אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

Summary

אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.

Abstract

Acinetobacter baumannii מוכר כפתוגן גראם-שלילי מאתגר בשל עמידותו הנרחבת לאנטיביוטיקה. חיוני להבין את המנגנונים העומדים מאחורי התנגדות זו כדי לעצב אפשרויות טיפוליות חדשות ויעילות. למרבה הצער, יכולתנו לחקור מנגנונים אלה ב- A. baumannii נפגעת על ידי מיעוט כלי מניפולציה גנטיים מתאימים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לשימוש במערכת כרומוזומלית מבוססת מיני-Tn7 להשגת ביטוי גנים בעותק יחיד בזן A. baumannii חסר מנגנוני אפלוקס פונקציונליים מסוג RND. החדרת עותק יחיד וביטוי משאבת אפלוקס מושרית הם יתרון למדי, מכיוון שנוכחותם של אופרוני אפלוקס RND על פלסמידים בעלי מספר העתק גבוה נסבלת לעתים קרובות בצורה גרועה על ידי תאי חיידקים. יתר על כן, שילוב וקטורי ביטוי מיני-Tn7 רקומביננטיים בכרומוזום של פונדקאי חלופי A. baumannii עם רגישות מוגברת לשטף מסייע לעקוף הפרעות ממשאבות אפלוקס אחרות. מערכת זו היא בעלת ערך לא רק לחקר משאבות אפלוקס חיידקיות לא מאופיינות אלא גם להערכת היעילות של מעכבים פוטנציאליים המכוונים למשאבות אלה.

Introduction

Acinetobacter baumannii הוא פתוגן בעדיפות עליונה של ארגון הבריאות העולמי בשל עמידותו המקיפה לכל סוגי האנטיביוטיקה¹. זהו פתוגן אופורטוניסטי המשפיע בעיקר על אנשים מאושפזים, פצועים או מדוכאי חיסון. A. baumannii מתחמק במידה רבה מאנטיביוטיקה באמצעות משאבות אפלוקס, הרלוונטית ביותר היא משפחת היצואנים Resistance-Nodulation-Division (RND)². הבנת האופן שבו משאבות אפלוקס אלה פועלות באופן מכניסטי תאפשר לפתח אפשרויות טיפוליות ממוקדות.

אחת הדרכים הנפוצות שבהן ניתן להבחין באופן ספציפי בין תהליכים תאיים היא באמצעות מניפולציה גנטית. עם זאת, הכלים הזמינים למחקרים גנטיים של A. baumannii מוגבלים, וכדי לבלבל עוד יותר את תכנון הניסוי, מבודדים קליניים עמידים לעתים קרובות לאנטיביוטיקה המשמשת באופן שגרתי לבחירה במניפולציות גנטיות³. משוכה שנייה בה נתקלים כאשר חוקרים משאבות אפלוקס באופן ספציפי היא שהן מווסתות בקפדנות - לעתים קרובות על ידי גורמים לא ידועים - מה שמקשה על בידוד מדויק וייחוס תפקוד למשאבה בודדת⁴. כשראינו את הצורך הזה להרחיב את ארגז הכלים של המחקר, פיתחנו מערכת ביטוי אינדוקטיבי מבוססת מיני-Tn7, חד-העתקה, המשלבת קלטת יעד רקומבינאז Flp (FRT), המאפשרת להסיר את סמן הבחירה ^5,6,7 (איור 1). מערכת השיבוט והביטוי האלגנטית הזו, שנוצרה לראשונה עבור Pseudomonas ^8,9,10, שימשה ליצירת משלים של משאבת אפלוקס בעותק יחיד לזן חסר משאבת אפלוקס RND של A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: להלן A. baumannii AB258) שיצרנו¹¹. היכולת לחקור משאבת אפלוקס אחת בכל פעם ולא להציף את תאי החיידקים בביטוי העתק גבוה (כפי שניתן לראות בדרך כלל במערכות ביטוי מבוססות פלסמיד), ניתן ללמוד טוב יותר על ההיבטים הפיזיולוגיים הקריטיים של כל משאבת אפלוקס עם הפרעה מינימלית וסיבוכים מופחתים.

מאמר זה מתאר כיצד להשתמש במערכת mini-Tn7 כדי להשלים גן שנמחק, RND efflux pump adeIJK, לתוך הכרומוזום של A. baumannii AB258 באמצעות סדרה של צעדים לא מסובכים שבוצעו במהלך 9 ימים⁷. קבוצת השלבים הראשונה מציגה מחדש את הגנים שנמחקו של משאבת ה-efflux ששובטו לתוך פלסמיד החדרה מבוסס mini-Tn7 (איור 2A) באתר ההחדרה היחיד שלTn7 במורד הזרם של הגן glmS שהשתמר היטב (איור 3A). התהליך הזה מנוהל על-ידי פלסמיד עוזר לא משוכפל (איור 2B) שמקודד לגנים הטרנספוזאזים הדרושים להחדרה מונעת Tn7. קבוצת השלבים השנייה משתמשת בפלסמיד כריתה (איור 2C) להסרה בתיווך רקומבינאז של הגן גנטמיצין שמשני צדדיו אתרי FRT (איור 3B) כדי ליצור זן לא מסומן. למרות שמערכת זו משמשת להבהרת התפקידים החיוניים והמעכבים האפשריים של משאבות RND ביחס לעמידות לאנטיביוטיקה, ניתן להשתמש בה כדי לחקור כל גן מעניין.

Protocol

1. הכנה ניסיונית

1. לטהר את פלסמיד pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (פלסמיד החדרה, איור 2A) עם הגן המעניין.
   הערה: כאן, הגן של עניין הוא adeIJK. ריכוז הפלסמיד הסופי צריך להיות ≥100 ng/μL.
2. טהרו את פלסמיד העזר (pTNS2)⁹ ואת פלסמיד הכריתה (pFLP2^ab)⁶ (איור 2B,C, בהתאמה), באופן אידיאלי לריכוז דנ"א פלסמיד סופי של ≥100 ננוגרם/μL.
3. הכינו 50 מ"ל מים סטריליים אולטרה-טהורים ו-25 מ"ל מרק LB סטרילי (לנוקס) (ראו טבלת חומרים).
4. הכינו לפחות צלחות אגר במשקל 10 ליברות, כל אחת עם התוספים הבאים: רגיל (ללא תוספים), גנטמיצין (גרם) ב-50 מיקרוגרם/מ"ל, קרבניצילין (Cb) ב-200 מיקרוגרם/מ"ל (לבחירה באמצעות גן עמידות לאמפיצילין) ו-5% סוכרוז (ראו טבלת חומרים).
5. יש להוציא את המתח לשימוש בהחדרה על אגר LB ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 16-18 שעות. כאן משתמשים ב-A. baumannii AB258.
   הערה: פרוטוקול זה חייב להתבצע בסביבה סטרילית ככל האפשר באמצעות מבער Bunsen בספסל או ארון בטיחות ביולוגי. כל החומרים המתכלים (קצוות פיפטה, לולאות חיסון, צינורות מיקרופוגה וכו ') צריכים להיות סטריליים.

2. הכנת תרבות

1. חסן מושבה אחת של A. baumannii AB258 לתוך 4 מ"ל של מרק LB בצינור תרבית סטרילי של 13 מ"ל באמצעות לולאת חיסון סטרילית או מקל חיסון סטרילי מעץ.
   הערה: תרבית יחידה של 4 מ"ל משמשת עבור דגימה אחת ובקרה אחת. הגדל את מספר התרביות בהתאם למספר הדגימות הדרושות.
2. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם רעידות (250 סל"ד).
3. הניחו בקבוק מים מזוקקים סטריליים (25-50 מ"ל) בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לשימוש בשלב 3.

3. הכנת תאים electrocompetent

1. הניחו את כל צינורות המיקרופוגה הסטריליים בנפח 1.5 מ"ל (שניים לכל תרבית) ואת קוביות האלקטרופורציה הסטריליות (שתיים בכל תרבית) על קרח (ראו טבלת חומרים). שמור את הדגימות על קרח ככל האפשר לאורך כל ההליך.
2. מניחים את בקבוק המים הסטריליים שאוחסן ב -4 מעלות צלזיוס על קרח.
3. מעבירים 1.5 מ"ל של תרבית חיידקים בן לילה לאחד מצינורות המיקרופוגה של 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות כדי לגלול את התאים.
   הערה: צנטריפוגה תבוצע באופן אידיאלי ב -4 מעלות צלזיוס, אך צנטריפוגה בטמפרטורת הסביבה מקובלת ואינה מזיקה.
5. בעזרת פיפטה בנפח 1 מ"ל, מסירים את כל הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא.
6. הוסף עוד 1.5 מ"ל של תרבית חיידקים לתוך אותו צינור microfuge. צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן להסיר את כל supernatant.
7. חזור על שלב 3.6 פעם אחת אחרונה עם 1 מ"ל התרבות הנותרים.
8. הוסף 1 מ"ל של מים סטריליים קרים כקרח לגלולת התא והשהה מחדש עם פיפטינג עדין עד שהגלולה כבר לא יושבת בתחתית צינור המיקרופוגה.
9. צנטריפוגה את התאים המרחפים מחדש ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות.
10. בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה 1 מ"ל. אין לשפוך את supernatant, במיוחד בשלבי השטיפה הבאים כאשר התאים נוטים ליצור כדוריות פחות קומפקטיות.
11. חזור על שלב השטיפה עם מים סטריליים קרים כקרח, שלבים 3.8 עד שלב 3.10, פעמיים נוספות.
12. יש להשהות מחדש בעדינות את גלולת התא הסופית ב-200 מיקרוליטר מים סטריליים קרים כקרח.
13. העבר 100 μL של תרחיף התא הסופי לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל השני קר כקרח. אליקוט שני זה יהפוך לשליטה השלילית להתחשמלות. שמור את דגימות התאים על קרח.

4. אלקטרופורציה

1. חם מראש 1 מ"ל של מרק LB ו LB אחד + Gm⁵⁰ צלחת אגר (מוכן בשלב 1.4) עבור כל דגימה ובקרה באינקובטור סטטי להגדיר 37 ° C.
2. בנפח משולב של 5 μL או פחות, הוסף 100-200 ng כל אחד מפלסמיד pTNS2 עוזר ואת פלסמיד החדרת pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK לאליציטוט של תאים אלקטרו-מוכשרים.
3. ערבבו בהקשה עדינה על קצות האצבעות כדי להבטיח ערבוב מלא של הפלסמידים עם התאים החשמליים מבלי להכניס בועות.
4. מוסיפים נפח שווה ערך של מים מזוקקים סטריליים לתא הבקרה השלילי aliquot ומערבבים בעדינות כנ"ל.
5. לדגור את הדגימות על קרח במשך 20 דקות.
6. מעבירים את כל דגימת התא לקובט אלקטרופורציה קר כקרח, ואז מניחים את הקובט בחזרה על קרח. חזור על הפעולה עבור דגימת תא הבקרה השלילית.
7. אלקטרופורציה של דגימת התא.
   1. הפעל את האלקטרופורטור והגדר אותו ל- 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (ראה טבלת חומרים).
   2. נגבו את פני השטח של הקובט עם רקמה רכה כדי להסיר קרח או לחות שנדבקו.
   3. הכנס את הקובט לתוך האלקטרופורטור וספק את השוק החשמלי.
   4. הוסיפו מיד 0.9 מ"ל של מרק LB שחומם מראש לתאים בקובט ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים עם התקשורת.
   5. מעבירים את כל מתלה התא לצינור מיקרופוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל (טמפרטורת החדר).
   6. בדוק את הערך קבוע הזמן על electroporator; לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ערך זה צריך להיות בין 4 ל- 6.
8. חזור על הליך האלקטרופורציה (שלבים 4.7.1 עד שלב 4.7.6) עבור דגימת תא הבקרה השלילית.
9. יש לדגור על הדגימות המחושמלות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ב-250 סל"ד כדי לאפשר התאוששות תאים.
10. בעזרת מפזר חיסון, פזרו 100 מיקרוליטר מכל דגימת תא מחושמל על צלחת אגר LB + Gm⁵⁰ שחוממה מראש.
    1. צנטריפוגה את הדגימות הנותרות ב 13,000 x גרם במשך 2 דקות כדי לגלול את התאים.
    2. לאחר הסרת כל supernatant באמצעות פיפטה, להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של מרק LV.
    3. יש למרוח כל דגימה על צלחות אגר LB + Gm^שחוממו מראש.
       הערה: יעילות אלקטרופורציה יכולה להיות תלוית מתח. כאשר מחשמלים זן בפעם הראשונה, זה יכול להיות אינפורמטיבי להוציא נפחים שונים, או אפילו דילולים, של דגימת האלקטרופורציה כדי להבטיח שללוחות המתקבלים יש מושבות מבודדות.
11. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.

5. בחירת מושבות מותמרות לסינון מבוסס PCR

1. בדוק את לוחות האלקטרופורציה. לשליטה השלילית לא צריכות להיות מושבות; למדגם צריכות להיות מושבות נפרדות.
   הערה: צלחות עם מושבות, בשלב זה ובכל השלבים הבאים שבהם מיוצרים צלחות אגר עם מושבות או טלאים, ניתן לאחסן ב -4 מעלות צלזיוס עד 3 ימים לפני שתמשיך.
2. באמצעות קיסמים סטריליים, הרימו עד 10 מושבות בודדות מצלחות האגר LB + Gm⁵⁰ והדביקו אותן על צלחת אגר LB + Gm⁵⁰ טרייה.
3. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.

6. אימות החדרת כרומוזומלית על ידי PCR מושבה

1. הסר את צלחות האגר LB + Gm⁵⁰ המכילות את המושבות המטולאות מהאינקובטור.
2. באמצעות קיסם סטרילי או קצה פיפטה סטרילי, להסיר חלק קטן (בערך בגודל של מושבה גדולה) מטלאי לתוך 20 μL של מים מזוקקים סטריליים בצינור PCR 0.2 מ"ל; מערבבים היטב. דגימת המים אמורה להיות עכורה לעין כאשר התאים משתחררים מהקיסם. הכינו כל מספר של דגימות שצריך לסנן, אבל 6 צריך להיות מספיק.
3. יש לדגור על צינור ה-PCR המכיל את התרחיף החיידקי בטמפרטורה של 100°C למשך 5-10 דקות.
4. באמצעות מיני-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים), סובבו את הדגימה במהירות המרבית הקבועה למשך 2 דקות כדי להשליך פסולת תאית.
5. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור PCR חדש בנפח 0.2 מ"ל ומניחים אותו על קרח. דגימה זו מכילה את ה- DNA של התבנית עבור תגובת PCR.
   הערה: ניתן לאחסן DNA של תבנית זו בטמפרטורה של -20°C לפני שתמשיך עם PCR.
6. הכן תערובת תגובת PCR המכילה מאגר פולימראז 1x, 200 μM dNTPs, פריימר קדמי ABglmS2_F_New 0.18 μM, פריימר הפוך 0.18 μM Tn7R (טבלה 1), U אחד של Taq DNA פולימראז ו-1 μL של DNA התבנית שהוכנה בנפח כולל של 25 μL. הכן פקד ללא תבנית (NTC), כולל כל ה- DNA של התבנית מלבד התבנית (ראה טבלת חומרים).
7. הזן את תנאי התגובה לתוך מחזור תרמי: 95 °C למשך 2 דקות; 95 ° C עבור 30 שניות, 49 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 30 s עבור סך של 35 מחזורים; 72 °C למשך 10 דקות; החזקה של 12°C. הפעל את הדגימות.
8. לאחר הוספת צבע העמסת DNA לריכוז סופי של 1x, יש להעמיס 10 μL מכל תגובת PCR על ג'ל אגרוז 2% ולרוץ במתח של 80 וולט למשך 40 דקות. גודל האמפליקון הצפוי עבור זוג פריימר זה הוא 382 bp. ל-NTC לא צריכות להיות להקות.
9. זהה את הדגימות שהפיקו את מוצר ה- PCR הצפוי. הכינו צלחת פסים על LB + Gm⁵⁰ צלחות אגר מכל אחד מהמדבקות החיוביות PCR; לדגור ב 37 ° C במשך 16-18 שעות. המטרה היא ליצור צלחת עם מושבות בודדות להכנת מלאי גליצרול לשימור זן מסומן זה וכנקודת מוצא ליצירת זן לא מסומן (המתואר להלן).

7. הסרתסמן^{Gm R} באמצעות pFLP2^ab

1. בצע את ההליך המוזכר בשלב 2: הכנת תרבית. הדגימה המשמשת להכנת תרבית הלילה היא מושבה בודדת מלוחות אגר LB + Gm⁵⁰ שהוכנו ליצירת מושבות נפרדות בשלב 6.9.
2. בצע את ההליך המוזכר בשלב 3: הכנת תאים electrocompetent. הכינו את התאים מתרבית הלילה להתחשמלות.
3. בצע את ההליך המוזכר בשלב 4: אלקטרופורציה. כאן, הפלסמיד שיש להכניס לתאים הוא pFLP2^ab (100-200 ng), אשר יסיר את גן העמידות לגנטמיצין, האגף את הגן המוחדר כרומוזומלית של עניין.
4. לאחר שהתאים התאוששו במשך שעה אחת (שלב 4.9), פזרו 100 μL של דגימת התא המחושמל על צלחת אגר LB + Cb²⁰⁰ שחוממה מראש (שהוכנה בשלב 1.4). לחץ סלקטיבי זה מבטיח שרק תאים המכילים את פלסמיד הכריתה pFLP2^ab יגדלו.
5. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 16-18 שעות.
6. בדוק את הצלחת עבור מושבות. לצלחת הבקרה השלילית לא צריכות להיות מושבות; צלחת מדגם LB + Cb²⁰⁰ אגר צריכה להיות מושבות נפרדות.
7. באמצעות קיסמים סטריליים, הצליבו עד 20 מושבות מבודדות על צלחת אגר LB + Cb²⁰⁰ וצלחת אגר LB + Gm⁵⁰ .
8. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
9. בדוק את הצלחות עבור טלאים. לשיבוטים שגדלים על צלחת האגר LB + Cb²⁰⁰ אך לא על צלחת האגר LB + Gm⁵⁰ הוסר גן העמידות לגנטמיצין מהתוספת המקורית.
10. בחר את המדבקות העמידות בפני קרבניצלין וגנטמיצין רגישות לפסים על צלחות אגר LB בודדות בתוספת 5% (w/v) סוכרוז, מה שמאלץ את גירוש פלסמיד pFLP2^ab מהחיידקים. בחר עד 10 מושבות.
11. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
12. בדוק את הצלחות עבור מושבות.
13. כאישור סופי לאובדן פלסמיד pFLP2^ab , הצליבו טלאי 4-6 מושבות מבודדות מלוחות הסוכרוז 5% על צלחת אגר LB + Cb²⁰⁰ וצלחת אגר LB.
14. לדגור את הצלחות במשך 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
15. בחר שיבוט שגדל על צלחת אגר LB, וזה קרבניצלין רגיש להכנת מלאי גליצרול כדי לשמר את הזן הלא מסומן הזה.
    1. אימות גנטי של הזן הבלתי מסומן יכול להתבצע באמצעות PCR מושבה (שלב 6: אימות החדרת כרומוזומלית על ידי PCR מושבה) באמצעות פריימרים המכוונים לגן עמידות לגנטמיצין.
    2. הכינו תערובת תגובת PCR המכילה 1x פולימראז באפר, 200 μM dNTPs, 0.18 μM Gm_F פריימר קדמי, 0.18 μM Gm_R פריימר הפוך (טבלה 1), 1U של Taq DNA פולימראז ו-1 μL של DNA התבנית שהוכנה בנפח כולל של 25 μL. הכן פקד ללא תבנית (NTC) כולל כל ה- DNA של התבנית מלבד התבנית, ובקרה חיובית באמצעות DNA מהזן המסומן.
    3. הזן את תנאי התגובה לתוך מחזור תרמי: 95 °C למשך 2 דקות; 95 ° C עבור 30 שניות, 50 ° C עבור 30 שניות, ו 72 ° C עבור 40 s עבור סך של 35 מחזורים; 72 °C למשך 10 דקות; החזקה של 12°C. הפעל את הדגימות.
    4. לאחר הוספת צבע העמסת DNA לריכוז סופי של 1x, יש לטעון 10 μL מכל תגובת PCR על ג'ל אגרוז 1% ולרוץ במתח של 80 וולט למשך 40 דקות. גודל האמפליקון הצפוי עבור זוג פריימר זה הוא 525 bp. השליטה החיובית צריכה להיות להקה אחת; הדגימות וה- NTC לא צריכות להיות להקות.

Results

הליך החדרת הכרומוזומלי לוקח רק שעתיים בסך הכל במשך 3 ימים כדי לראות מושבות תוצאה גדלות על לוחית אגר סלקטיבית (איור 1A-C). מספר המושבות הצפוי על לוח הטרנספורמציה תלוי במתח: ניתן לראות 20-30 או אפילו מאות מושבות שכן החדרת Tn7 באתרי attTn7 היא ספציפית ויעילה⁹. תיקון מושבות לוחות טרנספורמציה על מדיה סלקטיבית (איור 4A) משמר את הזן שעבר טרנספורמציה ומספק חומר מוצא לבדיקת PCR של מושבות (איור 1E ואיור 4B). ניתן לצמצם את בדיקת המושבות על ידי PCR למינימום האפשרי - אין צורך לעבד יותר מ-10 מושבות, ורובן אמורות להניב תוצאה חיובית להחדרה. מוצר ה-PCR עבור פריימרי ההקרנה, ABglmS2_F_New ו-Tn7R (טבלה 1), הוא 382 bp (איור 4B נתיב 4); בקרות שליליות לתגובה כוללות סוג פראי A. baumannii ATCC 17978 (איור 4B נתיב 2), AB258 (איור 4B נתיב 3), וללא תבנית (איור 4B נתיב 5). מושבות חיוביות ל-PCR מייצגות זנים משלימים ומסומנים.

הסרת גן העמידות לגנטמיצין (unmarking) נמשכת פחות מ-3 שעות, ונמשכות 6 ימים, מאחר שיש לבחור תאים שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד הכריתה באמצעות ציפוי סלקטיבי, ואז יש לרפא את פלסמיד הכריתה מהחיידקים (איור 1F). כריתה מבוססת רקומבינציה Flp-FRT מדויקת ויעילה ואמורה לגרום ל-≥20 מושבות על לוח הטרנספורמציה. מושבות המוצלבות על קרבניצלין (בחירה בעמידות ל-β-לקטם המוענקת על ידי פלסמיד הכריתה) וגנטמיצין (מחפשות אובדן עמידות לגנטמיצין) צריכות כולן להיות עמידות לקרבניצלין ורגישות לגנטמיצין, בהתאמה. פלסמיד הכריתה נאלץ לצאת מהחיידק על ידי גידול על צלחות אגר סוכרוז 5%. גידול על סוכרוז מאלץ את התאים לחסל pFLP2^ab כמו הגן sacB על פלסמיד מקדם את ההמרה של סוכרוז levans, רב סוכר רעיל לחיידקים^12,13. כל המושבות שגדלות על מצע סוכרוז 5% צריכות לגדול רק על צלחות אגר LB רגילות; לא אמורה להיות צמיחה על צלחות אגר קרבניצלין. מושבות הגדלות על לוחות אגר LB פשוטים מייצגים זנים לא מסומנים. אישור אובדן סמן הגנטמיצין יכול להיות מושג על ידי PCR מושבה באמצעות פריימרים Gm_F ו-Gm_R (טבלה 1 ואיור 5). זוג פריימר זה מניב אמפליקון של 525 bp רק בבקרה החיובית (הזן המסומן שנוצר בתחילה, איור 5 נתיב 4); ATCC 17978 מסוג פראי (איור 5 נתיב 2), AB258 (איור 5 נתיב 3), כל מושבה שנבדקה (איור 5 נתיב 5) ופקד ללא תבנית (איור 5 נתיב 6) לא אמורים להציג הגברה.

לאחר אישור הזן הלא מסומן, ניתן להתחיל בבדיקות פונקציונאליות עם בדיקות פנוטיפיות. כאן, הבחירה הראשונה המתבקשת היא קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של מגוון סוגי אנטיביוטיקה: ציפרופלוקסצין הוא מצע ידוע של AdeIJK, טטרציקלין ניתן להסרה על ידי AdeIJK (משאבת האפלוקס העיקרית היא AdeAB), ולקנמיצין יש השפעה מינורית יחסית על A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. באמצעות שיטת מיקרו-דילול מרק על פי הנחיות CLSI¹⁵, הזן הלא מסומן המשלים AB258::adeIJK אותגר עם כל אנטיביוטיקה בהיעדר ונוכחות של 50 מיקרומטר IPTG; זן פראי ATCC 17978 וזן חסר RND AB258 נכללו כקבוצת ביקורת (טבלה 2). בסך הכל, המגמה שנצפתה בערכי המיקרופון מספרת את הירידה הצפויה ברגישות של AB258::adeIJK לציפרופלוקסצין וטטרציקלין עם ביטוי מושרה של משאבת האפלוקס, המאמתת כי החדרת adeIJK הייתה מוצלחת.

איור 1: סקירה כללית של ההליך. (A) מכינים תרבית לילה של זן A. baumannii להשלמה. (B) התאים מתרבית הלילה נשטפים במים 3 פעמים באמצעות צנטריפוגה ונשמרים על קרח. (C) פלסמידים המסירה והעוזר מתווספים לתאים ומודגרים על קרח במשך 20 דקות. הדגימה היא electroporated, מדיה LB מתווסף, ואת התאים מורשים להתאושש במשך 1 שעה ב 37 ° C. אליקוט של 100 μL של תאים מתפשט על לוחות אגר LB + Gm⁵⁰ ומודגר ב 37 ° C בן לילה. (D) מושבות מלוחית הטרנספורמציה מודבקות על צלחת אגר LB + Gm⁵⁰ וגדלות בן לילה בטמפרטורה של 37°C. (E) מושבות מתוקנות מוכנות ל-PCR כדי לבדוק נוכחות של מוצר הגברה המשתרע על פני אתר החדרת הכרומוזומלי. הגברה PCR הוא דמיינו על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. דגימות חיוביות ל-PCR מייצגות החדרה מוצלחת של הגן המעניין לכרומוזום ויצירת זן מסומן. (F) מושבה חיובית לגנטמיצין מוכנה כמו בשלבים (A-C), עם אלקטרופורציה של פלסמיד pLFP2^ab כדי להסיר את קלטת הגנטמיצין מהחדרת הכרומוזומלי. ציפוי סלקטיבי על LB + Cb²⁰⁰ אגר מאשר ספיגה של פלסמיד. תיקון כפול על לוחות אגר LB + Cb²⁰⁰ ו- LB + Gm⁵⁰ חושף מושבות שהן Cb^R ו- Gm^S המאשרות את אובדן קלטת הגנטמיצין מההחדרה. גידול מושבות Cb^R נבחרות על 5% סוכרוז מרפא את פלסמיד pLFP2^ab מהתאים. מושבות מצלחת הסוכרוז 5% מודבקות על LB + Cb²⁰⁰ אגר ואגר LB כדי לחשוף מושבות Cb^S ו- Gm^S רצויות ולאשר את יצירת הזן הבלתי מסומן. Gm⁵⁰, gentamicin ב 50 מיקרוגרם / מ"ל; Cb²⁰⁰, carbenicillin ב 200 מיקרוגרם / מ"ל; ^R, עמיד; ^ס', רגיש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פלסמידים המשמשים בפרוטוקול זה. מפות פלסמיד כלליות של (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (פלסמיד החדרה), (B) pTNS2 (פלסמיד עוזר), ו-(C) pFLP2^ab (פלסמיד כריתה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: סכמטיות של הכנסה ואי סימון. (א) הכנסה. אתר החדרת Tn7 יחיד בכרומוזום A. baumannii ממוקם 24 bp מקצה הגן glmS2 . קו-אלקטרופורציה של פלסמיד ההחדרה והפלסמיד המסייע מאפשרת השלמה של הגן המעניין (גן מוכנס, סגול) יחד עם שאר קלטת ההחדרה (אתרי FRT לכריתת סמן, צהוב; גן accC1 לעמידות לגנטמיצין, ירוק; גן lacIq לביטוי מושרה, כחול) לתוך הכרומוזום. (ב) הסרת סימון. אלקטרופורציה של זן ההחדרה המשלים והמסומן עם פלסמיד הכריתה pFLP2^ab מאפשרת הסרה של גן עמידות הגנטמיצין (accC1, ירוק) באמצעות רקומבינציה Flp-FRT (אתרי FRT, צהוב), ויוצרת זן לא מסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: טרנספורמציה, תיקון ואישור החדרה על ידי PCR מושבה. תוצאה מייצגת של (A) צמיחה של מושבות טרנספורמציה לאחר תיקון, ו-(B) הגברת PCR של מושבה עם פריימרים ABglmS_F_New (אפור) ו-Tn7R (כתום) כדי לאשר החדרה כרומוזומלית. נתיב 1: סולם DNA במשקל מולקולרי נמוך; נתיב 2: ATCC 179798; נתיב 3: AB258; נתיב 4: AB258::adeIJK-LAC-GM; נתיב 5: שליטה ללא תבנית. הרצועה הצפויה של 382 bp מסומנת. שים לב כי פריימרים ספציפיים gentamicin-(Gm_F ו Gm_R, ירוק) יכול לשמש גם כדי לאשר החדרה כרומוזומלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: אישור אובדן סמן על ידי PCR מושבה. תוצאה מייצגת של הגברת PCR במושבה עם פריימרים ספציפיים לגנטמיצין (Gm_F ו-Gm_R) כדי לאשר את אובדן הסמן האנטיביוטי באמצעות כריתה מבוססת^ab pFLP. נתיב 1: סולם DNA במשקל מולקולרי נמוך; נתיב 2: ATCC 179798; נתיב 3: AB258; נתיב 4: AB258::adeIJK-LAC-GM; נתיב 5: AB258::adeIJK; נתיב 6: שליטה ללא תבנית. הרצועה הצפויה של 525 bp מסומנת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

זנים, פלסמידים ופריימרים	מאפיינים רלוונטיים	הפניה
כתם
א. באומני ATCC 17978	סוג זן	ATCC
א. באומני ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
פלסמידים
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	GmR, אמפרR	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, אמפרR, adeIJK	מחקר זה
pTNS2	אמפרR	9
pFLP2ab	pWH1266 מקור או שכפול, sacB, אמפרR	7
פריימרים	רצף (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
TN7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	מחקר זה
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	מחקר זה

טבלה 1: זני חיידקים, פלסמידים ופריימרים המשמשים בפרוטוקול זה. Gm, gentamicin; אמפ, אמפיצילין; ^R, עמיד.

	ציפרופלוקסצין		טטרציקלין		קנמיצין
IPTG	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	נד	0.500	נד	1.5	נד
AB258	0.031	נד	0.063	נד	4	נד
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
שינוי קיפול		4.01		4.03		0.25

טבלה 2: בדיקת הפונקציונליות של הגנים המוחדרים באמצעות רגישות לאנטיביוטיקה. השוואה בין ערכי ריכוז מעכב מינימלי (MIC) עבור A. baumannii ATCC 17978, AB258, AB258 לא מושרה::adeIJK ו- AB258::adeIJK המושרה על ידי IPTG כנגד ציפרופלוקסצין, טטרציקלין וקנמיצין. שינוי קיפול = מושרה (+ IPTG)/לא מושרה (− IPTG); nd = לא נקבע.

Discussion

אף על פי שהליך זה להחדרה כרומוזומלית של מערכת ביטוי גנים חד-עותקית מושרית ב- A. baumannii הוא פשוט מבחינה טכנית ואינו דורש עבודה רבה, ישנם מספר שלבים חשובים שיש לשים עליהם דגש. ראשית, הכנת התאים המוסמכים צריכה להיעשות על קרח ככל האפשר מכיוון שהתאים הופכים שבירים במהלך החלפת המדיה במים קרים כקרח. באופן אידיאלי, שלבי הצנטריפוגה מבוצעים ב -4 מעלות צלזיוס, אך צנטריפוגה בטמפרטורת החדר מקובלת. בהתחשב בשבריריות הגוברת של התאים במהלך שטיפת המים, פיפטינג עדין הוא גם קריטי. שנית, אלקטרופורציה רגישה לנוכחות יונים. שטיפת התאים עם סבבים מרובים של כדוריות והשהייה מחדש במים מבטיחה שהמדיה תוסר במלואה. כמו כן, פלסמידים צריכים להיות מטוהרים טריים וניתן לדלל אותם במאגרים סטנדרטיים של קיט אלוציה (בדרך כלל חיץ TE) כל עוד ריכוז ה- DNA של הפלסמיד גבוה מספיק. אנו שואפים להוסיף <5 μL של פלסמיד ל 100 μL של השעיית תאים כדי לשמור על חוזק יוני של המדגם נמוך מאוד, אם כי עד 10 μL צריך להיות נסבל. שלישית, יש להכין צלחות אגר סלקטיביות לפי הצורך כדי להבטיח את יעילות האנטיביוטיקה הנוספת. שים לב כי carbenicillin שימש במקום ampicillin הרגיל לבחירה במהלך השינוי של פלסמיד כריתה, pFLP2^ab. A. baumannii עמיד באופן מהותי לאמינופניצילינים (אמפיצילין)¹⁶; החלפת קרבוקסיפניצילין (קרבניצילין) מאפשרת המשך ברירה ב-β-לקטמאז המקודד בפלסמיד.

אופטימיזציה של פרוטוקול הניסוי היא מורכבת יותר ותשתנה בין מינים שונים של Acinetobacter (או אפילו זנים שעברו מניפולציה גנטית בתוך אותו מין) ואולי ריאגנטים מסוימים המשמשים במעבדה. לדוגמה, המתח המשמש לאלקטרופורציה יכול לנוע בין 1.8 ל -2.5 קילו-וולט, וייתכן שיהיה צורך לשנות מעט את תנאי התרמו-מחזור בהתאם ל- DNA פולימראז המשמש ל- PCR. רמזים מועילים שיש לשקול אם התאים גדלים בצורה גרועה לאחר אלקטרופורציה כוללים הפחתת ריכוז הגנטמיצין בלוחות האגר מ-50 מיקרוגרם/מ"ל ל-30 מק"ג/מ"ל ו/או הארכת זמן הדגירה של לוחות האגר ל-≥24 שעות. לגבי השלבים להסרת קלטת הגנטמיצין, ניתן להשיג הצלחה טובה יותר בשימוש בצלחות אגר LB עם 10% סוכרוז ו / או לדגור אותם ב 30 ° C במשך ≥24 שעות אם התנגדות קרבניצלין נמשכת.

ניתן למצוא בספרות שיטות רבות להכנת תאי A. baumannii לשימוש עם אלקטרופורציה, אך לעתים קרובות הן כוללות שלב תת-תרבותי לאחר תרבית הלילה הראשונית ולאחר מכן שלב צמיחה ארוך לצפיפות אופטית שנקבעה. גילינו שניתן להשתמש בתרבות לילה פשוטה באותה יעילות. אלקטרופורציה של A. baumannii תוארה היטב, והקוראים עשויים לקבל תובנה נוספת על היבט ספציפי זה של הפרוטוקול כאן^17,18. היתרונות העיקריים של מערכת השלמת גנים כרומוזומלית mini-Tn7 זו בהשוואה למערכת השלמה מבוססת פלסמיד הם היכולת לווסת את רמת הביטוי של הגן המשלים באמצעות מערכת מדכא lacI^q הנשלטת על ידי IPTG והבחירה להסיר את סמן הגנטמיצין (גן aacC1) באמצעות אתרי FRT הצמודים. נצפתה כי הסובלנות של התאים לביטוי של משאבות efflux יכול להשתנות בהתאם למשאבה שהוכנסה. לדוגמה, תאים רגישים יותר לביטוי של AdeIJK בהשוואה ל- AdeABC או AdeFGH; ניתן לטפל בכך על ידי שינוי ריכוז IPTG בתנאי תרבית. הסרת הסמן האנטיביוטי מפחיתה את הסיכון המוטציוני לזן עקב לחץ ברירה קבוע וכן מאפשרת חקירות רגישות בלתי מוגבלות לאנטיביוטיקה³.

מערכת mini-Tn7 זו שימשה בהצלחה עם מינים Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ ו- Acinetobacter ^5,6,21,22, עם זאת, קיימות מגבלות מסוימות. לדוגמה, ב- A. baumannii יש רק אתר החדרה פונקציונלי אחד שלTn7 בגנום⁵, כך שניתן ליצור זן עם מחיקות מרובות, אך ניתן להשלים רק גן אחד בכל פעם. כמו כן, מערכת זו עדיין לא הוכחה כיעילה עבור חיידקים גראם-חיוביים¹⁰.

משאבות אפלוקס RND הן מסייעות חשובות לעמידות לאנטיביוטיקה ב- A. baumannii. מה שהופך אותם לחזקים כל כך הוא המבנה בן שלושת החלקים שלהם המשתרע על פני הממברנות הפנימיות והחיצוניות, ומאפשר הסרת אנטיביוטיקה מהפריפלסמה אל מחוץ לתא. משאבות ה-RND הנחקרות והנפוצות ביותר – המכונות AdeABC, AdeFGH ו-AdeIJK – הוכחו כמסלקות אנטיביוטיקה המקיפה את כל הסוגים. הבהרת תפקוד משאבת ה- efflux בפירוט תספק נקודת התחלה טובה לתכנון אפשרויות טיפוליות חדשניות נגד זנים עמידים לתרופות מרובות. שימוש בזן מחיקת משאבת RND משולש AB258 והשלמת משאבה אחת בכל פעם מאפשר לחקור כל משאבה בנפרד מהאחרות, להבחין עבור כל משאבה בפרופילי המצע הייחודיים שלה ובמעכבים היעילים ביותר. כמובן, למשאבות אפלוקס יש גם תפקיד "יומיומי" בתפקוד התקין של החיידק. הבנת התפקידים האלה עלולה להוביל לשיתוק עקיף של המשאבות, שבתורו יפריע לשטף האנטיביוטי, ואולי יהפוך חיידקים עמידים לתרופות מרובות לרגישים שוב לאנטיביוטיקה נפוצה. באופן כללי, ניתן להשתמש במערכת mini-Tn7 כדי להציג כל גן מעניין למחקר מפורט או סמנים מועילים, לדוגמה, חלבונים פלואורסצנטיים לדימות מיקרוסקופי⁶.

השכיחות הגוברת של חיידקים עמידים לתרופות מרובות היא דאגה לכולנו. הבנת מנגנוני ההגנה המסופקים על ידי משאבות efflux בפתוגנים כמו A. baumannii היא קריטית למאבק בזיהומים חמורים. מערכת ביטוי גנים כרומוזומלית זו היא כלי רב עוצמה למחקרים מכניסטיים, כמו גם לזיהוי מעכבים לסיכול תפקוד משאבת השטף.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינור PCR 0.2 מ"ל	VWR	20170-012	לתכשירי הרתחת מושבה ותגובות PCR
צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל	Sarstedt	72-690-301	שימוש כללי
בצינורות תרבית 13 מ"ל, Pyrex	Fisher	14-957K	כלי תרבית נוזלית
6x מאגר טעינת DNA	Froggabio	LD010	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז טעינת דגימה צבע
אצטי חומצה, קרחון	פישר	351271-212	רכיב חיץ ריצה של ג'ל אגרוז
Agar	Bioshop	AGR003	מצע גידול מוצק
Agarose	BioBasic	D0012	הפרדה אלקטרופורטית של תוצרי תגובת PCR; בשימוש בריכוז של 0.8–
יחידת אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז	פישר	29-237-54	אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז; הפרדת תוצרי תגובת PCR
קרבניצילין	פישר	50841231	סלקטיבית
סגירות צינור תרבית	פישר	13-684-138	סגירת נירוסטה לצינורות תרבית של 13 מ"ל
סט דאוקסינוקלאוטיד טריפוספט (dNTP)	ביובייסיק	DD0058	רכיב תגובת PCR; מסופק כ-100 מ"מ כל אחד dATP, dCTP, dGTP, dTTP; מעורבב ומדולל עבור 10 מ"מ כל אחד dNTP
אמבטיה יבשה / מחמם בלוק	פישר	88860023	אמבטיה יבשה דיגיטלית איזוטמפ להכנות להרתחה
קוביות אלקטרופורציה	VWR	89047-208	קובטות אלקטרופורציה 2 מ"מ עם מכסה עגול
אלקטרופורטור	קול פארמר	940000009	110 VAC, 60 הרץ אלקטרופורטור
אתידיום ברומיד	פישר	BP102-1	הדמיה של תוצרי תגובת PCR וסמן DNA בג'ל אגרוז
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)	VWR	CA-EM4050	רכיב חיץ ריצה של ג'ל אגרוז
Gentamicin	Biobasic	GB0217	להכנת מדיה סלקטיבית
גליצרול	פישר	G33	הכנת מלאי חיידקים לאחסון לטווח ארוך במקפיא נמוך במיוחד
אינקובטור (טלטול)	ניו ברונסוויק סיינטיפיק	M1352-0000	Excella E24 שייקר חממה לגידול תרבית נוזלית
חממה (סטטית)	פישר	11-690-550D	תנור חממה איזוטמפ דגם 550D לגידול תרבית מוצק (LB אגר)
לולאת חיסון	Sarstedt	86.1562.050	פסים מושבות על צלחות אגר
מפזר חיסון	Sarstedt	86.1569.005	התפשטות של תרבית על צלחות אגר
מרק ליזוגני (LB), לנוקס	פישר	BP1427	מצע גידול נוזלי (20 גרם/ליטר: 5 גרם/ליטר נתרן כלורי, 10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים)
מיקרופוגה	פישר	75002431	Sorvall Legend Micro 17 לצנטריפוגה של דגימות
מיני צנטריפוגה	פישר	S67601B	צנטריפוגה של 0.2 מ"ל צינורות PCR צלחות
פטרי	SPL מדעי החיים	10090	למצעי גידול מוצקים (לוחות אגר): 90 x 15 מ"מ
פיפטות		פיפטות חד-ערוציות של מנדל גילסון שונות (P10, P20, P200, P1000)
ספק כוח	Biorad	1645050	PowerPac ספק כוח בסיסי לאלקטרופורזה
פריימרים	IDT	NA	PCR רכיב תגובה ספציפי לגן המעניין; מוכן ב-100 μ M לפי ההוראות בגיליון מפרט המוצר
Sucrose	BioBasic	SB0498	להכנת מדיה נגדית להסרת פלסמיד pFLP2ab מרכיב תגובת A. baumannii
Taq DNA פולימראז	FroggaBio	T-500	PCR; פולימראז מסופק עם מאגר 10x
Thermal	cycler	Biorad 1861096	דגם T100 עבור PCR
קיסמים	פישר	S24559	לתיקון מושבות על צלחות אגר
בסיס Trizma	Sigma	T1503	רכיב חיץ ריצה של ג'ל אגרוז
מים טהורים	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ מערכת טיהור מים: מים טהורים במיוחד להכנת מדיה ותמיסה, ושטיפת תאים
סמן DNA רחב טווח	Biobasic	M103R-2	קביעת גודל של מוצרי PCR על ג'ל אגרוז
מקלות חיסון מעץ	פישר	29-801-02	חיסון תרבויות עם מושבות מצלחות אגר