Method Article

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

DOI:

10.3791/66451

⸱

March 22nd, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) הוא חיישן ביולוגי חדשני המאפשר מדידה רציפה של רמות cAMP בתאים חיים. הביוסנסור נוצר מחלבון פלואורסצנטי בעל תמורות מעגליות המקושר לאזור הציר של Epac2. זה יוצר חיישן ביולוגי פלואורופור יחיד המציג פלואורסצנטיות מוגברת או מופחתת בעת קשירת cAMP. הביוסנסור קיים בגרסאות אדומות וירוקות כלפי מעלה, כמו גם בגרסאות ירוקות כלפי מטה, ובמספר גרסאות אדומות וירוקות הממוקדות למיקומים תת-תאיים. כדי להמחיש את יעילותו של הביוסנסור נעשה שימוש בגרסה הירוקה כלפי מטה, אשר פוחתת בפלואורסצנטיות בעת קשירת cAMP. שני פרוטוקולים המשתמשים בחיישן זה מודגמים: האחד משתמש בספקטרופוטומטר קריאת לוחות של 96 בארות התואם לסינון בתפוקה גבוהה והשני באמצעות הדמיה של תא בודד במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקורא הצלחות, תאי HEK-293 שגודלו בתרבית בצלחות 96 בארות עוררו עם 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר איזופרוטרנול, מה שגרם לירידות מהירות וגדולות בפלואורסצנטיות בגרסה הירוקה כלפי מטה. הביוסנסור שימש למדידת רמות cAMP בתאי שריר חלק של דרכי נשימה אנושיות בודדות (HASM) המנוטרות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הביוסנסור הירוק כלפי מטה הראה תגובות דומות לאוכלוסיות של תאים כאשר הוא מגורה באמצעות פורסקולין או איזופרוטרנול. בדיקה חד-תאית זו מאפשרת הדמיה של מיקום הביו-חיישן בהגדלה של פי 20 ו-40. לפיכך, חיישן ביולוגי cAMP זה רגיש וגמיש, ומאפשר מדידה בזמן אמת של cAMP הן בתאים אימורטליים והן בתאים ראשוניים, ועם תאים בודדים או אוכלוסיות של תאים. תכונות אלה הופכות את cADDis לכלי רב ערך לחקר דינמיקת איתות cAMP בתאים חיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדנוזין 3′,5′-מונופוספט מחזורי, cAMP, ממלא תפקיד מרכזי בתקשורת התאית ובתיאום תהליכים פיזיולוגיים שונים. cAMP פועל כשליח שני, ומעביר אותות חיצוניים מהורמונים, מוליכים עצביים או מולקולות חוץ-תאיות אחרות כדי ליזום שרשרת של אירועים תוך-תאיים1. יתר על כן, cAMP מעורב באופן מורכב במסלולי איתות שונים, כולל אלה הקשורים לקולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) וציקלזות אדניליל. הבנת התפקיד של cAMP באיתות תאי היא בסיסית לפענוח המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס תפקודים תאיים נורמליים ופיתוח טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מצבים רפואיים2.

בעבר ננקטו שיטות שונות למדידת cAMP במישרין או בעקיפין. אלה כללו תיוג רדיואקטיבי של מאגרי ATP תאיים ולאחר מכן טיהור עמודות, HPLC, בדיקות רדיואימוניות ובדיקות חיסוניות הקשורות לאנזימים 1,2. מבחני מורשת אלה מוגבלים על ידי העובדה שהם מדדי נקודת קצה, הדורשים מספר רב של דגימות כדי לבנות תגובות תלויות זמן. לאחרונה פותחו חיישני העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי ליצור בדיקות בתאים חיים, לייצר נתונים דינמיים בזמן אמת ולאפשר מיקוד חיישנים במקומות תת-תאיים שונים3. FRET ממנף שני פלואורופורים, תורם פלואורסצנטי אחד ומקבל פלואורסצנטי אחד שכאשר הוא נמצא בקרבת מקום, פלואורופור המקבל יתרגש מפלט הפלואורסצנט של התורם. שני הפלואורופורים הנפוצים ביותר הם חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) מכיוון שיש להם תכונות עירור ופליטה תואמות. בנוסף ל-CFP ול-YFP, השימוש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) ובחלבון הפלואורסצנטי האדום (RFP) משמש בדרך כלל עבור ביו-חיישנים של FET. חיישנים ביולוגיים של cAMP FRET פועלים על ידי תורם ומקבל בקצוות מנוגדים של חלבון הקישור של Epac2 cAMP. כריכת cAMP משנה את האישור של Epac ומגדילה את המרחק בין פלואורופוריםשל תורם ומקבל 3,4. שינוי קונפורמטיבי זה מזוהה על ידי אובדן של FRET, כלומר, עירור של פלואורופור מקבל על ידי אנרגיה המועברת מן טיפות פלואורופור התורם3. בעוד תהליך פשוט לכאורה, יש שפע של מגבלות ובעיות עם biosensor FRET עבור מחקר cAMP5. אחד מהם הוא הבחירה של חלבונים פלואורסצנטיים, למשל, GFP, אשר יכול dimerize באופן טבעי, ובכך להפחית את הרגישות6. ביו-חיישנים מבוססי CFET cAMP כוונו למיקרו-דומיינים ספציפיים7, אך ייתכנו מגבלות בשל גודלו הגדול של מבנה עם שני פלואורופורים6. בעיה משמעותית נוספת היא יחס האות לרעש הנמוך של אותות FRET כתוצאה מהחפיפה בין עירור ופליטה של הפלואורופור, וכתוצאה מכך תדירות דגימה גבוהה וניתוח מסובך של התוצאות 4,5.

לאחרונה, biosensor החדש (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis פתר מגבלות אלה ואחרות כשמדובר בחקר הרגולציה של איתות cAMP8. שיפור חשוב אחד הוא התלות בפלואורופור יחיד. הדבר מאפשר אות מהיר ויעיל עם טווח דינמי רחב יותר ויחס אות לרעש גבוה. כתוצאה מכך, יכול להיות דיוק רב יותר מכיוון שיש טווח פחות רחב של אורכי גל לסרוק דרך8. בדומה לגשושיות RET, הביו-סנסור כוון למיקומים תת-תאיים, מה שמאפשר מחקר בתיאוריית המידור וחקר רפסודות שומנים ולא רפסודות, ותחומים תת-תאיים אחרים9. אולי החשוב ביותר הוא ההתאמה של biosensor פלואורופור יחיד עבור סינון תפוקה גבוהה, אשר שיפר את הרגישות ואת יכולת השחזור על פני biosensors מבוסס FRET. הביוסנסור ארוז לתוך וקטור BacMam להתמרה קלה של מגוון רחב של סוגי תאים ושליטה מדויקת על ביטוי חלבונים.

בקרת ביטוי באמצעות וקטור BacMam יכולה להיות שימושית במיוחד בבדיקות באמצעות אורתולוגים GPCR ממינים שונים כדי להקל על פירוש נתונים ממחקרים בבעלי חיים. יתר על כן, שליטה על ביטוי הקולטן היא קריטית למדידת דרגות שונות של יעילות התרופה (למשל, אגוניסטים הפוכים ואגוניסטים חלקיים), ורמות נמוכות של ביטוי קולטן שימושיות כדי לחקות את הרמות הנמוכות הנמצאות ברקמת בעלי חיים. BacMam הוא וקטור baculovirus כי כבר שונה כדי להתמיר תאים יונקים כגון תרביות תאים ראשוניים HEK-293 שורות10. סמנים דומיננטיים הניתנים לבחירה מאפשרים ל- BacMam לספק יציבות רבה יותר על פני זיהומי פלסמיד מסורתיים11. מקדמים סלקטיביים כאלה מאפשרים העברה וביטוי גנים יעילים יותר. בנוסף, הוספת טריכוסטטין A (מעכב היסטון דאצטילאז) משפרת את רמות החלבון11. ניתן לשלוט ברמות הביטוי באמצעות הטיטר של וירוס BacMam המשמש ויש להתאים אותו לכל סוג תא. במקרה של ביוסנסור זה, חלבון פלואורסצנטי אדום או ירוק מקושר ל- Epac ב- N- ו- C-termini. כאשר cAMP נקשר, שינוי קונפורמטיבי בחיישן הביולוגי מזיז חומצות אמינו הסמוכות לחלבון הפלואורסצנטי. שינוי כזה מעביר את הספיגה מהמצב האניוני למצב הניטרלי ב-400 ננומטר, ובכך מקטין את הפלואורסצנטיות.

ישנם 90-120 GPCRs המבוטאים בתא בודד המגיבים למגוון רחב של אותות נוירוהומורליים12. לכן, ניתן לשער כי לפחות כמה עשרות GPCRs לכל תא יכולים לעורר או לעכב cAMP באמצעות צימוד Gs או Gi, בהתאמה. אמנם חלה התקדמות בניטור שליח שני זה בזמן אמת, כגון FRET, אך יש צורך בשיטות יעילות יותר. המתודולוגיה לניטור הסינתזה וההשפלה של אותות cAMP באמצעות cADDis בזמן אמת מוצגת כאן. ניתן לנטר את השינוי בפלואורסצנטיות בזמן אמת באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי למבחני תפוקה גבוהה או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לבדיקות חד-תאיות. שיטות אלה שימושיות למגוון רחב של שאלות ביולוגיות בנוגע לאיתות GPCR באמצעות cAMP.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בדיקת ספקטרופוטומטר לקריאת לוחות בתפוקה גבוהה

  1. זריעת תאי HEK-293 עם וקטור cADDis BacMam בצלחת 96 בארות (יום 1)
    1. לפצל ולהדביק תאים במכסה מנוע נגיפי.
      1. חומרי HEK חמים (טבלה 1) ו-0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
      2. יש לחטא את מכסה המנוע ואת החומרים על ידי ניגובם ברקמות ספוגות EtOH.
      3. מוציאים ומשליכים מדיה HEK מהבקבוק עם פיפטה סרולוגית.
      4. הוסף 5 מ"ל של Mg2+ ו- Ca2+ DPBS חופשי (37 ° C) עם פיפטה סרולוגית. הטה את הבקבוק קדימה ואחורה כדי לשטוף את התחתית עם DPBS. יש להסיר ולהשליך DPBS בעזרת פיפטה סרולוגית.
      5. טריפסיניזציה של התאים על ידי הוספת 3 מ"ל של 0.25% מחומם טריפסין-EDTA עם פיפטה סרולוגית. הטה את הבקבוק כדי להבטיח שהמגיב מצפה באופן מלא את תחתית הצלוחית. שים את המכסה על הבקבוק ולתת מגיב לשבת במשך 3-5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק מן הצלוחית.
        הערה: ניסוי זה ממוטבעבור 2 צלוחיות בגודל 75 ס"מ; ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות נפח עבור ריאגנטים אם נעשה שימוש במנגנון תרבית בגודל שונה.
      6. צייר 5 מ"ל של מדיה טרייה המכילה אנטיביוטיקה. לגרש ולצייר את נפח הבקבוק כדי לשטוף את הקירות של הבקבוק פיזית לנתק תאים.
      7. אסוף את הנפח הכולל של הבקבוק (8 מ"ל), והצנטריפוגה (25 ° C) בצינור 15 מ"ל ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
      8. לאחר הצנטריפוגה, מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית, נזהרים שלא להפריע לכדור.
      9. כדי לשטוף את התאים מבלי להפריע לכדור, הוסף 500 μL של DPBS ללא Mg2+ ו- Ca2+ DPBS לצד הצינור של 15 מ"ל. לאחר הוספה עדינה של ה-DPBS, יש להסיר ולהשליך חיץ רב ככל האפשר מבלי להפריע לכדור. חזור על הפעולה פעם נוספת.
      10. ספור את התאים והתאם לצפיפות תאים של 250,000 תאים/מ"ל תאים.
      11. הכינו תערובת מאסטר המבוססת על נפחי הריאגנט הדרושים לכל באר של צלחת תחתונה שחורה ושקופה בעלת 96 בארות. זה נקרא "צלחת רקמות". ראה כרכים בהמשך:
        הערה: דוגמה של באר אחת (נפח כולל 200 μL): 40 μL של וקטור BacMam biosensor (מלאי של 2 x10 10 גנים נגיפיים /mL), 2 μL trichostatin A (מלאי של 100 μM; ריכוז סופי 1 μM), 158 μL של 250,000 תאים / mL צפיפות התא. דוגמה של 10 בארות (נפח כולל 2 מ"ל): 400 μL של וקטור biosensor BacMam (מלאי של 2 x10 10 גנים נגיפיים /mL), 20 μL של trichostatin A (מלאי של 100 μM), מדיה 1,580 μL עם 250,000 תאים / mL צפיפות התא.
      12. מוסיפים 200 μL של תערובת מאסטר לכל באר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 באינקובטור במשך 24 שעות לפני שתרוצו על ספקטרופוטומטר קריאת הצלחות.
  2. פועל על קורא צלחות
    1. על ספסל, בזהירות להסיר את כל המדיה בכל באר ולהחליף עם 180 μL של DPBS עם Mg2+ ו Ca2+ ב 37 ° C.
    2. בדוק תאים במיקרוסקופ כדי לאשר את בריאות התא.
    3. עוטפים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות-שעה אחת.
    4. בזמן הדגירה, להכין את התרופות לקריאה בדילול 1:10 (המכונה גם פי 10) עבור המינון הסופי הרצוי. לכן, להכין 100 μM forskolin ו 100 nM isoproterenol.
    5. הוסף 60 μL של כל תרופה בצורה עמודית לצלחת שקופה של 96 בארות (המכונה "צלחת התרופה").
      הערה: עם דילול התרופה הנכון וכדי לייעל את הקריאה, התרופות מתווספות לצלחת שקופה של 96 בארות, המכונה "צלחת התרופה", שתועבר בזמן הקריאה ל"צלחת הרקמה" באמצעות פיפטור 96-multi, מה שמאפשר להוסיף את התרופה לכל הבארות בו זמנית ולהיקרא במהירות על ידי ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי.
  3. הגדרת קורא לוחות פלואורסצנטי
    1. התאם את ההגדרות של קורא לוחות הפלואורסצנציה.
      1. מצב קריאה: פלואורסצנטיות. סוג קריאה: קינטי. אורכי גל קוראים: 494 ננומטר ו-522 ננומטר.
      2. זמן קריאה: הזן 3 דקות לקריאת הפלורסנט הבסיסית ו-7 דקות לתוספת שלאחר התרופה". מרווח" מוזן כ- 00:00:30 למשך 30 שניות בין כל קריאה.
        הערה: ניתן למטב ולהגדיל את זמן הקריאה בהתאם לזמן הנדרש.
  4. איסוף נתונים
    1. מוציאים את לוחית הרקמה מהאינקובטור, מסירים את רדיד האלומיניום ואת מכסה הצלחת ומניחים את לוחית הרקמה בקורא הלוחות. סגור את מגירת הקורא כדי לאפשר ללוח הטישו לנוח ולהתאזן לטמפרטורת הקורא (37 מעלות צלזיוס).
    2. מניחים את הצלחת השקופה של 96 בארות (צלחת סמים) עם דילול התרופה מתחת לפיפטה 96-multi ומתרגלים שאיבת 20 μL מהבארות. ודא כי יש נפח שווה של התרופה נמשך קצות פיפטור.
    3. התחל ריצת מדידה "בסיסית".
      הערה: 40 RFU ומעלה נחשבים לנתונים בני קיימא. אם הנתונים נמוכים מערך זה, יש לעצור את הניסוי ולהשליכו.
    4. לוחית הרקמה תיפלט מהקורא בסוף ריצת קו הבסיס. במהירות ובזהירות להוסיף 20 μL מן צלחת התרופה שקופה צלחת רקמה שחורה. לאחר מכן, התחל במהירות את ריצת "הטיפול". צלחת הרקמה לא צריך להיות מחוץ לקורא במשך יותר מ -30 שניות לאחר הוספת תרופות.
      הערה: אם מוסיפים את התרופה מהר מדי, התאים מתנתקים מצלחת הרקמה, ויוצרים ניסוי בלתי שמיש. בנוסף, התאים נגועים בחלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש לאור; לכן, הוספה מהירה ומהירה של התרופות ותחילת הקריאה השנייה היא הכרחית כדי לא לפספס את החלק הראשון של התגובה.
    5. לאחר השלמת הקריאה השנייה, ודא כי לוחית הרקמה נפלטת מהקורא ואיסוף הנתונים מסתיים.
      הערה: לפני השלכת צלחת הרקמה, מומלץ לוודא שהתאים עדיין מחוברים לצלחת. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ. אם התאים מתנתקים, התוצאות אינן חוקיות ויש להשליכן. יהיה צורך לחזור על הניסוי.
    6. יצא את הנתונים המתקבלים כקובץ Excel.
    7. פתח את הנתונים הקריאים המיוצאים של Excel מקורא הלוחות והעתק והדבק מידע רלוונטי לתוך תבנית ההמרה של Excel. הנתונים יהפכו מקורא הלוחות המוגדר לקריאה בודדת של עמודות מימין לנתונים המועתקים.
      הערה: עמודות פלואורסצנטיות עבור באר לאורך זמן רשומות ב- RFUs (שכותרתו טרנספורמציית עמודה) וכשינוי עשרוני ביחס לקריאת RFU בקריאה הראשונית (t0 שכותרתו דלתא F). בתבנית Excel, טבלת Delta F מוגדרת לקריאה הבסיסית האחרונה לפני הוספת תרופות. זוהי נקודת איסוף הנתוניםהשישית .
    8. לאחר המרת הנתונים, העתק את הנתונים מדלתא F והדבק אותם בתוכנת ניתוח נתונים כדעיכה או דעיכה יחסית בפלואורסצנטיות לאורך זמן.
    9. שנה את כותרת X ל- "time (s)" ואת כותרת Y ל- "ΔF/F0" עבור ערכים עשרוניים יחסיים.

2. בדיקת תא בודד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך

  1. תאי זריעה (HASM) עם וקטור cADDis BacMam בצלחת 35 מ"מ (יום 1)
    1. לפצל ולהדביק תאים במכסה מנוע נגיפי.
      1. חומרי HASM חמים (טבלה 1), 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
      2. יש לחטא את מכסה המנוע ואת החומרים ולנגב את מכסה המנוע ברקמות ספוגות EtOH.
      3. מוציאים ומשליכים מדיית HASM מהבקבוק בעזרת פיפטה סרולוגית.
      4. הוסף 5 מ"ל של Mg2+ ו- Ca2+ DPBS חופשי (37 ° C) עם פיפטה סרולוגית חדשה והטה את הבקבוק כדי לשטוף את התחתית עם DPBS.
      5. טריפסיניזציה של תאים על ידי הוספת 3 מ"ל של 0.25% מחומם טריפסין-EDTA עם פיפטה סרולוגית. הטה את הבקבוק כדי להבטיח שהמגיב מצפה באופן מלא את תחתית הצלוחית. תן מגיב לשבת במשך 3-5 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק מן הצלוחית.
      6. צייר 5 מ"ל של מדיה טרייה המכילה אנטיביוטיקה ולגרש את פיפטה כדי להסיר את התאים מתחתית הצלוחית.
      7. אסוף את הנפח הכולל של צנטריפוגת הבקבוק (8 מ"ל) בצינור צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
      8. לאחר הצנטריפוגה, מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה סרולוגית, נזהרים שלא להפריע לכדור.
      9. מבלי להפריע לכדור, הוסף 500 μL של DPBS ללא Mg2+ ו- Ca2+ DPBS לצד צינור הצנטריפוגה. מוציאים ומשליכים כמה שיותר נוזלים וחוזרים על הפעולה פעם נוספת.
        הערה: ניסוי זה ממוטבעבור 2 צלוחיות בגודל 75 ס"מ; ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות נפח עבור ריאגנטים אם נעשה שימוש במנגנון תרבית בגודל שונה.
      10. ספור תאים והתאם לצפיפות תאים של 40,000 תאים/מ"ל.
      11. הכינו תערובת מאסטר המבוססת על נפח המגיב הדרוש לכל באר של צלחת 35 מ"מ. ראה כרכים בהמשך:
        הערה: דוגמה של באר 1 (נפח כולל 500 μL): 20 μL של וקטור BacMam biosensor (מלאי של 2 x10 10 גנים נגיפיים /mL), 5 μL trichostatin A (מלאי של 100 μM, ריכוז סופי 1 μM), 500 μL של 40,000 תאים / mL צפיפות התא. דוגמה עבור 4 בארות (נפח כולל 2 מ"ל): 80 μL של biosensor וקטור BacMam (מלאי של גנים נגיפיים /mL), 20 μL של trichostatin A (מלאי של 100 μM, ריכוז סופי 1 μM), 2000 μL מדיה 40,000 תאים / mL צפיפות התא.
      12. מוסיפים 500 μL של תערובת מאסטר לכל באר. לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 24 שעות לפני המשך הניסוי.
        הערה: מספר התא עשוי להשתנות בהתאם לקו התא. כדי להימנע מתאים חופפים עבור הניתוח, השתמש במספרי תאים נמוכים.
  2. הכנת חומרים פרמקולוגיים (יום 2)
    1. בזהירות להסיר את המדיה בכל באר ולהחליף עם 450 μL של DPBS עם Mg2+ ו Ca2+ ב 37 ° C.
    2. עטפו את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרו על דיסקת 35 מ"מ בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות-שעה אחת.
    3. בדוק תאים במיקרוסקופ כדי לאשר את בריאות התא.
    4. בינתיים, הכינו את התרופות לקריאת יחידת יומן 1 מעל הריכוז הסופי הרצוי (פי 10). לכן, להכין 100 μM forskolin ו 100 nM isoproterenol.
    5. עבור titers מינון יומן, להכין את התרופה ב 10 mM ולהשתמש דילולים סדרתיים כדי להשיג 100 μM של forskolin ו 100 ננומטר של isoproterenol.
  3. איסוף נתונים
    הערה: ההגדרות הבאות הן עבור מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי. התוכנה המלווה כל מיקרוסקופ יכולה להיות שונה; ההגדרות הכלליות המשמשות בפרוטוקול הנוכחי מתוארות כאן.
    1. הפעל את הרכזת המרכזית, ולאחר מכן את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך.
    2. פתח את התוכנה שתשמש ללכידה ובחר באפשרות לכידת קיטועי זמן .
    3. מניחים מחזיק דגימת צלחת 35 מ"מ בשלב המיקרוסקופ.
    4. הגדר עדשה אובייקטיבית ל - x20.
    5. השתמש במיקוד אוטומטי וקבל תמונה ברורה ככל האפשר. אם קשה למצוא תאים בודדים, התחל במטרה 4x ולאחר מכן עבור ל- 20x. מקדו את הדגימה באופן ידני אם במיקרוסקופ חסרה תכונת מיקוד אוטומטי.
      הערה: ניתן להשתמש בהגדלה של 40x אם יש צורך בפירוט מורפולוגי משמעותי יותר של התא.
    6. התאם את ההגדרות הבאות לקבלת איסוף נתונים מיטבי: בהירות אוטומטית (חשיפה), אורך גל עירור, איזון שחור (להפחתת רעשי רקע), מיקוד אוטומטי.
    7. לאחר מציאת אזור ראייה עם מספר תאים פלואורסצמיים ציטופלזמיים, רכוש נתונים באמצעות לכידת קיטועי זמן למשך 20 דקות כל 30 שניות.
    8. לחץ על Go כדי להתחיל את הקריאה.
    9. הפעל במשך 3 דקות כדי לאסוף את קו הבסיס. ברגע 3 דקות ללכוד נלקח, בעדינות להוסיף 50 μL של התרופה לבאר המתאימה. כאשר התרופות מתווספות, הריכוז הסופי על המנה יהיה 10 μM forskolin ו 10 ננומטר של isoproterenol.
      הערה: יש להוסיף את התרופה בזהירות; אין לגעת בצלחת עם קצה הפיפטה, מכיוון שהדבר עלול להזיז את שדה הראייה שנוצר ולהפוך את הדגימה לבלתי ניתנת לניתוח.
    10. השאר את הניסוי לרוץ במשך 17 דקות נוספות עם לכידת נתונים כל 30 שניות.
    11. לאחר השלמת הבדיקה, ודא שהנתונים מוכנים לניתוח.
      הערה: בעוד שהפרוטוקול הנוכחי אינו כולל בקרה על סחף מוקדי, זה יכול להיות מועיל לכלול אחד בניסוי. לדוגמה, השימוש בצבעים גרעיניים יכול לסייע בניהול סחף מוקד במהלך ניתוח מיקרוסקופ, במיוחד בעת לכידת תמונות של תאים חיים לאורך פרקי זמן ממושכים. חיישנים ביולוגיים של cADDis מפוזרים בדרך כלל באופן נרחב בתוך התא, מה שהופך מישור מוקד רחב ללכידה היעילה ביותר ומפחית את הצורך בשליטה על סחף מוקד9.
  4. ניתוח הנתונים
    הערה: התוכנה המלווה כל מיקרוסקופ יכולה להיות שונה, ולכן ההגדרות הכלליות שיש להשתמש בהן כדי לנתח את התמונות שצולמו מתוארות כאן.
    1. פתח את קובצי התמונה שצולמו במהלך הניסוי.
    2. השתמש בכלי מצולע או עיגול כדי לבחור את אזור העניין של כל תא לביצוע הניתוח. הניתוח צריך לתת את הבהירות של כל תא בכל נקודת זמן.
      הערה: שיטת העבודה המומלצת היא לבחור תאים בודדים ולא תאים הנוגעים בדופן הצלחת או תאים אחרים. זה מבטיח את איסוף הנתונים הטוב ביותר האפשרי. בחר מינימום של 5 תאים לניתוח בתוך כל תנאי, ושכפל את הניסוי לפחות שלוש פעמים.
    3. לאחר ניתוח הנתונים, פתח את הנתונים בגיליון אקסל וחשב את הבהירות הממוצעת עבור כל מצב בכל תמונה, החל מהתמונה ממש לפני הוספת החומרים הפרמקולוגיים או הרכב. בדוגמה זו, בסימן 3 דקות או בתמונההשישית שצולמה במיקרוסקופ, מכיוון שכל תמונה מצולמת כל 30 שניות.
    4. חשב ΔF/F0 עבור כל ערך ממוצע בכל תנאי.
    5. טען לתוך תוכנת ניתוח סטטיסטי והתווה ΔF/F0 כנגד הזמן ב- s.
      הערה: איור 1 מספק סקירה סכמטית של השלבים העיקריים של הפרוטוקולים.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי אימת את הביוסנסור הציטוסולי הן בקורא לוחות והן במבחני מיקרוסקופ. ברגע שהתאים ביטאו את הביו-סנסור, הם עוררו באמצעות 10 מיקרומטר פורסקולין (מפעיל ישיר של ציקלז אדניליל), איזופרוטרנול 10 ננומטר (אגוניסט ב-ß1AR ו-ß2AR), או רכב (איור 1). השינויים הבאים בפלואורסצנטיות, המעידים על ייצור cAMP, נלכדו כל 30 שניות.

הנתונים השתנו כשינוי הפלואורסצנטיות מהפלואורסצנטיות הראשונית (ΔF/F0). מודל דעיכה של אתר אחד יושם על נתוני הפלואורסצנטיות כדי לכמת את השינויים הזמניים ברמות cAMP בין התנאים השונים (איור 2 ואיור 3). ניתן להשתמש בפרמטרים של עקומות דעיכה אלה כדי לכמת את התגובה לריכוז נתון של התרופה. נעשה שימוש במכפלה של קצב הדעיכה (k) והרמה כערך יחיד המכמת את תגובת התרופה, ואלה שימשו ליצירת עקומות ריכוז-תגובה כאשר מיושמים ריכוזים מרובים של אותה תרופה13.

בקורא הלוחות, לאחר גירוי עם פורסקולין של 10 מיקרומטר, החיישן הציטוסולי הראה ירידה ניכרת בעוצמת הפלואורסצנטיות תוך שניות והתקדם במשך דקות רבות (מקו הבסיס 0 ΔF/Fo ב-200 שניות ל-0.7 ΔF/Fo ב-600 שניות) בתאי HEK-293 (איור 2A). בהתחשב בעיצוב החיישן הירוק, ירידה בפלואורסצנטיות מצביעה על עלייה בייצור cAMP, מה שמצביע על כך שהפורסקולין גרם לעלייה אחידה ברמות cAMP בציטוזול. גירוי תאי HEK-293 עם ריכוז תת-מקסימלי של איזופרוטרנול (10 ננומטר) הוביל לירידה מהירה אך קטנה יותר בפלואורסצנטיות של הביו-סנסור (-0.3 ΔF/Fo ב-600 שניות, איור 2A). כאשר הריכוזים הנמוכים האלה של איזופרוטרנול (10 ננומטר ו-100 ננומטר) נבדקו בבאר תאים אחת לאורך זמן, נצפו תנודות של רמות cAMP בתאי HEK-293 (איור 2B). המחזוריות של תנודות אלה הייתה באופן עקבי סביב 200 שניות. ניתוח הנתונים השגרתי כולל התאמת התגובה למודל דעיכת אתר יחיד, אשר מבצע ממוצע תנודות אלה (ראה קו מקשר). ממוצע של ניסויים מרובים יחד הוביל בדרך כלל לתנודות אלה להיות מטושטשות בנתונים. עם זאת, הביוסנסור מפגין רגישות וקינטיקה מהירה המאפשרים תצפית על תנודות cAMP.

cADDis ניתן למדוד גם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו מאפשרת ניטור של cAMP בתאים בודדים וניתן להתאים אותה גם כדי לדמיין חיישנים ביולוגיים הממוקדים למיקומים תת-תאיים שונים. במחקר הנוכחי, הביוסנסור שימש בתאי שריר חלק ראשוניים בדרכי הנשימה האנושיות (HASM). גירוי של HASM בכל אחד מכלי הרכב, 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר איזופרוטרנול מוביל לירידה ניכרת בעוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן (מקו הבסיס 0 ΔF/Fo ב-120 שניות ל--0.9 ΔF/Fo ב-410 שניות) (איור 3) (וידאו 1, וידאו 2 ווידאו 3). פלואורסצנטיות מפוזרת באופן שווה בכל הציטוזול של התאים ואינה כוללת את הגרעין (ראו סרטוני קיטועי זמן). לפיכך, פורסקולין ואיזופרוטרנול הפיקו ירידה מהירה ומשמעותית דומה בתאי HASM פלואורסצנטיים. נתונים אלה מדגימים את היכולת להשתמש בביוסנסור בתרביות תאים ראשוניות.

figure-results-1
איור 1: ייצוג סכמטי של שלבי פרוטוקול biosensor. בתחילה, תאי תרבית מפוצלים ומושהים מחדש עם מדיה טרייה, ולאחר מכן נגועים בנגיף BacMam הנושא את חיישני cADDis. תאים לאחר טרנספקציה מגורים עם חומרים פרמקולוגיים המפעילים מסלולים תאיים המשנים cAMP. שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות בתגובה לריכוז cAMP משתנה נלכדים באמצעות ספקטרופוטומטר קריאת לוחות (A) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (B), המספקים כימות בזמן אמת של דינמיקת cAMP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניטור בזמן אמת של cAMP בתאי HEK-293 חיים בספקטרופוטומטר קריאת לוחות. פלואורסצנטיות של תאי HEK-293 על לוחות 96 בארות המבטאים את הביו-חיישן נמדדה לאורך זמן. לאחר קביעת פלואורסצנטיות בסיסית, דעיכת פלואורסצנטיות נוטרה במשך 7 דקות. (A) דעיכה פלואורסצנטית לאחר תוספת של 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר של איזופרוטרנול מסומנת כממוצע ± SEM של 10-15 ניסויים. (B) תנודות דעיכה פלואורסצנטיות מוצגות על-ידי תכנון ניסוי יחיד לאחר תוספת של 10 ננומטר או 100 ננומטר של איזופרוטרנול. הנתונים בשני הגרפים מתאימים למודל דעיכת אתר יחיד (קו מקשר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניטור בזמן אמת של cAMP בתאי HASM חיים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. פלואורסצנטיות של תאי HASM על צלחות מצופות בקוטר 35 מ"מ המבטאות את החיישן הביולוגי נמדדה לאורך זמן. לאחר קביעת ערכי הבסיס, נמדדה דעיכה פלואורסצנטית כל 30 שניות במשך 20 דקות. הסוכן שצוין נוסף ב 120 שניות (חץ). הדעיכה הפלואורסצנטית של הביו-סנסור מתעקמת בתגובה לכל אחד מכלי הרכב, 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר איזופרוטרנול. נתונים מניסוי יחיד מוצגים עם קו מקשר. סרטוני וידאו בהילוך מהיר של תאים שטופלו ברכב (בקרה), פורסקולין או איזופרוטרנול כלולים כדי לספק ייצוג חזותי של התגובות הפלואורסצנטיות של הביו-סנסור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: סרטון קיטועי זמן של ניטור בזמן אמת של cAMP בתאי HASM חיים בתגובה לרכב. עקומות דעיכה פלואורסצנטיות של הביוסנסור בתגובה לרכב (בקרה). כל פריים צולם כל 30 שניות במשך 20 דקות. סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון 2: סרטון קיטועי זמן של ניטור בזמן אמת של cAMP בתאי HASM חיים בתגובה לפורסקולין של 10 מיקרומטר. עקומות דעיכה פלואורסצנטיות של הביוסנסור בתגובה לפורסקולין של 10 מיקרומטר. כל פריים צולם כל 30 שניות במשך 20 דקות. סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון 3: סרטון קיטועי זמן של ניטור בזמן אמת של cAMP בתאי HASM חיים בתגובה לאיזופרוטרנול של 10 ננומטר. עקומות דעיכה פלואורסצנטיות של הביוסנסור בתגובה לאיזופרוטרנול 10 ננומטר. כל פריים צולם כל 30 שניות במשך 20 דקות. סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

ניסוח מדיה
מדיום HASM
שםנפח
F-12K של האם419.65 מ"ל
פ.ב.ס.50 מ"ל
HEPES (1M)12.5 מ"ל
תמיסת נתרן הידרוקסידי6 מ"ל
ל-גלוטמין 200 מילימטר (100X)5 מ"ל
סידן כלורי (1 מטר)0.850 מ"ל
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100X)5 מ"ל
פרימוצין1 מ"ל
HEK בינוני
שםנפח
DMEM (1x)444 מ"ל
פ.ב.ס.50 מ"ל
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100X)5 מ"ל
פרימוצין1 מ"ל

טבלה 1: ניסוח מדיה של מדיום HASM ומדיום HEK.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידה מדויקת ורגישה של cAMP חיונית להבנת תפקידו בתהליכים תאיים שונים ולחקר הפעילות של מסלולי איתות תלויי cAMP. ישנן מספר שיטות נפוצות למדידת רמות cAMP, כולל ELISA, radioimmunoassay, חיישנים ביולוגיים של FRET ובדיקת cAMP של GloSensor 14,15,16,17,18. לכל בדיקת cAMP יש חוזקות וחולשות. הפרוטוקול מאפשר זיהוי וניטור בזמן אמת, החל מדקות ועד שעות, ומדידה של דינמיקת cAMP בתוך תאים חיים ללא צורך לכלול מעכבי פוספודיאסטראז. נקודה אחרונה זו היא קריטית עבור חוקרים המעוניינים לחקור את התפקיד של איזופורמים phosphodiesterase בוויסות איתות cAMP19. הביו-סנסור זמין באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) במספר גרסאות: פלואורופור ירוק שמקטין פלואורסצנטיות בעת קשירת cAMP, פלואורופור אדום שמפגין פלואורסצנטיות מוגברת בקשירת cAMP, ופלואורופור ירוק שמפגין פלואורסצנטיות מוגברת בקשירת cAMP. הגרסה כלפי מטה של הביו-חיישן שימושית ביותר מכיוון שהגורם המגביל העיקרי הוא רמת הביטוי של הביו-סנסור, וגרסה זו תציג פלואורסצנטיות מקסימלית בנקודת ההתחלה לפני תחילת הניסוי, ותקל על הצורך להעריך את ביטוי הביו-סנסור על ידי הוספת גירוי cAMP מקסימלי. הביוסנסור זמין גם בגרסאות הממוקדות למיקרו-דומיינים של ממברנה, ריסונים ראשוניים או לגרעין. גרסאות שונות אלה מאפשרות מדידות של cAMP בו זמנית בתאים ציטוסוליים וממברנה/ציליאליים בתוך אותו תא. כלים חדשניים אלה מיומנים באופן ייחודי בהדמיה וכימות של דינמיקת cAMP על פני רכיבים תאיים שונים, תחום מתפתח במהירות וחשוב של מחקר20.

החיישנים הביולוגיים מציעים שיטה פשוטה לניטור יעיל של דינמיקת cAMP בזמן אמת, ומאפשרים לחוקרים לצפות בשינויים מהירים ברמות cAMP עם רזולוציית זמן יוצאת דופן. אחת מנקודות החוזק העיקריות של הביו-חיישן טמונה ברגישות הגבוהה שלו, המאפשרת זיהוי של שינויים עדינים ומשמעותיים בריכוזי cAMP8. דוגמה לכך בתנודות cAMP נצפית ברמות נמוכות של גירוי איזופרוטרנול בתאי HEK-293 ללא נוכחות מעכב פוספודיאסטראז (איור 2B). התנהגות תנודתית זו אינה מובנת ונראית ייחודית לתאים אלה, אך הרגישות והקינטיקה המהירה של הביו-סנסור מאפשרות את זיהויים. יש לציין, עם זאת, כי biosensor יכול להיות רווי בקלות, ולכן biosensor זה יכול להיות מוגבל בכימות ההבדלים בין אותות cAMP בינוניים וגדולים. תכונה מגבילה זו רלוונטית במיוחד כאשר משתמשים במעכבי פוספודיאסטראז הגורמים לעלייה גלובלית ברמות cAMP כאשר קיים גם גירוי קולטן. בעוד אנו מציגים את הזיהום של HASM במחקר זה, חשוב להכיר באתגר הקשור להדבקת תאים ראשוניים באמצעות וקטור BacMam. התנאים צריכים להיות מותאמים לסוגי תאים בודדים על מנת להשיג ביטוי מספיק של הביו-סנסור. עם זאת, הרגישות והמדרגיות של החיישן הביולוגי הופכות אותו למתאים היטב למבחני תפוקה גבוהה.

שיפור נוסף של השימוש בחיישן ביולוגי זה על פני חיישנים מבוססי FRET הוא מזעור ההלבנה. חיישנים ביולוגיים פלואורסצנטיים רבים חשופים להלבנה לאור בעקבות עירור ממושך וחוזר. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים עירורים קצרי טווח במרווחים של 30 שניות זה מזה. הביו-חיישן הוא גם בהיר מאוד, ובכך מגביל את פוטנציאל ההלבנה עבור סוג זה של ניתוח. פוטו-הלבנה תיראה במהלך קו הבסיס הראשוני כסחף. אם מתרחשת סחף מקו הבסיס, ניתן להחסיר את קו הבסיס הנסחף מהנתונים לפני התאמת העקומה או להגדיל את מרווח הדגימה כדי להפחית את תדירות העירור.

כמו ביו-חיישנים אחרים של cAMP, לביו-חיישן זה יש ספציפיות גבוהה להיקשרות ל-cAMP. כתוצאה מכך, האותות הנוצרים על ידי בדיקה זו מתואמים ישירות לרמות cAMP, מה שמפחית באופן משמעותי את ההפרעה הפוטנציאלית מרכיבים תאיים אחרים ומספק תוצאות אמינות. יתר על כן, הרבגוניות של biosensor שווה הדגשה. בעוד הבדיקה GloSensor נמצא בשימוש נרחב בתחום, יש לו מגבלות מסוימות. לדוגמה, הסתמכות על טרנספקציה חולפת עלולה לגרום לחוסר יעילות בסוגי תאים ספציפיים, וניתוח של פרמטרים או תהליכים מרובים בתוך אותו תא הוא אתגר. בנוסף, הבדיקה מסתמכת על אנזימי לוציפראז שיכולים להיות מושפעים מתרכובות מסוימות, מה שעלול להוביל לפגיעה בדיוק התוצאה21. מצד שני, ניתן להשתמש בביוסנסור בסוגי תאים שונים ובמערכות ניסוי שונות, כולל תאים דבקים ותרחיפים. התאמתו להקשרים תאיים מגוונים מאפשרת לחוקרים לחקור דינמיקה של cAMP במערכות ביולוגיות שונות 22,23,24. השילוב של בדיקת biosensor זו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי משפר את התועלת שלה עוד יותר מאז מידע מורפולוגי התא ניתן גם לאסוף 25,26,27.

בדיקה זו מספקת לחוקרים גמישות רבה בתכנון הניסוי, ומאפשרת מגוון רחב של חקירות הקשורות לאיתות cAMP. הוא משרת מטרות רבות, ומאפשר מדידה של רמות cAMP בסיסיות, חקר תנודות cAMP בתגובה לגירויים או טיפולים מגוונים, וחקר דינמיקת cAMP במצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים. אחת מנקודות החוזק העיקריות של הבדיקה היא התאימות שלה לטכניקות אחרות, המאפשרת הבנה מקיפה יותר של איתות cAMP. על ידי שילוב הביוסנסור עם שיטות כגון צביעה אימונופלואורסצנטית או מניפולציה גנטית10, חוקרים יכולים לקבל תובנות עמוקות יותר על הוויסות המרחבי והזמני המדויק של cAMP בתוך תאים ספציפיים או מסלולי איתות. באמצעות אינטגרציה זו, חוקרים יכולים לחקור את הפונקציות המגוונות של cAMP בהקשרים שונים, מה שמוביל לתובנות חשובות לגבי המורכבות של תהליכים תאיים בתיווך cAMP. שימוש בטכניקות אלה מאפשר לחוקרים לדמיין ולכמת רמות cAMP הן ברמת התא הבודד והן ברמת האוכלוסייה, ומציע הבנה מקיפה של תפוצתו בתוך התא, כולל זיהוי מאגרי cAMP. כתוצאה מכך, השילוב של שיטות אלה מאפשר רכישת נתונים מדויקים, ותורם באופן משמעותי לידע שלנו על איתות cAMP.

בעוד שיטות מסורתיות היו בעלות ערך עבור ניתוח cAMP, המבוא של cADDis מייצג התקדמות מבטיחה בתחום זה. הספציפיות שלו, רגישותו ויכולותיו בזמן אמת הופכות אותו לתוספת רבת ערך לארגז הכלים של החוקר, במיוחד בשל התאמתו לתאים חיים. עם היכולת לנטר את רמות cAMP בזמן אמת והרגישות הגבוהה שלו, הביוסנסור מציע יתרון משמעותי בסביבות ניסוי שונות. התקדמות זו תורמת להבנה עמוקה יותר של האופי הדינמי של איתות cAMP והשלכותיו התפקודיות בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NHLBI) (HL169522).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחת 96 בארות (שקופה)פישרברנד21-377-203
צלחת 35 מ"מגריינר ביו-וואן627870כלי תרבית תאים עם תחתית זכוכית
צלחת 96 בארות קורנינג3904שחור עם תחתית שטוחה שקופה
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100x)Gibco15240062למדיה HEK ו- HASM
מיקרוסקופ פלואורסצנטי BZ-XKeyence
סידן כלורי (IM)איכות ביולוגית בע"מE506
צינור צנטריפוגה מדיה HASM (15 מ"ל)Thermo Scientific339651
DMEM ( 1x)Gibco11965092HEK מדיה
DPBS עם Mg2+ ו-Ca2+ Gibco14040-133
DPBS ללא Mg2+ ו-Ca2+Corning14040-133
סרום בקר עוברי (FBS)R& מערכות DS11195למדיה HEK ו-HASM
ForskolinMillipore344270תרופה
ירוקה למטה cADDis cAMP ערכת בדיקהמונטנה מולקולרית#D0200Gמגיב
חזיר F-12K Gibco21127022למדיה HASM
HEPES (1M)Gibco15630080למדיה HASM
איזופרוטרנולSigmaI6504תרופה
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)Gibco25030-081למדיה HASM
צינור מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1אנטיביוטיקה למדיה HASM
RNAse משםמגיב תרמו מדעי700511
תמיסת נתרן הידרוקסידסיגמאS2770עבור מדיה HASM
קורא צלחות Spectrmax M5מולקולריים
טריכוסטטין Aמגיב TCI AmericaT2477
טריפסין EDTAGibco25200-056מגיב
עבור מכשירים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
  3. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  4. Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769(2020).
  5. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
  6. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  7. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332(2018).
  8. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
  9. Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
  10. Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
  11. Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
  12. Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
  13. Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
  14. Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
  15. Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
  16. Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
  17. Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
  18. Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
  19. Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
  20. Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
  21. Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
  22. De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646(2022).
  23. Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
  24. Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
  25. Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
  26. Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297(2022).
  27. Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

cAMP BiosensorReal Time cAMPLive Cell ImagingFluorescent BiosensorcADDis SensorcAMP DynamicsHuman Airway Smooth MuscleSingle Cell ImagingFluorescence MicroscopyHigh Throughput Screening

Related Articles