הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66471

⸱

5 בינואר 2024

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.

תקציר

Acinetobacter baumannii מוכר כפתוגן גראם-שלילי מאתגר בשל עמידותו הנרחבת לאנטיביוטיקה. חיוני להבין את המנגנונים העומדים מאחורי התנגדות זו כדי לעצב אפשרויות טיפוליות חדשות ויעילות. למרבה הצער, יכולתנו לחקור מנגנונים אלה ב- A. baumannii נפגעת על ידי מיעוט כלי מניפולציה גנטיים מתאימים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לשימוש במערכת כרומוזומלית מבוססת מיני-Tn7 להשגת ביטוי גנים בעותק יחיד בזן A. baumannii חסר מנגנוני אפלוקס פונקציונליים מסוג RND. החדרת עותק יחיד וביטוי משאבת אפלוקס מושרית הם יתרון למדי, מכיוון שנוכחותם של אופרוני אפלוקס RND על פלסמידים בעלי מספר העתק גבוה נסבלת לעתים קרובות בצורה גרועה על ידי תאי חיידקים. יתר על כן, שילוב וקטורי ביטוי מיני-Tn7 רקומביננטיים בכרומוזום של פונדקאי חלופי A. baumannii עם רגישות מוגברת לשטף מסייע לעקוף הפרעות ממשאבות אפלוקס אחרות. מערכת זו היא בעלת ערך לא רק לחקר משאבות אפלוקס חיידקיות לא מאופיינות אלא גם להערכת היעילות של מעכבים פוטנציאליים המכוונים למשאבות אלה.

מבוא

Acinetobacter baumannii הוא פתוגן בעדיפות עליונה של ארגון הבריאות העולמי בשל עמידותו המקיפה לכל סוגי האנטיביוטיקה1. זהו פתוגן אופורטוניסטי המשפיע בעיקר על אנשים מאושפזים, פצועים או מדוכאי חיסון. A. baumannii מתחמק במידה רבה מאנטיביוטיקה באמצעות משאבות אפלוקס, הרלוונטית ביותר היא משפחת היצואנים Resistance-Nodulation-Division (RND)2. הבנת האופן שבו משאבות אפלוקס אלה פועלות באופן מכניסטי תאפשר לפתח אפשרויות טיפוליות ממוקדות.

אחת הדרכים הנפוצות שבהן ניתן להבחין באופן ספציפי בין תהליכים תאיים היא באמצעות מניפולציה גנטית. עם זאת, הכלים הזמינים למחקרים גנטיים של A. baumannii מוגבלים, וכדי לבלבל עוד יותר את תכנון הניסוי, מבודדים קליניים עמידים לעתים קרובות לאנטיביוטיקה המשמשת באופן שגרתי לבחירה במניפולציות גנטיות3. משוכה שנייה בה נתקלים כאשר חוקרים משאבות אפלוקס באופן ספציפי היא שהן מווסתות בקפדנות - לעתים קרובות על ידי גורמים לא ידועים - מה שמקשה על בידוד מדויק וייחוס תפקוד למשאבה בודדת4. כשראינו את הצורך הזה להרחיב את ארגז הכלים של המחקר, פיתחנו מערכת ביטוי אינדוקטיבי מבוססת מיני-Tn7, חד-העתקה, המשלבת קלטת יעד רקומבינאז Flp (FRT), המאפשרת להסיר את סמן הבחירה 5,6,7 (איור 1). מערכת השיבוט והביטוי האלגנטית הזו, שנוצרה לראשונה עבור Pseudomonas 8,9,10, שימשה ליצירת משלים של משאבת אפלוקס בעותק יחיד לזן חסר משאבת אפלוקס RND של A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: להלן A. baumannii AB258) שיצרנו11. היכולת לחקור משאבת אפלוקס אחת בכל פעם ולא להציף את תאי החיידקים בביטוי העתק גבוה (כפי שניתן לראות בדרך כלל במערכות ביטוי מבוססות פלסמיד), ניתן ללמוד טוב יותר על ההיבטים הפיזיולוגיים הקריטיים של כל משאבת אפלוקס עם הפרעה מינימלית וסיבוכים מופחתים.

מאמר זה מתאר כיצד להשתמש במערכת mini-Tn7 כדי להשלים גן שנמחק, RND efflux pump adeIJK, לתוך הכרומוזום של A. baumannii AB258 באמצעות סדרה של צעדים לא מסובכים שבוצעו במהלך 9 ימים7. קבוצת השלבים הראשונה מציגה מחדש את הגנים שנמחקו של משאבת ה-efflux ששובטו לתוך פלסמיד החדרה מבוסס mini-Tn7 (איור 2A) באתר ההחדרה היחיד שלTn7 במורד הזרם של הגן glmS שהשתמר היטב (איור 3A). התהליך הזה מנוהל על-ידי פלסמיד עוזר לא משוכפל (איור 2B) שמקודד לגנים הטרנספוזאזים הדרושים להחדרה מונעת Tn7. קבוצת השלבים השנייה משתמשת בפלסמיד כריתה (איור 2C) להסרה בתיווך רקומבינאז של הגן גנטמיצין שמשני צדדיו אתרי FRT (איור 3B) כדי ליצור זן לא מסומן. למרות שמערכת זו משמשת להבהרת התפקידים החיוניים והמעכבים האפשריים של משאבות RND ביחס לעמידות לאנטיביוטיקה, ניתן להשתמש בה כדי לחקור כל גן מעניין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה ניסיונית

  1. לטהר את פלסמיד pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (פלסמיד החדרה, איור 2A) עם הגן המעניין.
    הערה: כאן, הגן של עניין הוא adeIJK. ריכוז הפלסמיד הסופי צריך להיות ≥100 ng/μL.
  2. טהרו את פלסמיד העזר (pTNS2)9 ואת פלסמיד הכריתה (pFLP2ab)6 (איור 2B,C, בהתאמה), באופן אידיאלי לריכוז דנ"א פלסמיד סופי של ≥100 ננוגרם/μL.
  3. הכינו 50 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים ו-25 מ"ל מרק LB סטרילי (לנוקס) (ראו טבלת חומרים).
  4. הכינו לפחות צלחות אגר במשקל 10 ליברות, כל אחת עם התוספים הבאים: רגיל (ללא תוספים), גנטמיצין (גרם) ב-50 מיקרוגרם/מ"ל, קרבניצילין (Cb) ב-200 מיקרוגרם/מ"ל (לבחירה באמצעות גן עמידות לאמפיצילין) ו-5% סוכרוז (ראו טבלת חומרים).
  5. יש להוציא את המתח לשימוש בהחדרה על אגר LB ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 16-18 שעות. כאן משתמשים ב-A. baumannii AB258.
    הערה: פרוטוקול זה חייב להתבצע בסביבה סטרילית ככל האפשר באמצעות מבער Bunsen בספסל או ארון בטיחות ביולוגי. כל החומרים המתכלים (קצוות פיפטה, לולאות חיסון, צינורות מיקרופוגה וכו ') צריכים להיות סטריליים.

2. הכנת תרבות

  1. חסן מושבה אחת של A. baumannii AB258 לתוך 4 מ"ל של מרק LB בצינור תרבית סטרילי של 13 מ"ל באמצעות לולאת חיסון סטרילית או מקל חיסון סטרילי מעץ.
    הערה: תרבית יחידה של 4 מ"ל משמשת עבור דגימה אחת ובקרה אחת. הגדל את מספר התרביות בהתאם למספר הדגימות הדרושות.
  2. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם רעידות (250 סל"ד).
  3. הניחו בקבוק מים מזוקקים סטריליים (25-50 מ"ל) בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לשימוש בשלב 3.

3. הכנת תאים electrocompetent

  1. הניחו את כל צינורות המיקרופוגה הסטריליים בנפח 1.5 מ"ל (שניים לכל תרבית) ואת קוביות האלקטרופורציה הסטריליות (שתיים בכל תרבית) על קרח (ראו טבלת חומרים). שמור את הדגימות על קרח ככל האפשר לאורך כל ההליך.
  2. מניחים את בקבוק המים הסטריליים שאוחסן ב -4 מעלות צלזיוס על קרח.
  3. מעבירים 1.5 מ"ל של תרבית חיידקים בן לילה לאחד מצינורות המיקרופוגה של 1.5 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות כדי לגלול את התאים.
    הערה: צנטריפוגה תבוצע באופן אידיאלי ב -4 מעלות צלזיוס, אך צנטריפוגה בטמפרטורת הסביבה מקובלת ואינה מזיקה.
  5. בעזרת פיפטה בנפח 1 מ"ל, מסירים את כל הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא.
  6. הוסף עוד 1.5 מ"ל של תרבית חיידקים לתוך אותו צינור microfuge. צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן להסיר את כל supernatant.
  7. חזור על שלב 3.6 פעם אחת אחרונה עם 1 מ"ל התרבות הנותרים.
  8. הוסף 1 מ"ל של מים סטריליים קרים כקרח לגלולת התא והשהה מחדש עם פיפטינג עדין עד שהגלולה כבר לא יושבת בתחתית צינור המיקרופוגה.
  9. צנטריפוגה את התאים המרחפים מחדש ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות.
  10. בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה 1 מ"ל. אין לשפוך את supernatant, במיוחד בשלבי השטיפה הבאים כאשר התאים נוטים ליצור כדוריות פחות קומפקטיות.
  11. חזור על שלב השטיפה עם מים סטריליים קרים כקרח, שלבים 3.8 עד שלב 3.10, פעמיים נוספות.
  12. יש להשהות מחדש בעדינות את גלולת התא הסופית ב-200 מיקרוליטר מים סטריליים קרים כקרח.
  13. העבר 100 μL של תרחיף התא הסופי לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל השני קר כקרח. אליקוט שני זה יהפוך לשליטה השלילית להתחשמלות. שמור את דגימות התאים על קרח.

4. אלקטרופורציה

  1. חם מראש 1 מ"ל של מרק LB ו LB אחד + Gm50 צלחת אגר (מוכן בשלב 1.4) עבור כל דגימה ובקרה באינקובטור סטטי להגדיר 37 ° C.
  2. בנפח משולב של 5 μL או פחות, הוסף 100-200 ng כל אחד מפלסמיד pTNS2 עוזר ואת פלסמיד החדרת pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK לאליציטוט של תאים אלקטרו-מוכשרים.
  3. ערבבו בהקשה עדינה על קצות האצבעות כדי להבטיח ערבוב מלא של הפלסמידים עם התאים החשמליים מבלי להכניס בועות.
  4. מוסיפים נפח שווה ערך של מים מזוקקים סטריליים לתא הבקרה השלילי aliquot ומערבבים בעדינות כנ"ל.
  5. לדגור את הדגימות על קרח במשך 20 דקות.
  6. מעבירים את כל דגימת התא לקובט אלקטרופורציה קר כקרח, ואז מניחים את הקובט בחזרה על קרח. חזור על הפעולה עבור דגימת תא הבקרה השלילית.
  7. אלקטרופורציה של דגימת התא.
    1. הפעל את האלקטרופורטור והגדר אותו ל- 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (ראה טבלת חומרים).
    2. נגבו את פני השטח של הקובט עם רקמה רכה כדי להסיר קרח או לחות שנדבקו.
    3. הכנס את הקובט לתוך האלקטרופורטור וספק את השוק החשמלי.
    4. הוסיפו מיד 0.9 מ"ל של מרק LB שחומם מראש לתאים בקובט ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים עם התקשורת.
    5. מעבירים את כל מתלה התא לצינור מיקרופוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל (טמפרטורת החדר).
    6. בדוק את הערך קבוע הזמן על electroporator; לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ערך זה צריך להיות בין 4 ל- 6.
  8. חזור על הליך האלקטרופורציה (שלבים 4.7.1 עד שלב 4.7.6) עבור דגימת תא הבקרה השלילית.
  9. יש לדגור על הדגימות המחושמלות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ב-250 סל"ד כדי לאפשר התאוששות תאים.
  10. בעזרת מפזר חיסון, פזרו 100 מיקרוליטר מכל דגימת תא מחושמל על צלחת אגר LB + Gm50 שחוממה מראש.
    1. צנטריפוגה את הדגימות הנותרות ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות כדי לגלול את התאים.
    2. לאחר הסרת כל supernatant באמצעות פיפטה, להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של מרק LV.
    3. יש למרוח כל דגימה על צלחות אגר LB + Gmשחוממו מראש.
      הערה: יעילות אלקטרופורציה יכולה להיות תלוית מתח. כאשר מחשמלים זן בפעם הראשונה, זה יכול להיות אינפורמטיבי להוציא נפחים שונים, או אפילו דילולים, של דגימת האלקטרופורציה כדי להבטיח שללוחות המתקבלים יש מושבות מבודדות.
  11. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.

5. בחירת מושבות מותמרות לסינון מבוסס PCR

  1. בדוק את לוחות האלקטרופורציה. לשליטה השלילית לא צריכות להיות מושבות; למדגם צריכות להיות מושבות נפרדות.
    הערה: צלחות עם מושבות, בשלב זה ובכל השלבים הבאים שבהם מיוצרים צלחות אגר עם מושבות או טלאים, ניתן לאחסן ב -4 מעלות צלזיוס עד 3 ימים לפני שתמשיך.
  2. באמצעות קיסמים סטריליים, הרימו עד 10 מושבות בודדות מצלחות האגר LB + Gm50 והדביקו אותן על צלחת אגר LB + Gm50 טרייה.
  3. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.

6. אימות החדרת כרומוזומלית על ידי PCR מושבה

  1. הסר את צלחות האגר LB + Gm50 המכילות את המושבות המטולאות מהאינקובטור.
  2. באמצעות קיסם סטרילי או קצה פיפטה סטרילי, להסיר חלק קטן (בערך בגודל של מושבה גדולה) מטלאי לתוך 20 μL של מים מזוקקים סטריליים בצינור PCR 0.2 מ"ל; מערבבים היטב. דגימת המים אמורה להיות עכורה לעין כאשר התאים משתחררים מהקיסם. הכינו כל מספר של דגימות שצריך לסנן, אבל 6 צריך להיות מספיק.
  3. יש לדגור על צינור ה-PCR המכיל את התרחיף החיידקי בטמפרטורה של 100°C למשך 5-10 דקות.
  4. באמצעות מיני-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים), סובבו את הדגימה במהירות המרבית הקבועה למשך 2 דקות כדי להשליך פסולת תאית.
  5. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור PCR חדש בנפח 0.2 מ"ל ומניחים אותו על קרח. דגימה זו מכילה את ה- DNA של התבנית עבור תגובת PCR.
    הערה: ניתן לאחסן DNA של תבנית זו בטמפרטורה של -20°C לפני שתמשיך עם PCR.
  6. הכן תערובת תגובת PCR המכילה מאגר פולימראז 1x, 200 μM dNTPs, פריימר קדמי ABglmS2_F_New 0.18 μM, פריימר הפוך 0.18 μM Tn7R (טבלה 1), U אחד של Taq DNA פולימראז ו-1 μL של DNA התבנית שהוכנה בנפח כולל של 25 μL. הכן פקד ללא תבנית (NTC), כולל כל ה- DNA של התבנית מלבד התבנית (ראה טבלת חומרים).
  7. הזן את תנאי התגובה לתוך מחזור תרמי: 95 °C למשך 2 דקות; 95 ° C עבור 30 שניות, 49 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 s עבור סך של 35 מחזורים; 72 °C למשך 10 דקות; החזקה של 12°C. הפעל את הדגימות.
  8. לאחר הוספת צבע העמסת DNA לריכוז סופי של 1x, יש להעמיס 10 μL מכל תגובת PCR על ג'ל אגרוז 2% ולרוץ במתח של 80 וולט למשך 40 דקות. גודל האמפליקון הצפוי עבור זוג פריימר זה הוא 382 bp. ל-NTC לא צריכות להיות להקות.
  9. זהה את הדגימות שהפיקו את מוצר ה- PCR הצפוי. הכינו צלחת פסים על LB + Gm50 צלחות אגר מכל אחד מהמדבקות החיוביות PCR; לדגור ב 37 ° C במשך 16-18 שעות. המטרה היא ליצור צלחת עם מושבות בודדות להכנת מלאי גליצרול לשימור זן מסומן זה וכנקודת מוצא ליצירת זן לא מסומן (המתואר להלן).

7. הסרתסמןGm R באמצעות pFLP2ab

  1. בצע את ההליך המוזכר בשלב 2: הכנת תרבית. הדגימה המשמשת להכנת תרבית הלילה היא מושבה בודדת מלוחות אגר LB + Gm50 שהוכנו ליצירת מושבות נפרדות בשלב 6.9.
  2. בצע את ההליך המוזכר בשלב 3: הכנת תאים electrocompetent. הכינו את התאים מתרבית הלילה להתחשמלות.
  3. בצע את ההליך המוזכר בשלב 4: אלקטרופורציה. כאן, הפלסמיד שיש להכניס לתאים הוא pFLP2ab (100-200 ng), אשר יסיר את גן העמידות לגנטמיצין, האגף את הגן המוחדר כרומוזומלית של עניין.
  4. לאחר שהתאים התאוששו במשך שעה אחת (שלב 4.9), פזרו 100 μL של דגימת התא המחושמל על צלחת אגר LB + Cb200 שחוממה מראש (שהוכנה בשלב 1.4). לחץ סלקטיבי זה מבטיח שרק תאים המכילים את פלסמיד הכריתה pFLP2ab יגדלו.
  5. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.
  6. בדוק את הצלחת עבור מושבות. לצלחת הבקרה השלילית לא צריכות להיות מושבות; צלחת מדגם LB + Cb200 אגר צריכה להיות מושבות נפרדות.
  7. באמצעות קיסמים סטריליים, הצליבו עד 20 מושבות מבודדות על צלחת אגר LB + Cb200 וצלחת אגר LB + Gm50 .
  8. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  9. בדוק את הצלחות עבור טלאים. לשיבוטים שגדלים על צלחת האגר LB + Cb200 אך לא על צלחת האגר LB + Gm50 הוסר גן העמידות לגנטמיצין מהתוספת המקורית.
  10. בחר את המדבקות העמידות בפני קרבניצלין וגנטמיצין רגישות לפסים על צלחות אגר LB בודדות בתוספת 5% (w/v) סוכרוז, מה שמאלץ את גירוש פלסמיד pFLP2ab מהחיידקים. בחר עד 10 מושבות.
  11. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  12. בדוק את הצלחות עבור מושבות.
  13. כאישור סופי לאובדן פלסמיד pFLP2ab , הצליבו טלאי 4-6 מושבות מבודדות מלוחות הסוכרוז 5% על צלחת אגר LB + Cb200 וצלחת אגר LB.
  14. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  15. בחר שיבוט שגדל על צלחת אגר LB, וזה קרבניצלין רגיש להכנת מלאי גליצרול כדי לשמר את הזן הלא מסומן הזה.
    1. אימות גנטי של הזן הבלתי מסומן יכול להתבצע באמצעות PCR מושבה (שלב 6: אימות החדרת כרומוזומלית על ידי PCR מושבה) באמצעות פריימרים המכוונים לגן עמידות לגנטמיצין.
    2. הכינו תערובת תגובת PCR המכילה 1x פולימראז באפר, 200 μM dNTPs, 0.18 μM Gm_F פריימר קדמי, 0.18 μM Gm_R פריימר הפוך (טבלה 1), 1U של Taq DNA פולימראז ו-1 μL של DNA התבנית שהוכנה בנפח כולל של 25 μL. הכן פקד ללא תבנית (NTC) כולל כל ה- DNA של התבנית מלבד התבנית, ובקרה חיובית באמצעות DNA מהזן המסומן.
    3. הזן את תנאי התגובה לתוך מחזור תרמי: 95 °C למשך 2 דקות; 95 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 40 s עבור סך של 35 מחזורים; 72 °C למשך 10 דקות; החזקה של 12°C. הפעל את הדגימות.
    4. לאחר הוספת צבע העמסת DNA לריכוז סופי של 1x, יש לטעון 10 μL מכל תגובת PCR על ג'ל אגרוז 1% ולרוץ במתח של 80 וולט למשך 40 דקות. גודל האמפליקון הצפוי עבור זוג פריימר זה הוא 525 bp. השליטה החיובית צריכה להיות להקה אחת; הדגימות וה- NTC לא צריכות להיות להקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הליך החדרת הכרומוזומלי לוקח רק שעתיים בסך הכל במשך 3 ימים כדי לראות מושבות תוצאה גדלות על לוחית אגר סלקטיבית (איור 1A-C). מספר המושבות הצפוי על לוח הטרנספורמציה תלוי במתח: ניתן לראות 20-30 או אפילו מאות מושבות שכן החדרת Tn7 באתרי attTn7 היא ספציפית ויעילה9. תיקון מושבות לוחות טרנספורמציה על מדיה סלקטיבית (איור 4A) משמר את הזן שעבר טרנספורמציה ומספק חומר מוצא לבדיקת PCR של מושבות (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אף על פי שהליך זה להחדרה כרומוזומלית של מערכת ביטוי גנים חד-עותקית מושרית ב- A. baumannii הוא פשוט מבחינה טכנית ואינו דורש עבודה רבה, ישנם מספר שלבים חשובים שיש לשים עליהם דגש. ראשית, הכנת התאים המוסמכים צריכה להיעשות על קרח ככל האפשר מכיוון שהתאים הופכים שבירים במהלך החלפת המדיה במים קרים כקרח. באופן אידיאלי, שלבי הצנטריפוגה מבוצעים ב -4 מעלות צלזיוס, אך צנטריפוגה בטמפרטורת החדר מקובלת. בהתחשב בשבריריות הגוברת של התאים במהלך שטיפת המים, פיפטינג עדין הוא גם קריטי. שנית, אלקטרופורציה רגישה לנוכחות יונים. שטיפת הת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק גילוי מהמועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ל- AK. הסכמות המשמשות באיורים נוצרות עם BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור PCR 0.2 מ"לVWR20170-012לתכשירי הרתחת מושבה ותגובות PCR
צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"לSarstedt72-690-301שימוש כללי
בצינורות תרבית 13 מ"ל, PyrexFisher14-957Kכלי תרבית נוזלית
6x מאגר טעינת DNAFroggabioLD010אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז טעינת דגימה צבע
אצטי חומצה, קרחוןפישר351271-212רכיב חיץ ריצה של ג'ל אגרוז
AgarBioshopAGR003מצע גידול מוצק
AgaroseBioBasicD0012הפרדה אלקטרופורטית של תוצרי תגובת PCR; בשימוש בריכוז של 0.8–
יחידת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוזפישר29-237-54אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז; הפרדת תוצרי תגובת PCR
קרבניציליןפישר50841231סלקטיבית
סגירות צינור תרביתפישר13-684-138סגירת נירוסטה לצינורות תרבית של 13 מ"ל
סט דאוקסינוקלאוטיד טריפוספט (dNTP)ביובייסיקDD0058רכיב תגובת PCR; מסופק כ-100 מ"מ כל אחד dATP, dCTP, dGTP, dTTP; מעורבב ומדולל עבור 10 מ"מ כל אחד dNTP
אמבטיה יבשה / מחמם בלוקפישר88860023אמבטיה יבשה דיגיטלית איזוטמפ להכנות להרתחה
קוביות אלקטרופורציהVWR89047-208קובטות אלקטרופורציה 2 מ"מ עם מכסה עגול
אלקטרופורטורקול פארמר940000009110 VAC, 60 הרץ אלקטרופורטור
אתידיום ברומידפישרBP102-1הדמיה של תוצרי תגובת PCR וסמן DNA בג'ל אגרוז
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)VWRCA-EM4050רכיב חיץ ריצה של ג'ל אגרוז
GentamicinBiobasicGB0217להכנת מדיה סלקטיבית
גליצרולפישרG33הכנת מלאי חיידקים לאחסון לטווח ארוך במקפיא נמוך במיוחד
אינקובטור (טלטול)ניו ברונסוויק סיינטיפיקM1352-0000Excella E24 שייקר חממה לגידול תרבית נוזלית
חממה (סטטית)פישר11-690-550Dתנור חממה איזוטמפ דגם 550D לגידול תרבית מוצק (LB אגר)
לולאת חיסוןSarstedt86.1562.050פסים מושבות על צלחות אגר
מפזר חיסוןSarstedt86.1569.005התפשטות של תרבית על צלחות אגר
מרק ליזוגני (LB), לנוקספישרBP1427מצע גידול נוזלי (20 גרם/ליטר: 5 גרם/ליטר נתרן כלורי, 10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים)
מיקרופוגהפישר75002431Sorvall Legend Micro 17 לצנטריפוגה של דגימות
מיני צנטריפוגהפישרS67601Bצנטריפוגה של 0.2 מ"ל צינורות PCR צלחות
פטריSPL מדעי החיים10090למצעי גידול מוצקים (לוחות אגר): 90 x 15 מ"מ
פיפטות פיפטות חד-ערוציות של מנדל גילסון שונות (P10, P20, P200, P1000)
ספק כוחBiorad1645050PowerPac ספק כוח בסיסי לאלקטרופורזה
פריימריםIDTNAPCR רכיב תגובה ספציפי לגן המעניין; מוכן ב-100 μ M לפי ההוראות בגיליון מפרט המוצר
SucroseBioBasicSB0498להכנת מדיה נגדית להסרת פלסמיד pFLP2ab מרכיב תגובת A. baumannii
Taq DNA פולימראזFroggaBioT-500PCR; פולימראז מסופק עם מאגר 10x
ThermalcyclerBiorad 1861096דגם T100 עבור PCR
קיסמיםפישרS24559לתיקון מושבות על צלחות אגר
בסיס TrizmaSigmaT1503רכיב חיץ ריצה של ג'ל אגרוז
מים טהוריםMillipore SigmaZLXLSD51040MilliQ מערכת טיהור מים: מים טהורים במיוחד להכנת מדיה ותמיסה, ושטיפת תאים
סמן DNA רחב טווחBiobasicM103R-2קביעת גודל של מוצרי PCR על ג'ל אגרוז
מקלות חיסון מעץפישר29-801-02חיסון תרבויות עם מושבות מצלחות אגר
2% מדיה במיוחד

מקורות

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288(2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373(2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110(2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045(2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ביטוי משאבות שאיבהמערכת Chromosomal Mini-Tn7מנגנוני שאיבה מסוג RNDתאים אלקטרו-קומפטנטיםסריקת Colony PCRעמידות לאנטיביוטיקההשחלת גנים
אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.