן נוזלי בזהירות כדי למנוע חנקן נוזלי להיכנס אליה.
    1. לאחר שהאיזופנטאן הגיע לטמפרטורה אופטימלית (-140 עד -149 מעלות צלזיוס) והתעבה מעט, החזיקו את הקריומולד המכיל OCT ואת המסה שקועים חלקית באיזופנטאן עד שה-OCT קפא. שומרים את הקריומולד הקפוא על קרח יבש עד להעברתו למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
  8. קריוסקציה הקפיאה דגימות מסה עם הכיוון כך שהקוטב הקדמי נחתך ראשון, נע אחורית דרך הדגימה. הגדר את טמפרטורת בלוק הרקמה ל -20 ° C ואת טמפרטורת להב ההקפאה ל -15 ° C. עבור כל 200 מיקרומטר, חתכו 4 שקופיות (2 עם מקטעים של 10 מיקרומטר, 2 עם מקטעים של 6 מיקרומטר) לפני שתזיזו 200 מיקרומטר הלאה, חתכו 4 שקופיות נוספות וחזרו על עצמן לאורך הדגימה.
  9. השתמש בחתכי 10 מיקרומטר לניתוח היסטולוגיה (טריכרום של מאסון, המטוקסילין ואוסין, אדום פיקרוסיריוס וכו ') ובחתכי 6 מיקרומטר לאימונוהיסטוכימיה.
    הערה: עבור היסטולוגיה, ניתן להשתמש גם במקטעים של 6 מיקרומטר.
  10. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי.
  11. מדוד את אזורי החתך של ~200 סיבי שריר של שריר המסה באמצעות תוכנת Image J.

3. ניתוח אימונוהיסטוכימי

  1. לניתוח אימונוהיסטוכימי של שרשרת כבדה של מיוזין עוברי, תקן שקופיות ב- 4% PFA למשך שעה אחת ב- RT.
  2. שטפו את המגלשות ב-PBS 3 פעמים ב-RT, ואפשרו לכל שטיפה לשבת במשך 10 דקות.
  3. חדרו רקמות על ידי דגירה של המגלשות עם 0.5% Triton X-100 ב-RT למשך 15 דקות.
  4. שטפו את המגלשות ב-PBS 3 פעמים ב-RT, ואפשרו לכל שטיפה לשבת במשך 10 דקות.
  5. יש לדגור עם נוגדן חד-שבטי ראשוני מעכברים מארחים (1:200) בסרום עיזים תקין (NGS) ב-4°C למשך הלילה.
  6. שטפו את המגלשות ב-PBS-Tween 3 פעמים ב-RT, ואפשרו לכל שטיפה לשבת במשך 10 דקות.
  7. דגרו עם נוגדן משני נגד עכבר עם תווית פלואורופור מפונדקאי ארנב (1:500) ב-2% NGS ב-RT במשך שעתיים.
  8. שטפו את המגלשות ב-PBS-Tween 3 פעמים ב-RT, ואפשרו לכל שטיפה לשבת במשך 10 דקות.
  9. הרכיבו את המגלשות באמצעות 3 טיפות של תושבת פלואורסצנטית DAPI לפני הנחת הכיסוי.

תוצאות

התוצאות להערכת VML גולגולתי והתחדשות רקמות באמצעות ביו-חומרים כוללות תוצאות כמותיות ואיכותיות כאחד.

איור 2 מציג דוגמה להערכה איכותנית באמצעות המודל שתואר קודם לכן. התצפית על גדילת סיבי שריר דה נובו בתוך ההידרוג'ל שלנו היא תוצאה חיובית איכותית (איור 2A), והיא מצביעה על כך שחומר ביולוגי יכול לספק תמיכה אדריכלית מספקת וגורם גדילה או אספקת חומרי מזון. שימור הידרוג'ל בתוך מיטת הפצע (איור 2B) נראה על כתם HE. הערכה איכותית של רקמות אחרות בתוך חומר ביולוגי עשויה להיעשות, כמו למשל זיהוי כלי דם באמצעות HE (איור 2C) והטריכרום של מאסון (איור 2D). הענפים המנדיבולריים והבוקליים של עצב הפנים נראים בפינה השמאלית העליונה ובפינה הימנית העליונה של התמונה באיור 2B, מאשרים את המיקום הנכון של הידרוג'ל במיטת הפציעה של VML ומספקים התמצאות. שכבת פאשיה נראית מעל ההידרוג'ל, מה שמאשר שהסגירה הפשיסטית הייתה מוצלחת ונשארה שלמה בתקופה שלאחר הניתוח. תוצאה שלילית שתיראה בשלב זה תכלול אובדן מלא של הידרוג'ל (איור 2E) או אובדן סגירה פשיאלית ושחול ממיטת הפצע (איור 2F), כאשר HE מראה עדות למיטת פצע או צלקת פיברוטית בהתאם לזמן שחלף לאחר הניתוח.

אנליזה אימונוהיסטוכימית היא קריטית בהערכת ביו-חומרים לטיפול ב-VML גולגולתי על מנת לזהות סוגי תאים ואינטראקציות מולקולריות ברמה התאית. מכיוון ש-VML גורם לאובדן תאים מקומיים וארכיטקטורה המסוגלים לחדש את שרירי השלד, התחדשות שרירי דה נובו באתר הפגוע היא תוצאה חשובה בטיפול4 ובהערכת היעילות בטיפולים מבוססי ביו-חומרים עבור VML. איזופורמים התפתחותיים של מיוזין, כולל עובריים (MYH3) ומיוזין ילודים (MYH8), באים לידי ביטוי מחדש בחידוש סיבי שרירי השלד ומספקים סמן ספציפי לחידוש סיבים18,19. איור 3 מראה דוגמה לאופן שבו אימונוהיסטוכימיה יכולה לשמש לזיהוי סוגים תאיים בעלי עניין, במקרה זה, שרשרת מיוזין עוברית כבדה.

לבסוף, ניתן להשתמש ב-ImageJ כדי לכמת תכונות של שקופיות היסטולוגיה, כולל אימונוהיסטוכימיה וכתמים מיוחדים כמו הטריכרום של מאסון, כדי למדוד את התגובה הפיברוטית (איור 4). הסרת חלק מהשריר בפציעות VML משנה את ארכיטקטורת השריר והרכבו, מה שמוביל לשקיעת קולגן I מוגברת ופיברוזיס ברקמת התא הגולמי 2,3. מחקרים רבים המעריכים טיפולים מבוססי ביו-חומרים עבור VML משווים פיברוזיס בין קבוצת ההתערבות שלהם לבין קבוצת ביקורת4. באמצעות השיטה שתוארה כאן, ניתן לזהות את מיטות הפצע בחיות שעברו פגיעה ב-VML על הטריכרום של מאסון כצלקות פיברוטיות (איור 4A). דה-קונבולוציה של צבעים באמצעות ImageJ יכולה לבודד ולכמת את הערוץ הכחול המתאים לרקמת חיבור (איור 4B), ולאחר מכן להגדיר אותה לגווני אפור לצורך מדידה (איור 4C). ניתן לבודד ולמדוד את שטח הצלקת באמצעות תמונה J (איור 4D) ולכייל אותו לסרגל קנה מידה בתמונה לקבלת גודל מדויק ואזור הניתן לשחזור. באמצעות גישה זו ניתן למדוד את שקיעת רקמת החיבור (איור 4E).

figure-results-1
איור 1: סכמה כירורגית המדגימה את השלבים. (A,B) פגיעה במעסה כירורגי VML. (C) יישום ביו-חומרי. (ד) קציר מסה. (E) מורפולוגיית שריר לאחר הקציר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: צביעת הטריכרום של HE ושל מאסון. (A) קטעי מסה של חולדה מוכתמת HE, מממשק הידרוג'ל-שריר עם חצים המציינים מבנים המזוהים מורפולוגית כסיבי שרירי שלד. (B) קטע מסה חולדה מוכתם HE, המדגים את שפע סיבי שרירי השלד לאורך הידרוג'ל. (C) HE-stained ו-(D) הרקמה המוכתמת בטריכרום של Masson עם חצים המציינים מבנים המזוהים מורפולוגית ככלי דם. (ה,ו) תוצאות שליליות המראות אובדן מלא של הידרוג'ל עם ג'ל דבק בהיבט השטחי של המעסה ולא במיטת הפצע ואובדן לא שלם של הידרוג'ל עם אובדן סגירה פשיאלית, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: צביעה אימונוהיסטולוגית עבור שרשרת כבדה של מיוזין עוברי (eMHC) ולמינין על חתכי רוחב של מעסה חולדה. (A) שבועיים לאחר הניתוח. (B) 12 שבועות לאחר הניתוח. ריכוז מוגבר של eMHC נראה במדגם של 12 שבועות ביחס למדגם של שבועיים. תמונות שצולמו בהגדלה של פי 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח פיברוזיס כמותי. (A) אזור מסה חולדה מוכתם בטריכרום של Masson לכימות שקיעת רקמת חיבור כפרוקסי לפיברוזיס פצע לאחר פגיעת VML לאחר 12 שבועות. (B) תמונה J שימשה לפירוק התעלה הכחולה המתאימה לרקמת חיבור. (C) התמונה הומרה לגווני אפור לצורך ניתוח. (D) האזור המתאים לצלקת הפיברוטית בודד, ו-(E) חושבו שטח החתך ואחוזי השדה המתאימים ללבן (רקע) ולשחור (רקמת חיבור). תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול שבהם נדרשת תשומת לב מיוחדת כדי להשיג תוצאה אופטימלית. שלב 1.4 מתאר את החתך הראשוני וההפרדה הקהה של העור מהפאשיה השטחית. דיסקציה קהה צריכה להיעשות ישירות לאורך העור עם מספריים המצביעים הרחק מהשריר התחתון והפאשיה כדי למנוע ניקוב ויצירת חלון דרך הפאשיה שלא במתכוון. יש להימנע מההיבט הקאודלי של המעסה השטחי כדי למנוע פגיעה לא מכוונת בווריד התת-מנדיבולרי או בעורק התרדמה החיצוני. שלבים 1.5 ו-1.6 מתארים את יצירת החלון הפשיאלי ופגם VML, בהתאמה. יש להקפיד שהחתך הפשיאלי יהיה בגודל המינימלי הנדרש על מנת להתאים את ביופסיית הניקוב דרכו, שכן הפאשיה נוטה להתכווץ הרחק מהחתך, ויכול להיות קשה לאתר את הקצוות בשלב 1.8 אם נעשה חתך גדול מדי. שוב, דיסקציה קהה מתחת לפשיה צריכה להיעשות רק מספיק כדי לאפשר לביופסיה של הניקוב להיכנס לתוך החלון ובזווית מתאימה כדי להיות בניצב ללסת התחתונה. בעת יצירת פציעת VML, חשוב לזהות את האזור הגדול ביותר בין הענפים המנדיבולריים והבוקליים של עצב הפנים. העצב המנדיבולרי הדיסטלי מתחלק לחטיבה עליונה ותחתונה, ויש שונות במיקום שבו החטיבה העליונה מסתעפת מהחטיבה התחתונה לכיוון הענף הבוקאלי של עצב הפנים. מכיוון שחלוקה זו עדיפה, חלק מבעלי החיים עשויים להיות בעלי החלוקה העליונה של העצב המנדיבולרי ישירות בבטנו של המעסה, שם אמור להיווצר הפגם. במקרים אלה, אין להשתמש בבעל החיים לניתוח, מכיוון שסביר להניח שתהיה פגיעה עצבית היקפית שתבלבל את הנתונים. בעת יצירת ביופסיית הניקוב, ייתכן שיהיה צורך בפיתול עדין כדי לחדור לעומק המלא של 5 מ"מ. שלב 2.4 מתאר את הכתמים של דגימת הרקמה לאחר שטיפתה כדי להסיר לחות מוגזמת. זה נעשה כדי למנוע גבישי קרח להיווצר במהלך הקפאת הרקמה ולאחר מכן הפחתה בממצאים הקפאה על היסטולוגיה20.

אחד היתרונות של שיטה זו הוא קלות הגישה לשריר המסה השטחי והמחסור היחסי במבנים בסיכון גבוה שעלולים להיתקל בהם במהלך הניתוח. מכיוון שכלי הדם נכנסים לקצה הקאודלי של השריר, ניתן להימנע מדימום משמעותי ברוב המקרים. זה חשוב מכיוון שזה לא רק מקטין את הסיכון לתחלואה אלא גם מגביר את הסטנדרטיזציה ומקטין את הסיכוי שלאיסכמיה יש השפעה מבלבלת על התחדשות השרירים. בגלל הזמינות של מארז פאשיאלי, פרוטוקול זה עשוי לשמש להערכת ביו-חומרים בגורמי צורה נוזליים או מוצקים. בעוד הידרוג'ל אצלולרי שימש כדוגמה לפרוטוקול זה, ניתן לשכפל שיטה זו כדי לבדוק ביו-חומרים עם שילוב תאי גזע אנושיים באמצעות חולדות מדוכאות חיסון, כפי שנעשה במחקרים קודמים של VML21 בגפיים.

מחקר זה אינו מגדיר באופן רשמי את הפציעה בגודל קריטי ב-VML, הנקודה המדויקת שבה מנגנוני תיקון אנדוגניים כבר לא יכולים לחדש את השריר עדיין אינה ברורה. בעוד שסביר להניח שההגדרה עשויה לכלול הסרה של אחוז מסוים מנפח השריר, ואכן 20% מצוטטים לעתים קרובות, ישנן ראיות סותרות, והנתונים מצביעים על כך שגורמים אחרים, כולל המיקום והגיאומטריה של הפציעה, גיל החיה, בין היתר עשויים גם הם לתרום 16,21,22,23. למרות זאת, התצפית על צלקת סיבית והתכווצות נראית לעין של גבול השריר שנצפתה לאחר 12 שבועות לאחר הפציעה (איור 4A) מראה שהתרחש שיפוץ פתולוגי, מה שמרמז מאוד על כך שהפציעות המשמשות כאן הן בגודל קריטי ביחס להגדרה הסטנדרטית.

מכיוון ששרירי הגולגולת בבני אדם, כמו שרירי היד הפנימיים, קטנים בהשוואה לשרירי הגפיים הפרוקסימליים ומבצעים תנועות מדויקות יותר, הם נוטים יותר שתפקודם יושפע על ידי VML. המעסה נבחר בפרוטוקול זה בגלל כמות מספקת לבדיקות וקלות גישה. עם זאת, הגיאומטריה והמיקום של הפציעה הם גורמים חשובים בהערכת VML, ומסקנות שנוצרו באמצעות מודל זה עשויות שלא להיות מתורגמות ישירות לשרירים גולגולתיים אחרים. המעסה הוא שריר של מסטיקציה, ובעוד שהוא תורם להבעות פנים אצל ילדים24, תפקידו בהבעות הפנים פוחת בבגרות24. פציעות בשרירי פנים אחרים, כגון זיגומטיקוס מז'ור, עלולות לגרום לסבל פסיכולוגי גדול יותר בעקבות VML בשל תפקידם הישיר יותר בהבעות הפנים לאורך החיים ביחס למססטר2 5,26. בנוסף, מחקר זה לא העריך את ייצור הכוח in vivo, מגבלה שהיא תחום צורך בשטח. עד כה, לא דווח על שיטה ניתנת לשחזור לבדיקה תפקודית של שרירי הגולגולת עם רגישות מספקת כדי להשוות בין קבוצות הטיפול, וזה מסובך בגלל שרירי הפיצוי הנרחבים בתוך הפנים. פיתוחים עתידיים של פרוטוקול זה ישאפו להציג גישות למדידה ישירה של כוח בשרירי פנים בודדים.

שיטות חלופיות של ניתוח היסטולוגי של VML מסה במודל מכרסם הם מוגבלים מאוד. קים ועמיתיו יצרו מערכת EMG לבישה כדי להעריך את הפונקציונליות של שרירי מסה פגועי VML בעכברים. עם זאת, נקודת הזמן הסופית שלהם הייתה 4 שבועות, הם לא הדגימו הדמיה של חומר ביולוגי בתמונות היסטולוגיה, לא תיארו סגירה פשיאלית, והתמקדו בעיקר בתיקוף של מערכת EMG שלהם לעומת ניתוח של התחדשות שרירים ותאימות ביולוגית של טיפולים מבוססי ביו-חומרים17. יש צורך בטיפולים חדשים לאיבוד שרירים נפחיים גולגולתיים, ומודל VML מסה זה ניתן לשחזור מספיק כדי להעריך את תגובת השרירים לפגיעה ב-VML ולהעריך את השפעות הטיפולים על התחדשות, פיברוזיס והתכווצות, במיוחד בשלושת החודשים הראשונים לאחר הפציעה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מלגות המחקר השנתית של UCSF ותוכנית C-Doctor Interdisciplinary Translational Project. תודה לחברי מעבדת פומרנץ והתוכנית לביולוגיה קרניופלציאלית באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו על תרומתם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
F1.652 נוגדן חד שבטי בעל שרשרת כבדה של מיוזין (עוברי)DSHBF1.652
נוגדן משני נגד עכבר IgG2b נספג צולב, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21242
עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
אגרופי ביופסיה סטנדרטיים של אינטגרה, אגרוף ביופסיה סטנדרטי חד פעמי; 5 מ"מ, קוטר: 0.19 אינץ', 0.5 ס"מאינטגרה12460411
הרכבה בינונית עם DAPI - מימי, FluoroshieldAbcamab104139
ארנב נגד עכבר IgG H& L (Alexa Fluor 647) תרחיףAbcamab150127
Sulfamethoxazole/Trimethoprim, בטעם דובדבן, 473 מ"לMed-Vet Internationalמק"ט: RXBAC-SUSP
אוראלי

מקורות

  1. Gilbert-Honick, J., Grayson, W. Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering. Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626(2020).
  2. Aguilar, C. A., et al. Multiscale analysis of a regenerative therapy for treatment of volumetric muscle loss injury. Cell Death Discov. 4, 33(2018).
  3. Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
  4. Kiran, S., Dwivedi, P., Kumar, V., Price, R., Singh, U. Immunomodulation and biomaterials: Key players to repair volumetric muscle loss. Cells. 10 (8), 2016(2021).
  5. Greising, S. M., Corona, B. T., McGann, C., Frankum, J. K., Warren, G. L. Therapeutic approaches for volumetric muscle loss injury: A systematic review and meta-analysis. Tissue Eng Part B: Rev. 25 (6), 510-525 (2019).
  6. Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. N Engl J Med. 347 (24), 1924-1931 (2002).
  7. Testa, S., et al. The War after war: Volumetric muscle loss incidence, implication, current therapies and emerging reconstructive strategies, a comprehensive review. Biomedicines. 9 (5), 564(2021).
  8. Emara, A., Shah, R. Recent update on craniofacial tissue engineering. J Tissue Eng. 12, 204173142110037(2021).
  9. Dado, D. V., Kernahan, D. A. Anatomy of the orbicularis oris muscle in incomplete unilateral cleft lip based on histological examination. Ann Plast Surg. 15 (2), 90-98 (1985).
  10. Stål, P., Eriksson, P. O., Eriksson, A., Thornell, L. E. Enzyme-histochemical and morphological characteristics of muscle fibre types in the human buccinator and orbicularis oris. Arch Oral Biol. 35 (6), 449-458 (1990).
  11. Raposio, E., Bado, M., Verrina, G., Santi, P. Mitochondrial activity of orbicularis oris muscle in unilateral cleft lip patients. Plast Reconstr Surg. 102 (4), 968-971 (1998).
  12. Cheng, X., Shi, B., Li, J. Distinct embryonic origin and injury response of resident stem cells in craniofacial muscles. Front Physiol. 12, 690248(2021).
  13. Carvajal Monroy, P. L., et al. A rat model for muscle regeneration in the soft palate. PLoS One. 8 (3), e59193(2013).
  14. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Dev Biol. 337 (1), 29-41 (2010).
  15. Pavlath, G. K., Thaloor, D., Rando, T. A., Cheong, M., English, A. W., Zheng, B. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).
  16. Rodriguez, B. L., Vega-Soto, E. E., Kennedy, C. S., Nguyen, M. H., Cederna, P. S., Larkin, L. M. A tissue engineering approach for repairing craniofacial volumetric muscle loss in a sheep following a 2, 4, and 6-month recovery. PLoS One. 15 (9), e0239152(2020).
  17. Kim, H., et al. Real-time functional assay of volumetric muscle loss injured mouse masseter muscles via nanomembrane electronics. Adv Sci. 8 (17), e2101037(2021).
  18. Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet Muscle. 5, 22(2015).
  19. Agarwal, M., et al. Myosin heavy chain-embryonic regulates skeletal muscle differentiation during mammalian development. Development. 147 (7), (2020).
  20. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), e51586(2014).
  21. Kim, J. H., et al. Neural cell integration into 3D bioprinted skeletal muscle constructs accelerates restoration of muscle function. Nat Commun. 11 (1), 1025(2020).
  22. Anderson, S. E., et al. Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps. Tissue Eng Part C Methods. 25 (2), 59-70 (2019).
  23. Kim, J. T., Kasukonis, B. M., Brown, L. A., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Recovery from volumetric muscle loss injury: A comparison between young and aged rats. Exp Gerontol. 83, 37-46 (2016).
  24. Guédat, C., Stergiopulos, O., Kiliaridis, S., Antonarakis, G. S. Association of masseter muscles thickness and facial morphology with facial expressions in children. Clin Exp Dent Res. 7 (5), 877-883 (2021).
  25. VanSwearingen, J. M., Cohn, J. F., Bajaj-Luthra, A. Specific impairment of smiling increases the severity of depressive symptoms in patients with facial neuromuscular disorders. Aesthetic Plast Surg. 23 (6), 416-423 (1999).
  26. Versnel, S. L., Duivenvoorden, H. J., Passchier, J., Mathijssen, I. M. J. Satisfaction with facial appearance and its determinants in adults with severe congenital facial disfigurement: A case-referent study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63 (10), 1642-1649 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל מכרסם של אובדן שרירים נפחי Masseter לחקר חומרים ביו-הנדסיים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.