ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין
במאמר זה
סיכום
תקציר
ננו-מכונות מבוססות DNAzyme (DNM) לזיהוי רצפי DNA ו-RNA (אנליטים) הם מבנים רב-תכליתיים העשויים מאוליגונוקלאוטידים. תפקידיהם כוללים קשירת אנליטים הדוקה, זיהוי אנליטי סלקטיבי ביותר, הגברת אות פלואורסצנטי על ידי שסעים קטליטיים מרובים של מצע כתב פלואורוגני, ומשיכה של מצע פלואורוגני להגברת תגובת החיישן. יחידות פונקציונליות מחוברות לפיגום DNA משותף לצורך פעולתן המשותפת. 10-23 DNMs החותכים RNA מתאפיינים ברגישות משופרת בהשוואה לבדיקות הכלאה לא קטליטיות. יציבות הדנ"מ והסיכוי המוגבר לזיהוי המצע מסופקים על ידי מקטע דנ"א דו-גדילי, אריח. DNM יכול להבדיל בין שני אנליטים עם הבדל נוקלאוטיד יחיד ב-RNA מקופל ובדנ"א דו-גדילי ולזהות אנליטים בריכוזים ~1000 נמוכים פי 1000 מבדיקות הכלאה אחרות ללא חלבון. מאמר זה מציג את הרעיון מאחורי הפוטנציאל האבחנתי של פעילות DNA-nanomachine וסוקר תכנון, הרכבה ויישום של DNM במבחני זיהוי חומצות גרעין.
מבוא
אחת השיטות המוקדמות ביותר לזיהוי חומצות גרעין היא קשירה משלימה של אוליגונוקלאוטידים סלקטיביים לרצפי RNA או DNA שנותחו. שיטה זו משתמשת במקטעי חומצות גרעין (גשושים) שיכולים ליצור זוגות בסיס ווטסון-קריק עם DNA ממוקד או RNA אנליטי1. לאחר מכן הקומפלקס נבדל מן האנליט והגשושית הבלתי קשורה על ידי מגוון טכניקות. שיטות מסוימות, כגון כתם צפוני, הכלאה באתרו , או qPCR, מבוססות על תופעת הקשירה המשלימה2. לגשושיות ההכלאה הנפוצות ביותר יש שני חסרונות משמעותיים: רגישות נמוכה (הן יכולות להגיע לרמות מיקרומולאריות עד ננומולריות) וכן סלקטיביות נמוכה לווריאציות של נוקלאוטידים בודדים (SNV), כולל מוטציו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תכנון DNM
- בחר אזור ייחודי בתוך הגנום המעניין.
הערה: עבודה זו משתמשת באזור בגנום של וירוס אפשטיין-בר (EBV) במיקומים 13972-14154 (OR652423.1). - צור ערכת פריימר להגברה של המקטע שנבחר, לדוגמה, באמצעות הכלי Primer3 המוטבע ב- Ugene26.
- פתח את כלי האינטרנט UNAFold27 (ראה רשימת חומרים) והוסף את האזור שנבחר. שנו את טמפרטורת הקיפול ל-55°C, ואת התנאים היוניים ל-250 מילימול של יונים חד-ערכיים, ו-200 מילימול של Mg2+.
- פתח את המבנה המשני המתקבל של מקטע ssDNA ובחר סיכת שיער יציבה. אתר את אתר הקישור של ננו-מכונ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מטרת הניסוי הראשון הייתה להראות את הרכבת הדנ"מ לפני המקטע הסינתטי של האנליט. כל גדילי ה-DNM המרכיבים נוספו למאגר התגובה והורכבו בכד. קומפלקס ה- DNM שהורכב הוערך עבור גודלו הנכון וההומוגניות שלו על ידי דף מקורי. דף מקורי מציג את ה-DNM שהורכב עם האנליט בנתיב 1 ושני גדילי DNM בנתיבים 2 ו-4. אם ננו-מכונת הדנ"א לא הייתה מורכבת, 2 או 3 פסים נפרדים היו נראים במקום רצועה אחת בעלת ניידות נמוכה (נתיב 2 באיור 2A).
החלק השני של הפרוטוקול מרמז על אפיון פונקציונלי של ביצועי DNM.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התכנון של מכונות DNA הוא פשוט, אך דורש ניסיון מסוים בתכנון בדיקות הכלאה או ננו-מבנים פונקציונליים של DNA. ראוי לשמור על קטע אנליטי קצר ככל האפשר כדי להפחית את מספר המבנים המשניים האפשריים ולפשט את פלישת ה- DNM למבנה המשני. תכולת CG צריכה להיות מתחת ל -60% כדי למנוע מבנים תוך-מולקולריים יציבים. הרכבה מוצלחת של ה-DNM מושגת בקצב קירור איטי. במקרים מסוימים, DNMs ניתן להרכיב באופן ספונטני בצינור, ואת שלב החישול ניתן לבטל. הרכבת DNM יכולה להתבצע במחזור תרמי עם 0.1-0.3 ° C / min או בכמויות גדול.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
תודות
המחברים רוצים להודות ליקטרינה ו. ניקיטינה על מתן gDNA של EBV. Muhannad Ateiah, Maria Y. Berezovskaya, ומריה ס 'רובל מודים למשרד החינוך והמדע של הפדרציה הרוסית (מענק No FSER-2022-0009) ואת תוכנית עדיפות 2030.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור 1.5 מ"ל | Biofil | CFT011015 | |
| 100 bp+ DNA סולם | Evrogen | NL002 | |
| 100-1000 ומיקרו; L פיפטה | Kirgen | KG-Pro1000 | |
| 10-100 ומיקרו; L פיפטה | Kirgen | KG-Pro100 | |
| 1-10 ומיקרו; L פיפטה | Kirgen | KG-Pro10 | |
| 20-200 ומיקרו; L פיפטה | Kirgen | KG-Pro200 | |
| 2-20 ומיקרו; L pipette | Kirgen | KG-Pro20 | |
| 4x טעינת ג'ל צבע | Evrogen | PB020 | |
| אקרילאמיד 4K | AppliChem | A1090,0500 | |
| אמוניום פרסולפט | קארל רוט | 2809447 | |
| Biorender | Biorender | https://www.biorender.com | |
| Bisacrylamide | Molekula | 22797959 | |
| חומצה בורית | TechSnab | H-0202 | |
| מערכת הדמיה ChemiDoc | BioRad | 12003153 | |
| Costar 96-Well Black Polystyrene | Plate Corning | COS3915 | |
| DinaMelt | RNA Institute | ||
| http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php EDTA | Amresco | Am-O105 | |
| אתידיום ברומיד | BioLabMix | EtBr-10 | |
| HEPES | Amresco | Am-O485 | |
| מגנזיום כלוריד | AppliChem | 131396 | |
| מיני פרוטאן טטרה תא | BioRad | 1658001EDU | |
| פיפטה 10 ומיקרו; טיפים | L Kirgen | KG1111-L | |
| פיפטה 1000 ומיקרו; טיפים L | Kirgen | KG1636 | |
| פיפטה 200 ומיקרו; טיפים | L Kirgen | KG1212-L | |
| Pixelmator Pro | Pixelmator Team | https://www.pixelmator.com/pro/ | |
| אשלגן כלורי | קארל רוט | 1782751 | |
| PowerPac ספק כוח בסיסי | BioRad | 1645050 | |
| RNAse / DNAse מים ללא | Invitrogen | 10977049 | |
| איטום סרט עבור לוחות PCR | Sovtech | P-502 | |
| נתרן כלורי | וקטון | HCh (0,1) | |
| קורא מיקרופלייט מולטי-מוד | Spark Tecan | Spark- 10M | |
| T100 מגבר | BioRad | 10014822 | |
| TEMED | Molekula | 68604730 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Amresco | Am-O497 | |
| UNAFold | מכון | http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php | |
| אמבט מים | LOIP | LB-140 | |
| <חזק>אוליגוס בשימוש | |||
| <חזק>אנליט: | Evrogen | הזמנה ישירה, טיהור | |
| התפלה סטנדרטיGAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC | |||
| Tile-Arm3: | Evrogen | הזמנה ישירה, טיהור התפלה סטנדרטי | |
| CCG GGCTGCTGTGCCATT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT | |||
| <חזק>Dzb-אריח: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGAA ACCTT | Evrogen | הזמנה ישירה, טיהור התפלה סטנדרטי | |
| <חזק>Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA | Evrogen | הזמנה ישירה, טיהור | |
| התפלה סטנדרטי<חזק>אוליגונוקלאוטיד תת-F: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1 | סדר ישיר של DNA-Syntez | , טיהור HPLC |
מקורות
- Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
- Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
