מאמר שיטה

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66461

⸱

9 בפברואר 2024

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

במאמר זה

סיכום

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

תקציר

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme (DNM) לזיהוי רצפי DNA ו-RNA (אנליטים) הם מבנים רב-תכליתיים העשויים מאוליגונוקלאוטידים. תפקידיהם כוללים קשירת אנליטים הדוקה, זיהוי אנליטי סלקטיבי ביותר, הגברת אות פלואורסצנטי על ידי שסעים קטליטיים מרובים של מצע כתב פלואורוגני, ומשיכה של מצע פלואורוגני להגברת תגובת החיישן. יחידות פונקציונליות מחוברות לפיגום DNA משותף לצורך פעולתן המשותפת. 10-23 DNMs החותכים RNA מתאפיינים ברגישות משופרת בהשוואה לבדיקות הכלאה לא קטליטיות. יציבות הדנ"מ והסיכוי המוגבר לזיהוי המצע מסופקים על ידי מקטע דנ"א דו-גדילי, אריח. DNM יכול להבדיל בין שני אנליטים עם הבדל נוקלאוטיד יחיד ב-RNA מקופל ובדנ"א דו-גדילי ולזהות אנליטים בריכוזים ~1000 נמוכים פי 1000 מבדיקות הכלאה אחרות ללא חלבון. מאמר זה מציג את הרעיון מאחורי הפוטנציאל האבחנתי של פעילות DNA-nanomachine וסוקר תכנון, הרכבה ויישום של DNM במבחני זיהוי חומצות גרעין.

מבוא

אחת השיטות המוקדמות ביותר לזיהוי חומצות גרעין היא קשירה משלימה של אוליגונוקלאוטידים סלקטיביים לרצפי RNA או DNA שנותחו. שיטה זו משתמשת במקטעי חומצות גרעין (גשושים) שיכולים ליצור זוגות בסיס ווטסון-קריק עם DNA ממוקד או RNA אנליטי1. לאחר מכן הקומפלקס נבדל מן האנליט והגשושית הבלתי קשורה על ידי מגוון טכניקות. שיטות מסוימות, כגון כתם צפוני, הכלאה באתרו , או qPCR, מבוססות על תופעת הקשירה המשלימה2. לגשושיות ההכלאה הנפוצות ביותר יש שני חסרונות משמעותיים: רגישות נמוכה (הן יכולות להגיע לרמות מיקרומולאריות עד ננומולריות) וכן סלקטיביות נמוכה לווריאציות של נוקלאוטידים בודדים (SNV), כולל מוטציות נקודתיות. הנושא דורש גישה מתוחכמת, שכן הפתרונות לחסרונות אלה מתנגשים זה בזה3. כדי לספק את הסלקטיביות הטובה ביותר, האוליגונוקלאוטיד המזהה צריך להישמר קצר מספיק כדי ליצור היברידים לא יציבים עם אנליטים לא תואמים. אוליגונוקלאוטידים קצרים כאלה אינם מסוגלים לקשור חומצות גרעין ממוקדות בחוזקה ולהרפות את המבנים המשניים שלהן, ולכן לעתים קרובות אינם מצליחים לספק אות הניתן לזיהוי. זה מאתגר במיוחד לזהות מקטעים עשירים ב-CG ב-RNA ביולוגי, או DNA דו-גדילי (dsDNA). מצד שני, בדיקות ארוכות אינן רגישות ל- SNV3. כדי לשבור את הקיפאון, הרעיון של בדיקה בינארית פותח4.

חיישנים בינאריים מפצלים גשושית גילוי אחת לשני חלקים ומתמחים במקטעים שלה, ושומרים על אחד מהם זמן רב כדי לשחרר את סיכות השיער או לפלוש ל-dsDNA. מקטע הגשושית הבינארי השני נשאר קצר כדי להיות רגיש לבסיס לא תואם, ובכך מספק אמצעי לגילוי SNV. האות יופק אם שני חלקי החיישן הבינארי מחוברים יחד4. ניתן להמחיש את הקומפלקס המלא באמצעות FRET5, בדיקת משואות מולקולרית 6,7, או G-quadruplexes עם פעילות דמוית פרוקסידז 8,9,10, או אחרת DNAzyme 11,12,13 RNA. חיישנים בינאריים עם ליבת DNAzyme 10-23 תוארו היטב. הם הותאמו לאיתור שברי חומצות גרעין חד-גדיליות שנוצרו באופן סינתטי11, או תוצרי הגברה חד-גדיליים 14,15. גילוי ללא הגברה אפשרי גם, למשל, במקרה של 16S rRNA המופק מתרבית תאים, שכן מולקולה זו נמצאת בשפע בתאים12,16. חיישנים בינאריים עם ליבת DNAzyme 10-23 יכולים להיות מותאמים גם לזיהוי חומצות שאינן גרעיניות, כגון עבור יוני עופרת17. עם זאת, רגישות נמוכה עדיין נחשבת לאחד החסרונות העיקריים של חיישני DNAzyme בינאריים 10-23, וגישות שונות, כולל מפלים18 או שיטות חלופיות לשיפור אותות19, פותחו כדי לטפל בבעיה זו. למרבה הצער, הטכניקות הנ"ל מגדילות באופן דרסטי את העלות וחוסר היציבות של רכיבי החיישן, ולכן הן לא נכנסו לפרקטיקה.

הניסוי המתואר בעבודה זו משתמש ב-10-23 ננו-חיישנים מבוססי DNAzyme המכונים DNA-nanomachines (DNM)20,21. המבנים האלה כוללים חיישנים בינאריים וגם (1) מנחי דנ"א שמאגפים את הגשושית הבינארית, משחררים את האזורים המובנים ופולשים לדנ"א דו-גדילי, ו-(2) אריח דנ"א שמחזיק את כל חלקי הדנ"א יחד בסמיכות ומגדיל את הסיכוי להיווצרות אותות (איור 1). בסך הכל, 10-23 DNM מבוססי DNAzyme מפחיתים את גבול הגילוי (LOD) עד לטווח הפיקומולרי21; הם יכולים לשמש כדי לזהות 16rRNA בתא lysates22 או לדווח על נוכחות של RNA נגיפי ללא הגברה 23,24. יחד עם זאת, הדנ"מ נשאר רגיש ל-SNV ואף יכול לשמש לגנוטיפ אללים באורגניזמים הטרוזיגוטיים25. שיטת DNM יכולה לשמש כטכניקה משלימה לכל סוג הגברה להדמיית המוצר או זיהוי המוצר בתערובת מורכבת עם סלקטיביות גבוהה. ה- DNMs, שלא כמו בדיקות TaqMan ומשואות קונבנציונליות, אינם דורשים חימום של הדגימה ולכן ניתן להשתמש בהם בפרוטוקולי זיהוי נקודות קצה, מה שהופך את הזיהוי הכולל לחסכוני.

מאמר זה מתאר את הפיתוח בסיליקו של DNM ומדגים נהלים להרכבה ואפיון פונקציונלי של DNM. העבודה בוצעה באמצעות מקטע סינתטי של וירוס אפשטיין-בר (EBV) המתאים למיקומים 13972-14154 של הדנ"א הנגיפי (OR652423.1) (ראה טבלת חומרים).

פרוטוקול

1. תכנון DNM

  1. בחר אזור ייחודי בתוך הגנום המעניין.
    הערה: עבודה זו משתמשת באזור בגנום של וירוס אפשטיין-בר (EBV) במיקומים 13972-14154 (OR652423.1).
  2. צור ערכת פריימר להגברה של המקטע שנבחר, לדוגמה, באמצעות הכלי Primer3 המוטבע ב- Ugene26.
  3. פתח את כלי האינטרנט UNAFold27 (ראה רשימת חומרים) והוסף את האזור שנבחר. שנו את טמפרטורת הקיפול ל-55°C, ואת התנאים היוניים ל-250 מילימול של יונים חד-ערכיים, ו-200 מילימול של Mg2+.
    1. פתח את המבנה המשני המתקבל של מקטע ssDNA ובחר סיכת שיער יציבה. אתר את אתר הקישור של ננו-מכונות הדנ"א באזורים הבלתי מובנים או, לחילופין, על הלולאות של מבני סיכות הראש כדי להשיג קשירה חזקה יותר של המטרה.
  4. אם אתר האנליטה הממוקד מקופל במבנה של לולאת גזע, מקם את זרוע 1 ו-2 באופן הבא: ודא שזרוע 2 קושרת צד אחד של הגבעול, הלולאה ו-3-5 nt של צד הגבעול השני; זרוע 1 קושרת שבר של צד הגבעול השני.
  5. פתח את הכלי DinaMelt28 (ראה טבלת חומרים) ונתח את רצפי הזרועות ואת רצפי המשלים ההפוכים שלהן. השתמש בכלי DinaMelt כדי לוודא שה- Tm של זרועות 2 ו- 3 הוא מעל 65 ° C: לפחות 10 ° C מעל טמפרטורת הבדיקה (55 ° C).
    1. שמור על Tm של זרוע 1 לפחות 1-3 ° C מעל טמפרטורת התגובה (55 ° C) אם סלקטיביות זיהוי גבוהה תושג29.
  6. שלבו רצפי זרועות 1 ו-2 עם חצאי ליבת ה-DNAzyme ומקטעי הקישור F-sub13.
  7. נתח את המבנה המשני של גדילי הדנ"א המתוכננים באמצעות UNAFold27.
    הערה: 55°C (טמפרטורת בדיקה), 200 mM Mg2+, 250 mM יונים חד-ערכיים (HEPES, Na+, K+).
    1. השתמש בעיצוב רק אם ΔG המתקפל נמוך מ - 4 קק"ל / מול. נסו להימנע מרצפים ארוכים עשירים ב-CG. אם המבנה המשני יציב מדי, הציגו מוטציה לזרוע כדי להגדיל את ΔG30 המתקפל. לחלופין, הצבת זרוע 3 2-3 nt הרחק מזרוע 2 היא אסטרטגיה נוספת לשינוי רצף זרוע 3 כדי למנוע מבנים בין-מולקולריים יציבים.
  8. צור רצף אקראי למקטע אריח DNA ארוך כמו זרוע 3. שלב את רצף Arm 3 עם רצף אריחי DNA באמצעות (dT)4-6 או אתילן גליקול (למשל, טריאתילן גליקול (TEG) או הקסאתילן גליקול (HEG)). גרסת ה-DNM שהוצגה בניסוי משתמשת ב-(dT)6.
  9. קשר את זרוע 2 עם הרצף המשלים למקטע אריח ה- DNA שנבחר בשלב 1.8 באמצעות מקשר.
  10. נתח את המבנה המשני של גדילי ה- DNA המעוצבים באמצעות אפליקציית האינטרנט UNAFold. ודא שאנרגיית הקיפול של כל גדיל DNA היא מעל 4 kJ/mol ב- 55 ° C, והימנע מרצפים ארוכים מועשרים ב- CG. רצוי, לשנות את רצף אריחי ה- DNA.
  11. צייר את המבנה באמצעות כל תוכנת גרפיקה וקטורית זמינה. מאמר זה משתמש ב- Biorender וב- Pixelmator Pro לתצוגה חזותית (ראה טבלת חומרים). ודא את הדיוק בכיוונים 5'->3' עבור כל גדיל.
    הערה: השג את הרצפים מספק מסחרי אמין.

2. בדיקה פונקציונלית של ה- DNM

  1. הכנת חיץ וריאגנטים
    1. הכן את מאגר התגובה המורכב מ- 50 mM HEPES (pH 7.5-7.8), 50 mM NaCl, 150 mM KCl ו- 200 mM MgCl2. ממלאים במים נטולי יונים, עד 50 מ"ל.
    2. הכן 10 מיקרומטר aliquots של Dzb-Tile ו Tile-Arm3 oligonucleotides. הכן תמיסת 1 מיקרומטר של Dza, 100 מיקרומטר F-sub, ו 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 ננומטר אנליטים ב RNase / מים חופשיים או מים סטריליים deionized. הפרטים של רצפי האוליגונוקלאוטידים מופיעים בטבלת החומרים.
  2. הרכבת DNM
    1. הפשירו לחלוטין את תמיסות האוליגונוקלאוטיד לפני השימוש. ערבבו בעדינות על ידי הקשה (אין לערבל באופן אינטנסיבי). סובב למטה (במהירות, למספר שניות) את הפתרון באמצעות מיקרוצנטריפוגה.
    2. ערבב 1 מיקרומטר כל אחד של Dzb-Tile ו- Tile-Arm3 ב- 200 μL של מאגר התגובה בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 0.5 מ"ל.
    3. מערבבים את הצינור בעדינות ומסובבים את התמיסה.
    4. עוטפים את מכסה הצינור הסגור בסרט פרפין. לחלופין, השתמש בצינורות מכסה בורג.
    5. דוגרים על הצינור לתוך 500 מ"ל עם מים רותחים למשך 2 דקות, ואז מכבים את תנור החימום ונותנים לטמפרטורה להתקרר באופן פסיבי למשך הלילה.
    6. הכינו את 12% ה-PAGE המקורי: ערבבו 1 מ"ל של 10х TBE buffer, 3 מ"ל של 40% AA:BA, מים נטולי יונים, עד 10 מ"ל, 50 μL של APS ו-5 μL של TEMED (ראו טבלת חומרים). מעבירים את התערובת לקסטת הג'ל ונותנים לה להתפלמר.
    7. מערבבים 1 μL של כל דגימה, כלומר, DNM מורכב, Dzb-Tile, ו Tile-arm3, עם 1 μL של 4x טעינת צבע לטעון אותם לתוך ג'ל.
    8. הכניסו את הקלטת לתא, מלאו אותה במאגר TBE 1x ותנו לג'ל לפעול במשך 90 דקות במתח של 80 וולט.
    9. צבעו את הג'ל עם אתידיום ברומיד ודמיינו אותו באמצעות מערכת תיעוד ג'ל (ראו טבלת חומרים).
  3. בדיקת לוד
    1. הכן 160 μL של 200 ננומטר F-sub במאגר התגובה. זה נעשה כדי להעריך את הרקע הבסיסי של יציבות המצע.
    2. הכינו 7 אליציטוטים של 160 מיקרוליטר של DNM, F-sub ו-Dza שהורכבו מראש בריכוזים של 20 ננומטר של DNM ו-Dza ו-200 ננומטר של F-sub במאגר התגובה. מתוך שבעת הצינורות, שמור על צינור #1 כרקע ריק כדי להעריך את ההרכבה הספונטנית של ליבת DNAzyme.
    3. הוסף את האנליט לתוך צינורות #2-7 בריכוזים הסופיים של 1 pM, 10 pM, 100 pM, 200 pM, 500 pM ו 1000 pM.
    4. מערבבים בעדינות, מסובבים את הצינורות, ומסווגים את התמיסות לשלושה חלקים של 50 מיקרוליטר לצלחת שחורה של 96 בארות. אטמו את הצלחת בסרט אופטי שקוף.
    5. לדגור את הצלחת באמבט מים ב 55 ° C במשך 1 שעות. סובבו את הצלחת.
    6. מדוד פלואורסצנטיות ב- 525 ננומטר (λex = 495 ננומטר). חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל נקודה.
    7. חשב את היחס הריק לבסיסי על ידי חלוקת האות של הצינור המכיל F-sub ו- DNM באות של הצינור המכיל F-sub בלבד. ודא שהיחס נמצא בטווח של 1.1-1.5.
    8. חשב את יחס האות לריק על-ידי חלוקת האות של הצינור המכיל F-sub, DNM והאנליט לאות של הצינור המכיל F-sub ו- DNM בלבד. שקול את האות כחיובי אמיתי אם הוא גבוה מממוצע הרקע בתוספת שלוש סטיות תקן.
    9. חזרו על הניסוי פעמיים וודאו שסטיית התקן בין החזרות האנליטיות קטנה מ-0.5.

תוצאות

מטרת הניסוי הראשון הייתה להראות את הרכבת הדנ"מ לפני המקטע הסינתטי של האנליט. כל גדילי ה-DNM המרכיבים נוספו למאגר התגובה והורכבו בכד. קומפלקס ה- DNM שהורכב הוערך עבור גודלו הנכון וההומוגניות שלו על ידי דף מקורי. דף מקורי מציג את ה-DNM שהורכב עם האנליט בנתיב 1 ושני גדילי DNM בנתיבים 2 ו-4. אם ננו-מכונת הדנ"א לא הייתה מורכבת, 2 או 3 פסים נפרדים היו נראים במקום רצועה אחת בעלת ניידות נמוכה (נתיב 2 באיור 2A).

החלק השני של הפרוטוקול מרמז על אפיון פונקציונלי של ביצועי DNM וזיהוי של חומצות גרעין מטרה. במחקר זה נעשה שימוש במקטע הסינתטי של EBV 13972-14154. לשם כך, קטעי הדנ"מ שהורכבו מראש, יחד עם ה- Dza, הודגרו עם ריכוזים שונים של האנליט במשך שעה אחת ב 55 מעלות צלזיוס. נמדדו שני ערכי אות פלואורסצנטי בקרה: זה של מקטעי ה-DNM שהורכבו מראש ו-Dzb ללא האנליט (ריק), וזה של הרקע מ-F-sub (בסיסי). נעשו שלוש מדידות טכניות. לצורך הסטטיסטיקה, נערכו גם שלושה ניסויים עצמאיים. ראוי לציין כי ריכוז המגנזיום במחקר זה גבוה ממה שניתן למצוא בספרות30. רמות גבוהות של יוני מגנזיום מגבירות את האות בכל מבחנות הבדיקה, מכיוון שהן מקדמות מחשוף F-sub ספונטני31. ביצענו אופטימיזציה של הרכב חיץ התגובה במהלך השלבים המוקדמים של פיתוח הטכנולוגיה ולא חזרנו על תהליך זה בכל מחקר שבוצע.

לאחר דגירה של שעה נמדדה פלואורסצנטיות הדגימה באמצעות ספקטרופלואורומטר (ראו טבלת חומרים). כדי לאשר את זיהוי הדנ"א שניתח על ידי הדנ"א, השווינו את האות הפלואורסצנטי של החיישן שהורכב עם הדנ"א שניתח וזה של הבקרה השלילית, שאינה מכילה שום אנליט נוסף. יחס האות לריק (יחס בין יחידות הפלואורסצנטיות היחסיות הממוצעות של הבארות המכילות את האנליט לבין הבארות ללא אנליט) צריך להיות לא פחות מ-1.5 כדי לאשר גילוי מוצלח32. היחס הריק לבסיסי (פלואורסצנטיות של תגובת חיישן בהיעדר אנליט חלקי זה של בקרת F-sub בלבד) צריך להיות בטווח של 1.1-1.5; ניתן לכוונן יחס זה על ידי שינוי ריכוזי DNM ו- Dzb (טווח הריכוז האופייני לכל אחד מהם הוא 5-20 ננומטר). בפרקטיקה שלנו, LOD מכומת כהצטלבות של קו המגמה ושלוש סטיות תקן מעל הממוצע הריק (איור 2B). ה- DNM יעיל אם ה- LOD הוא <100 pM33. יש לעצב מחדש את ה-DNM אם ה-LOD גבוה מ-100 pM.

figure-results-1
איור 1: הדנ"ם בעל שלוש הזרועות ששימש במחקר הזה. שלושה אוליגונוקלאוטידים, Dza, Dzb-Tile ו-Tile-Arm3, מסומנים בירוק, כחול וסגול, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אפיון DNM. (A) הרכבה של DNM באמצעות אלקטרופורזה טבעית בג'ל פוליאקרילאמיד 12%, 80 V, 1 שעות, באמצעות סולם DNA של 50 bp+. (B) גבול הזיהוי של דנ"א סינתטי לאחר דגירה של 60 דקות ב-55°C. הקו האופקי מייצג את הסף, והקו האנכי הוא LOD. הערכים הממוצעים של שלוש מדידות בלתי תלויות מוצגים בסטיית תקן אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

התכנון של מכונות DNA הוא פשוט, אך דורש ניסיון מסוים בתכנון בדיקות הכלאה או ננו-מבנים פונקציונליים של DNA. ראוי לשמור על קטע אנליטי קצר ככל האפשר כדי להפחית את מספר המבנים המשניים האפשריים ולפשט את פלישת ה- DNM למבנה המשני. תכולת CG צריכה להיות מתחת ל -60% כדי למנוע מבנים תוך-מולקולריים יציבים. הרכבה מוצלחת של ה-DNM מושגת בקצב קירור איטי. במקרים מסוימים, DNMs ניתן להרכיב באופן ספונטני בצינור, ואת שלב החישול ניתן לבטל. הרכבת DNM יכולה להתבצע במחזור תרמי עם 0.1-0.3 ° C / min או בכמויות גדולות של מי קירור. במקרה של הרכבה לא נכונה של DNM, אנו מציעים להאט את שינוי הטמפרטורה במהלך שלב החישול.

כדי למדוד את ה-LOD דרושות לפחות שבע נקודות ריכוז אנליטיות: ריכוז אנליט 0pM, שהוא F-sub + DNM, ושישה ריכוזי אנליטים שונים, לדוגמה, בטווח של 1 ננומטר עד 1 pM כדי לצפות בתלות ליניארית (איור 2B). לעתים קרובות, יותר משבע נקודות ריכוז שימשו לדיוק גבוה יותר. עבור כל נקודת ריכוז, יש לבצע שלושה ניסויים טכניים (50 μL כל אחד). לכן, הנפח הכולל עבור כל ריכוז היה 160 μL (עודף 10 μL, בהתחשב בשגיאת פיפטה).

טכניקת DNM מציגה רגישות גבוהה יותר עבור SNV מאשר מערכות מבוססות הכלאה אחרות. סלקטיביות גבוהה ל-SNV יכולה להיות רלוונטית למטרות מסוימות, כגון זיהוי מוטציות נקודתיות הקשורות לגנוטיפ חיידקי22 או בחירת הטרוזיגוטים בצמחים25. אנליטות לא ספציפיות ידרשו את אותו הליך ניסיוני. כדי למנוע כל חוסר הבנה של SNV לריכוז נמוך של אנליטיק, אנו מציעים להשוות את האות של האנליט הניסויי הלא ידוע לזה של אות של אנליט משלים מלא ידוע של אותו ריכוז.

השיטה יכולה להיות מיושמת בהצלחה על ssDNA, miRNA, RNA מקופל, או amplicons dsDNA. מקטעי רנ"א ארוכים או dsDNA, במיוחד מקטעי CG עשירים, עשויים לדרוש DNM המצויד ב-4-6 זרועות קושרות אנליטים, בעוד ששתי זרועות קושרות אנליטים מספיקות לאנליטים חד-גדיליים בעלי מבנה משני לא יציב (ΔG מתקפל מעל -10 קק"ל/מול). השיטה יכולה להיות מיושמת לזיהוי של מגברי PCR, SDA או LAMP. DNM יכול לשמש לזיהוי ללא הגברה של rRNA בדגימות מבושלות של תרבית חיידקים מבלי לבודד RNA כולל 22,34,35. ייתכן שהטכניקה לא תעבוד טוב עם ריכוזים נמוכים כמו הרמה הפמטומולרית ועם מקטעי dsDNA, שתכולת ה-CG שלהם באזורי האיגוף גבוהה מ-65%. ניתן להעריך את תכולת ה-CG, למשל, באמצעות מחשבון התוכן של Biologics CG36. אנו מציעים להוסיף חלקי וו37 לתכנוני ה-DNM כדי להגביר את הרגישות או להפוך את ה-dsDNA ל-ssDNA במקרים של תכולת CG גבוהה. מגבלה נוספת של השיטה היא שהדנ"מ רגיש לאיכות הדגימות, ולכן חומצות הגרעין אמורות להיות מטוהרות בקפידה. כנ"ל לגבי איכות רצפי האוליגונוקלאוטידים של DNM. לכן, מוצע לוודא את היציבות והטוהר של כל אספקת אוליגונוקלאוטידים. בהשוואה לטכניקות הגברה קונבנציונליות, העיצוב של ה- DNM דורש מיומנויות, ועד לתאריך פרסום המאמר, הוא כמעט ידני לחלוטין. הדנ"מ זקוק לבדיקות מקדימות על מקטעים סינתטיים לפני שהוא חושף אותם לדגימות דנ"א או רנ"א אמיתיות, ובכך מאריך את משך הפיתוח הכולל של מערכת הבדיקה.

השיטה היא ורסטילית ויכולה לאמץ סוגים שונים של בדיקות כתב. ניתן להכפיל אותו38, וניתן להפוך את הטכניקה לגרסה קולורימטרית אם ה-F-sub מוחלף במצע יוצר G-quadruplex39. נוכחותו של פולימראז קשורה לשגיאות בצמיחת הגדיל; לפיכך, שיטה זו היא יתרון על פני PCR קונבנציונאלי בזמן אמת PCR דיגיטלי כמו גם טכניקות אחרות תלויות nuclease, כגון SHERLOCK ו DETECTR, בשל היעדר אנזימים חלבון מתכלים ואת הליך זיהוי חזק ופשוט40,41.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

המחברים רוצים להודות ליקטרינה ו. ניקיטינה על מתן gDNA של EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya, ומריה ס 'רובל מודים למשרד החינוך והמדע של הפדרציה הרוסית (מענק No FSER-2022-0009) ואת תוכנית עדיפות 2030.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור 1.5 מ"לBiofilCFT011015
100 bp+ DNA סולםEvrogenNL002
100-1000 ומיקרו; L פיפטהKirgenKG-Pro1000
10-100 ומיקרו; L פיפטהKirgenKG-Pro100
1-10 ומיקרו; L פיפטהKirgenKG-Pro10
20-200 ומיקרו; L פיפטהKirgenKG-Pro200
2-20 ומיקרו; L pipetteKirgenKG-Pro20
4x טעינת ג'ל צבעEvrogenPB020
אקרילאמיד 4KAppliChemA1090,0500
אמוניום פרסולפטקארל רוט2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
חומצה בוריתTechSnabH-0202
מערכת הדמיה ChemiDocBioRad12003153
Costar 96-Well Black PolystyrenePlate CorningCOS3915
DinaMeltRNA Institute
http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php EDTAAmrescoAm-O105
אתידיום ברומידBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
מגנזיום כלורידAppliChem131396
מיני פרוטאן טטרה תאBioRad1658001EDU
פיפטה 10 ומיקרו; טיפיםL KirgenKG1111-L
פיפטה 1000 ומיקרו; טיפים LKirgenKG1636
פיפטה 200 ומיקרו; טיפיםL KirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
אשלגן כלוריקארל רוט1782751
PowerPac ספק כוח בסיסיBioRad1645050
RNAse / DNAse מים ללאInvitrogen10977049
איטום סרט עבור לוחות PCRSovtechP-502
נתרן כלוריוקטוןHCh (0,1)
קורא מיקרופלייט מולטי-מודSpark TecanSpark- 10M
T100 מגברBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldמכוןhttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
אמבט מיםLOIPLB-140
<חזק>אוליגוס בשימוש
<חזק>אנליט: Evrogenהזמנה ישירה, טיהור
התפלה סטנדרטיGAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogenהזמנה ישירה, טיהור התפלה סטנדרטי
CCG GGCTGCTGTGCCATT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
<חזק>Dzb-אריח: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGAA
ACCTT		Evrogenהזמנה ישירה, טיהור התפלה סטנדרטי
<חזק>Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogenהזמנה ישירה, טיהור
התפלה סטנדרטי<חזק>אוליגונוקלאוטיד תת-F: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		סדר ישיר של DNA-Syntez, טיהור HPLC
RNA

מקורות

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNAzymeDNAzyme RNADNADNANative PAGEDNA
DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.