מאמר שיטה

בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

DOI:

10.3791/66458

⸱

26 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery and Laboratory of Pediatric Surgery, West China Hospital / West China School of Medicine, Sichuan University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר הליך שונה לבידוד מהיר של ביציות נקיות בשלב I בדגי זברה נטולות תאי גרנולוסה, ובכך מספק שיטה נוחה למחקר ספציפי לביציות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לחקר התפתחות הביציות השלכות משמעותיות בביולוגיה התפתחותית. דג הזברה (Danio rerio) נמצא בשימוש נרחב כאורגניזם מודל לחקר תהליכים התפתחותיים מוקדמים מביצית לעובר. בדגי זברה, הביציות מוקפות בשכבה אחת של תאי גרנולוזה סומטיים. עם זאת, הפרדת תאי גרנולוזה מביציות מציבה אתגר, שכן השגת ביציות טהורות חיונית לניתוח מדויק. למרות שהוצעו שיטות שונות לבידוד ביציות דגי זברה בשלבים התפתחותיים שונים, הטכניקות הנוכחיות אינן מצליחות להסיר תאי גרנולוזה לחלוטין, ומגבילות את הדיוק של ניתוח גנום המתמקד בביציות בלבד. במחקר זה פיתחנו בהצלחה תהליך מהיר ויעיל לבידוד ביציות טהורות בשלב I בדגי זברה תוך סילוק זיהום תאי גרנולוזה. טכניקה זו מאפשרת אנליזה ביוכימית ומולקולרית, במיוחד בחקר היבטים אפיגנטיים ומבנה גנומי ספציפיים לביציות. יש לציין כי השיטה ידידותית למשתמש, ממזערת את נזקי הביציות ומספקת פתרון מעשי למחקר וניתוח בהמשך.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה הוא בין מערכות המודל החשובות ביותר בביולוגיה התפתחותית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים השתמשו בדגי הזברה כמודל לחקר אירועים ביולוגיים חשובים ותהליכי בקרה מביצית לעובר. אלה כוללים את התהליכים המורכבים של התפתחות והבשלת ביציות1, הפונקציונליות של גנים אימהיים2, ויסות מעברים אימהיים-זיגוטיים3, וניתוחי אומיקס נרחבים4.

תאי גרנולוסה, התאים הסומטיים העוטפים ומזינים את הביצית המתפתחת בתוך זקיק השחלה 5,6, ממלאים תפקיד מרכזי בתהליך התפתחותי זה. כאשר תאי נבט קדמוניים (PGC) מתפתחים לאוגוניה, הם מוקפים בשכבה אחת של תאי גרנולוזה7. יחד עם תאי התא החיצוניים, הביצית ותאי הגרנולוזה הסובבים אותה מהווים זקיק בוגר8. בהתחשב בהבחנה הבסיסית בין תאי נבט לתאים סומטיים, השגת דגימת ביצית טהורה היא הכרחית, במיוחד עבור ניתוחים הקשורים לגנום.

בתוך המבנה הפוליקולרי של דגי זברה, תאי גרנולוזה מציגים בדרך כלל קוטר של מיקרון בודד8, מה שמדגיש את הקשר האינטימי בין תאי גרנולוזה לביציות9. קשר הדוק זה מציב אתגר בהשגת הפרדה מלאה בשל ההבדל הניכר הן במספר תאי גרנולוזה והן בנפחם לעומת הביציות (מאות תאי גרנולוזה לעומת ביצית בודדת)10,11. אפילו זיהום מינימלי עם תא גרנולוזה יחיד יכול לעכב ניתוחים במורד הזרם המתמקדים במיוחד בביציות. לכן, עבור מחקרים המתמקדים במאפיינים גנומיים ואפיגנטיים, חיסול תאי גרנולוזה הוא חיוני.

בעזרת קריטריונים מורפולוגיים מאופיינים היטב, ניתן להבחין בין ביציות בכל שלב על פי קוטר11. תהליך האוגנזה בדגי זברה מסווג לחמישה שלבים על פי מורפולוגיה וקריוטיפ11. ביציות שלב I (בקוטר 7-140 מיקרומטר) מקיפות ביציות מתחילת המיוזה ועד לשלב המוקדם של המיוזה I. באופן מכריע, הביציות האלה שקופות, ומאפשרות תצפית על הגרעין המרכזי באמצעות אור מועבר (איור 1Ai). ביציות שלב II (קוטר 140-340 מיקרומטר) הופכות בהדרגה מוקצפות ושקופות. עם הגדלת הזקיקים והתפשטות הנאדיות בקליפת המוח, קשה להבחין בין שלפוחיות הנבט במרכז12 (איור 1Aii). ביציות שלב III (קוטר 340-690 מיקרומטר) צוברות בהדרגה ויטלוגנין, וזקיקים טריים נעשים אטומים יותר ויותר (איור 1Aiii). מיוזה ממשיכה בשלב IV של הביציות (קוטר 690-730 מיקרומטר) כאשר הכרומוזומים נכנסים לאמצע המיוזה II, שם הם קופאים (איור 1Aiv). ביציות שלב V (קוטר 730-750 מיקרומטר) הבשילו והן מוכנות לביוץ 7,11 (איור 1Av).

בהתבסס על המאפיינים הייחודיים של כל אחד מהשלבים הנ"ל, הוצעה שיטה לבודד ביציות משלבים I עד III על ידי עיכול שחלות דגי זברה באמצעות תמיסת עיכול המכילה collagenase I, collagenase II והיאלורונידאז, ולאחר מכן סינון באמצעות מסננת תאים בגודל ספציפי13. עם זאת, בעוד שיטה זו מאפשרת קבלת ביציות בשלבים התפתחותיים שונים, היא אינה מצליחה להפריד לחלוטין ביציות ותאי גרנולוזה. חוקרים אחרים הציעו גם שיטות להפרדת תאי גרנולוזה מביציות. עם זאת, שיטות אלה מסתמכות בעיקר על גישות מכניות, אשר יכולות לגרום נזק לביציות, הן גוזלות זמן, ואינן מספיקות להשגת מספר משמעותי של ביציות לניתוח14,15.

בהתחשב במגבלות השיטות הקיימות ודרישות המחקר הספציפיות, מחקר זה שואף לבסס הליך להפרדה יסודית של ביציות ותאי גרנולוזה ולהשיג מספר מספיק של ביציות נקיות בשלב I לניתוח. בהמשך לשיטה13, אנו משתמשים בחיץ עיכול משופר (ראו טבלת חומרים) שהוא עדין יותר ומקל על פיזור הביציות ודיסוציאציה של תאי גרנולוזה. לאחר מכן, הביציות מועברות דרך מסננת תאים, ולאחר מכן שטיפה וברירה מיקרוסקופית נוספת, המאפשרת רכישת מספר רב של ביציות נקיות בשלב I.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל דגי הזברה טופלו בהתאם להנחיות מחמירות לטיפול בבעלי חיים שהותוו על ידי הגופים הלאומיים ו/או המקומיים הרלוונטיים לרווחת בעלי חיים. התחזוקה והטיפול בדגים קיבלו אישור הן מהרשויות המקומיות והן מוועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים מערב סין באוניברסיטת סצ'ואן (אישור מס' 20220422003). שחלות דגי זברה מכילות תערובת של ביציות רב-שלביות, כאשר כל שלב התפתחותי קיים בשחלות של דגי זברה בוגרים. עם זאת, דגי זברה צעירים נבחרו למחקר זה בשל הדומיננטיות של ביציות בשלב מאוחר (שלב II-III) בשחלות של דגים בוגרים, שהם גדולים ואטומים. לעומת זאת, לצעירים יש שחלות שטוחות ומוארכות המורכבות בעיקר מביציות בשלב I (איור 1B) (איור 1B). מחקרים קודמים הוכיחו כי המאפיינים המורפולוגיים של אוגנזה מוקדמת בדגי זברה בוגרים וצעירים עקביים ביותר, ותומכים בהיתכנות השימוש בדגי זברה צעירים13. ההליכים המתוארים להלן, המתוארים באיור 2, מספקים תיאור מפורט של תהליך הבידוד, החל מדיסקציה ועד לקבלת ביציות נקיות בשלב I. לעיון נוסף, הריאגנטים, המאגרים והציוד שנעשה בהם שימוש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. דיסקציה של השחלה

  1. בחר מספר נקבות דגי זברה באורך סטנדרטי (SL) הנע בין 10 מ"מ ל -15 מ"מ.
    הערה: ה-SL, הנמדד מהחוטם ועד בסיס הזנב במילימטרים, משמש כקריטריון אמין לבחירת דגים מתאימים. מומלץ להשתמש בדגים צעירים בין 5 ל -7 שבועות לאחר ההפריה (wpf) עם SL הנע בין 10 מ"מ ל -15 מ"מ עבור הליך זה. השחלות של דגי זברה צעירים תפוסים בעיקר על-ידי ביציות מוקדמות, מה שמספק תנאים אופטימליים להשגה קלה של ביציות בשלב I (איור 1B).
  2. הרדימו את נקבות הדגים הצעירים על ידי הכנסתם למים קרים כקרח (0-4 מעלות צלזיוס).
    הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים כדי להבטיח המתת חסד ולמזער את הכאב שחווים דגי זברה במהלך המתת חסד: לאשר כי הטמפרטורה של המים הקרים כקרח נמצאת בטווח 0-4 מעלות צלזיוס באמצעות מדחום, להעביר במהירות את דגי הזברה למים הקרים כקרח, ולשמור אותם במים קרים כקרח לפחות 10 דקות לאחר הפסקת התנועה הניתוחית16, 17,18.
  3. יש לייבש עודפי מים על פני הדג באמצעות נייר סופג.
  4. נתחו את דגי הזברה תחת סטריאומיקרוסקופ על ידי ביצוע השלבים הבאים:
    1. חותכים את הראש באמצעות מיקרו-מספריים לאורך השוליים האחוריים של כיסוי הזימים; חותכים את הזנב לאורך הקלואקה. מעבירים את תא המטען האמצעי לצלחת בקוטר 35 מ"מ המכילה 2 מ"ל L-15 בינוני (עם L-גלוטמין).
    2. לנתח את תא המטען האמצעי בתווך L-15. חותכים לאורך הציר המרכזי של הבטן ומסירים את הקרביים ואת שלפוחית השתן.
      הערה: הקרביים של דגי הזברה מחוברים. לכן, צבטו את המעי האחורי ליד אזור פי הטבעת והרימו אותו כדי להסיר בקלות את כל המסה הקרבית.
    3. נתקו את השחלות הדו-צדדיות מהבטן באמצעות פינצטה. הסר את רקמת השומן, הקשקשים ורקמות גוף אחרות המחוברות לשחלה.
      הערה: השחלות מכוסות ברקמת שומן. לכן, עדיף להסיר אותם יחד כדי למנוע נזק מכני לביציות.
      אזהרה: טפל בפינצטה בזהירות כדי למנוע פציעה.

2. עיכול

  1. מעבירים את השחלות לצלחת בת 6 בארות המכילה 2 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה של תאי קינגר ודגרים במשך 2-3 שעות ב 28.5 מעלות צלזיוס. נערו את צלחת 6 הבארות כל 30 דקות כדי לקדם פיזור.
    הערה: השתמש בפינצטה כדי להפריד את השחלות לגושי רקמות קטנים כדי לשפר את יעילות העיכול. זמן העיכול משתנה; ניטור קבוע וסיום התהליך כאשר מספר משמעותי של ביציות שלב I מפוזרות מתחת לסטריאומיקרוסקופ. פתרון הדיסוציאציה התאית של קינגר הוא פתרון העבודה וניתן להשתמש בו ישירות. ניתן לאחסן אותו ביציבות בטמפרטורה של -20°C לאחר האריזה ולהפשיר אותו בטמפרטורה נמוכה (4°C) לפני השימוש.
  2. הוסף L-15 בינוני שחומם מראש ב 28.5 ° C למאגר העיכול כדי לעצור את העיכול.

3. סינון

  1. הכניסו מסננת תאים של 100 מיקרומטר לבאר אחרת של צלחת 6 הקידוחים, הוסיפו מדיום L-15 וודאו שהרמה הבינונית גבוהה יותר מהמסנן.
    הערה: הקוטר התיאורטי של הביציות בשלב I הוא פחות מ-140 מיקרומטר. עם זאת, ביציות בקטרים גדולים יותר עדיין עשויות לעבור דרך מסננת התא. לכן, מסננת תאים בקוטר קטן יותר מהמטרה נבחרה בשלב זה. ניתן להתאים את גדלי הרשת בהתאם לצרכים הניסיוניים הספציפיים.
  2. ציירו את מדיום העיכול דרך מסננת התא באמצעות פיפטה. המתינו 1-2 דקות עד שכל הביציות בשלב I עברו דרך המסננת, ואז הסירו אותן. ודא כי הביציות נשארות בנוזל לאורך כל תהליך ההחזרה.
    הערה: שמירה על הביציות בתווך מסייעת לשמור על שלמותן ועל מצבן האופטימלי. אם הביציות נחשפות לאוויר לתקופה ממושכת, הן עלולות להתייבש ולהיפגע, מה שישפיע על יעילות ההפרדה הסופית. שמור את פיפטה מתחת לפני השטח הנוזליים בעת העברת הביציות דרך מסננת התא במקום להוסיף אותם בצורה מרחפת.

4. כביסה

  1. מוציאים את עודפי המדיום בעזרת פיפטה. מוסיפים 4 מ"ל של מדיום L-15 טרי ומרחפים בעדינות את הביציות. המתינו 1-2 דקות, ואז הסירו את הסופרנטנט.
    הערה: השתמש במכשירים בעלי תכונות הדבקה נמוכות כדי למנוע נזק לביציות.
  2. חזור על שלב 4.1 5-6 פעמים עד שלא יהיו זיהומים אחרים.
    הערה: טיפול עדין במהלך תהליך הכביסה חיוני כדי למנוע נזק לביציות. למרות קבלת שפע של ביציות בשלב I (כ-200-400 ביציות שלב I מדגי זברה אחד) לאחר שלבי השטיפה הקודמים, הביציות עדיין עשויות להיות מעורבבות עם שברי תאים, ביציות משלבים אחרים, או גרגירים קטנים שנוצרו על ידי ביציות שבורות בשלב מאוחר. בנוסף, חלק מתאי הגרנולוזה עדיין עשויים להיצמד לפני השטח של מספר ביציות עקב עיכול אנזימי חלקי. לכן, עבור יישומים הדורשים רמת טוהר גבוהה יותר, כגון ריצוף גנום, נדרשים צעדים נוספים לבחירת ביציות נקיות לחלוטין. כדי לטפל בכך, המשך לשלבים 5 ו- 6.

5. בחירה לבקרת איכות

  1. מעבירים את הביציות השטופות בשלב I לצלחת בקוטר 35 מ"מ המכילה מדיום L-15 טרי.
  2. תחת מיקרוסקופ עם הגדלה שווה או עולה על פי 10, הסר שברי תאים, ביציות בשלב אחר וביציות שלב I המודבקות על ידי תאי גרנולוזה באמצעות כלי שניתן לתפעל בדייקנות, כגון מחט הזרקה קהה.
    הערה: שלב זה דורש סבלנות מהנסיין, אך הוא מבטיח בידוד של ביציות נקיות ושלמות.
    אזהרה: טפל במחטי הזרקה בזהירות כדי למנוע פציעה.

6. אישור על ידי צביעה גרעינית

הערה: לצורך חידוד נוסף של הביציות המבודדות, נעשה שימוש בצביעה עם Hoechst 33342 כדי לזהות ולהסיר ביציות בודדות שהודבקו בתאי גרנולוזה שאולי הוחמצו בשלב הקודם.

  1. הוסף ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 למדיום L-15 ודגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  2. התבונן בפלואורסצנטיות Hoechst דרך מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת עירור לייזר UV.
    הערה: Hoechst מעורר בדרך כלל באזור אולטרה סגול, בדרך כלל באורכי גל בין 310 ל 360 ננומטר. מומלץ להשתמש בהגדלה בין 80x ל 100x בתהליך זה. השתמש במצב החשיפה האוטומטי. ניתן להתאים את אורך גל העירור וזמן החשיפה בהתבסס על מודל המיקרוסקופ הספציפי והדרישות האישיות.
  3. באמצעות מחט, בזהירות לבחור את הביציות שאינן עומדות בקריטריונים הרצויים.
    הערה: בעת הדמיה של התאים, כרומטין גרעיני גדול נמצא במרכז הביצית. אם תאי גרנולוזה היו נצמדים לביצית, גרעינים קטנים ובהירים היו נראים לעין, נצמדים לקצה הביצית (איור 3). בחר אותם מתחת למיקרוסקופ.
  4. יש לשטוף ביסודיות ובאופן חוזר ונשנה את הביציות עם L-15 כדי להסיר עודפי Hoechst.
  5. השתמש בביציות בשלב I שזוהו ישירות לשאיבה לאחר מכן או אחסן אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחר הקפאת הבזק בחנקן נוזלי.
    אזהרה: יש ללבוש מסכת מגן וכפפות קריוגניות בעת טיפול בחנקן נוזלי ובמקפיאים בטמפרטורה נמוכה במיוחד.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מדגים את המורפולוגיה השחלתית שנצפתה גם בדגי זברה בוגרים וגם בדגי זברה צעירים, ומציג ביציות בשלבי התפתחות שונים כדי לשמש כנקודת התייחסות. איור 1A מספק ייצוג גרפי של המורפולוגיה והגודל של הביצית בכל שלב התפתחותי, החל משלב הגדילה הראשוני (שלב I) וכלה בשלב הביצית המבייצת (שלב V). איורים 1Ai-v ממחישים את הקטרים המתאימים לשלבים I עד V של הביציות. איור 1B (פאנל שמאלי) מציג תמונות שחלות בדגים צעירים (6 wpf עם SL = 1.5 ס"מ). יש לציין כי השחלה הצעירה מציגה מראה לובולרי מובהק, המאופיין בעיקר בשפע של ביציות שקופות בשלב I, המלוות באוכלוסייה קטנה יותר של ביציות שלב II. שכיחות זו של הביציות בשלב I מקלה מאוד על ההתבוננות והשאיבה שלהן. הפאנל הימני מתאר את המורפולוגיה של שחלה הדג הבוגר (6 חודשים), שם ניתן לצפות בביציות בשלבי התפתחות שונים. עם זאת, ביציות אטומות בשלב מאוחר (שלב II-III) הן הדומיננטיות בשחלה.

איור 2 מדגים את התהליכים המייצגים משלב הדיסקציה ועד לקבלת ביציות נקיות בשלב I. איור 3 מציג ביציות שלב I שהתקבלו גם בשיטת הייחוס וגם בשיטה שעברה שינוי. בעקבות צביעת הוכסט, גרעיני הביצית ותאי הגרנולוזה הציגו פלואורסצנטיות כחולה תחת אור UV. בתמונות שהתקבלו בשיטת הייחוס (איור 3A), פני השטח של הביציות היו מוקפים בצפיפות בגרעיני תאי גרנולוזה מוכתמים רבים. לעומת זאת, ביציות שלב I המופרדות בשיטה המותאמת (איור 3B) מציגות חשיפה וניקיון מלאים, ללא צביעת גרעיני תאי גרנולוזה.

הממצאים הדגימו את יעילות השיטה המוצעת לבידוד ביציות שלב I. תהליך ההתפתחות של ביציות בדגי טלאוסט מציג מספר מאפיינים משותפים7. כדי להעריך את תחולתו בין המינים, נערכו ניתוחים נוספים על מיני דגים אחרים. נקבות בריכות נרכשו משוק מקומי, וביציות בשלב מוקדם (קוטר <100 מיקרומטר) בודדו באותו הליך. ההרכב השחלתי של לוך הבריכה הציג גם תערובת של ביציות בשלבים התפתחותיים מרובים, המאופיינים בדמיון בולט במורפולוגיה ובגודל הביציות לזה של דגי הזברה באותו שלב. כפי שמודגם באיור 4A, השחלות של נקבות בריכה בוגרות נשלטו על-ידי ביציות מאוחרות אטומות ששולבו בביציות מוקדמות שקופות. שכבה אחת ברורה של תאי גרנולוזה נצפתה על פני השטח של הביציות. בהתאם לתצפיות שלנו בדגי זברה, ביציות הלואץ' בקוטר של פחות מ-100 מיקרומטר התאימו לשלב שלפני שלב הדיפלוטן. איור 4B מתאר את הביציות הנקיות של הבריכה (Misgurnus anguillicaudatus) שהתקבלו בשיטה שעברה שינוי. בהשוואה לשחלות דגי זברה, שחלות לוך הבריכה מאתגרות יותר לניתוק. לאחר 6-7 שעות של עיכול, יותר ביציות בשלב מוקדם להתנתק. עם זאת, גישה מותאמת זו הניבה את הביציות הנקיות והעירומות הרצויות. דגי זברה שייכים למשפחת Cyprinidae, בעוד שדגי בריכה מסווגים במשפחת Cobitidae. שתי משפחות אלה מציגות קשר טקסונומי מרוחק, אך שלב התפתחות השחלות והמורפולוגיה שלהן דומים להפליא, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בשיטה זו בדרך כלל לניתוח ביציות של מיני דגים שונים.

figure-results-1
איור 1: תמונות מייצגות של שחלות וביציות של דגי זברה בשלבים שונים. (A) מורפולוגיה וגודל הביציות בכל שלב התפתחותי (St). i-v מייצג את התמונות והקוטר של הביציות משלב I עד V. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) מורפולוגיה שחלתית של דגי זברה בוגרים וצעירים. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות מייצגות של הליך הבידוד, מדיסקציה ועד רכישת ביציות נקיות בשלב I. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ביציות שלב I שהושגו בשתי השיטות. (A) ביציות שלב (St) I שבודדו בשיטה הנזכרת. (B) ביציות שלב I שבודדו בשיטה שעברה שינוי. גרעיני הביצית ותאי הגרנולוזה הוכתמו ב-Hoechst והתרגשו מאור UV. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. BF = שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ביציות בשלב מוקדם מלואץ' בריכות שהתקבלו בשיטה שעברה שינוי. (A) תמונות מייצגות של שחלות וביציות של שחלות וביציות של שחלות בריכה. i, ii מייצג את השחלות של לואש בריכות תחת הגדלות שונות, ו- III-IV מייצג את הביציות בשלב מוקדם של לואש בריכות. מוטות קנה מידה: i (500 מיקרומטר); II (200 מיקרומטר); III, IV (100 מיקרומטר). (B) ביציות בשלב מוקדם שבודדו מלואץ' בריכות. הביציות וגרעיני תאי הגרנולוזה הוכתמו ב-Hoechst ועוררו באור UV. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. BF = שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה פיתחנו שיטה לבידוד ביציות טהורות ונקיות בשלב I, למעט תאי גרנולוסה, לצורך אנליזה במורד הזרם (במיוחד אנליזות גנומיות). בהשוואה בין שיטה שונה זו לשיטה13 הנזכרת, הביציות בשלב I המתקבלות בשיטה זו שלמות מורפולוגית, מספיקות במספרן וללא זיהום עם תאים סומטיים אחרים, מה שהופך אותן מתאימות למחקרים וניתוחים שונים לאחר מכן. יתר על כן, בהשוואה לשיטות הפרדה מכניות אחרות14,15, השיטה המשופרת פשוטה יותר לתפעול, מאפשרת רכישת מספר גדול יותר של ביציות ומונעת נזק לביציות.

יתר על כן, בנוסף לבידוד יעיל של ביציות דגי זברה שלב I, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על לוקים בריכות, מה שמצביע על תחולתה הרחבה בקרב מגוון מיני דגים. כדי לחקור את ההשפעה של זיהום תאי גרנולוזה על ביטוי גנים וניתוח אפיגנטי, ערכנו ריצוף RNA (RNA-seq) וניתוח CUT&Tag על ביציות שהתקבלו בשיטות הייחוס והשינוי. למרות שכמה גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי זוהו על ידי RNA-seq, כמה גנים שהתבטאו באופן ספציפי בתאי גרנולוזה עדיין זוהו (הנתונים לא מוצגים). הניתוח גילה גם הבדלים משמעותיים בשינויים בהיסטון בין ביציות שבודדו בשיטות שונות (הנתונים לא הוצגו). תוצאות אלה מדגישות את חשיבותה של שיטה זו בהפרדה מוחלטת של ביציות ותאי גרנולוזה לצורך ביטוי גנים מדויק וניתוח אפיגנטי.

מספר היבטים דורשים תשומת לב בעת יישום השיטה המוצעת: (1) בחירת הגודל המתאים של דגי זברה היא קריטית. זה מבטיח כי מספיק ביציות מתקבלות ומפחית את שלבי הכביסה הבאים. השחלות של דגי זברה עם SL <10 מ"מ אינן מספקות מספיק ביציות, ולכן דורשות מספר גדול יותר של דגים כדי לעמוד בדרישות הדגימה ולחץ רבייה גובר. לעומת זאת, דגי זברה עם SL גדול מ -15 מ"מ מציגים היווצרות הדרגתית של ביציות שלב II-III, שהקרומים שלהם נשברים בקלות במהלך תגובת העיכול. (2) כאשר משתמשים בדגים גדולים יותר, דליפה של תוכן תאים כתוצאה מביציות פגומות עלולה להוביל לזיהום, ובכך לעכב את תגובת העיכול במידה מסוימת. במקרים כאלה, מומלץ להסיר את חיץ העיכול הישן, לשטוף אותו עם L-15, ולאחר מכן להוסיף פתרון חדש של דיסוציאציה של תאי קינגר להמשך העיכול. (3) אם קיים ציוד מתאים, טלטול במהלך העיכול יכול להגביר את ההפרדה.

בשלב 3.1, תאי גרנולוזה קטנים יותר עשויים ללוות ביציות דרך מסננת התא. עם זאת, תצפיות מעשיות מצביעות על כך שדגימת הביצית הסופית שנאספה אינה מכילה תאי גרנולוסה. למעט במקרים בהם עיכול לא שלם הביא לנוכחות של שאריות תאי גרנולוזה בחלק מהביציות, לא זוהו במערכת תאי גרנולוזה אחרים המסומנים על ידי Hoechst. כאן, שיערנו כי תאי גרנולוזה, בהיותם קטנים וקלים יותר, עשויים להישאר תלויים בתווך התרבית ולאחר מכן הוסרו במהלך שלבי השטיפה המרובים. יעילות הבידוד כומתה גם על ידי חישוב שיעור הביציות עם חיבור תאי גרנולוזה וביציות נקיות לאחר צביעת הוכסט. שיעורי ביציות נקיות של עד 98% נצפו בדגימות המכילות 1000 ביציות.

למרות יתרונותיה הרבים, לגישה המוצעת היו גם כמה מגבלות ראויות לציון. ראשית, שיטה זו אומתה לצורך מיצוי DNA או RNA, ריצוף וזיהוי מיידי של תאים חיים שלמים, אך ההיתכנות והאמינות של התרחבות לאזורי בדיקה אחרים טרם אומתו. מגבלה נוספת היא שניתן ליישם את השיטה המוצעת רק לבידוד ביציות שלב I, שכן יעילות הבידוד לשלבים אחרים אינה מספקת. לפיכך, נדרשים מאמצים נוספים לשיפור היעילות והישימות של השיטה המוצעת. בנוסף, מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בבחינה האם ניתן ליישם את השיטה המוצעת כדי לבודד ביעילות ביציות משלבים אחרים, ובכך להרחיב את תחולתה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170813 ו- 31871449) ומחלקת המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2024NSFSC0651), ופרויקט 1.3·5 לדיסציפלינות של מצוינות - קרן מחקר קליני, בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (2024HXFH035). המחברים רוצים להודות לג'או וואנג וליאנצ'יו גאו מהמעבדה לכירורגיית ילדים על גידול דגי זברה הקשורים לעבודה זו. המחברים מבקשים להודות גם לכל הסוקרים שהשתתפו בסקירה, כמו גם ל-MJEditor (www.mjeditor.com) על מתן שירותי עריכה באנגלית במהלך הכנת כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת דיסוציאציה של תאים של קינגרPlantChemMedPC-33689ניתן לאחסן ביציבות ב-20 מעלות; C לאחר האריזה וניתן להשתמש בו לאחר הפשרה בטמפרטורה נמוכה (4 ° C). ניתן להשתמש בו ישירות לניתוק שחלות דג הזברה. הטמפרטורה האופטימלית היא 28.5 מעלות; C, למשך כ 2-3 שעות. ניתן להתאים את משך הזמן בהתאם לתנאי הדיסוציאציה הספציפיים, מקוצרים או מורחבים (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
מסנני תאים (100 μ m )Falcon352360
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeissAxio Zoom.V16
מלקחייםDumont#5
מחט נימית מזכוכית/קהה על ידי צריבה עם מצית
HoechstYesen40732ES03
קצות פיפטה ספיחה נמוכה (10 μ l )LabsellectT-0010-LR-R-S
Leibovitz' s L-15 בינוני בינוני (עם L-גלוטמין)HycloneSH30525.01
דלי קרח//מים קרים כקרח משמשים להמתת חסד של דג זברה
אינקובטורWIGGENSWH-01
דג צעיר//5– 6 שבועות לאחר ההפריה, אורך סטנדרטי [SL] של 10– צלחת פלסטיק 15 מ"מ
(35 מ"מSORFA230101
סטריאומיקרוסקופמוטיSMZ-161
צלחת תרבית רקמות (6 בארות)SORFA0110006
Vannas מספריים קפיצייםמדע עדיןToosl#15000-00
/)

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304(2021).
  2. Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385(2020).
  3. Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).
  4. Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014(2022).
  5. Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
  6. Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
  7. Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
  8. Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).
  9. Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
  10. Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
  11. Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
  12. Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
  13. Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
  14. Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
  15. Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
  16. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  17. Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

L 15

מאמרים קשורים