משימת זיכרון עבודה מרחבי מעוררת תיאבון לעכברים במבוך רדיאלי חצי אוטומטי בעל 8 זרועות, המפחיתה את אסוציאציות הזיכרון המפחיד במבוך

זיכרון עבודה¹ הוא תהליך קוגניטיבי שיכול להכיל כמות מוגבלת של מידע לתקופה קצרה בזמן שהוא עובר מניפולציה ומשמש בתכנון וביצוע של משימה מנטלית, כגון שינון מספר טלפון או מסלול ליעד ממיקום אחר. זה קשור קשר הדוק לאינטליגנציה נוזלית, שהיא היכולת לחשוב במהירות ולחשוב בצורה מופשטת. הוא האמין כי אימון זיכרון עבודה יכול לשפר את האינטליגנציה הנוזלית². זיכרון עבודה, אם כן, חיוני למחקרי מחקר.

רוב ניסויי ההתנהגות הפופולריים של מכרסמים תוכננו במקור עבור חולדות בשנות ה-80, וכיום חוקרים מיישמים לעתים קרובות את הפרוטוקולים האלה על עכברים. עם זאת, ישנם הבדלים התנהגותיים עקביים בין חולדות ועכברים 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . במיוחד, ניהול פחד הוא גורם חשוב שיכול להשפיע על תוצאות הניסויים, שכן עכברים נוטים יותר ללחץ בהשוואה לחולדות ^{3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}. לכן, חשוב לקחת בחשבון את ההבדלים בעת החלת פרוטוקולים אלה על עכברים. בפרוטוקול שלנו, ניסינו למזער את גורמי הסטרס במהלך מטלת זיכרון העבודה במבוך הזרוע הרדיאלית. זה נעשה על ידי תזמון קפדני של סגירת הדלתות באמצעות תוכנת מעקב העכבר ובקרת המבוך. כמו כן, נמנע תפיסת עכברים בסוף המפגש במרכז המרכזי. גישה זו אפשרה לעכברים לבחור את הזרוע הבאה שלהם מבלי לקשר את המיקום לפחד להיתפס. עיכוב לכידת העכברים עד לאחר איסוף כל התגמולים במבוך הבטיח שהפרס האחרון לא יהיה קשור לחוויית הלכידה.

מבוך הזרוע הרדיאלית היבשתית (RAM) הוא מכשיר פופולרי ונפוץ להערכת למידה וזיכרון מרחבי ולא מרחבי, ולבדיקת זיכרון עבודה והתייחסות במכרסמים. זהו אחד המכשירים הפופולריים ביותר ללמידה וזיכרון מרחבי בעכברים 20,21,22. זיכרון RAM מנצל את הנטייה הטבעית של מכרסמים לחקור את המבוך, למצוא חידושים וללמוד מידע מרחבי על בסיס ניסוי וטעייה, בנוסף לחיפוש מזון. ניתן להעצים את הנטייה הזו על ידי הגבלת התזונה שלהם ותגמול במזון מועדף במבוך. כיום, נעשה שימוש במספר גרסאות של מנגנון ה-RAM, למשל, עם 6, 8, 12 או 16 זרועות ומנגנון סגור חלקית או פתוח/מוגבה 23,24,25. רוב הפרוטוקולים של ימינו מבוססים על זה של Olton et ^al.20,26, אך משתמשים במבוכים פשוטים יותר (6 או 8 זרועות) ^{9,24,27,28,29}. בדיקת זיכרון עבודה במבוך זרועות רדיאלי (6 או 8 זרועות) היא חזקה יותר ממבוך T (2 זרועות) מאחר שלחיות יש יותר אפשרויות של זרועות לחקור.

זיכרון ה-RAM המקורי תוכנן על ידי אולטון וסמואלסון²⁰ כדי להעריך למידה וזיכרון מרחבי בחולדות המשתמשות בפיתיונות מזון לחיזוק חיובי, בניגוד למבוכי מים כמו מבוך המים של מוריס ומבוך מים רדיאלי בעל 8 זרועות המשתמשים בחיזוק שלילי, כלומר טבילה במים 20,30,31,32. אולטון וסמואלסון,²⁰, מצאו שלחולדות יש זיכרונות מצוינים ממקומות כשהם עוברים דרך ה-RAM. הם הראו שההיפוקמפוס מעורב בעיבוד מידע מרחבי. לכן הם הציגו את הרעיון של מערכת זיכרון כפולה, הכוללת זיכרון עבודה והתייחסות, במכרסמים. מערכת זיכרון כפולה זו הוצעה בעבר על ידי הוניג³⁶ בהתבסס על ניסויים עם יונים. אולטון ועמיתיו מצאו שתפקוד ההיפוקמפוס חיוני לזיכרון עבודה. זה הושג על ידי יצירת נגעים באזור האנטורינלי, גוף הפימבריה-פורניקס, הקדמי להיפוקמפוס, המחיצה או הפורניקס הפוסט-קומיסורי כדי לשבש כל אחד מחיבורי הסיבים החיצוניים העיקריים של היווצרות ההיפוקמפוס 26,33,34,35. נגעי פורניקס-פימבריה לא השפיעו על זיכרון הייחוס²⁶.

בפרוטוקולים מודרניים, בעלי חיים מורגלים לסביבה על ידי מתן אפשרות לחקור את המבוך בחופשיות במשך 10-15 דקות ביום במשך 3 ימים רצופים, ולאחר מכן אימון מבוך במשך 1-3 שבועות עם מזון מועדף בקצה כל הזרועות או זרועות נבחרות קבועות, בדיקת זיכרון עבודה, או זיכרון עבודה וזיכרון ייחוס באותו ניסוי. ^{בהתאמה 9,29,37}.

לעתים קרובות, הפרוטוקולים האלה אינם מתוארים במלואם, והבדלי ההתנהגות בין חולדות ועכברים אינם נלקחים בחשבון היטב. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול והניסיון שלנו בפירוט, במיוחד כיצד להימנע מקשירת חוויות מפחדות למקומות ותזמון בהתבסס על הבדלי ניהול פחד בין חולדות ועכברים. פרוטוקול זה מיועד לחוקרים שרוצים לחקור זיכרון עבודה מרחבי וליישם אותו על אלקטרופיזיולוגיה, הדמיה בזמן אמת והיסטולוגיה באמצעות עכברים.

כל הניסויים בעכברים אושרו מראש על ידי הוועדה האתית של UCL ואושרו על פי חוק בעלי חיים (נהלים מדעיים) 1986 והחקיקה שלאחר מכן של ממשלת בריטניה.

1. הכנת תוכניות לבקרת המבוך האוטומטית ביישום תוכנה

הערה: נעשה שימוש במבוך הזרוע הרדיאלי האוטומטי, כפי שמוצג באיור 1A-C, ובפריסת החדר באיור 1D.

1. הכן זרימת עבודה ניסיונית לסגירת דלת כמתואר באיור 2.
2. הגדר את תחילת שלב ההתרגלות 1 (איור 2A) ביישום תוכנה. לשם כך, בצע את השלבים הבאים.
   1. הגדר את תחילת הקלטות הניסיון והוידאו, וסגור את כל הזרועות בתוכנה. 5 שניות לאחר שהתוכנה מזהה את העכבר במרכז המרכזי של המבוך, היא מתחילה לעקוב ופותחת את כל הדלתות.
   2. כאשר העכבר נכנס לזרוע ונמצא במרחק של 4 ס"מ מהדלת הקרובה ביותר של דלתות הרכזת המרכזית, סגור את כל הדלתות. ואז, מיד לאחר סגירת כל הדלתות, פתח את דלת הזרוע שבחר העכבר.
   3. לאחר שהעכבר חוזר לרכזת המרכזית, סגור את הדלת והגבל אותה לרכזת המרכזית למשך 5 שניות. חזור על כך למשך 30 דקות.
   4. הפסק את הקלטת הווידאו והמעקב בחלוף 30 דקות, והעכבר חוזר לרכזת המרכזית.
      הערה: תן לעכבר לחקור את המבוך בחופשיות כרצונו.
3. שלב ההתרגלות 2 (איור 2B)
   1. הגדר את תחילת תקופת הניסיון והקלטת הווידאו בתוכנה המשויכת וסגור את כל הדלתות.
   2. 5 שניות לאחר שהתוכנה מזהה את העכבר במרכז המרכזי של המבוך, התחל לעקוב אחריו ופתח את כל הדלתות.
   3. סיים את הניסיון אם העכבר נכנס לכל זרוע לפחות פעמיים או לאחר 30 דקות ולאחר מכן חוזר לרכזת המרכזית. תן לעכבר לחקור את המבוך בחופשיות כרצונו.
4. שלב ההתרגלות 3 (איור 2C)
   הערה: שלב זה הוא שילוב של שלבים 1 ו-2.
   1. הגדר את התוכנה להתחיל את הקלטת הניסיון והווידאו ולסגור את כל הדלתות.
   2. הגדר את התוכנה לשלוט בדלתות המבוך 5 שניות לאחר שהתוכנה מזהה את העכבר ברכזת המרכזית. הגדר את תחילת המעקב בנקודה זו ופתח את כל הדלתות.
   3. סגור את כל הדלתות כאשר העכבר נכנס לזרוע ונמצא במרחק של 4 ס"מ מהדלת הקרובה ביותר של דלתות הרכזת המרכזית. ואז פתח את דלת הזרוע.
   4. סגור את הדלת כאשר העכבר נכנס במלואו לרכזת המרכזית והגביל את העכבר ברכזת המרכזית למשך 3 שניות. חזור על רצף זה למשך 30 דקות או עד שהעכבר נכנס לכל זרוע לפחות פעם אחת.
   5. הגדר את סיום הניסיון לאחר מילוי התנאי, וכאשר העכבר נכנס לרכזת המרכזית במלואה.
      הערה: תן לעכבר לחקור את המבוך בחופשיות כרצונו.
5. מטלת זיכרון עבודה (איור 2D, E)
   1. הגדר את התוכנה להתחלת הניסיון וההקלטה, וסגור את כל הדלתות.
   2. 5 שניות לאחר שהתוכנה מזהה את העכבר ברכזת המרכזית, הגדר את התוכנה להתחיל במעקב.
   3. התחל את שלב הריצה הכפויה. הצג 4 זרועות שנבחרו באופן פסאודו-אקראי אחת לעכבר.
   4. כאשר העכבר נכנס לזרוע הראשונה ונמצא במרחק של 3 ס"מ מהרכזת המרכזית, ודא שהדלת נסגרת ותוחמת אותה בזרוע למשך 15 שניות.
   5. תן לדלת להיפתח ותן לעכבר לחזור לרכזת המרכזית.
   6. סגור את הדלת ולאחר מכן פתח את הזרוע השנייה.
   7. חזור על כך עד הזרוע הרביעית.
   8. כאשר העכבר חוזר לרכזת המרכזית לאחר הזרוע הרביעית של שלב הריצה הכפויה, הגבל אותו לרכזת המרכזית למשך 5 שניות.
   9. תנו לכל הדלתות להיפתח והתחילו את שלב הריצה החופשית.
   10. סיים את הניסיון כאשר העכבר חוזר לרכזת המרכזית לאחר שאסף את כל התגמולים/נכנס לכל הזרועות לפחות פעם אחת.

2. הכנת כלובי בית לדיור פרטני

1. הקימו כלובים חדשים באמצעות חומרי קינון סטנדרטיים לניסוי חדש.
   1. שים מצעים חדשים, נסורת, איגלו נייר, מנהרת נייר, פסי קינון מנייר ובלוק נשיכה מעץ בכלובים חדשים לכל עכבר לצורך הניסוי.
   2. הנח את קופסת המזון וסגור את המכסה.
      הערה: עכברים עלולים לפגוע בחלקים לאוורור אם הם ללא קופסת המזון.

3. טיפול, שקילה והגבלת תזונה בחדר החזקת בעלי חיים (יום -7 עד יום 0)

1. הנח את העכבר למנהרת הנייר המסופקת בכלוב הביתי ביד בעדינות.
2. הרם את העכבר מהכלוב המקובץ באמצעות מנהרת הנייר 38,39,40 עם היד, שמור אותו בגובה החזה למשך מספר שניות. לחלופין, תן לעכבר לטפס על היד מרצון.
   הערה: טיפול בבעלי חיים עם מתח מינימלי חיוני לניסויים התנהגותיים. לעולם אל תרים אותם בזנב, וזה מלחיץ עבור עכברים. הרגלת עכברים לנסיין חשובה גם היא. עכברים צריכים להיות מורגלים ורגועים, אחרת הם לא ילמדו היטב במבוך מאוחר יותר.
3. החזק תמיד את העכבר באותה שיטת טיפול. שים את העכבר על המשקל לניטור משקל הגוף ורשום את משקל גופו.
   הערה: אין להלחיץ את העכברים בתנועת גוף מהירה או על ידי השמעת רעשים חזקים. עדיף לעשות זאת בסביבה שקטה. אחרת, הם עלולים לקפוץ מהמשקל או מידו של הנסיין. כמו כן, אם העכברים לחוצים, הם יכולים להראות עיניים פוזלות, לחרוק ועלולים לנשוך את ידו של הנסיין^41,42.
4. לאחר השקילה הכניסו את העכבר לכלוב החדש שהוכן קודם לכן.
5. הכניסו עכברים לדיאטה עם כמות מוגבלת במשך שבוע לפני החשיפה למבוך הזרוע הרדיאלי. זה מניע אותם לחפש מזון במבוך לתגמולי מזון המסופקים. תגמול המזון במהלך הניסוי הוא חלב מרוכז מדולל וממותק.
6. הכניסו 2 ~ 3 גרם צ'או סטנדרטי לכלוב ושמרו על משקל הגוף בין 85 ~ 90% מהמשקל ההתחלתי לאורך כל הניסוי.
   הערה: עכברי C57BL/6 אוכלים 3-4 גרם צ'או רגיל כל יום⁴³.
7. שימו לב לירידה במשקל הגוף במהלך הלילה כמדריך לסטנדרטיזציה של כמות המזון שתינתן למחרת. מכאן ואילך, תנו כמות יומית מספקת של צ'או סטנדרטי כדי לשמור על 85-90% ממשקל הגוף ההתחלתי שלהם לאורך כל הניסוי.
   הערה: בעלי חיים אלה צריכים לרדת במשקל לאט. עקוב אחר משקל הגוף והבעות הפנים שלהם כדי למנוע לחץ.
8. ספקו 1 מ"ל חלב מרוכז מדולל (פרס; חלב מרוכז ממותק: מים = 1: 1) בכוס פלסטיק קטנה בכלוב הביתי כדי להרגיל עכברים עד סוף שלב ההתרגלות 1. ודא שעכברים אוכלים את הפרס. שנה את מזון התגמול אם זן העכברים מראה ניאופוביה למזון המוצג.
   הערה: משלב ההתרגלות 2, אל תספק את התגמול בכלוב הביתי. אם משקל גופו של עכבר כלשהו יורד מתחת ל-80% מהמשקל ההתחלתי, יש להמית אותו בהתאם ל-IACUC ולהנחיות ספציפיות למדינה. אם עכבר אינו נמצא בטווח משקל הגוף הרגיל עבור קו העכבר בו נעשה שימוש (20-30 גרם בגיל 8-12 שבועות) בבדיקת משקל הגוף הראשונה, אין לשקול אותו בקבוצה כדי למנוע קושי לשמור על משקל גופו בטווח הנדרש מאוחר יותר.

4. הבאת עכברים לחדר הבדיקה

1. השתמש בעגלה כדי להביא עכברים לחדר בדיקות ההתנהגות לאט.
2. השאירו את העכברים ללא הפרעה על העגלה למשך 5 דקות.

5. סידור החדר

1. הגדר את תאורת החדר המאירה את הרכזת המרכזית בעקיפין, על 80 לוקס עם נורות לבנות חמות, והשמע רעש לבן ב-70 dB הנמדד ברכזת המרכזית. הערה: ידוע שחשיפה לרעש לבן בעוצמה בינונית מובילה חולדות לביצועים טובים יותר במבוך מורכב מבחינה גיאומטרית^44,45. נראה שרעש לבן עושה יותר מסתם להסוות את הרעש הבלתי נמנע בסביבה; רעש לבן של 70 דציבל מגביר את ספיגת הכולין במספר אזורים במוח של חולדות, כולל קליפת המוח הקדם-מצחית, ההיפותלמוס וההיפוקמפוס (אך לא בסטריאטום)⁴⁶ וידוע כי ביצועי זיכרון העבודה של זיכרון העבודה תלויים בשלמות המסלולים הכולינרגיים בהיפוקמפוס, בקליפת המוח הקדמית ובמוח הקדמי ^32,47. ידוע גם שבעלי חיים משתמשים ברמזים חזותיים דיסטליים ופרוקסימליים כדי לנווט במדויק בסביבתם. עם זאת, עכברים תלויים ברמזים חזותיים דיסטליים יותר מאשר ברמזים פרוקסימליים כדי לנווט במהלך למידה מרחבית⁴⁸. בניסוי זה, רמזים פרוקסימליים שהודפסו על פיסת נייר קטנה הוכנסו לקירות האחוריים של כל הזרועות של זיכרון ה-RAM בעל 8 הזרועות, אך הם לא הפחיתו את התנהגות השרשור. לעומת זאת, רמזים חזותיים דיסטליים א-סימטריים מבחינה גיאומטרית (על התקרה והקירות של החדר), הפחיתו את שרשרת החיננית והיו חיוניים לניווט מרחבי ב-RAM.

6. שלב ההתרגלות 1 - לא מתוגמל (יום 1 - 2)

הערה: אין פיתיון פרסים במבוך. שלב זה נועד להרגיל עכברים לדלתות המבוך ולצלילים שלהם.

1. התחל את מעקב העכבר והקלטת הווידאו על ידי לחיצה על כפתור התחל בתוכנה והבאת העכבר למבוך מבלי להלחיץ אותו. עשו זאת על ידי תנועה איטית ושינוי הגובה לאט בזמן שהעכבר נמצא ביד הנסיין. הנח את העכבר ברכזת המרכזית.
   הערה: אם עכברים רועדים על ידו של הנסיין, האטו את התנועות. זה סימן לפחד. עכברים נעים במהלך תקופת הכליאה של 5 שניות במרכז המרכזי לפני תחילת שלב הריצה הכפויה. הם יכולים לפנות לכל צד כאשר הם ממוקמים במרכז המרכזי.
2. המשך לעקוב אחר התנהגות העכבר על צג המחשב הממוקם הרחק מהמבוך או מתחת למפלס קיר המבוך. אם העכבר מנסה לברוח מהמבוך על ידי טיפוס על הקיר, פשוט קום מהכיסא כדי להראות את קיומו של הנסיין וצעד לעברו, תוך מעקב אחר ביצועיו. בתרחיש הגרוע ביותר, דחוף את העכבר בחזרה למבוך.
   הערה: בדרך כלל, עכברים חוזרים למבוך לאחר ששמעו את רעש החיכוך של בגדי הנסיין כשהם מתקרבים אליו. זה צריך להיעשות במהירות. אם הנסיין ימשיך לעשות זאת, העכברים יישארו במבוך אחרי שלבי ההתרגלות 1 עד 3. אם עכברים ממשיכים לקפוץ מהמבוך, רצוי להסיר אותם מניסויים וניתוחים נוספים.
3. לאחר הניסוי, אספו את העכבר מזרוע המבוך על ידי כך שתאפשרו לעכבר לטפס על ידו של הנסיין מרצונו, בעוד היד השנייה מכסה את הזרוע כדי למנוע ממנו לקפוץ מהמבוך.
4. צחצחו את צואת העכברים ונגבו את המבוך עם טישו יבש כדי להסיר עקבות של התגמולים. לאחר מכן, נגב עם טישו רטוב וייבש את המבוך עם טישו יבש (כ -2 דקות).
5. עשה זאת עבור כל עכבר בתורו למשך יומיים.
   הערה: לאחר 30 דקות, ייתכן שעכברים לא ביקרו בכל 8 הזרועות של המבוך. זה נורמלי וזו לא בעיה. עכברים נוטים לבקר בזרועות בדפוס לא שיטתי ולא רציף ולנוע בזהירות, ומבלים זמנים לא אחידים בכל זרוע. עכברים יכולים לטפס על קירות המבוך ו/או לקפוץ מהמבוך בשלב זה. אם זה קורה (למשל, העכבר מנסה לטפס על הקירות), מנעו זאת על ידי כך שתוודאו שהנסיין גורם לעכבר להיות מודע לנוכחותו על ידי התקרבות למבוך והשמעת רעש, כמו למשל רשרוש בגדים. לכן, ייתכן שתידרש התבוננות מדוקדקת בהתנהגות העכבר ב-RAM ופעולה מהירה. לאחר מספר חזרות על הליך זה, עכברים יישארו במבוך. אם למרות הכל העכבר לא נשאר ב- RAM במהלך ההתרגלות, הסר אותו מהניתוח.

7. שלב ההתרגלות 2 - מתוגמל (יום 3 - 4)

הערה: שלב זה נועד לעודד עכברים לחקור את המבוך בחופשיות כדי לקבל תגמולי מזון.

1. הניחו 70 מיקרוליטר של תגמול המזון בכל מזון היטב בכל זרוע.
2. התחל את מעקב העכבר והקלטת הווידאו על ידי לחיצה על כפתור התחל בתוכנה ולאחר מכן הנחת העכבר על הרכזת המרכזית של המבוך כפי שמוסבר ב-6.1.
3. המשך לצפות בהתנהגות העכבר על צג המחשב ממקום מרוחק ורשום זאת במידת הצורך, למשל, טיפוס על הקיר או קפיצה מהמבוך. סיים את הניסיון כאשר העכבר נכנס לכל זרוע לפחות פעמיים או 30 דקות.
4. לאחר הניסוי, אספו את העכבר מהמבוך בזרוע על ידי כך שתאפשרו לעכבר לטפס על ידו של הנסיין מרצונו, בעוד היד השנייה מכסה את הזרוע כדי למנוע ממנה לקפוץ מהמבוך.
5. נקה את המבוך כמתואר בסעיף 6.4 (שלב ההתרגלות 1; כ-2 דקות).
6. עשה זאת עבור כל עכבר בתורו פעמיים ביום למשך יומיים.
   הערה: בשלב זה, עכברים עשויים להפגין התנהגות של שרשור דייזי, אך אין צורך לדאוג מכיוון ש-4 ערכי הזרועות הנוספים במשימת זיכרון העבודה עלולים להרתיע תנועה זו. בשלב זה, עכברים יכולים לעצור בזרוע מבלי לצרוך את התגמול. ביום הרביעי, עכברים צריכים להיות מאומנים יותר מאשר ביום השלישי, אך עדיין יכולים לעצור באמצע הזרוע.

8. שלב ההתרגלות 3 - מתוגמל (יום 5 - 6)

הערה: שלב זה נועד לאפשר לעכברים להתרגל לסביבה של השילוב של שלבים 1 ו-2.

1. פיתיון את כל בארות המזון עם 70 מיקרוליטר מהתגמול.
2. התחל את מעקב העכבר והקלטת הווידאו על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה של התוכנה והצבת העכבר במרכז המרכזי של המבוך.
3. המשך לצפות בהתנהגות העכבר על צג המחשב ממקום מרוחק, עד שהעכבר ייכנס לכל זרוע לפחות פעם אחת או 30 דקות. אם העכבר מנסה לברוח מהמבוך, פעל מהר כפי שצוין בשלב ההתרגלות 1 (6.2).
4. לאחר הניסוי, הוציאו את העכבר מהמבוך על ידי כך שתניחו לו לטפס על ידו של הנסיין מרצונו, בעוד היד השנייה מכסה את הזרוע כדי למנוע ממנו לקפוץ מהמבוך.
5. נקה את המבוך כמתואר ב 6.4 (שלב התרגלות 1) (כ -2 דקות).
6. עשה זאת עבור כל עכבר פעמיים ביום למשך יומיים.
   הערה: בשלב זה, הוצאת כל העכברים המנסים לברוח מהמבוך מהניתוח היא הטובה ביותר.

9. מטלת זיכרון עבודה - מתוגמלת (יום 7 - יום 15)

1. פיתיון כל הזרועות עם 40 מיקרוליטר מהתגמול. מקם את התגמול בכל מזון קרוב מאוד למרכז המרכזי כדי להקשות על עכברים לראות מהרכזת המרכזית.
2. התחל את המעקב וההקלטה של העכבר על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה של התוכנה ולאחר מכן הנח את העכבר על הרכזת המרכזית של המבוך מבלי להלחיץ אותו.
3. במהלך 5 שניות הכליאה במרכז המרכזי, התרחקו ושבו איפשהו הרחק מהמבוך. עקוב אחר התנהגות העכבר ורשום את רצף הזרוע שהעכבר מבקר במבוך (ראה קובץ משלים 1).
4. הפסיקו לתעד את רצף ביקורי הזרוע כאשר העכבר אוסף את כל שמונת תגמולי המזון, שזה סוף מטלת זיכרון העבודה, ואז תנו לו לבקר בארבע זרועות נוספות.
   הערה: על ידי כך, לעכברים יכול להיות עוד קצת זמן לפני שהם נתפסים, מה שמאפשר לעכברים להתמקד במטלת זיכרון העבודה. שלב זה גם מאפשר לעכברים לחזק את העובדה שהתגמולים אינם מתחדשים לאחר שנאספו.
5. לאחר ארבעת ביקורי הזרוע הנוספים, הסר את העכבר מהמבוך בסוף ביקור הזרוע האחרון על ידי כך שתאפשר לו לטפס על היד תוך כיסוי הזרוע ביד השנייה.
   הערה: על ידי אי תפיסת עכברים ברכזת המרכזית, עכברים לא יקשרו להיתפס עם הרכזת המרכזית, שם העכברים מחליטים לאיזו זרוע ללכת. ברגע שהעכברים מכירים את המשימה, כולל ביקורי הזרוע הנוספים, הם יכולים לנוע בחופשיות ליד באר המזון האחרונה או לבלות זמן מה במרכז המרכזי. עם זאת, עליהם לסיים את 4 ביקורי הידיים הנוספים תוך 3 דקות. אם הם לא מסיימים אותו תוך 5 דקות, החזירו אותם לכלוב הביתי.
6. בחר את הכלוב הבא כדי להתאים את רמת העוררות על ידי הקשה על הכלוב לניסיון הבא.
7. נקה את המבוך כמתואר ב 6.4 (שלב התרגלות 1) (כ -2 דקות).
8. עברו לעכבר הבא וחזרו על כך 6 פעמים עבור כל עכבר בתורו למשך 9 ימים.
   הערה: משך הזמן הממוצע של ארבעת ביקורי הזרוע הנוספים אמור להתארך בניסויים מאוחרים יותר, מכיוון שעכברים לומדים לזהות מתי אין תגמולים נוספים זמינים או שאין זרועות חדשות שלא ביקרו להיכנס אליהן.

10. ניקוד

1. חשב "ציון שיעור הצלחה יומי" (%) = 4 (שערים) / (מספר כניסת זרוע כולל [4+ שגיאות]) x 100.
   הערה: לאחר הריצה הכפויה, רק ארבע זרועות מתמלאות בפרס, השערים. אם הם נכנסים לזרוע שהעכבר ביקר בה בריצה הכפויה, ספרו אותה כשגיאה אחת, כמו גם זרועות חוזרות בריצה החופשית.
2. חשב את "ציון יחס הניסיון המושלם" (%) ב-6 ניסיונות = [(מספר הניסיונות המושלמים) / 6 ] x 100
   הערה: ציון מושלם פירושו שאין שגיאה בזיכרון העבודה.
3. בחר מהירות, מרחק ותאוצה של העכבר בתוכנה לניתוח וחשב את הממוצעים לכל יום. הקפד לא לכלול את ארבעת ביקורי הזרוע הנוספים בניתוחים אלה. כמו כן, מדדו את משך ארבעת הביקורים הנוספים בזרוע על ידי סקירת סרטוני המעקב אחר העכבר לאחר הניסוי.
   הערה: עכברים יכולים לבצע סיבובים מהירים מיד לאחר הכניסה לזרוע. אל תספור ותציין את זה כערך, מכיוון שמדובר בתיקון טעויות מהיר, מה שאומר שזיכרון העבודה תקף⁴⁹. עם זאת, אם העכבר חוצה את נקודת האמצע של הזרוע או נשאר בזרוע יותר מ-3 שניות, ספור והבקיע את הכניסה. ציוני שיעורי ההצלחה היומיים מצביעים על עקומות הלמידה של העכברים, וציוני יחס ניסוי מושלמים מצביעים על יעילות שימור זיכרון העבודה.

11. סטטיסטיקה

1. אם בוחנים את ההבדל בין קו הבקרה לקו עכבר נוק-אאוט, כפי שנעשה בפרסום הקודם⁵⁰, בצע את הסטטיסטיקה כמתואר להלן.
   1. השווה את הנתונים שהתקבלו מקבוצות הביקורת והניסוי באמצעות מדידות חוזרות ANOVA דו-כיווניות עם ניתוח פוסט הוק (למשל, מבחן בונפרוני) [מדידת כל נבדק ב-9 נקודות זמן שונות].
   2. אם משווים קבוצות, בדקו לפחות 10 ורצוי ~20 עכברים בכל קבוצה. כאשר ההשפעה של מניפולציה גנטית, יצירת נגעים או טיפול תרופתי ברורה, גודל המדגם יכול להיות קטן יותר כדי להסיק אותו.

פרוטוקול זה שימש בפרסום הקודם שלנו, שבו שאלנו אם אוליגודנדרוציטים חדשים ומעטפות מיאלין נחוצים לביצוע משימות זיכרון עבודה מרחבי באמצעות עכברי MyRF cKO והבקרה50. מצאנו שביצועי מטלת זיכרון העבודה השתפרו בעכברי הביקורת, אך לא בעכברי MyRF cKO. משימת זיכרון העבודה עוררה וקידמה התפשטות והתמיינות של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים (OPCs), ומיאלינציה של אוליגודנדרוציטים (OL) באזורי המוח הקשורים לעיבוד זיכרון עבודה בעכברים מסוג בר. ביצענו גם את מטלת החילופין המתוגמלת של מבוך T כדי להעריך זיכרון עבודה מרחבי. משימה זו בוצעה כדי לזהות מחסור בזיכרון עבודה בעכברי MyRF cKO. עם זאת, לא נצפו הבדלים משמעותיים בניתוח ההיסטולוגי בין קבוצת העכברים שביצעה את משימת ההחלפה המתוגמלת במבוך T לבין קבוצת הביקורת בכלוב הביתי. לכן, הגענו למסקנה שהפרוטוקול המוצג כאן יעיל יותר ממטלת החילופין המתוגמלת של מבוך T לחקר זיכרון עבודה.

לכל עכבר היו 6 ניסיונות של מטלת זיכרון העבודה ביום שנמשכו שעה בסך הכל. לפיכך, פרוטוקול זה איפשר מקסימום 8 עכברים בעוקבה. בימים הראשונים של ההתרגלות, עכברים בילו זמן לא אחיד בזרועות המבוך, ותנועותיהם היו איטיות. הם נשארו בקצה הזרועות במשך זמן רב. עד לסוף היום החמישי של ההתרגלות במבוך, הם בילו זמנים משתנים בזרועות המבוך ויכלו לחזור למרכז המרכזי מבלי לגעת בתגמולים (איור 3A). אולם ביום השישי, חיות נכנסו לכל זרוע לפחות פעם אחת בתוך 8-15 דקות, בילו פרק זמן דומה בכל זרוע, מה שהצביע על כך שהחיות היו רגילות למבוך והיו מוכנות למשימה (איור 3A, השורה התחתונה של יום 6 ואיור 3B).

במהלך שלבי ההתרגלות, הם עמדו לעתים קרובות על גפיהם האחוריות והסתכלו למעלה מהזרועות או מהרכזת המרכזית. התנהגות דומה נצפתה במהלך מטלת זיכרון העבודה, אולם הם לא בהכרח הסתובבו באותו כיוון (למשל, 2 -> 3-> 5 -> 8 [עם כיוון השעון] או 8 -> 5 -> 3 ->2 [נגד כיוון השעון]). הם יכולים לשנות את כיוונם (למשל, 5 -> 4 -> 6 -> 1). לעכברים בודדים לא הייתה נטייה קהילתית נראית לעין לבחור את רצף הזרועות. עכברים נוטים להשקיע קצת יותר זמן בבחירת הזרוע המתוגמלת האחרונה מאשר הזרוע המתוגמלת הראשונה בריצה החופשית. זה היה כנראה בגלל שהיו להם ארבע אפשרויות לבחור מהן בבחירה הראשונה בריצה החופשית, ורק אפשרות אחת לפרס האחרון. הזרוע הראשונה בשלב הריצה הכפויה הוצגה לעכברים לפחות 50 שניות (15+15+15+5) לפני תחילת הריצה החופשית. לכן, מטלת זיכרון העבודה הזו לא הייתה קלה מאוד לביצוע ללא שגיאות זיכרון עבודה. סרטון משלים 1 מציג עכבר שעובר ניסוי מושלם ביום 8 של אימון מטלת זיכרון העבודה.

באמצעות כל אחת ממערכות הניקוד, מצאנו שהביצועים שלהם היו כמעט שטוחים בשלושת הימים הראשונים של תקופת בדיקת ה-RAM בת 9 הימים, אך השתפרו באופן ניכר לאחר מכן (איור 4A, B). לאחר 6 ימים של התרגלות ו-9 ימים של אימוני מבוך, עכברי C57BL/6 זכרים השיגו באופן קבוע ≥ 80% ציון שיעור הצלחה יומי מהיום ה-8, המוגדר כ-4/(4+E), כאשר E הוא מספר השגיאות. המרחק הממוצע שנסע בריצות החופשיות התקצר עם הזמן, אולם המהירות והתאוצה הממוצעות היו קבועות למדי מיום ליום (איור 4C-F). עכברים עשויים לפתח זיכרון פחד להיתפס במהלך ארבעת ביקורי הזרוע הנוספים, מה שיכול להיות אחת הסיבות לכך שעכברים בילו זמן רב יותר לקראת סוף הניסוי (איור 4G).

בפרוטוקול זה, שלבי ההתרגלות נמשכו 6 ימים, מה שיכול להוביל להתאמת שעון הגוף לניסוי, גם אם מחזור האור/חושך לא התהפך במתקן של בעלי חיים.

איור 1: מפרטים ומאפיינים של זיכרון RAM. (A) מראות של המבוך מה-CCD המותקן על התקרה ומהצד, והמידות. (B) באר המזון הייתה שקועה בעומק של 1.5 ס"מ מתחת למפלס רצפת המבוך כך שעכברים לא יכולים לראות את התוכן ממרחק של >10 סנטימטרים. (ג) הגדרת זירת מבוך. הרכזת המרכזית והזרוע 1-8 מוצגים. (D) סכימה של חדר הניסוי והרמזים החזותיים החיצוניים עם תצלום של החדר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דיאגרמות זרימה של תוכניות בקרת המבוך. (A) שלב התרגלות 1 (ימים 1 ו-2). (B) שלב ההתרגלות 2 (ימים 3 ו-4). (C) שלב ההתרגלות 3 (ימים 5 ו-6). (D) מטלת זיכרון עבודה (ימים 7-15). (E) סכימה של פרדיגמת מטלת זיכרון העבודה. עכברים עברו דרך ארבע זרועות הריצה הכפויה, שנבחרו באופן אקראי, היו מוגבלים ברכזת המרכזית למשך 5 שניות, ואז הלכו לריצה החופשית כדי לאסוף את התגמולים הנותרים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מפות חום ומפות קיני ציפורים במהלך ההתרגלות של 6 ימים. (A) מפות חום של מסלולי עכברים במהלך ימי ההתרגלות 1-6, עבור שלושה עכברים. בימי ההתרגלות 3-6, העכברים עברו שני ניסויים ביום; מפות החום העליונות מציגות את הניסויים הראשונים והתחתונות מציגות את הניסויים השניים. (B) מפות קן ציפורים ליום 6 להתרגלות. שלושת העליונים מציגים את הניסויים הראשונים ושלושת התחתונים מראים את הניסויים השניים של עכברים 1, 2 ו-3. הטבלה התחתונה מפרטת את משך הניסוי עבור אותם שלושה עכברים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מטלת זיכרון העבודה של זיכרון ה-RAM. (A) ציוני שיעור הצלחה יומיים ממוצעים (%) המחושבים על ידי [4/(מספר כניסות זרוע במהלך הריצה החופשית) x 100]. ממוצע הציונים מ-6 ניסויים היה לאותו יום. (ב) ציוני ניסיון מושלמים במהלך 9 ימי המשימה. (ג) מרחקים בודדים וממוצע. (D) מהירויות ריצה אינדיבידואליות של העכברים במטלה והממוצע. (E) תאוצות בודדות של העכברים והממוצע. (F) האטות אינדיבידואליות של העכברים והממוצע. (ז) משך זמן אישי וממוצע של 4 ביקורי הזרוע הנוספים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון משלים 1: העכבר עובר ניסוי מושלם ביום 8 של אימון מטלת זיכרון העבודה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: גיליון הקלטה לדוגמה. רשמו את רצף ביקורי הזרוע תוך כדי צפייה בהתנהגות העכבר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.