הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיית מיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה של הרכבה עצמית של מוטיב כוכב תלת-נקודתי של DNA באמצעות הקשה פוטותרמית מחוץ לתהודה

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66470

⸱

22 במרץ 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne, 2Programmable Biomaterials Laboratory, Institute of Materials, School of Engineering, Ecole Poly-technique Fédérale Lausanne

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מראים את פרוטוקול ההדמיה לצפייה באינטראקציות ביומולקולריות עם הקשה פוטותרמית מחוץ לתהודה (PORT), שבו אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה, זיהינו מגבלות מערכת וחקרנו שיפורים פוטנציאליים בהדמיה של מכלול מוטיב DNA של שלושה כוכבים.

תקציר

מיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה (HS-AFM) היא טכניקת הדמיה מולקולרית פופולרית להדמיית תהליכים ביולוגיים של מולקולה בודדת בזמן אמת בשל יכולתה לצלם בתנאים פיזיולוגיים בסביבות נוזליות. מצב הקשה על תהודה פוטותרמית (PORT) משתמש בלייזר כונן כדי להניע את השלוחה בצורה מבוקרת. הפעלה ישירה זו של שלוחה יעילה בתחום MHz. בשילוב עם הפעלת לולאת המשוב על עקומת הכוח של תחום הזמן במקום משרעת התהודה, PORT מאפשר הדמיה במהירות גבוהה של עד עשר פריימים לשנייה עם שליטה ישירה על כוחות דגימת הקצה. PORT הוכח כמאפשר הדמיה של דינמיקת הרכבה עדינה וניטור מדויק של דפוסים הנוצרים על ידי ביומולקולות. עד כה, הטכניקה שימשה למגוון מחקרים דינמיים במבחנה , כולל דפוסי הרכבת מוטיב 3 נקודות ה-DNA המוצגים בעבודה זו. באמצעות סדרה של ניסויים, פרוטוקול זה מזהה באופן שיטתי את הגדרות פרמטר ההדמיה האופטימליות ואת הגבולות האולטימטיביים של מערכת ההדמיה HS-PORT AFM וכיצד הם משפיעים על תהליכי הרכבה ביומולקולרית. בנוסף, הוא חוקר השפעות תרמיות לא רצויות פוטנציאליות הנגרמות על ידי לייזר ההנעה על הדגימה והנוזל שמסביב, במיוחד כאשר הסריקה מוגבלת לאזורים קטנים. ממצאים אלה מספקים תובנות חשובות שיניעו את התקדמות היישום של מצב PORT בחקר מערכות ביולוגיות מורכבות.

מבוא

מיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה (HS-AFM) היא טכניקת הדמיה שצומחת במהירות 1,2,3,4. הוא פועל במהירויות המאפשרות לחוקרים לדמיין אינטראקציות ביומולקולריות בזמן אמת 5,6,7,8,9. הקשה פוטותרמית מחוץ לתהודה (PORT) היא מצב הדמיה מחוץ לתהודה הדומה להקשה בכוח שיא10,11, מצב כוח פועם12,13 או מצב קפיצה14. עם זאת, במקום להתנודד אנכית של הסורק, PORT מתנודד אנכית רק את השלוחה דרך לייזר עירור הממוקד בשלוחה (בדרך כלל קרוב לנקודת ההידוק). השלוחה מתעוותת עקב אפקט הבימורף: לייזר עירור מאופנן כוח מחמם מעת לעת את השלוחה המצופה, המתכופפת עקב מקדמי ההתפשטות התרמית השונים של השלוחה וחומרי הציפוי15. ניתן למזער את חימום השלוחה והדגימה על ידי שימוש בלייזר כונן שנכבה ומופעל מחדש מעת לעת במהלך כל מחזור תנודה, במקום להשתמש בכונן סינוסואידלי מלא5.

DNA שימש ליצירת מוטיבים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, מעניינים מבחינה מבנית ושימושיים מבחינה ביוכימית במשך מספר שנים 16,17,18,19,20. בנוסף, מבני DNA הוכחו כמתאימים באופן אידיאלי לאפיון איכות הדמיית AFM21 ולהערכת אפקט הקצה של AFM22 במהירות גבוהה. כוכבי שלוש נקודות DNA קהים (3PS) הפכו למעשיים כמערכת מודל ניתנת לתכנות לחקירת הארגון העל-מולקולרי של מולקולות בעלות מבנה דומה במערכות ביולוגיות מורכבות אחרת19. בעבר, ההרכבה העצמית של סריגים שנוצרו על ידי מונומרים של DNA טרימרי קהה הייתה במעקב באמצעות HS-AFM23. בסופו של דבר, אלה מתארגנים לרשתות גדולות עם סדר משושה. כאן, ההרכבה העצמית של כוכבי DNA 3 נקודות19 מצולמת בטכניקת PORT במהירויות סריקה מהירות מספיק כדי לעקוב אחר ההרכבה העצמית ומנגנוני התיקון שלה24 תוך הבטחת הפרעה מינימלית של התהליך או נזק לדגימה. כמו בכל מצב HS-AFM, יש פשרה בין איכות הדמיה ניתנת להשגה, מהירות הדמיה וההפרעה הלא רצויה של הדגימה. על ידי בחירת הפשרה הנכונה, ניתן להבין טוב יותר את דפוסי הארגון העצמי של מכלולים על-מולקולריים. פרוטוקול זה, אם כן, ישתמש בהגדרה דומה עם DNA 3PS כמערכת מודל כדי לייעל את הפרמטרים הספציפיים ל-PORT. זה יאפשר פעולה במהירויות הדמיה גבוהות בגדלי סריקה גדולים מספיק תוך מזעור נזק לדגימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מדגם ומאגרים

הערה: אריח ה-DNA ששימש במחקר זה הוא מוטיב כוכב 3 נקודות שפותח במעבדת מאו באוניברסיטת פרדו19,25. כל האוליגונוקלאוטידים ששימשו במחקר זה נרכשו מ-Integrated DNA Technologies, Inc. אסוף את החומרים והריאגנטים הדרושים.

  1. מערבבים את ה-DNA החד-גדילי (ssDNAs) ביחס מולארי של 1:3:3 (S1 0.6 μM, 1.8 μM עבור S2 ו-1.8 μM עבור S3) במאגר החישול (5 mM TRIS, 1 mM EDTA ו-10 mM MgAc2). הריכוז הסופי של מוטיב ה-DNA חייב להיות 0.6 מיקרומטר (49 ננוגרם/מיקרוליטר כאשר המשקל המולקולרי של 3PS הוא 82020.3 גרם/מול).
  2. מניחים את תמיסת ה-DNA בכלי עמיד בחום ומחממים אותה ל-80 מעלות צלזיוס. קררו לאט את תמיסת ה-DNA מ-80 מעלות צלזיוס ל-20 מעלות צלזיוס במשך תקופה של 4 שעות. תהליך חישול זה מסייע לאוליגונוקלאוטידים של ssDNA ליצור את מוטיב ה-DNA הדו-גדילי הרצוי.
  3. לטיהור, טען את תמיסת ה-DNA המחושלת על ג'ל אגרוז 3% כדי להסיר את עודפי ה-ssDNA וכל תוצר לוואי לא רצוי. הפעל את הג'ל 3% ב-60 וולט למשך כ-2.5 שעות במאגר רץ המכיל 0.5x Tris-Borate-EDTA (TBE) ו-10 מ"מ מ"ג (CH3COO)2.
  4. זהה ואתר את הרצועה על הג'ל המכילה את מוטיב ה-DNA. ודא שהלהקה עברה למיקום ספציפי בהתבסס על גודלה.
  5. הסר בזהירות את הרצועה המכילה את מוטיב ה-DNA מהג'ל. חלץ את מוטיב ה-DNA משבר הג'ל שנכרת על ידי הנחתו בעמודת סיבוב מיצוי ג'ל וצנטריפוגה ב-3,000 x g ו-4 °C למשך 10 דקות.
  6. החלף את המאגר במוטיב ה-DNA המופק במאגר החישול באמצעות רכז צנטריפוגלי. צנטריפוגה ב-3000 x גרם בטמפרטורת החדר (או נמוכה יותר) עד שהתמיסה המרוכזת נמוכה מ-100 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר חישול וחזור על שלב זה פעמיים כדי להבטיח שהמאגר מוחלף.
  7. לדלל את מוטיב ה-DNA ל-6 ננומטר למטרות הדמיה. השתמש בספקטרופוטומטר או בשיטות מתאימות אחרות כדי לקבוע ולהתאים במדויק את הריכוז. מוטיב ה-DNA מוכן כעת להדמיה.
    הערה: כל המאגרים בפרוטוקול הם בעלי pH 8.0. פרטי הרצף עבור שלוש הלהקות המתאימות הם כדלקמן:
    S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2: ACTATGACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG
    S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. צמיחת קצה שלוחה

  1. הרכבה שלוחה על מחזיק שלוחת SEM: ודא שהשלוחה נקייה וללא כל מזהמים. הרכיבו את השלוחים על מחזיק מתאים התואם למערכת SEM. ניתן לחלוק את עיצוב מחזיק השלוחה שנבנה בהתאמה אישית על פי בקשה.
  2. הזרקת גז: מחממים את הגז המקדים (למשל, מבשר פננתרן C14H10 לקצות פחמן אמורפיים) לשימוש במערכת הזרקת הגז כדי לגדל את הקצה החדש. ברגע שהוואקום נמוך מ-10-5 מבר, נקה את קו הזרקת הגז 10 פעמים למשך 2 שניות כדי לוודא שאין שאריות אוויר לא רצויות בקו הזרבובית (יש לעשות זאת כשהשסתום לתא האקדח סגור).
  3. התאמת מיקום קצה: השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי לאתר את קצה השלוחה. הטה את מחזיק השלוחה לזווית (למשל, 11° במקרה זה) שווה ערך לזו שהשלוחה תציג כאשר היא מונחת על מחזיק שלוחה AFM ביחס למשטח, כך שהקצה הגדל יהיה בניצב לפני השטח בזמן ההדמיה. התאם את המיקום והמיקוד של ה-SEM כדי לקבל תצוגה ברורה של קצה השלוחה, שם יגדל קצה ננו-פחמן חד.
  4. תצהיר המושרה על ידי קרן אלקטרונים ממוקדת (FEBID):
    1. הגדר את פרמטרי התצהיר בתוכנה שנבחרה (במקרה זה, SmartFIB), כגון זרם אלומה (I) ומתח תאוצה (V), מרחק עבודה (WD), הגדלה, צורה חשופה, זמן מינון/שקיעה וזמן שהייה. הפרמטרים הבאים שימשו לגידול קצות פחמן אמורפיים, המציגים תכונות מכניות טובות להדמיית AFM, מה שמוביל לאורכים סביב 130 ננומטר ורדיוסים בטווח של 2-4 ננומטר:
      בחירת נקודה/נקודה כצורה חשופה
      WD = 5 מ"מ
      I = 78 pA, ו- V = 5 קילו וולט
      זמן שהייה = 1 מיקרומטר
      מינון = 0.05 nC, וזמן שקיעה = 0.64 שניות
      הגדלה = 20000x
    2. התחל את תהליך התצהיר כדי להגדיל את הקצה על ידי הקרנת קרן האלקטרונים בנקודה על קצה השלוחה ובמקביל הזרקת הגז המבשר, וסגירת הגז בסיום התצהיר. במקרה זה, תוכנת SmartFIB מבצעת זאת באופן אוטומטי לאחר הגדרת המתכון שהוזכר לעיל.
  5. ניתוח לאחר הצמיחה: בצע הדמיית SEM לאחר הצמיחה כדי לבחון את הקצה החדש שגדל ולהבטיח את איכותו ומאפייניו (רדיוס הקצה ואורכו). המתן 1-2 דקות לאחר צמיחת הקצה כדי לוודא שכל הגז המקדים נשאב החוצה כדי למנוע שקיעה חוזרת במהלך הדמיית ה-SEM. הסר את מחזיק המדגם מתא ה- SEM.
  6. מיחזור שלוחה: במקרה שבמערכת ה-SEM מותקנת גם קרן יונים ממוקדת משולבת (FIB), הסר קצה פגום או מלוכלך שגדל בעבר על ידי כרסומו עם מערכת ה-FIB באמצעות זרמי FIB נמוכים (למשל, 1 pA, כדי למנוע נזק לשלוחה). בצע את הסרת הקצה על ידי כרסום בצורת חתך רוחב, מקצה הקצה לבסיס, כדי למנוע קריסת הקצה. זה יאפשר לגדל מחדש אחד חדש.

3. חומרת HS-AFM

  1. מערך ההדמיה מורכב מראש PORT5, 26 (איור 1A), סורק מהיר26 עם דיסק לדוגמה עם נציץ למעלה, בקר תואם27, מגבר מתח גבוה עם רוחב הפס הגבוה הנדרש להדמיה במהירות גבוהה, בסיס AFM ומחשב עם התוכנה הנדרשת לשליטה בציוד שהוזכר לעיל27.
    הערה: במקרה זה, מדובר ברכיבי קוד פתוח שעבורם ניתן לקבל תוכניות מהמעבדה למכשור ביולוגי וננו ב-EPFL27, 28. כמו כן, ניתן להשתתף בסדנאות כיצד לבנות את ראש ה-PORT והבקר29, כמו גם להוריד ולהשתמש בתוכנה מבוססת LabView.
  2. הנח בזהירות שלוחה קצרה במיוחד (למשל, AC10DS או שווה ערך) מתחת לתפס הקפיץ על מחזיק השלוחה באמצעות פינצטה. ודא ששבב השלוחה קבוע ויציב.
  3. הוסף 50 מיקרוליטר נוזל באמצעות מזרק דרך יציאת הגישה השמאלית לנוזל, כפי שמודגם באיור 1B. כאשר לייזר העירור עדיין כבוי, יישר את לייזר הקריאה על השלוחה באמצעות שלושת הכפתורים הייעודיים בראש ה-AFM המוצגים באיור 1A. עשה זאת על ידי התבוננות בצל השלוחה על נייר לבן תוך מקסום הסכום (שיטת צל). לאחר מכן, מרכז את נקודת הלייזר על הפוטו-דיודה באמצעות שני הכפתורים הייעודיים.
  4. הפעל ויישר את לייזר הכונן על ידי סימון התיבה הפעלת עירור בעירור VI, כך שהוא מפעיל ומתנודד את השלוחה. הצג את אות עירור השלוחה ואת אות הסטייה של השלוחה על אוסצילוסקופ מחובר. אם תנודת הסטייה נמוכה מדי (או לא קיימת) ייתכן שלייזר ההנעה רחוק מאוד מהשלוחה במקרה כזה, השתמש בשיטת הצל וכבה את לייזר ההסטה ליישור קל יותר. מקסם את משרעת התנודה באמצעות כפתורי כוונון לייזר ההנעה המוצגים באיור 1A.
  5. כדי לכוונן את משרעת התנודה השלוחה ב-PORT, הזן בבקרה המתאימה של התוכנה את מתח השיא לשיא שנשלח למעגל הבקרה של דיודות הלייזר (מעתה ואילך, כניסת AC משיא לשיא) בעירור VI. כדי לשמור על דיודת הלייזר במשטר ההולכה ולכן, לייזר, הוסף מתח DC למעגל הבקרה של דיודת הלייזר (מעתה ואילך, כניסת קיזוז DC), שנעשית גם מתיבת תצורה בעירור VI. שניהם ישפיעו גם על עוצמת הלייזר, אותה ניתן למדוד באמצעות מד כוח לייזר ומשמש לכוונון משרעת התנודה של השלוחה.
  6. קבע את תדר העירור הפוטותרמי המרבי שניתן להחיל על השלוחה שחייבת להיות מתחת לתדר התהודה של השלוחה . קבע את תדר התהודה על ידי כוונון תרמי או טאטא תדרים. לשלוחים ששימשו במחקר זה (AC10DS), שתדירות התהודה שלהם בנוזלים היא בסביבות 400 קילו-הרץ (1 מגה-הרץ באוויר)30, יש אזור כיפוף קוואזיסטטי מתחת ל-300 קילו-הרץ5. לפיכך, יש להשתמש בתדרי PORT מתחת לגבול זה (בסביבות 100-200 קילו-הרץ).
  7. התאם את פרמטרי ההדמיה וההגדרות עבור קצב PORT וקצב סריקה לערכים הנדרשים ב-Excitation ו-Scan Vis בהתאמה (הפרמטרים המשמשים במאמר זה מצוינים בתיאורי האיורים). לאחר הגדרת פרמטרי ההגדרה וההדמיה, בצע את ניסויי ההדמיה הנדרשים כדי לצפות ולעקוב אחר האינטראקציות המולקולריות.
    הערה: מכיוון ששלוחות-AC10DS אינן נמכרות עוד, ייתכן שיהיה צורך להשתמש בחלופה כגון Fastscan D או BioLever31 עד שתהיה מקבילה זמינה.

4. השגת עקומות אינטראקציה נכונות

  1. בתחילה, התקרב למשטח הדגימה במצב מגע על ידי לחיצה על התחל בבקר Z VI המוגדר למצב מגע.
    1. במצב זה, קצה ה-AFM בא במגע ישיר עם הדגימה. לאחר ההגעה לפני השטח, בצע עקומת כוח מול מרחק ברמפה VI כדי להשיג את כיול רגישות הסטייה של השלוחה.
    2. כמו כן, העריכו את קבוע קפיץ השלוחה, או ממפרטי ספק שלוחה (פחות מדויק), המתקבל באמצעות אינטרפרומטר, או באמצעות כיול מבוסס כוונון תרמי לאחר כיול רגישות הסטיה. כיול שלוחה מדויק חיוני לבקרת כוח מדויקת של דגימת קצה.
  2. לאחר נסיגה מוחלטת של ה-Z-piezo מהמשטח שבו הקצה לא יכול להגיע למשטח על ידי לחיצה למעלה בבקר Z VI, עבור למצב PORT בבקר Z VI, והפעל את לייזר העירור בתיבת הסימון עירור VI. כדי להתחיל, הגדר את מצב ה-PORT כך שיפעל בתדר הרצוי ב-Excitation VI, אשר, במקרה ניסיוני זה, הוא 100 קילו-הרץ, באמצעות שלוחה AC10DS.
  3. הקלט את התנודה נטולת השלוחה קרוב אך לא נוגע במשטח. לאחר מכן, הפעל את המשוב בבקר Z במגע עם המשטח כדי להקליט ולחץ על נכון כדי לקבל את התנודה של השלוחה כאשר השלוחה נמצאת במגע לסירוגין עם פני השטח, שניהם בננומטרים. הפחיתו את עקומת התנודה החופשית מעקומת המגע לסירוגין כדי לקבל את עקומת האינטראקציה האמיתית, והמרו אותם ל-pN באמצעות קבוע קפיץ השלוחה (במקרה זה, 0.1 N/m).

5. הדמיית HS-AFM

  1. הכן תמיסה של Mg(CH3COO)2 בריכוז של 10 מ"מ. באמצעות מזרק המילטון, הזרקו 50 מיקרוליטר מהתמיסה המוכנה של 10 מ"ג (CH3COO)2 לתוך התעלה הנוזלית של מחזיק השלוחה, וצרו טיפת נוזל העוטפת את השלוחה.
  2. התקרב בהדרגה אל השלוחה אל פני השטח על ידי לחיצה על התחל ב-Z Controller VI. לאחר זיהוי המשטח, סובב את ה-Feedback ON ומצא את השיא של עקומת האינטראקציה בעקומות כוח ORT VI. מצא את נקודת הגדרת הכוח הנמוכה ביותר המאפשרת מעקב נכון (מתחת ל-300 pN כדי למנוע נזק של דגימות ביולוגיות שבירות).
  3. הגדר את גודל הסריקה ב-Scan VI ל-800 ננומטר על 800 ננומטר ואת קצב הקו ל-100 הרץ. סרוק את המשטח על ידי לחיצה על החץ מסגרת (למטה) ב-Scan VI כדי לבדוק את איכות המשטח. אם מתגלים זיהומים כלשהם, טפל בבעיה על ידי ניקוי המשטח, השלוחה ו/או מחזיק השלוחה לפני שתמשיך.
  4. לאחר הסריקה, משוך את השלוחה מהמשטח על ידי לחיצה על נסיגה בבקר Z VI. הסר את תמיסת החיץ מהחור במחזיק השלוחה עם מזרק המילטון כדי למנוע בעיות נפח מת.
  5. הכן תמיסת DNA 3PS מדוללת מחלק 1 של הפרוטוקול. הזרקו 50 מיקרוליטר מתמיסת ה-DNA 3PS המדוללת לתעלה הייעודית של מחזיק השלוחה.
  6. התחל את תהליך ההדמיה על ידי חזרה על שלבים 5.2-5.3, סריקת אזור של 800 ננומטר על 800 ננומטר בקצב קו ברירת מחדל של 100 הרץ (256 שורות × 256 פיקסלים). לאחר הסריקה הראשונית, התאם את גודל ומהירות ההדמיה ב-Scan VI לערכים שצוינו להמשך רכישת נתונים.
  7. שמור את נקודת ההגדרה של כוח הקלט של אינטראקציית הקצה-דגימה בתיבת נקודת ההגדרה של Z Controller VI ברמה הנמוכה ביותר הנדרשת למעקב נכון (מתחת ל-300 pN) לאורך תהליך ההדמיה כדי למזער נזק/הפרעה לדגימה, אלא אם צוין אחרת. חזור על תהליך זה עבור כל אזורי הדגימה הנדרשים.

6. עיבוד תמונה

  1. הגדר את הסביבה להפעלת קוד עיבוד האצווה המותאם אישית של Pygwy (Python for Gwyddion), והבטיח ש-Python וכל הספריות הדרושות. מידע נוסף ניתן למצוא באתר האינטרנט של גווידיון32 מותקנים כהלכה במערכת. זה מבטיח שהקוד יפעל בצורה חלקה ויכול לגשת לפונקציות הנדרשות.
  2. פתח את קוד עיבוד האצווה המותאם אישית של Pygwy (מסופק לפי בקשה). זה יספק גישה לכלים ולפונקציות הדרושים לעיבוד וניתוח תמונה.
  3. התחל את עיבוד התמונה על ידי ביצוע תיקון קו חציוני אופקי בתמונות. שלב זה נועד להסיר כל אי סדרים או חפצים הקיימים בקווי הסריקה, ולהבטיח ששלבי העיבוד הבאים מבוססים על נתונים מדויקים. לאחר הסרת רקע המישור, החל את תיקון הקו. השתמש בהסרת צלקות כדי לשפר עוד יותר את התמונות על ידי ביטול סימנים או פגמים לא רצויים הנגרמים על ידי גורמים חיצוניים. שלב זה משפר את המראה החזותי הכללי של התמונות.
  4. שפר את הנראות והניגודיות של התמונות על ידי התאמת מפת גובה הצבע. זה מבטיח שתכונות מעניינות יוצגו בבירור ויבלטו בתמונות.
  5. בחר את התמונות המעובדות שיש לשלב לסרטון. קבע את קצב הפריימים הרצוי עבור הסרטון. במקרה זה, הגדר אותו ל -7 פריימים לשנייה (fps).
  6. חשב את משך הזמן של כל מסגרת. השתמש בפיג'י (ImageJ) כדי לשלב את התמונות המעובדות לסרטון. ודא שקצב הפריימים ומשך הפריימים מוגדרים כהלכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בחקירה זו, תהליך ההרכבה הדינמי של מוטיבים של כוכב 3 נקודות DNA לאיים יציבים נצפה בהצלחה תוך שימוש ביכולות של HS-PORT AFM. טכניקה זו אפשרה לנו ללכוד את הרכבת המבנים הללו בזמן אמת. באיור 2A,B, אנו מקבלים סריקת תמונה ברורה בקצבי קו של 100 הרץ ו-200 הרץ, בהתאמה, עבור קצב PORT של 100 קילו-הרץ (גודל סריקה של 800 ננומטר על 800 ננומטר). זה מתאים ל-3.9 ו-1.95 מחזורי תנודה לפיקסל, בהתאמה. עם זאת, הדמיה במהירויות גבוהות יותר ללא עליות מקבילות בקצב ה-PORT שיאפשרו מינימום של מחזור תנודה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעת הדמיית דגימות ביולוגיות עדינות, מצבי הדמיה של הקשה מחוץ לתהודה ב-AFM שימושיים במיוחד מכיוון שהם יכולים לשלוט ישירות בכוחות האינטראקציה של קצה-דגימה10. ביניהם, מצב ה-PORT בולט בשל שיעורי התנודה הגבוהים יותר שהוא יכול להגיע אליהם, מה שמאפשר קצבי סריקה גבוהים יותר. מכיוון ש-PORT מפעיל את השלוחה באופן ישיר ורק באמצעות לייזר, הוא מאפשר עירור בתדרים גבוהים בהרבה ממצבי הקשה קונבנציונליים מחוץ לתהודה, במיוחד בעת שימוש בשלוחים קצרים במיוחד עם תדרי תהודה גבוהים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף

תודות

המחברים מודים לרפאל זינג על עזרתו בתכנות סקריפט פייתון לעיבוד סדרות תמונות. GEF מכיר במימון מ-H2020 - UE Framework Program for Research & Innovation (2014-2020); ERC-2017-CoG; InCell; מספר פרויקט 773091. VC מודה כי פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק של מארי סקלודובסקה-קירי מס' 754354. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ באמצעות מענק 200021_182562.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AC10DSאולימפוסBL-AC10FS-A2הופסק 
Biometra Compact XS/SBiometra GmbH846-025-199 אלקטרופורזה  יחידה
Biometra TRIOBiometra GmbH207072Xthermocycler לחישול
הגדרת AFM מותאמת אישיתמעבדה למכשור ביו-ננו, המכון הבין-פקולטי לביו-הנדסה, בית הספר להנדסה, Ecole Polytechnique Fé dé rale Lausanneניתן להשגה דרך המעבדה למכשור ביו-ננו
EDTAITW ריאגנטיםA5097במאגר חישול
מד כוח לייזרThorlabsPM100Dאופטי כף יד דיגיטלי  קונסולת מד חשמל ואנרגיה
ספק כוח תוסס 3AP, MP-310מדע עיקריMP-310ספק כוח אלקטרופורזה
MgAc2ABCR GmbHAB544692במאגר חישול
TBEThermo Scientific327330010מאגר ריצה לאלקטרופורזה
TRISBio-Rad1610719במאגר חישול

מקורות

  1. Ando, T. High-speed atomic force microscopy and its future prospects. Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).
  2. Uchihashi, T., Scheuring, S. Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes. Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).
  3. Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy. FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).
  4. Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action. Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).
  5. Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6. Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).
  6. Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9, 4983(2018).
  7. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).
  8. Fukuda, S., Ando, T. Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes. Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).
  9. Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).
  10. PeakForce Tapping. , Available from: https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html (2023).
  11. Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021). , Springer. Singapore. 671-679 (2022).
  12. Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties. Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).
  13. Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation. Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).
  14. De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. Jumping mode scanning force microscopy. Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).
  15. Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. Scanning attractive force microscope using photothermal vibration. Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).
  16. Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).
  17. Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif. Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).
  18. Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles. Molecules. 26 (6), 1502(2021).
  19. He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays. Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).
  20. Lipid-DNA Method. , Available from: http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm (2023).
  21. Pyne, A. L. B., et al. Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides. Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).
  22. Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).
  23. Nievergelt, A. P., et al. Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control. Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).
  24. Caroprese, V., et al. Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity. bioRxiv. , (2023).
  25. Welcome to Mao Group. , Available from: https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html (2023).
  26. Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag. 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).
  27. SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/ (2023).
  28. Open Hardware. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/ (2023).
  29. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/ (2023).
  30. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW (2023).
  31. BioLever. AppNano. , Available from: https://www.appnano.com/product-page/biolever (2023).
  32. Python Scripting. , Available from: http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html (2023).
  33. Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).
  34. Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling. arXiv. , (2023).
  35. Giessibl, F. J. Advances in atomic force microscopy. Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).
  36. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). Encyclopedia of Biophysics. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

AFM במהירות גבוההמצב PORTדימות הרכבה עצמיתהפעלת קנטילברהרכבה ביו-מולקולריתדימות בזמן אמתניתוח עקומות כוח
הדמיית מיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה של הרכבה עצמית של מוטיב כוכב תלת-נקודתי של DNA באמצעות הקשה פוטותרמית מחוץ לתהודה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.