מאמר שיטה

מוסטזיס פצע ניקוב והכנת דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח מונטאז'

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66479

⸱

24 במאי 2024

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

הליך פצע ניקוב להיווצרות פקקת המוסטטית מוצג כאן. הטרומבי שנוצר גדול וקוטרו מאות מיקרונים. לפיכך, גישות הדמיית נפח מתאימות. אנו מציעים מונטאז' מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח שידור כגישה ברזולוציה גבוהה הזמינה לרבים ומפרטים פרוטוקול הכנה.

תקציר

המוסטאזיס, תהליך של שליטה פיזיולוגית נורמלית של נזק לכלי הדם, הוא בסיסי לחיי אדם. כולנו סובלים מחתכים קלים ומפצעי דקירה מעת לעת. בהמוסטאזיס, צבירת טסיות המגבילה את עצמה מובילה להיווצרות פקקת מובנית שבה הפסקת הדימום נובעת מסגירת החור מבחוץ. אפיון מפורט של מבנה זה עשוי להוביל להבחנות בין המוסטאזיס לפקקת, מקרה של צבירת טסיות יתר המובילה לקרישה חסימתית. מוצגת כאן גישה מבוססת הדמיה למבנה פקקת פצעי ניקוב המתבססת על היכולת של מיקרוסקופ אלקטרונים בחתך דק לדמיין את פנים התרומבי ההמוסטטי. השלב הבסיסי ביותר בכל פרוטוקול ניסויי מבוסס הדמיה הוא הכנת דגימה טובה. הפרוטוקול מספק נהלים מפורטים להכנת פצעי דקירה וטרומבי עשיר בטסיות בעכברים למיקרוסקופ אלקטרונים עוקב. ניתן נוהל מפורט לקיבוע באתרו של פקקת פצע הניקוב היוצרת ועיבודו לאחר מכן לצביעה והטבעה למיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ אלקטרונים מוצג כטכניקת הדמיה סופית בגלל יכולתו, בשילוב עם חתך רציף, לדמיין את הפרטים של פנים פקקת ברזולוציה גבוהה. כשיטת הדמיה, מיקרוסקופ אלקטרונים נותן דגימה בלתי משוחדת ופלט ניסיוני המשתנה מננומטר למילימטר ב -2 או 3 ממדים. תוכנה חופשית מתאימה למיקרוסקופ אלקטרונים מצוטטת שתתמוך במיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח שבו ניתן למזג מאות מסגרות כדי לתת הדמיה בקנה מידה ננומטרי של חתכי טרומבי פצע ניקוב שלמים. לפיכך, כל אזור משנה של קובץ התמונה יכול להיות ממוקם בקלות לתוך ההקשר של חתך מלא.

מבוא

היווצרות פקקת פצע לנקב שמובילה להפסקת דימום היא אחד האירועים החיוניים ביותר בחיים1. עם זאת, למרות חיוניות זו, הידע על מה שקורה מבחינה מבנית במהלך היווצרות פקקת, בין אם זה בווריד, עורק, אירוע טרשתי, או קריש חסימתי, הוגבל על ידי רזולוציה ועומק הדמיה. מיקרוסקופ אור קונבנציונלי מוגבל בעומקו בהשוואה לפקקת פצע ניקוב מלא, 200 עד 300 מיקרומטר ב-Z1, וברמת הרזולוציה בהשוואה לגודל אברוני טסיות הדם והמרווח ביניהם, לעתים קרובות פחות מ-30 ננומטר2. מיקרוסקופ אור דו-פוטוני יכול להפיק את עומק ההדמיה הדרוש אך אינו משפר את הרזולוציה באופן משמעותי. ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אור, למשל, טכניקות סופר-רזולוציה, עדיין מוגבלת ברזולוציה, בפועל ~ 20 ננומטר ב- XY וכפול מזה ב- Z, ועומק מוגבל, לא יותר מאשר מיקרוסקופ אור קונבנציונלי. יתר על כן, מיקרוסקופ אור ברזולוציית על, כמו רוב מיקרוסקופ האור המחקרי, מבוסס על מיקרוסקופ פלואורסצנטי, טכניקה המוטה מטבעה לקבוצה קטנה של חלבונים מועמדים שעבורם קיימים נוגדנים טובים או מבנים מתויגים טובים3. לסיכום, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קונבנציונלי יכול, לכל היותר, לדמיין את פני השטח של פקקת עשירה בטסיות דם.

כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה לאפיון מבנה פקקת, היו לנו שלוש מטרות. ראשית, יש לייצר פצע נקב מוגדר בווריד או בעורק של עכבר שניתן לייצב בקלות באתרו על ידי קיבוע כימי. שנית, ליישם הליך הכנה המדגיש את שימור הממברנה, מטרה העולה בקנה אחד עם המטרה של הגדרת המיקום של טסיות בודדות בתוך פקקת יוצרת. שלישית, השתמש בטכניקת הדמיה בלתי משוחדת, שבתמונה אחת ניתן לשנות את קנה המידה שלה מקנה מידה ננומטרי לכמעט מילימטרי.

מיקרוסקופ אלקטרונים מונטגדי ורחב שטח נבחר כטכניקת הדמיה עיקרית מסיבה חשובה אחת: בהדמיה של מיקרוסקופ אלקטרונים רואים מגוון עצום של תכונות בתוך התא המתארות את אברוניו ותכונותיו בתוך האברונים. ניתן לזהות עצמים קטנים כגון ריבוזומים. טווח תכונות זה נראה מכיוון שכתמי המתכות הכבדות צפופות האלקטרונים, אורניל, עופרת ואוסמיום, המשמשים למיקרוסקופ אלקטרונים ליצירת ניגודיות, נקשרים למגוון רחב של מולקולות. בתמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים רואים הרבה ממה שיש שם, בעוד שבגישות של אימונופלואורסנציה ותיוג חלבונים, רואים רק את מה שנדלק. זה אומר, למשל, את אתרי האנטיגן הקיימים על מין חלבון בודד נתון. במקרה של מולקולה מתויגת, לרוב חלבון, זהו האתר(ים) שבו נמצא החלבון. כל שאר המולקולות כהות ואינן מוארות. עם זאת, האם בחירה זו של מיקרוסקופ אלקטרונים מעשית? פקקת פצע ניקוב יש גודל של 300 על 500 מיקרומטר, ובגודל פיקסל של 3 ננומטר, כלומר תמונה של 100,000 על 167,000 פיקסלים. מצלמת מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה יש 4000 על 4000 פיקסלים. משמעות הדבר היא שיש לתפור/למזג כ- 1000 מסגרות כדי ליצור תמונה אחת. זוהי אפשרות שהייתה קיימת ברוב מיקרוסקופ האלקטרונים שיוצרו ב-15 השנים האחרונות. שלב המיקרוסקופ ממוחשב, וניתן לתפור את התמונות יחד עם מחשב. זהו הרציונל שהוביל לבחירות שעמדו בבסיס ניסוח הפרוטוקול המוצג.

לסיכום, אנו מציגים להלן סדרה של צעדים המעניקים פצע הניתן לשחזור בווריד או בעורק של עכברים, שלאחר מכן, בעקבות שלבי קיבוע באתרם ושלבי הטבעה מאוחרים יותר, ניתן לדמיין על ידי מונטאז', מיקרוסקופ אלקטרונים שידור שטח רחב בקנה מידה ננומטר ובתמונה תפורה דמיינו בקנה מידה קרוב למ"מ, קנה המידה של בפועל באתרו פקקת קבועה. סקלביליות מסוג זה נדרשת להבנת היווצרות פקקת הן כבעיה בהמטולוגיה/בריאות והן כמערכת ביולוגית התפתחותית שבה טסיות הדם הן סוג התא העיקרי. פיתוחים אלה מספקים מעלה גדולה של מיקרוסקופ אלקטרונים, כלומר, אדם רואה מה יש שם, לא רק מה נדלק. לקבלת פרוטוקול מפורט על הכנת דגימות עבור מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים בלוק טורי (SBF-SEM), הקורא מופנה למאמר שפורסם לאחרונה על ידי Joshi et al.4.

פרוטוקול

הניסויים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה. כאן נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 זכרים ונקבות בני 8 - 12 שבועות. עכברים אלה הם מבוגרים צעירים עם הצטברות קטנה של שומן. אותם הליכים חלים על עכברים מוטנטים עבור חלבונים שונים החשובים hemostasis, כגון גורם פון Willebrand או טסיות גליקופרוטאין VI (GPVI)5,6. כל הציוד, כלי הניתוח, הריאגנטים והחומרים האחרים שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 1 ומפורטים בטבלת החומרים.

1. פצע ניקוב וריד ג'וגולרי/עורק הירך 1,7

  1. הרדמה של העכבר
    1. הניחו את העכבר בתא האינדוקציה וסובבו את הוופורייזר האיזופלורן לקביעת קצב זרימה גבוה (500 מ"ל/דקה, 3% איזופלורן). Isoflurane נבחר כי יש לו השפעה קטנה על קוטר כלי הדם.
      אזהרה: חשיפה ארוכת טווח לאיזופלורן עלולה לגרום להשפעות בריאותיות שליליות. השימוש בוופורייזר בזרימה נמוכה, מיכלי לכידת גז הרדמה ואוורור טוב בחדר יכולים להפחית מאוד את החשיפה.
    2. כאשר העכבר נראה במצב שינה, צבוט את אחת מאצבעות רגליו של העכבר כדי לראות אם העכבר מגיב. אם כן, החזיר את העכבר לתא האינדוקציה למשך מספר דקות ולאחר מכן נסה שוב את בדיקת הצביטה. אם העכבר אינו מגיב, הניחו אותו במצב שכיבה על צלחת החימום (מכוסה בעבר ברדיד אלומיניום).
    3. הנמיכו את הוופורייזר לספיקה נמוכה (100 מ"ל/דקה, 1.75% איזופלורן). הניחו את אפו של העכבר בתוך חרוט האף. מרחיבים כל איבר ומדביקים כלפי מטה עם חתיכות קטנות של סרט הדבקה.
    4. הכנס את בדיקת הטמפרטורה הרקטלית והגדר את הטמפרטורה ל -37 ° C בבקר הטמפרטורה. הדביקו את כבל בדיקת הטמפרטורה כדי למנוע מהגשושית להישלף בטעות.
  2. חתך עכבר
    1. בעזרת הקוצצים יש לגלח את צוואר העכבר וחזהו (עבור וריד הצוואר) או את רגל ימין הפנימית (עבור עורק הירך). נגבו את גזירי הפרווה בעזרת פד אלכוהול. במידת הצורך, עברו שוב על האזור עם הקוצצים כדי להסיר את שאריות הפרווה.
    2. נגבו שוב את האזור עם כרית אלכוהול טרי כדי לנקות את כל הגזירה. חשוב מאוד שהאזור יהיה נקי ככל האפשר. אשר את מישור הניתוח של ההרדמה באמצעות צביטת בוהן.
    3. בעזרת מספריים ומלקחיים קהים, להרים ולחתוך את העור מעל וריד הצוואר הימני. חתכו חלון עגול בעור גדול מספיק כדי לחשוף את הווריד הצווארי וחלק מהרקמה שמסביב.
  3. ניקוי הווריד הצווארי (אותם עקרונות חלים על עורק הירך)
    1. באמצעות טכניקת הדיסקציה הקהה, דחפו בעדינות הצידה את בלוטות השומן והלימפה, כמו גם את רקמת החיבור.
      הערה: ניקוי כללי סביב הספינה מתבצע בשלב זה; עם זאת, ניקוי זהיר ויסודי יתבצע מתחת למיקרוסקופ לאחר שווריד הצוואר מקובע בפרפורמלדהיד למשך 24 שעות.
    2. ממלאים מזרק 20 מ"ל במי מלח רגילים המחוממים ל 37 מעלות צלזיוס. טען את המזרק לתוך משאבת עירוי מזרק. חבר את מחט הפרפר 27G ואת הצינור הקשור למזרק.
    3. כוונו את משאבת המזרק לקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה. זרם המלח העדין ישטוף דם מהווריד/העורק המנוקב. מקמו את זרם המלח כמה מ"מ לצד אתר הניקוב, ולא ישירות מעליו.
  4. ניקוב הווריד הצווארי/עורק הירך
    1. הפעל את הטיימר. קבל מחט היפודרמית 30G (קוטר נומינלי 300 מיקרומטר) עבור הווריד הצווארי ומחט היפודרמית 33G (קוטר 200 מיקרומטר) עבור עורק הירך. השימוש במחט קטנה יותר נותן רק זמן דימום מעט ארוך יותר למצב עורקי בלחץ גבוה יותר.
    2. סובב את השיקוע כלפי מעלה. מקמו את המחט בזווית של 25° מעל הווריד הצווארי/עורק הירך. שימו לב לשעה.
    3. נקב במהירות את כלי השיט, תוך הקפדה לנקב את החלק העליון של הכלי בלבד. היזהרו לא לנקב גם את תחתית הכלי. שימו לב לזמן שבו הדימום נפסק לחלוטין.
    4. המתינו לפרק הזמן המתאים לקבלת היווצרות פקקת (איור 2A) לפני שתתחילו בקיבוע זילוח (כלומר, 1, 5, 10 או 20 דקות כדי להשיג שלבים שונים של התפתחות פקקת). יש להרדים את בעל החיים על ידי המתת חסד או לפעול לפי הנחיות מוסדיות מקומיות להמתת חסד.
  5. ביצוע קיבוע זילוח transcardial
    1. הגדר את המשאבה הפריסטלטית לפני תחילת הניתוח. מניחים שתי מבחנות חרוטיות בנפח 50 מ"ל במדף מבחנה. מלאו צינורית אחת בתמיסת קיבוע פרפורמלדהיד 4% שהוכנה בתמיסת חיץ נתרן קקודילט (0.2 M נתרן קקודילט, 0.15 M נתרן כלורי ב- pH 7.4) למחקרי ניקוב ג'וגולרי ומלאו את הצינור השני בתמיסת חיץ נתרן קקודילט.
      הערה: התנאים המפורטים כאן מספיקים למקרה בלחץ נמוך של הצוואר ולאחר מכן משתנים עבור מקרה לחץ גבוה יותר של עורק. במחקרי מערכת לחץ גבוה יותר עם עורקים, כלומר עורק הירך, מקבע הפרפורמלדהיד מתווסף עם 0.1% גלוטראלדהיד, וקיבוע טפטוף חיצוני משולב עם קיבוע זילוח.
    2. הניחו את קצה הספיגה של צינור המשאבה לתוך הצינור המכיל את תמיסת החיץ. חברו מחט פרפר 27G עם צינורות נלווים לקצה היציאה של צינור המשאבה והניחו את המחט בכד נקי.
    3. כוונו את המשאבה הפריסטלטית לקצב זרימה של 10 מ"ל/דקה. הפעל את משאבת הזילוח.
    4. כאשר תמיסת החיץ מתחילה לזרום מהמחט לתוך הכד, כבה את המשאבה. הצינור והמחט מוכנים כעת לזילוח הטרנסקרדיאלי.
    5. חשוף את חלל החזה על ידי ביצוע חתך קו אמצע בעור מראש עצם החזה ועד כמה מילימטרים מעבר לתחתית עצם החזה באמצעות מספריים מנתחים ומלקחיים קהים. בצע חתכים רוחביים לאורך בסיס כלוב הצלעות, החל מקו האמצע וחיתוך מהמדיאלי לצדדי בכל צד.
    6. מיד לפני תחילת זילוח קרום הלב, לפתוח במהירות את כלוב הצלעות ולשקף כל צד כדי לחשוף את הלב.
    7. הפעל את המשאבה הפריסטלטית. מניחים את קצה מחט הפרפר 27G בבסיס החדר השמאלי.
    8. תוך כדי החזקת המחט מאובטחת בחדר השמאלי, חותכים חריץ באוריק הימני באמצעות מספריים חדים לניתוח כדי לאפשר לדם ולנוזל הזלוף לזרום החוצה. שים לב לשעה בטיימר.
    9. יש לערבב עם תמיסת חיץ למשך 3 דקות כדי לשטוף את הדם ממערכת הדם. בעודכם עדיין מחזיקים את המחט מאובטחת בחדר השמאלי, כבו את המשאבה הפריסטלטית והעבירו את קצה הספיגה של צינור המשאבה הפריסטלטית אל צינור 50 מ"ל המכיל את התמיסה המקבעת.
    10. שים לב לשעה בטיימר. הפעל שוב את המשאבה הפריסטלטית ונקב עם התמיסה המקבעת למשך 7 דקות. כבו את המשאבה הפריסטלטית.
    11. מוציאים את המחט מהחדר השמאלי ומניחים אותה בכוס פסולת. הניחו את קצה הספיגה של צינור המשאבה לתוך מים מזוקקים.
    12. הפעל את המשאבה הפריסטלטית ותן לכ -20 מ"ל מים לזרום דרך הצינור ולהוציא את מחט 27G לתוך הפסולת כדי לנקות את הצינור. הקפד לתת לכל המים לצאת מהצינור והמחט לפני כיבוי המשאבה.

2. איסוף דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים

  1. לאחר קיבוע זילוח בתוספת קיבוע חיצוני ראשוני של 2 דקות במקרה של פצעי ניקוב בעורק הירך, יש לנתח בזהירות את החלק של וריד הצוואר/עורק הירך המכיל את אתר הניקוב והפקקת (איור 2A). בעזרת מספריים חדים, בצע חיתוך אלכסוני לרוחב הקצה הדיסטלי של קטע הכלי ובצע חיתוך ישר לרוחב הקצה הפרוקסימלי של קטע הכלי.
    הערה: ביצוע חתכים באופן זה מסייע לכוון את כלי הדם מאוחר יותר ולזהות את כיוון זרימת הדם בכלי השיט.
  2. יש לטבול את מקטע כלי הדם בטמפרטורת חדר טרייה, 4% פרפורמלדהיד בתמיסת חיץ נתרן קקודיל (0.2 M נתרן קקודילט, 0.15 M נתרן כלורי ב- pH 7.4) ולהניח בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  3. מעבירים את הרקמה הקבועה ל-4°C למשך 24 שעות. למחרת, קח צלחת תרבית 35 מ"מ המכילה משטח סיליקון בעובי ~ 5 מ"מ (שהוכן מראש על פי הוראות היצרן). יוצקים מספיק נתרן cacodylate תמיסת חיץ לתוך צלחת כדי לטבול את קטע הווריד קבוע.
  4. תוך כדי צפייה תחת מיקרוסקופ אור (~ 15x הגדלה), העבירו בזהירות את הרקמה לצלחת 35 מ"מ המכילה תמיסת חיץ והצמידו כל קצה של הכלי לשטיח הסיליקון באמצעות סיכות מינוטין מנירוסטה ומלקחיים עדינים.
  5. נקו בזהירות את מקטע הווריד הצווארי/עורק הירך באמצעות זוג מספריים זעירים ומלקחיים עדינים מאוד.
    1. לווריד הצוואר בלבד: מוציאים את אחת הפיכות ובעזרת המספריים חותכים את דופן כלי הדם מול אתר הניקוב/פקקת לאורך. פתחו את הכלי בעדינות, ובעזרת 4 עד 5 פינים (כל אחד מהם נחתך לשניים עם חותכי חוטים), הצמידו אותו לשטיחון הסיליקון כשהצד האינטרלומינלי פונה כלפי מעלה.
  6. שאפו את תמיסת החיץ, החליפו אותה במהירות בתמיסת 1% פרפורמלדהיד בתמיסת חיץ נתרן קקודילט והניחו את המכסה על המנה. אין לתת לרקמה להתייבש בכל עת. תמיד לשמור אותו שקוע בנוזל.
  7. אחסנו את הרקמה בטמפרטורה של 4°C עד שיגיע הזמן לעבד אותה למיקרוסקופ אלקטרונים (איור 2B). עיבוד חלק מדגימות פצע ניקוב הווריד הצווארי/עורק הירך להדמיה על ידי SBF-SEM4 ואחרות להדמיה על ידי WA-TEM 8,9. שלבי WA-TEM מתוארים בפירוט להלן.
    התראה: יש לבצע את כל העבודות הכוללות פורמלדהיד, פרופילן אוקסיד, OsO4 ו-2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) במכסה אדים כימי. אלה כימיקלים מסוכנים. חשיפה ל-OsO4 עלולה לגרום לעיוורון ולמוות.
    הערה: כל נפחי השטיפה והכתמים גדולים לפחות פי 2 מנפח הדגימה. ניתן להחליף את 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS) עבור 0.1 M נתרן cacodylate buffer. במהלך הליך הקיבוע, חשוב מאוד לא לתת את הדגימות להתייבש, כמו זה ישפיע באופן משמעותי על מבנה אולטרה. השתמש צינורות פוליפרופילן.

3. הכנת דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח (WA-TEM)

הערה: שלב זה מייצג נקודת החלטה שבה החוקר מתחייב להתכונן ל- WA-TEM. הליך הכנה זה אינו תומך ב- SBF-SEM. עבור נפח SBF-SEM EM, כל הצביעה חייבת להיעשות לפני הטבעה בפלסטיק. ראה4 לקבלת פרוטוקול הכנה SBF-SEM.

  1. שטפו את דגימת הרקמה בצלחת 35 מ"מ 2x עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) או PBS בטמפרטורת החדר (RT). שמור את הדגימה מוצמדת, המאפשרת מעקב אחר כיוון הדגימה באמצעות שלבי הכנה אלה.
  2. תקן עם 0.8 מ"ל של 0.05% מלכיט ירוק / 2.5% גלוטראלדהיד / 0.1 M נתרן cacodylate (pH 6.7 - 7.0) במשך 20 דקות על קרח.
  3. הסר את הקיבוע ושטוף את הדגימה 4x במשך 5 דקות כל אחד עם 0.1 M נתרן cacodylate. יש להסיר 0.1 M נתרן cacodylate.
  4. Postfix עם 0.8 מ"ל של 0.8% K3Fe(CN)6 או K4Fe(CN)6 / 1.0% OsO4 K3Fe(CN)6 ב 0.1 M נתרן cacodylate. הניחו כיסוי מעל הצלחת כדי להרחיק את האור (OsO4 רגיש לאור). מכתים למשך 20 דקות עד שעה ב-RT.
  5. הסר את OsO4 ושטוף 4x במשך 5 דקות כל אחד עם מאגר נתרן cacodylate 0.1 M. יש להסיר את מאגר הנתרן הקקודילט ואת הכתם עם 1% חומצה טאנית למשך 20 דקות על קרח.
  6. יש להסיר חומצה טאנית ולשטוף במשך 5 דקות עם חיץ נתרן קקודילט באורך 0.1 מ', 1x ו-2x למשך 5 דקות כל אחד במים מזוקקים (DI) באיכות מולקולרית.
  7. יש להכתים עם 0.5% אורניל אצטט (UA) למשך שעה RT או למשך הלילה ב-4°C (75°F) בחושך.
  8. מוציאים את האורניל אצטט ושוטפים 5x במשך 5 דקות כל אחד במים מזוקקים ברמה מולקולרית. לפני השטיפה האחרונה ובזמן שהדגימה עדיין שקועה במי DI, חתכו את משטח הסיליקון סביב הדגימה המוצמדת בעזרת סכין גילוח. הרימו את פיסת משטח הסיליקון הקטנה הזו מהצלחת והכניסו אותה לצינור פוליפרופילן.
    הערה: חשוב שהדגימה תישאר מוצמדת לחתיכת הסיליקון כשהיא בתוך הצינור. מעבר לצינורות פוליפרופילן בשלב זה הוא הכרחי מכיוון שתחמוצת הפרופילן המשמשת בשלבים הבאים תפגע בפוליסטירן של לוחות 35 מ"מ.
  9. לאחר הסרת החיץ האחרון, יש לשטוף בקצרה 1x עם 25% אתנול. השליכו את 25% האתנול ודגרו עם 25% אתנול למשך 3 דקות על קרח.
  10. הסר את 25% אתנול. יש לשטוף בקצרה 1 פעמים באתנול 50%. השליכו את 50% האתנול ודגרו עם 50% אתנול למשך 3 דקות על קרח.
  11. הסירו את 50% האתנול ושטפו בקצרה 1x עם 75% אתנול. השליכו את האתנול 75% ודגרו עם 75% אתנול למשך 3 דקות על קרח.
  12. הסירו את האתנול 75% ושטפו בקצרה 1x עם 95% אתנול. השליכו את האתנול 95% ודגרו עם 95% אתנול למשך 3 דקות על קרח.
  13. הסירו את האתנול 95% ושטפו 3x, לפחות 10 דקות בכל פעם, עם 100% אתנול (הוכחה 200). הסר 100% אתנול והוסף פרופילן אוקסיד (PO). יש לשטוף 3 פעמים לפחות 10 דקות כל אחת, עם PO.
  14. הכינו את תערובת השרף כמתואר להלן.
    1. חממו את רכיבי השרף ב-60°C לנזילה מלאה. ערבבו היטב 12.5 מ"ל של Embed-218, 7.5 מ"ל של Araldite 502 ו-27.5 מ"ל של DDSA יחד בצינור של 50 מ"ל ב-60°C. תערובת זו יכולה להישמר במשך 6 חודשים ב 4 °C. יש לחמם ל-60°C לפני השימוש. Aliquot את הסכום הנדרש לפני השימוש.
  15. הטמע את הדגימות כמתואר להלן.
    1. מניחים aliquot של תערובת שרף בצינור ולהוסיף 20 μL / מ"ל של מפעיל DMP-30. מערבבים היטב על ידי סיבוב ב 60 °C; הצבע צריך להתכהות.
    2. יש לדלל את האליציטוט הזה של שרף פעיל ב-50% ב-PO ולאפשר לשרף ול-PO להתערבב לחלוטין.
    3. הסר את שטיפת PO האחרונה מהצינורית המכילה את הדגימה והחלף אותה בתערובת 50% שרף/PO, כמעט מלא את הצינורית לחלוטין. סובבו את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    4. למחרת, לערבב aliquot חדש של שרף (1 מ"ל לדגימה) עם 20 μL / מ"ל של DMP-30.
  16. הניחו את הדגימה בכלי פוליפרופילן עם נפח קטן של תערובת שרף/PO 50% מצינור הדגימה תחת מיקרוסקופ מנתח (~ הגדלה פי 6) והוציאו בזהירות את הפינים מהרקמה. העבר רק את הרקמה לצלחת פוליפרופילן אחרת המכילה כמות קטנה של 100% שרף עם מפעיל DMP-30.
  17. ממלאים תבנית הטבעה סיליקון בשרף 100% עם מפעיל DMP-30 ומניחים בזהירות את הדגימה בתבנית. מניחים תבנית בתנור ואופים ב 60 מעלות צלזיוס לפחות 48 שעות. הדגימה שהוכנה מוצגת באיור 2B.
  18. בצע הדמיה של מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח (WA-TEM) כמתואר בסעיף10,11. ראו איור 3 לתיאור התהליך העובר מנקב ראשוני לפקקת תלת-ממדית בת דקה אחת. הכללת פרוטוקול מפורט להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים WA-TEM אינה כלולה כאן והיא חורגת מהיקף הפרוטוקולים הנוכחיים על הכנת הדגימה.
    הערה: WA-TEM היא יכולת לא מוערכת מספיק של רוב מיקרוסקופ אלקטרונים שידור מודרני עם שלב ממוחשב. תוכנת Shareware התומכת בפונקציות אלה10,11 זמינה מקבוצתו של ד"ר דיוויד מסטרונרד, אוניברסיטת קולורדו, בולדר (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

תוצאות

כימות השפעות התרופה על זמן דימום פצע דקירה
זמני דימום פצעי ניקוב מספקים מודל פיזיולוגי של סיכון תרופתי שניתן לבצע בקלות בעכברים. תוצאות שמגיעות מניסוי פצע דקירה הן ניבוי. כאן, אנו מראים עקומת דימום של מנה-תגובה dabigatran. Dabigatran, מעכב טרומבין, משמש כנוגד קרישה פומי הפועל באופן ישיר, מה שנקרא DOAC12. מודל פצע ניקוב הווריד הצווארי שימש להערכת הסיכון הגלום במינונים שונים של דביגאטראן באמצעות דימום ממושך פוטנציאלי באמצעות היווצרות פקקת מאוחרת בעכברים. מינון משתנה של 15, 50, או 150 מיקרוגרם / ק"ג של dabigatran ניתן תוך ורידי (i.v.) 20 דקות לפני ניקוב הווריד הצווארי. אנו מראים את זמן הדימום בריכוזים שונים של דביגאטראן (איור 4). ברמת המינון, נצפתה הארכה משמעותית של זמן הדימום, p <0.051. זה מצביע על גורם סיכון משמעותי בשימוש בתרופה בבני אדם. באופן ניסיוני, התרופה במינונים אלה יש השפעה משמעותית על ultrastructure של פקקת יוצר.

הערכת מצב הפעלת טסיות הדם בפקקת פצע ניקוב יוצרת
גישת WA-TEM מספקת גם סקירה כללית של אזור פצע במישור יחיד כאשר מסתכלים עליו בהגדלה נמוכה יותר וגם פרטים רבים בהגדלה גבוהה יותר (איור 5). הפרטים המתקבלים יכולים להיות ממוקמים ישירות בהקשר של סקירה. השתמשנו בגישה זו כדי להעריך את הגיוס של טסיות בצורת דיסקואידים לפקקת פצע ניקוב יוצרת. טסיות הדם במחזור הדם הן דיסקואידיות, ומכאן שמן, ומכילות סט שלם של גרגרי הפרשה. שאלת מפתח הייתה כיצד ניתן לגייס טסיות במחזור הדם לפקקת הגדלה מבלי להפריע לתכונות הזרימה החופשית של הטסיות הנותרות. עבודתנו מצביעה על השערת Tether and Activate שבה טסיות הדם מגויסות לפקקת בזו אחר זו, בתהליך קשירה כטסיות דיסקואידים המכילות סט שלם של אברונים2. הראיות לכך מגיעות מ- WA-TEM של טרומבי ורידים ג'וגולרי דקה לאחר הניקוב. לאחר חתך כדי להניב פרוסות פקקת מלאות מאמצע הפצע שעדיין מדמם, צילמנו 500-800 פריימים, 4,000 על 4,000 פיקסלים, גודל פיקסל 3.185 ננומטר ברשת רסטר XY מלבנית על פני הממד המלא של הפקקת בחתך רוחב באמצעות שלב אוטומטי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת באמצעות תוכנת SerialEM10. לאחר מכן נתפרו מסגרות באמצעות תוכנת eTomo, חלק מחבילת תוכניות IMOD11. התוצאה היא תמונה בודדת בגודל משתנה, לדוגמה, 120,000 פיקסלים על 90,000 פיקסלים שיהיו במסך מלא בזום נמוך, 0.02, או בפירוט בזום גבוה יותר, 0.25 עד 1.0 באמצעות תוכנת 3DMOD, שוב חלק מחבילת תוכניות IMOD (איור 5). בנטו, הניתוח מונחה התוכנה מצא כי טסיות דיסקואידים הקשורים לפקקת הקשורים לפקקת בתוך חור הנקב היו מרווחים זה מזה כחרוזים על חוט. במרחק קצר בתוך הפקקת, צורת הדיסקואיד הייתה פחות ברורה, והטסיות היו קשורות יותר זו לזו. עמוק יותר בתוך הפקקת, טסיות הדם היו מעוגלות, ארוזות היטב ומגורענות חלקית. רצף של מורפולוגיה הצביע על קשירה ראשונית של טסיות הדם לפקקת באמצעות מולקולת קשירה ארוכה, ככל הנראה גורם פון וילברנד, וכי כל שלבי הפעלת טסיות נוספים הוגבלו לפנים הפקקת הנוצרת. לפיכך, גיוס טסיות הדם לפקקת יכול להתרחש מבלי להפריע לזרימת הדם בתוך הווריד הצווארי.

figure-results-1
איור 1: התארגנות כירורגית לביצוע ניסוי פקקת פצע ניקוב עורק הירך/עורק הירך. ציוד כירורגי (A) ומכשירים (B) מסודרים בקפידה ליעילות התנועה מכיוון שהתזמון הוא קריטי במהלך הניסוי. (C) לאחר קיבוע הזלוף, החלק של הכלי המכיל את פקקת פצע הניקוב מוצמד לשטיחון סיליקון בצלחת תרבית של 35 מ"מ תוך כדי צפייה תחת מיקרוסקופ האור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מעבר מכלי דם לדגימות פלסטיק משובצות שיחולקו עבור WA-TEM או SBF-SEM. (A) מוצג עורק הירך עם פצע ניקוב והיווצרות פקקת חוץ-וסקולרית מצטברת (עיגול וחץ). (B) פקקת (עיגול וחץ) מוטמעת בפלסטיק עבור חתך עבור WA-TEM עם מיקרוטום עבור הדמיה דו-ממדית עוקבת. (C) פקקת (עיגול וחץ) מוטמעת בפלסטיק, גזורה כדי לתת מקל קצר, פחות מ-1 מ"מ, לחיבור סיכה בתוך תא הדמיה SBF-SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: פצע ניקוב להיווצרות פקקת: סכמה של זרימה מכינה מפצע ניקוב (A) לפרוסת תמונה של פקקת ורידים ג'וגולרית (B) שלאחר הניקוב. דופן כלי הדם מסומנת בכחול על פרוסת התמונה, הנקודות השחורות הקטנות ליד דופן כלי הדם הן תאי דם אדומים, וצברי טסיות הפקקת מופיעים כאזורים אפורים כהים. נתון זה שונהמ-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: דוגמה לנתונים, בצורה גרפית, שנוצרו בניסוי פצע ניקוב ורידים ג'וגולרי. מוצגת עקומת דימום של תגובת מינון דביגאטרנית. נתון זה שונהמ-1. זמן הדימום פירושו בריכוזים שונים של dabigatran מוצגים יחד עם פסי שגיאה המציינים פלוס או מינוס סטיית תקן. ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t של התלמיד הצביע על ערך p של <0.05. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: תמונות WA-TEM של פרוסה שנתפרה יחד ליצירת מונטאז'. (A) מסגרות בודדות ברזולוציה גבוהה נאספות ולאחר מכן נתפרות יחד לצורך מיקום תכונות בהקשר רחב יותר. (B) על-ידי התקרבות ניתן להוציא פרטים חשובים בהקשר (פולי: לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים, אנדו: אנדותל, ו-col: סיבי קולגן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

אנו מציגים הליך פצע ניקוב מפורט לייצור תרומבי המוסטטי בוורידים הצוואריים ובעורקי הירך, קיבוע זילוח באתרם , ועיבוד דגימה למיקרוסקופ אלקטרונים של שידור שטח רחב מונטאז'. ההליכים הכוללים שימושיים ליצירת תרומבי המוסטטי לניתוח אולטרה-סטרוקטורלי ולהשוואת זמני דימום בעכברי ניסוי, למשל, עכברים שטופלו בסוגים ובמינונים שונים של תרופות. הוא שימושי גם להשוואת זמני דימום בעכברי בר מסוג ביקורת לזמני דימום בעכברי נוקאאוט (כלומר, נוקאאוטים עבור גליקופרוטאינים שונים בטסיות הדם המקיימים אינטראקציה עם ליגנדות דביקות ולאחר מכן במיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לניתוח אימונופלואורסנציה כקריאה העיקרית עם אובדן תכונות שהופכות את מיקרוסקופ האלקטרונים לבחירה חזקה. מצד שני, אימונופלואורסנציה היא כלי ראשוני לאיתור חלבונים בתוך מבנה. כמו בכל פרוטוקול טכני, ישנם שלבים שהם קריטיים יותר מאחרים וישנם שלבים בתוך הפרוטוקול שניתן להתייחס אליהם כנקודות בחירה חשובות לניתוח הבא.

השלבים הקריטיים, נקודות הבחירה לניתוח הבא והמגבלות מתוארים כדלקמן. שלב ניקוב המחט בפועל: פצע הניקוב נעשה באמצעות מחט מזרק המוחזקת בזווית של 25° לווריד או לעורק. זה ממזער את הסיכוי של ניקוב על פני שני הצדדים של הווריד או העורק. זווית של 90 מעלות, לעומת זאת, ממקסמת את הסיכוי שלא לגרד את שכבת האנדותל התוך-וסקולרית או לפגוע במטריצת הקולגן החוץ-כלי בצד החיצוני של כלי הדם, אך טומנת בחובה סיכון גדול יותר לנקב בשני צידי הווריד או העורק. הבחירה היא של ניסיון, ידיים וביטחון.

הקיבוע העיקרי כאן נעשה עם פרפורמלדהיד מחורר, מולקולה קטנה המכילה קבוצת אלדהיד תגובתית אחת. מכיוון שהוא מכיל קבוצה אחת תגובתית מבחינה כימית, לפרפורמלדהיד יש נטייה מועטה להצליב רכיבים תאיים ונטייה מועטה להרוס אנטיגניות ולכן, לסיכום, נחשב לקיבוע חלש יחסית לגלוטאראלדהיד, קיבוע נפוץ במיקרוסקופ אלקטרונים, המכיל שני אלדהידים תגובתיים ולכן מייצר הרבה יותר קישור צולב מולקולרי13. זהו שלב באתרו שנועד לשמר את המבנה. שלבי הזילוח מנקים תאי דם אדומים שאינם לכודים בטרומבי מהתכשיר. זה נותן תכשיר שהוא ללא רוב תאי הדם האדומים ומקל על התמקדות בתכונות טסיות. חקרנו שימוש בקיבוע באתרו עם תערובת גלוטראלדהיד/פרפורמלדהיד המיושמת באופן אקסטרה-וסקולרי. הליך זה יעיל, במיוחד במצב של זרימה/לחץ גבוה. עם זאת, הוא מתקן תאי דם אדומים במחזור במקום. זה יכול לסבך ניתוח סגמנטציה עוקב של מיקרוגרפים אלקטרונים עבור הצורה וההרכב של אגרגטים טסיות היוצרים את פקקת פצע ניקוב. השימוש בגלוטראלדהיד מסבך מאוד הליכים אימונופלואורסנטיים חלופיים בגלל הרמה הגבוהה של אוטופלואורסצנטיות הנוצרת על ידי הקיבוע.

הצמדה/החלקה של כלי הדם הקבוע על כרית סיליקון חיונית לאיתור הפקקת למטרות הטבעה. בשלב זה, הכיוון של הדגימה ביחס לזרימת הדם הוא עקב ידוע עבור השלבים הבאים. חור הנקב והפקקת שנוצרה יכולים להיות ממוקמים בקלות בכלי הדם הפתוח. לעומת זאת, קשה למצוא את הפקקת בכלי דם שלמים ומנותקים. זה יהיה נכון במיוחד במדגם עשיר בכדוריות דם אדומות קבועות במחזור. היכולת לעקוב אחר מיקום המחט בערימת השחת היא קריטית.

לאחר פתיחת כלי הדם וצילום היכן ממוקם פקקת הפקקת, חור הניקוב, מהווה נקודת בחירה. בפרוטוקול הכולל, השלבים הבאים המוצגים הם ספציפיים להכנת המדגם עבור WA-TEM. בשלב זה, ניתן לבצע בחירות פרוטוקול אחרות. מצד אחד, הדגימה יכולה להיות מעובדת עבור מיקרוסקופ immunofluorescence ולא מיקרוסקופ אלקטרונים. מצד שני, הדגימה יכולה להיות מעובדת עבור מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים טורית (SBF-SEM או גישה אחרת של מיקרוסקופ אלקטרונים נפחי) במקום WA-TEM. שלבי העיבוד עבור SBF-SEM שונים לחלוטין מכיוון שכדי להתכונן להליך זה, כל שלבי צביעת המתכות הכבדות למיקרוסקופ אלקטרונים חייבים להיעשות מראש הטבעה4.

שלבי צביעת המתכות הכבדות בפרוטוקול זה נועדו להדגיש ממברנות לעומת ריבוזומים וכרומוזומים, קומפלקסים ביולוגיים עשירים בחומצת גרעין. ניתן להשתמש בפרוטוקולים אחרים של צביעת מתכות כבדות, לדוגמה, Storrie and Attardi14 ו- Liu et al.15.

תשומת לב להבדלים בוורידים ובעורקים חשובה. יש לקזז את הלחץ הגבוה יותר של העורק לעומת הווריד 16,17. לדוגמה, מחט בקוטר קטן יותר משמשת לייצור פצע עורק הירך לעומת הפצע הצווארי. זה מפצה על הלחץ הגבוה יותר, נותן זמן הפסקת דימום כמעט שווה. בהליך פצע ניקוב הווריד הצווארי, ניתנת עדיפות לשימוש בפרפורמלדהיד כקיבוע בתנאים היפרטוניים מכיוון שפאראפורמלדהיד, כקיבוע קטן ויחיד המכיל אלדהיד, פועל במהירות אך הוא קיבוע חלש הנוטה להשאיר אנטיגניות ללא פגע. משמעות הדבר היא שניתן להשלים את הפרוטוקולים המתוארים כאן על ידי מחקרי לוקליזציה בתיווך נוגדנים ברמת האור או מיקרוסקופ האלקטרונים18,19. במקרה של פצע ניקוב עורק הירך, גלוטראלדהיד, קיבוע צולב חזק יותר, משמש בשילוב עם paraformaldehyde ב 0.1 M נתרן cacodylate buffer, pH 7.4, כדי לייצב ולתקן פקקת עורקים. שינוי זה נדרש כדי לקזז את לחץ הדם הגבוה יותר של עורק לעומת וריד. במקרה העורקי, ריכוז נתרן cacodylate הוא מחצית הריכוז המשמש פתרון קיבוע עבור טרומבי ורידים jugular.

הליך עיבוד הדגימה למיקרוסקופ אלקטרונים המוצג כאן מותאם ל- WA-TEM ומספק מידע על מיקרוסקופ אלקטרונים בנפח מוגבל. WA-TEM מפיק סדרה מוגבלת של תמונות ברזולוציה גבוהה, בגודל פיקסל של 3.185 ננומטר או פחות, על פני חתכי טרומבי מלאים במקביל או בניצב לזרימה1. שילוב של סכיני זכוכית ויהלום משמש לייצור ידני של סדרה של חתכי רוחב בהיקף מוערך של 10%, 25%, 50%, 75% ו-90% לתוך פקקת. השגת חתכי פקקת מלאים דורשת הדמיה של מאות פריימים עם מצלמה איכותית של 4,000 x 4,000 פיקסלים במיקרוסקופ אלקטרונים. לאחר מכן המסגרות נתפרות זו לזו. כמעט 400 - 800 מסגרות נדרשות כדי להשיג תמונת חתך מלאה. WA-TEM ניתן להשלים על ידי SBF-SEM. SBF-SEM מפיק סדרה של תמונות רציפות של פני הבלוק כשהוא נחתך בהדרגה בצעדים קטנים עם סכין יהלום סגורה בתוך הוואקום של תא ההדמיה SEM1. תמונות אלה ניתן להרכיב יחד כדי לתת עיבוד 3 מימדי מלא של פקקת יוצר. מכיוון שהמיקרוטום נמצא בתוך תא ההדמיה של SEM, כל שלבי הצביעה עבור SBF-SEM חייבים להיעשות תוך הטבעה מראש. השילוב של שתי גישות מיקרוסקופ אלקטרונים אלה מאפשר לצלם ברזולוציה של ~3 ננומטר או יותר על פני מספר מוגבל של חתכים, WA-TEM, או על פני העומק המלא של פקקת פצע ניקוב בגודל מילימטר קרוב, SBF-SEM. צפייה בתמונות WA-TEM תפורות בתוכנת 3DMOD10 מאפשרת מניפולציה מהירה בין רמות זום שונות, כך שניתן למקם אפילו תצוגות ברזולוציה גבוהה בהקשר בתוך חתך רוחב פקקת מלא.

לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול מוכח לייצור תרומבי פצעי ניקוב בעכברים, קיבוע שלהם באתרם ועיבודם למיקרוסקופ אלקטרונים באופן בו ניתן למקם את הפקקת בקלות בתוך הווריד או העורק ואת כיוונה ביחס למעקב אחר זרימת הדם. נקודות החלטה שונות מוצגות כך שהמשתמש יכול לקבל החלטות כיצד ינותחו הדגימות. אנו מתמקדים בהכנה למיקרוסקופ אלקטרונים המדגיש את הממברנות לעומת רכיבים אחרים בתא. בסופו של דבר, החלק של הפרוטוקול שהוא הכללי ביותר לחקירות אחרות הוא ההערכה של המחברים כי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור שטח רחב (WA-TEM) הוא גישת מונטאז' התומכת בידע ננומטרי של תאים, כלומר, טסיות בתוך מבנה גדול, בגודל מילימטרי, כאן פקקת יוצרת. היכולת המתקבלת למקם פרטים בתוך ההקשר הכולל היא הכוח המרכזי של שילוב השלבים השונים להליך מלא.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים למחקר זה.

תודות

המחברים מודים לעמיתיהם באוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (ג'רי וור וסונג ו' רי), באוניברסיטת פנסילבניה (טים סטאלקר ולורנס בראס), באוניברסיטת קנטקי (סידני ו' וייטהארט וסמיטה ג'ושי), ובמכון הלאומי לדימות ביולוגי וביו-הנדסה של המכונים הלאומיים לבריאות (ריצ'רד ד' ליפמן ומריה א' ארונובה) שמהם למדנו רבות. המחברים מביעים הערכה לאיגוד הלב האמריקאי ולמכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 ל-BS ופרסי משנה ממענקי ה-NIH R01 HL146373 ו-R35 HL150818) על תמיכה כספית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% תמיסת מלח רגילהMedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint סט ורידים בקרקפתMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint מחטים היפודרמיותMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint מחטים היפודרמיות מיוחדותMedlineNDA26393
50 מ"ל צינורות חרוטייםפישר סיינטיפיק06-443-20
רפידות הכנה לאלכוהול (70% אלכוהול איזופרופילMedlineMDS090670Z
רדיד אלומיניוםפישר סיינטיפיק01-213-100
צלחת חימום בעלי חייםPhysitemp מכשיריםHP-1M
Araldite GY 502אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי10900
Axiocam 305 צבע R2 מיקרוסקופיה מצלמהקרל זייס מיקרוסקופיה426560-9031-000
BD מזרקי Luer-Lok, 20 מ"לMedlineB-D303310Z
סידן כלורידפישר סיינטיפיקC79-500
צלחות תרבית תאים 35 מ"מ x 10 מ"מקורנינג בע"
430165 כותנה קצה אפליקטוריםMedlineMDS202055H
DMP-30 מפעילאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית13600
Dodecenyl Succinic Anhydride / DDSAElectron Microscopy Sciences13700
מלקחיים חבישה, 5 אינץ', מעוקל, משונן, צר קצהIntegra Miltex6-100
מלקחיים, 5 אינץ', סטנדרטי, משונןאינטגרה Miltex6-6
EMBED 812 שרףאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית14900
אתיל אלכוהול, נטול מים 200 הוכחהמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15055
פישרברנד 4 כיווני צינור מתלהפישר סיינטיפיק03-448-17
פישרברנד טיימר דיגיטליפישר סיינטיפיק14-649-17
משאבת עירוי מזרק יחיד של פישרברנדפישר סיינטיפיק7801001
ספוגי גזה 2 אינץ' x 2 אינץ'- 4 שכבותMedlineNON26224H
גלוטראלדהיד (תמיסה 10%)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית16120
הרדמה נוזלית איזופלורן, 100 מ"לMedline66794-017-10
מיקרו-פיין בסגנון תכשיטן מלקחיים, סגנון 5Fאינטגרה Miltex17-305צריך 2 זוגות.
צינורות משאבה L/S, סיליקון, L/S 15; 25 רגלVWRMFLX96410-15
L-חומצה אספרטיתFisher ScientificBP374-100
עופרת חנקתיתFisher ScientificL-62
מלכיט ירוק 4אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II ראש משאבהVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S כונן דיגיטלי במהירות משתנהVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5 אינץ' חותכי חוטיםפישר סיינטיפיק50-191-9855
אוסמיום טטרוקסיד 4% תמיסה מימיתמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית19150
פרפורמלדהיד (16% תמיסה)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710
בקרטמפרטורה PhysitempPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
אשלגן פרוציאנידסיגמא-אולדריץ'P-8131
תחמוצת פרופילן, ACS מגיבאלקטרונים מיקרוסקופיהמדעית 20401
כוסות זכוכית פיירקספישר סיינטיפיק02-555-25B
בדיקת טמפרטורת פי הטבעת לעכבריםPhysitemp InstrumentsRET-3
סקוטש קסם קלטת בלתי נראית, 3/4 אינץ' x 1000 אינץ'3M חברה305289
מאגר נתרן קקודילאט 0.2M, pH 7.4אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizerקנט סיינטיפיקSF-01
SomnoFlo ערכת התחלה לעכבריםקנט מדעיSF-MSEKIT
נירוסטה Minutien Pinsמדע משובח כלים26002-10
סטריאומיקרוסקופ steREO Discovery.V12מיקרוסקופיה קרל זייס495015-9880-010
סילגארד 184 סיליקון אלסטומרמכשירי דיוק עולמייםSYLG184מחצלת סיליקון
חומצה טאניתמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי21700
תיוקרבוהידרזיד (TCH)סיגמא-אולדריץ'88535
אורניל אצטטאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית22400
Vannas אביב מיקרו מספרייםFine ScienceTools 15000-08
Von Graefe מלקחיים להלבשת עיניים, 2.75 אינץ', מעוקל,אינטגרה משוננת Miltex18-818צריך 2 זוגות.
Wagner מספרייםכלי מדע עדינים14068-12
Wahl MiniFigura גוזם בעלי חייםBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite תוכנהקארל זייס מיקרוסקופיה410135-1001-000
)מ

מקורות

  1. Rhee, S. W., et al. Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates. Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).
  2. Pokrovskaya, I. D., et al. Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site. Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).
  3. Yadav, S., Storrie, B. The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships. Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).
  4. Joshi, S., et al. Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis. J Vis Exp. (193), e64985(2023).
  5. Guerrero, J. A., et al. Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation. Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).
  6. Kato, K., et al. The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion. Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).
  7. Tomaiuolo, M., et al. Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury. Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).
  8. Cocchiaro, J. L., et al. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  9. Pokrovskaya, I. D., et al. Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway. Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).
  10. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  11. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  12. Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants. Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).
  13. Kiernan, J. A. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do. Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).
  14. Storrie, B., Attardi, G. Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation. J CellBiol. 56, 819-831 (1973).
  15. Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking. Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).
  16. Klarhofer, M., et al. High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger. Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).
  17. Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. Physiology, cardiovascular. StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).
  18. Pokrovskaya, I. D., et al. SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets. Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).
  19. Pokrovskaya, I. D., et al. 3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets. Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מוסטזיס פצע ניקוב והכנת דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים רחב שטח מונטאז'
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.