Method Article

כימות עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת מימדיים

DOI:

10.3791/66493

⸱

September 27th, 2024

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קוצים דנדריטיים הם תאים פוסט-סינפטיים של רוב הסינפסות המעוררות. שינויים במורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי מתרחשים במהלך התפתחות עצבית, הזדקנות, למידה והפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות רבות, המדגישים את החשיבות של ניתוח עמוד שדרה דנדריטי אמין. פרוטוקול זה מתאר כימות מדויק ושחזור של מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת-ממדיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קשרים סינפטיים מאפשרים חילופי מידע ועיבודו בין נוירונים. האתר הפוסט-סינפטי של סינפסות מעוררות נוצר לעתים קרובות על קוצים דנדריטיים. עמוד השדרה הדנדריטי הוא מבנה בעל עניין רב במחקר המתמקד בפלסטיות סינפטית, התפתחות עצבית והפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. עמוד השדרה הדנדריטי עובר שינויים מבניים במהלך חייו, כאשר תכונות כגון מספר עמוד השדרה הכולל, גודל עמוד השדרה הדנדריטי ותת-סוג מוגדר מורפולוגית משתנות בתגובה לתהליכים שונים. התוויית המנגנונים המולקולריים המווסתים שינויים מבניים אלה של עמוד השדרה הדנדריטי מסתמכת על מדידה מורפולוגית. זה מחייב ניתוח מדויק וניתן לשחזור של עמוד השדרה הדנדריטי כדי לספק ראיות ניסיוניות. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט לכימות וסיווג עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות Neurolucida 360 (תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת מימדי). פרוטוקול זה מאפשר לקבוע תכונות מפתח של עמוד השדרה הדנדריטי כגון צפיפות עמוד השדרה הכוללת, נפח ראש עמוד השדרה וסיווג לתת-סוגים של עמוד השדרה ובכך מאפשר ניתוח יעיל של פנוטיפים מבניים של עמוד השדרה הדנדריטי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קוצים דנדריטיים הם בליטות של דנדריטים המהווים לעתים קרובות את האתר הפוסט-סינפטי של סינפסות גלוטמטרגיות 1,2. קוצים דנדריטיים הם בעלי עניין מיוחד בתחום הפלסטיות הסינפטית. עמוד השדרה משתנה לעתים קרובות כאשר הכוח הסינפטי משתנה, הופך גדול וחזק יותר בעוצמה סינפטית לטווח ארוך או קטן יותר וחלש יותר בדיכאון סינפטי לטווח ארוך 3,4,5,6,7. מעבר לפלסטיות הסינפטית, הפרופיל של עמוד השדרה הדנדריטי משתנה לאורך תוחלת החיים. בהתפתחות מוקדמת, יש תקופה של היווצרות וצמיחה של עמוד השדרה הדנדריטי, ואחריה גיזום עמוד השדרה הדנדריטי עד הגעה למצב יציב 8,9,10. במוח מזדקן, אובדן עמוד השדרה מלווה בהתכווצות המוח ובירידה קוגניטיבית11. בנוסף, הפרעות נוירולוגיות, נוירודגנרטיביות ופסיכיאטריות רבות מאופיינות בעמוד שדרה דנדריטי חריג. באזורים מרובים במוח אצל אנשים הסובלים מסכיזופרניה יש פחות עמוד שדרה דנדריטי, ככל הנראה כתוצאה משינוי בגיזום סינפטי12. הפרעות בספקטרום האוטיסטי מאופיינות גם בפאתולוגיות עמוד השדרה הדנדריטי13. אובדן עמוד השדרה הדנדריטי הוא סימן ההיכר של מחלת אלצהיימר ופרקינסון14,15. בהתחשב במגוון הרחב של נושאי המחקר הכוללים חקירות של תכונות עמוד השדרה הדנדריטי, טכניקות לכימות מדויק של עמוד השדרה הן בעלות חשיבות עליונה.

צביעה, כלומר שיטת גולג'י, או תיוג נוירונים באמצעות מילוי צבע או ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים הן שיטות נפוצות להדמיית עמוד השדרה הדנדריטי 16,17,18. לאחר הדמיה, ניתן לנתח קוצים עם מגוון לקוחות תוכנה חופשיים וזמינים מסחרית. התפוקה הרצויה של הניתוח היא גורם חשוב בקביעת איזו תוכנה תהיה בשימוש הרב ביותר. פיג'י היא אפשרות תוכנה מעשית לשאלות המתמקדות בצפיפות עמוד השדרה הדנדריטי. עם זאת, טכניקה זו מסתמכת במידה רבה על ספירה ידנית גוזלת זמן שיכולה להציג את הפוטנציאל להטיה. תוספים חדשים כגון SpineJ מאפשרים כימות אוטומטי, ובנוסף מאפשרים ניתוח מדויק יותר של צוואר עמוד השדרה19. החיסרון של גישות אלה הוא אובדן ניתוח תלת מימדי לקביעת נפח עמוד השדרה, מכיוון ש- SpineJ מוגבל לערימות תמונות דו-ממדיות. בנוסף, השגת מידע על תת-סוג עמוד השדרה הופכת למאתגרת באמצעות תהליכים אלה. ארבעת תת-הסוגים הדומיננטיים של עמוד השדרה, דק, פטרייה, עקשן ופילופודיה, כולם מרמזים על פונקציות נפרדות ומסווגים במידה רבה באמצעות מורפולוגיה20. קוצים דקים מאופיינים בצוואר מוארך וראש מוגדר21. לקוצים פטריות יש ראש עמוד שדרה הרבה יותר גדול ובולט22. קוצים עקשניים קצרים ויש להם שונות מועטה בין הראש לצוואר23. פילופודיה הם קוצים לא בוגרים עם צוואר ארוך ודק וללא ראש שניתן להבחין בו בבירור24. בעוד שסיווג מספק מידע בעל ערך, קוצים קיימים על רצף של ממדים. הסיווג לקטגוריות מבוסס על טווחי מדידות מורפולוגיות25,26. מדידה ידנית של קוצים לצורך סיווג מגבירה את הנטל הלוגיסטי על החוקרים בגישה זו.

אפשרויות תוכנה אחרות המתמקדות באופן ספציפי בניתוח תלת מימדי של עמוד השדרה הדנדריטי מתאימות יותר לחקירות של נפח עמוד השדרה ותכונות תת-סוג 27,28,29,30,31. למרות הקושי שמציג ניתוח תלת מימדי, כגון רזולוציה ירודה של מישור Z ומריחה, אפשרויות תוכנה אלה מאפשרות שחזור תלת מימדי אמין של דנדריטים ועמוד שדרה דנדריטי באופן חצי אוטומטי מונחה משתמש. סיווג אוטומטי של קוצים מזוהים לתתי הסוגים שלהם הוא גם תכונה הקיימת בחלק מחבילות התוכנה לניתוח עמוד השדרה הללו. זה יכול להקל על חששות של עומס עבודה פוטנציאלי והטיה ניסיונית. Neurolucida 360 היא תוכנה מסחרית אחת המאפשרת זיהוי וסיווג עמוד שדרה דנדריטי תלת מימדי אמין וניתן לשחזור32. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף כדי להכין ביעילות רקמות קבועות, לרכוש תמונות, ובסופו של דבר לכמת ולסווג עמוד שדרה דנדריטי באמצעות תוכנה זו.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים בבעלי חיים פעלו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב המשתמשים בבעלי חיים במחקר אינטרמורלי ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי לבריאות הנפש.

1. הכנת פרוסות היפוקמפוס קבועות

  1. מרדימים עכברים בהזרקה תוך צפקית של קטמין/קסילזין (קטמין: 100 מ"ג/ק"ג; קסילזין: 8 מ"ג/ק"ג). יש לאמת את פעולת ההרדמה באמצעות צביטת זנב ולהצמיד את העכבר לצלחת הזילוח.
  2. באמצעות מספריים כירורגיים גדולים, להסיר את העור והפרווה מן החזה, המאפשר הדמיה קלה יותר של כלוב הצלעות הבסיסי.
  3. בצע חתך אופקי מתחת לרוחב כלוב הצלעות, הימנעות הכבד והסרעפת. בעזרת מלקחיים עדינים, משכו את תהליך הקסיפואיד למעלה וחתכו כל צד צדדי של כלוב הצלעות. הופכים את כלוב הצלעות לאזור הצוואר ומהדקים למקומו באמצעות מלקחיים hemostat.
  4. הכנס מחט פרפר 21 גרם לחדר השמאלי של הלב והתחל לנקב בטמפרטורת החדר 1x PBS בערך 5 מ"ל / דקה. בצע חתך קטן באטריום הימני עם מספריים כירורגיים קטנים. מחוררים עם PBS עד שהפתרון שמשאיר את האטריום פנוי.
  5. כבו את משאבת הזילוח כדי לוודא שלא נכנסות בועות לצינור. הניחו את הצינורית מ-PBS לתוך 4% פרפורמלדהיד קר כקרח (PFA) ב-PBS. יש לערבב עם PFA בקצב של 5 מ"ל/דקה עד להקשיחות מלאה של החיה, כ-25 מ"ל.
    הערה: ודא שה-PFA טרי (לא יותר משבוע אם המלאי מאוחסן בטמפרטורה של 4° צלזיוס) לקיבוע מיטבי.
  6. הסר את העור מפני השטח של הגולגולת עם מספריים כירורגיים קטנים. בצע חתך midsagittal עם מספריים כירורגיים קטנים לאורך הסדק המרכזי של הגולגולת. בצע חתכים רוחביים rostral אל נורת הריח מעל המוח הקטן.
  7. פתח את הגולגולת עם מלקחיים עדינים כדי לחשוף את המוח. בעזרת מרית, גרפו את המוח בעדינות מנורות הריח והכניסו ל-PBS 4% PFA למשך הלילה.
    הערה: לקבלת פרוטוקול מקיף יותר של זילוח מכרסמים, עיין ב- Gage et al.33.
  8. Cryoprotect המוח קבוע על ידי החלפת 4% PFA עם 15% סוכרוז PBS במשך יום אחד. לאחר מכן, החליפו את 15% הסוכרוז ב-30% סוכרוז בתמיסת PBS למשך יום אחד עד שהמוח שוקע בתמיסה.
  9. הסר את המוח מתמיסת הסוכרוז והניחו אותו בצלחת פטרי עם PBS. חותכים את המוח הקטן ואת נורת הריח באמצעות להב אזמל.
  10. הניחו כמות קטנה, בקוטר 1-2 ס"מ, של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) על משטח מחזיק הדגימה. הרכיבו את המוח באופן קורונלי למחזיק הדגימה עם משטח החיתוך הקאודלי ב- OCT. הקפיאו במהירות את המוח על ידי הנחת מחזיק הדגימה בקרח יבש כתוש עד להקפאה נראית לעין, בערך 5-7 דקות.
  11. ודא שזווית הלהב של ההקפאה מוגדרת בין 0° ל- 5° כדי ליצור חלקים אחידים. התאימו את זווית לוח הגלגול לשיטוח אופטימלי של הפרוסה. עיין במדריך הציוד לקבלת הוראות ספציפיות.
  12. הניחו את מחזיק הדגימה בהקפאה עם המשטח הגחוני של המוח הקרוב ביותר ללהב. חתכו את המוח לחלקים של 30 מיקרומטר בהיפוקמפוס הגבי, והשליכו את כל הפרוסות להיפוקמפוס.
    הערה: ניתן להתאים חלק זה של הפרוטוקול לכל אזור רצוי במוח לפי בחירתו. שלבים 1.9-1.12 ישתנו בהתאם לאזור העניין.
  13. מעבירים פרוסות היפוקמפוס גביות ל-PBS. בעזרת מברשת צבע, הרכיבו בעדינות את חלקי ההיפוקמפוס על שקופית מיקרוסקופ. הסירו את עודפי התמיסה בעזרת צמר גפן או מגבוני משימה עדינים.
  14. יש למרוח 100 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה קשיח על שקופית המיקרוסקופ המכסה את כל פרוסות המוח. כדי למנוע בועות, הנמיכו את הכיסוי באיטיות באמצעות מלקחיים על אמצעי ההרכבה. אם נוצרות בועות, טפחו בעדינות על הכיסוי עם מלקחיים כדי לאפשר להם לברוח. תן לשקופיות לשקוע במהלך הלילה לפני ההדמיה.

2. הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה

  1. השתמש בעיניות בהגדלה נמוכה כדי לזהות תאים פלואורסצנטיים. עבור למטרה של 63x (NA = 1.4) ומעלה, תוך החלת מדיום טבילה מתאים על המטרה.
    הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם מטרה של 63x ומעלה.
  2. זהה מקטעים דנדריטיים מסומנים היטב עם חפיפה מוגבלת לרכישת תמונה. הגדר את עוצמת הלייזר והרווח כדי להבטיח שהדנדריטים הפלואורסצנטיים אינם רוויים. בנוסף, הפחתת מהירות הסריקה יכולה לספק רזולוציית תמונה טובה יותר.
  3. רכוש ערימות z המקיפות את המקטעים הדנדריטיים המלאים לניתוח עתידי. ערימות Z הגדולות מ-10 מיקרומטר אינן רצויות בשל הפוטנציאל הנוסף לחפיפה דנדריטית במישור Z.
    הערה: השתמש בגודל הקטן ביותר הזמין של z-step (0.2-0.7 מיקרומטר) ובגודל חור סיכה של יחידה אוורירית אחת. גודל הצעד הקטן יותר יוצר יותר תמונות בערימת z, ומפצה על רזולוציית Z המוגבלת של מיקרוסקופים רבים.
  4. אופציונלי: אם זמין, השתמש בפונקציונליות תוכנת deconvolution המתאימה של המיקרוסקופ כדי לבטל תמונות מפותלות (deconvolution images). זה יאפשר תמונות ברזולוציה גבוהה יותר.

3. כימות עמוד השדרה הדנדריטי

  1. פתח את Neurolucida 360 (v2022.1.1 ואילך). פתח את קובץ התמונה בתוכנה לניתוח עמוד השדרה (File > Open > Image). ודא שקובץ התמונה גלוי בחלון הראשי ובסביבה התלת-ממדית. אם החלון סביבת תלת-ממד אינו מופיע, לחץ לחיצה שמאלית על סביבת תלת-ממד בסרגל הכלים העליון של החלון הראשי בכרטיסיה מעקב (איור משלים 1)
    הערה: חלק זה של הפרוטוקול יכול להיות מותאם לכל תמונה דנדריטית, לא רק דנדריטים מרקמת עכבר.
  2. בכרטיסייה Change Image Display בחלון 3D Environment, ודא שהתמונה מוצגת כאמצעי אחסון תלת-ממדי בתיבה Display Image As . בתיבה הגדרות אוסף תמונות בכרטיסיה תמונה , בחר הקרנה מרבית בתפריט הנפתח הצג את פני השטח כ . (תרשים משלים 2)
  3. זהה מקטע דנדריטי מתאים למעקב.
    1. לחץ לחיצה שמאלית על הכלי הזזה של נקודת ציר בסרגל הכלים העליון של החלון סביבת תלת-ממד . לחץ לחיצה שמאלית על הדנדריט הרצוי כדי להגדיר נקודת ציר חדשה. פעולה זו תשנה את הכיוון כדי לאפשר התקרבות יעילה.
    2. קבע מחדש את הכיוון המקורי בלחיצה שמאלית על הסמל 'אפס כיוון '. לאחר קביעת נקודת הציר, לחץ לחיצה שמאלית על הכלי הזזת נקודת ציר כדי להתחיל לעקוב אחר הדנדריט. (תרשים משלים 2).
      הערה: הדנדריט האידיאלי הוא אחד עם חפיפה מוגבלת עם דנדריטים אחרים בכל אחד ממישורי הקואורדינטות ולא מצטלב עם דנדריט אחר או שטחי אחר מתחת. דנדריטים בסמיכות נמוכה לאחרים במישור XY עדיפים גם כדי למנוע הקצאה לא מתאימה של קוצים שכנים לדנדריט העוקב. כמו כן יש לציין כי לדנדריטים בעוביים, סדרים ומרחקים שונים מסומה יש צפיפות עמוד שדרה דנדריטית שונה34,35. זה צריך להיות מובא בחשבון בתכנון הניסוי. דנדריטים מסדר שניוני בעובי <1.5 מיקרומטר הם מועמדים אידיאליים למעקב (איור 1).
  4. לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על הכרטיסיה עץ בחלון סביבת תלת-ממד . לחצו לחיצה שמאלית על ' מונחה משתמש' למצב העקיבה ועל 'ליבות כיווניות' כשיטה ב'אפשרויות עקיבה מונחות משתמש'.
  5. לחץ לחיצה שמאלית על הדנדריט כאשר ליבה עגולה מופיעה כדי להתחיל את העקיבה. הזז את הסמן לאורך המקטע הדנדריטי. פעולה זו תאכלס את הגרעינים באופן אוטומטי. אם הגרעינים אינם מאוכלסים באופן אוטומטי, ראה שלב 3.51.
    1. הזיזו בעדינות את הסמן קדימה ואחורה על הדנדריט עד שהגרעינים יתאכלסו. לחץ לחיצה שמאלית כדי לשמר את הגרעינים הקיימים שזוהו. אם הגרעינים מפסיקים להתאכלס, לחץ לחיצה שמאלית כאשר ליבה מאוכלסת במורד הדנדריט כדי למקם ליבה באופן ידני. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסיים את העקיבה. ודאו שאורך הדנדריט העוקב הוא לפחות 7 מיקרומטר (איור משלים 3).
  6. ודא את דיוק המעקב הדנדריטי באמצעות כל שלושת הכיוונים של הסביבה התלת-ממדית, גובה, פיהוק וגלגול, על-ידי לחיצה שמאלית וגרירה של החלון סביבת תלת-ממד . זהה נקודות שבהן המעקב הדנדריטי נמצא מחוץ למיקום המתאים על הדנדריט. יכולים להיות מקרים שבהם הוא נראה במדויק מלמעלה למטה, אולם בממד z הנקודות אינן על הדנדריט (איור 2).
  7. לתיקון מקטעים דנדריטיים שלא אותרו כהלכה, לחצו לחיצה שמאלית על הכרטיסייה 'עריכה' בתפריט 'עץ '. לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על הדנדריט המעניין ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על נקודות.
  8. העבר נקודות שמוקמו בצורה לא נכונה בחזרה למקטע הדנדריט באמצעות לחיצה וגרירה. מחק נקודות מיותרות על-ידי לחיצה שמאלית על הנקודה ולחיצה על הלחצן מחק . שנה את גודל הנקודות אם הדנדריט אינו מלא כראוי. לשינוי גודל הנקודה, לחצו לחיצה שמאלית על נקודה והתאימו את מחוון העובי לשינוי הגודל (איור משלים 4).
    הערה: דנדריטים שאינם מלאים כראוי עלולים לגרום לזיהוי קוצים כוזבים שהם מרכיבים של המקטע הדנדריטי. לעומת זאת, מילוי יתר של דנדריטים יכול לטשטש קוצים אמיתיים.
  9. חזור על שלבים 3.3-3.8 עבור דנדריטים מרובים בתמונה לפני שתמשיך לזיהוי עמוד השדרה בשלב 3.10.
  10. לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על הכרטיסיה Spine בחלון 3D Environment. הגדר הגדרות זיהוי עבור טווח חיצוני, גובה מינימלי וספירת ווקסל מינימלית. בהתאם להכנה, ייתכן שיהיה צורך לשנות את הערכים שנקבעו מראש במקרה של הצדקה ברורה וספציפית לשינויים. התנאים שנקבעו מראש הם טווח חיצוני: 2.5 מיקרומטר, גובה מינימלי: 0.3 מיקרומטר, ספירת ווקסל מינימלית: 10 ווקסלים.
    הערה: תכשירים שונים, כגון תרביות תאים לעומת רקמות אקוטיות, כמו גם נקודות זמן התפתחותיות שונות ידרשו קריטריונים שונים שיש לגזור מהספרות הקיימת. כמו כן, חשוב לציין כי שינוי הגדרות הזיהוי יכול לשנות באופן משמעותי את התוצאות. לדוגמה, גובה מינימלי גבוה יותר יכול להוציא קוצים קצרים. הגדרות הזיהוי חייבות להישאר עקביות לאורך כל מהלך הניסוי.
  11. הגדר את רגישות הגלאי ל- 70% ולחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על זהה הכל. זה יאכלס את עמוד השדרה שזוהה על ידי רגישות גלאי זה על כל הדנדריטים. אם רוצים לבחור קוצים באופן ספציפי לדנדריט, לחץ לחיצה שמאלית על התיבה לחץ על תמונה כדי לזהות הכל על הענף הקרוב ביותר, ולחץ לחיצה שמאלית על כל דנדריט באופן ידני עם רגישויות שונות לגלאים.
    הערה: בשלב זה זה נורמלי שלא כל עמוד השדרה הדנדריטי יתאכלס. באופן דומה, אנשים שאינם קוצים עלולים להתאכלס בצורה לא נכונה. הרגישות הראשונית של 70% היא גם גמישה; זה עשוי להשתנות בהתאם להכנה.
  12. בחן את הקוצים שנבחרו על ידי רגישות גלאי זה על ידי לחיצה וגרירה של הדנדריט לכל שלושת הכיוונים. אם רוב הקוצים שזוהו אינם מלאים במלואם, המשך לשלב 3.12.1. אם הקוצים שזוהו מלאים יתר על המידה, המשך לשלב 3.12.2. אם נראה שהקוצים שזוהו מלאים כראוי, המשך לשלב 3.13.
    1. הגדל את רגישות הגלאי ב- 5%-10% ולחץ שוב באמצעות לחצן העכבר השמאלי על זהה הכל . זה יחליף את כל הקוצים שזוהו בעבר עם חדשים ברגישות גבוהה יותר. חזור על הפעולה לפי הצורך עד שהקוצים שזוהו יתמלאו כראוי.
    2. הקטן את רגישות הגלאי ב- 5%-10% ולחץ שוב על לחצן העכבר השמאלי זהה הכל . זה יחליף את כל עמוד השדרה שזוהה בעבר עם חדשים ברגישות נמוכה יותר . חזור על הפעולה לפי הצורך עד שהקוצים שזוהו יתמלאו כראוי.
  13. לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על שמור על קוצים קיימים בכרטיסיה 'שידרה ' של סביבת התלת-ממד. אם האפשרות 'לחץ על תמונה כדי לזהות הכל בענף הקרוב ביותר ' נבחרה, בטלו את הבחירה בה.
    הערה: על ידי בדיקת שמור על עמוד שדרה קיים מבטיח שזיהוי חדש של קוצים דנדריטיים באופן ידני לא יחליף קוצים שזוהו בעבר. ודא שתיבה זו נבחרה לפני שתמשיך, כדי לא לדרוס את העבודה הקודמת.
  14. לחץ לחיצה שמאלית על Move Pivot Point ולחץ לחיצה שמאלית על הדנדריט הדורש זיהוי נוסף של עמוד השדרה כדי להגדיר את נקודת הציר.
    1. בטל את הבחירה באפשרות Move Pivot Point. זהה עמוד שדרה דנדריטי לא מלא. הגדל את רגישות הגלאי ב-10%-20% מעבר לגילוי הקודם ולחץ לחיצה שמאלית על עמוד השדרה. אם עמוד השדרה שזוהה נמצא מתחת או מלא יתר על המידה, המשך לשלב 3.14.3 או 3.14.4. אם עמוד השדרה אינו מאוכלס, תופיע ההודעה לא ניתן לזהות עמוד שדרה במיקום שנבחר . במקרה זה, המשך לשלב 3.14.2.
    2. הגדל את רגישות הגלאי בהדרגה, אולי מעל 100%, עד שעמוד השדרה זוהה ומלא כראוי. אם עמוד השדרה מזוהה אך אינו מלא כראוי, המשך לשלב 3.14.3. אם עמוד השדרה מלא יתר על המידה, המשיכו לשלב 3.14.4 (איור 3).
    3. לחץ לחיצה שמאלית על הכרטיסיה עריכה ולחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על עמוד השדרה הממולא. לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על הסר. בטל את הבחירה בכרטיסיה עריכה . הגדל את הרגישות ב 5%-10% ולחץ לחיצה שמאלית על עמוד השדרה. חזור על שלב זה אם עמוד השדרה עדיין לא מלא.
    4. לחץ לחיצה שמאלית על הכרטיסיה עריכה ולחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על עמוד השדרה הממולא יתר על המידה. לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על הסר. בטל את הבחירה בכרטיסיה עריכה . הפחיתו את הרגישות ב-5%-10% ולחצו על עמוד השדרה. חזור על שלב זה אם עמוד השדרה עדיין מלא יתר על המידה.
  15. חזור על שלבים 3.14-3.14.4 עד שכל עמוד השדרה זוהה על ידי זיהוי חזותי. בדוק שוב את הדנדריט עבור כל עמוד שדרה השייך לדנדריטים שכנים, קוצים מזויפים המתאימים ללא אות אמיתי, או מקטעים פוטנציאליים של דנדריט המסומנים בטעות כעמוד שדרה. מחק קוצים שגויים אלה באמצעות הפונקציה הסר .
  16. בדוק את הקוצים המזוהים על הדנדריט. במקרים מסוימים, קוצים מרובים עשויים להופיע כעמוד שדרה קונגלומרט אחד. אם נראה שעמוד שדרה מקיף שניים, לחץ לחיצה שמאלית על הכרטיסיה עריכה . לחצו לחיצה שמאלית על השידרה ולחצו לחיצה שמאלית על 'הסתר בחירה'. לאחר אישור עמוד שדרה של קונגלומרט, בכרטיסיה עריכה , לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על הצג בחירה ובחר פצל. אם יותר משני קוצים נמצאים בקונגלומרט אחד, ייתכן שיהיה צורך לחזור על השלב הזה (איור 4).
    הערה: אם עמוד השדרה של הקונגלומרט אינו מתפצל לאחר שלב 3.16, הסר את עמוד השדרה . לאחר מכן בחר את עמוד השדרה האינטנסיבי יותר של הקונגלומרט ברגישות נמוכה יותר. ברגע שעמוד השדרה האינטנסיבי יותר מתמלא, הגדל את הרגישות כדי לבחור את עמוד השדרה השני שאינו מלא. לחילופין, מחיקת עמוד השדרה של הקונגלומרט ולאחר מכן הגברת הרגישות עשויה לאפשר פיצול נכון.
  17. כאשר כל הקוצים הניתנים לזיהוי חזותי זוהו ומולאו כראוי, בכרטיסיה עמוד השדרה , לחץ לחיצה שמאלית על סווג הכל כדי לסווג את הקוצים לארבעה תת-סוגים: דק, פטריות, עקשן ופילופודיה (איור 5).
    הערה: פרמטרי סיווג עמוד השדרה עשויים להשתנות בחלון הגדרות בתיבה סיווג בכרטיסיה שידרה . כמו בהגדרות הגלאים, מומלץ מאוד רציונל ברור לשינוי הפרמטרים הקיימים. הערכים שנקבעו מראש הם יחס ראש לצוואר: 1.1, יחס אורך-ראש: 2.5, גודל ראש פטרייה: 0.35 מיקרומטר, פילופודיום אורך- 3 מיקרומטר.
  18. בסרגל הכלים העליון של החלון סביבת תלת-ממד, בחר שמור והצג בסייר Neurolucida. Neurolucida Explorer הוא המקום שבו הנתונים נאספים מן המעקבים. העבודה תישמר כקובץ .dat המכיל את כל העקיבה והקוצים.
  19. בחלון Explorer בכרטיסיה תצוגה , לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על בחר הכל כדי לסמן את כל הדנדריטים והקוצים.
  20. לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי על הכרטיסיה נתח בסרגל הכלים העליון. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התפריט הנפתח מבנה . לחץ לחיצה שמאלית על ניתוח מבנה מסועף.
  21. בהתאם למשתנים המעניינים, ניתן לבחור כל אחד מהניתוחים. שני השימושיים ביותר לשאלות המתמקדות בצפיפות עמוד השדרה ובנפח עמוד השדרה הממוצע הם כל עץ > כל דנדריט וקוצים > פרטי עמוד השדרה. בחר אישור, והנתונים יופיעו בשני חלונות נפרדים.
  22. העתק את הנתונים לגיליון אלקטרוני לצורך הידור וניתוח נוספים.
    הערה: העץ הבודד יופרד על ידי דנדריט, אך נפח עמוד השדרה לא יהיה. באמצעות פונקציית המיון בגיליון האלקטרוני, ניתן לסנן את פרטי עמוד השדרה לפי תכונות.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש יעיל בשיטת ניתוח זו מתחיל בבחירת מקטעים דנדריטיים למעקב. כפי שמתואר באיור 1, הדנדריטים האידיאליים למעקב אינם קרובים לדנדריטים אחרים. דנדריטים הפועלים במקביל עלולים לגרום לזיהוי לא נכון של קוצים מדנדריט שכן. דנדריטים המצטלבים ישירות או רצים בניצב במישור z שונה מוסיפים קושי משמעותי גם למעקב דנדריטי מדויק. חשוב גם לציין את ההבדלים בעובי הדנדריט. כפי שדווח בעבר, ישנם הבדלים מרכזיים בצפיפות עמוד השדרה עם דנדריטים בעובי משתנה36. יכולים להיות גם הבדלים באותו דנדריט עם מרחק גדול יותר מנקודת ההסתעפות37. מעקב אחר דנדריטים באותו סדר ועובי, באופן אידיאלי עם מקורות נקודת הסתעפות דומים, יכול לשלוט על ההטרוגניות הקיימת של צפיפות עמוד השדרה הדנדריטי. זיהוי נקודת ההסתעפות בתכשירים מסוימים עשוי להתברר כבלתי אפשרי, אך עובי הדנדריט צריך תמיד להיות גורם ניתן לשליטה במעקב הדנדריטים. המעקב המדויק אחר מקטעים דנדריטיים חיוני להשגת תוצאות מדויקות מניתוח זה. יש לוודא שכל הנקודות של הדנדריט העוקב נמצאות באמת בתוך הדנדריט. צפייה בדנדריט התלת-ממדי מכיוונים שונים יכולה לסייע בתהליך זה. כפי שמודגם באיור 2A,B, התצוגה מלמעלה למטה מראה מה שנראה כמו דנדריט שעוקב כראוי. במבט מהצד; עם זאת, נקודות רבות אינן ממוקמות על הדנדריט עצמו. נושאים אלה אינם קיימים במבט מהצד של איור 2C. כמו כן, חיוני לוודא שדנדריטים מלאים כראוי במהלך העקיבה. דנדריט שאינו מלא מספיק יכול לגרום לכך שחתיכות של דנדריטים יזוהו באופן לא הולם כקוצים. דנדריט מלא יתר על המידה יכול למנוע זיהוי קוצים אמיתיים בגלל סף הגובה המינימלי. הערכה ידנית זו של המעקב מונחה המשתמש היא קריטית כדי לאפשר ניתוח מדויק של עמוד השדרה הדנדריטי.

זיהוי עמוד השדרה הדנדריטי דורש גם גישה מונחית משתמש. השימוש בפונקציה "Detect All" כדי להגדיר את סף הרגישות האחיד של הגלאי אינו מספק מסיבות רבות. השימוש בתכונה "זהה הכל" שימושי לזיהוי הקוצים הברורים ביותר, אך יש לבדוק את מילוי הקוצים הללו כדי לאמת. הקוצים המזוהים עם "Detect All" הראשוני עשויים להיות לא מלאים. כדי לתקן זאת, יש למחוק בנפרד את עמוד השדרה שזוהה ואז לזהות אותו מחדש באופן ידני ברגישות גבוהה יותר של הגלאי (איור 3A-C). זה מבטיח כי עמוד השדרה הוא מלא כראוי. קיימת הטרוגניות משמעותית ברגישות הגלאי הנדרשת לעמוד השדרה שיש לקחת בחשבון באופן ידני. הגברת רגישות הגלאי כדי לזהות כולם עלולה לגרום לקוצים מלאים מדי, הדורשים תיקון ידני גם כן (איור 3D). בעיה נוספת עם רגישות לא נכונה לגלאי היא יצירה לא מתאימה של עמוד שדרה קונגלומרט, עמוד שדרה דנדריטי מלא אחד המקיף מספר קוצים. שני קוצים שנמצאים בסמיכות זה לזה יכולים להתמזג בצורה לא נכונה לעמוד שדרה קונגלומרט אחד (איור 4A,B). לתוכנת זיהוי עמוד השדרה יש תכונת "פיצול", שניתן להשתמש בה כדי להפריד קוצים שמוזגו על ידי מילוי יתר. תכונת ה"פיצול" מאפשרת ליצור בקלות את עמוד השדרה הבודד מעמוד השדרה של הקונגלומרט (איור 4C). מעקב דנדריטים מדויק ומילוי עמוד השדרה הדנדריטי מאפשרים סיווג מדויק לתתי סוגים של עמוד השדרה. סיווג עמוד השדרה מסתמך על מורפולוגיה מהקוצים המלאים ועל המרחק מדנדריטים, כך שכל שלב בתהליך משחק תפקיד בסיווג המורפולוגי (איור 5).

בשל הצורך בבחירה ידנית וסף, חיוני לעקוב אחר תקן אחיד לכל הניתוחים. הדבר רלוונטי במיוחד אם משתמשים מרובים תורמים לניתוח נתונים. כדי להבטיח שכל החוקרים המבצעים ניתוח פועלים לפי אותו תקן, החוקרים צריכים להשוות נתונים מאותם דנדריטים שאותרו. זה יכול להפחית את הפוטנציאל להטיית נסיין על ידי וידוא שכל חוקר מזהה עמוד שדרה על סמך קריטריונים משותפים ואחידים בצורה עיוורת. קיימת גם אפשרות להטיה של חוקר יחיד בין ימים או אפילו באותו יום עקב עייפות. זה צריך להיות מנוטר לאורך כל תהליך ניתוח הנתונים. כדי להבטיח עוד יותר את תקפות הניתוח, השוואת התוצאות הראשוניות לאלה שפורסמו בספרות מבטיחה כי הפרוטוקול מתבצע ביעילות. חשוב לציין כי השוואה זו תהיה יעילה רק אם ההכנה והפרמטרים משותפים. הבדלים בצביעה, רכישת אותות פלואורסצנטיים, סדר ועובי הדנדריטים, או אזור המוח יכולים לתרום לתוצאות שונות 8,36. במקרה של תוצאות חסרות שפורסמו, שימוש במספר חוקרים כדי לאמת את זיהוי עמוד השדרה מאפשר ביטחון מוגבר באמינות וביכולת השחזור של הניתוח. תיקיית ניתוח משלימה נכללה בכתב יד זה. תיקייה זו מכילה קבצים של תמונות לדוגמה של מקטעים דנדריטיים, דנדריטים שאותרו, דנדריטים שאותרו עם קוצים מזוהים ומסווגים, ופלט נתונים (טבלה משלימה 1, קובץ משלים 1, קובץ משלים 2, קובץ משלים 3 וקובץ משלים 4). משתמשים חדשים יכולים להתאמן על ערכת נתונים זו כדי לתרגל את ההליכים המתוארים במאמר זה. תוצאות שנוצרו על-ידי משתמשים בתוך 10% מערך הנתונים לדוגמה שסופק נחשבות קבילות לשחזור תקן הניתוח. בשל הקריטריונים הסובייקטיביים הפוטנציאליים של עמוד שדרה מלא במלואו והצורך בבדיקה ידנית של קוצים שזוהו באופן אוטומטי, השונות בין ובתוך החוקרים היא חלק נורמלי מהניתוח. אם התוצאות שנוצרו יעברו סף זה; עם זאת, יש לערוך השוואה זה לצד זה כדי לקבוע מקרים של נפחי עמוד שדרה שונים, כמו גם קוצים שנכללו או לא נכללו כראוי. לאחר מכן ניתן לנתח מחדש את מערך הנתונים לדוגמה עד להגעה לסף המקובל.

figure-results-1
איור 1: בחירת דנדריטים לניתוח עמוד השדרה הדנדריטי. (A) תצוגה בנפח תלת-ממד של תמונות קונפוקליות מחסנית z שנלקחו מדנדריטים פרוקסימליים CA1 בקו העכבר המהונדס THY1-YFP. שימו לב להטרוגניות של סדר הדנדריטים עם דנדריטים ראשוניים עבים יותר באליפסות כחולות ודנדריטים דקים יותר, שניוניים ושלישוניים באליפסות ורודות. (B) מועמדים אידיאליים למעקב אחר דנדריטים מסומנים באליפסות ירוקות. שימו לב לעובי ולהצטלבויות המוגבלות, החפיפות והקרבה לדנדריטים אחרים. האליפסה האדומה מציינת מקטעים דנדריטיים שיש להימנע מהם לצורך מעקב דנדריטי עקב הצטלבויות גבוהות, חפיפות וקרבה לדנדריטים אחרים. דנדריטים ראשוניים עבים יותר גם אינם מועמדים מתאימים למעקב. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מעקב מדויק אחר מקטעים דנדריטיים. (A) תצוגה בנפח תלת-ממד של תמונות קונפוקליות מסוג z-stack שנלקחו מדנדריטים פרוקסימליים CA1 בקו העכבר המהונדס THY1-YFP למעקב באמצעות שיטת הליבה הכיוונית מונחית המשתמש. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) דוגמה למעקב לקוי אחר דנדריטים. נראה כי הדנדריט עוקב כראוי בתצוגה מלמעלה למטה. מבט מהצד מראה שהדנדריט מלא בצורה לא נכונה בנקודות החורגות מהדנדריט. (C) דוגמה למעקב דנדריט תקין. התצוגה מלמעלה למטה נראית דומה ל- B, אך התצוגה הצידית שונה באופן מהותי. הדנדריט ב-C נמצא במעקב תקין כפי שמצוין על ידי היותו מלא לחלוטין ללא סטיות מהדנדריט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מילוי מדויק של קוצים דנדריטיים באמצעות בחירה ידנית. (A) תצוגה בנפח תלת-ממד של תמונות קונפוקליות מסוג z-stack שנלקחו מדנדריטים פרוקסימליים CA1 בקו העכבר המהונדס THY1-YFP בעמוד השדרה הממתינים לזיהוי ידני. סרגל קנה מידה = 0.5 מיקרומטר. (B) דוגמה לעמוד שדרה דנדריטי שאינו מלא. יש אות פלואורסצנטי משמעותי שעדיין נראה לעין עקב מילוי לא שלם. (C) דוגמה לעמוד שדרה דנדריטי מלא כראוי. נוכחותה של "קורונה" של אות שבקושי נראית סביב החלק החיצוני של המילוי היא התקן למילוי מדויק של קוצים דנדריטיים. (D) דוגמה לעמוד שדרה דנדריטי מלא יתר על המידה. רגישות הגלאי גבוהה מדי, וכתוצאה מכך עמוד השדרה מלא יתר על המידה. המילוי חרג מגבולות הפלואורסצנטיות ויש לו עטרה כמעט בלתי מורגשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: פיצול קוצים דנדריטיים של קונגלומרטים. (A) תצוגה בנפח תלת-ממד של תמונות קונפוקליות מסוג z-stack שנלקחו מדנדריטים פרוקסימליים CA1 בקו העכבר המהונדס THY1-YFP עם שני קוצים בסמיכות. סרגל קנה מידה = 0.15 מיקרומטר. (B) דוגמה לשני קוצים עצמאיים שמולאו בצורה לא נכונה כעמוד שדרה דנדריטי קונגלומרט אחד. (C) בעקבות השימוש בתכונה "פיצול", עמוד השדרה של הקונגלומרט מתפצל לשני קוצים דנדריטיים נפרדים מלאים כראוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: זיהוי וסיווג עמוד השדרה הדנדריטי לתתי-סוגים. (A) תצוגה בנפח תלת-ממדי של תמונות קונפוקליות מחסנית z שנלקחו מדנדריטים פרוקסימליים CA1 בקו העכבר המהונדס THY1-YFP של מקטע דנדריטי עוקב שבודד לצורך כימות וסיווג עמוד השדרה הדנדריטי. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) מקטע דנדריטי עוקב עם כל הקוצים הדנדריטיים שזוהו ונבדקו כדי להבטיח מילוי ופיצול נאותים. התוכנה מקצה צבעים באופן שרירותי לקוצים מזוהים בשלב זה. (ג) סיווג כל עמוד השדרה הדנדריטי המזוהה לתתי סוגים באמצעות פרמטרים מוגדרים בתוכנה. כחול = פטרייה, צהוב = דק, וירוק = עקשן. פילופודיה אינם נוכחים בשל גילה של רקמה זו. (D) תמונות מייצגות של קוצים פטרייתיים, דקים ועקשנים שאינם מלאים (למעלה) ומלאים (למטה). סרגל קנה מידה = 0.3 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: גישה לסביבה התלת-ממדית. Z-stack של תמונות קונפוקליות שנצפו בממשק התוכנה. ניווט בסביבה תלת-ממדית מהכרטיסייה מעקב במציג הראשי מודגש בצהוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: פרמטרי תמונה והגדרות כיוון עבור סביבה תלת-ממדית. מציג סביבה תלת-ממדית עבור תמונות z-stack קונפוקליות. פרמטרים בכרטיסיה 'שינוי תצוגת תמונה ' המסומנת בחצים צהובים מוגדרים ל'הצג תמונה כ: עוצמת קול תלת-ממדית ' ו'הצג משטח כ: הקרנה מרבית'. הזזת נקודת Pivot Point ואיפוס כיוון מזוהים על-ידי חצים צהובים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: מעקב אחר מקטעי דנדריטים. (A) נפח תלת-ממדי של תמונות קונפוקליות מסוג z-stack עבור מעקב אחר דנדריטים. כאשר כרטיסיית העץ, הליבה מונחית המשתמש והליבה הכיוונית נבחרות כולן, העקיבה מתחילה בהצבת הליבה הראשונית על הדנדריט בלחיצה שמאלית. (B) התפשטות גרעינים כיווניים במורד הדנדריט בעקבות תנועת הסמן. (C) לחיצה שמאלית במורד הדנדריט ממלאת את הגרעינים הכיווניים. (D) דוגמה לגרעינים כיווניים שאינם מאכלסים דנדריט. במקום זאת, גרעין בודד נמצא בהמשך הקטע. (E) לחיצה שמאלית על הגרעין הבודד ממלאת את הדנדריט בין שתי הנקודות. לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני מסיימת את העקיבה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: התאמת נקודות בדנדריטים עוקבים. (A) מקטע דנדריט במעקב ממתין לכוונון נקודה. עריכת דנדריט דורשת בחירה בכרטיסייה "עץ" ובכרטיסייה "ערוך". שניהם מודגשים בצהוב. דנדריט נבחר לעריכה בלחיצה שמאלית. (B) בחירת כרטיסיית הנקודות, המסומנת בצהוב, מאפשרת בחירה של נקודות בודדות במקטע הדנדריט. עובי הנקודה הירוקה הוא 1.2 מיקרומטר. (C) נקודה מותאמת למילוי הדנדריט בצורה מדויקת יותר. ערך העובי החדש של הנקודה הירוקה הוא 0.6 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 1: תוצאות ניתוח תמונה לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: מעקב תמונה לדוגמה עם דנדריטים spines.dat אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: מעקב לדוגמה עם dendrites.dat אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 3: דוגמת תמונת דנדריט file.czi אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 4: דוגמת תמונת דנדריט file.jpx אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הספציפיים של הכנת הדגימה, הדמיה ותהליך הכימות והסיווג של עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנת שחזור תלת מימדית. תוכנה זו היא כלי רב עוצמה המסוגל לייצר נתונים מבניים חזקים התורמים למגוון רחב של חקירות. לאורך התהליך, ישנם כמה שלבים קריטיים שהופכים את הפרוטוקול הזה לפחות נטל מתודולוגי ומשפרים את התפוקה הכוללת של הנתונים. השיטה לתיוג קוצים דנדריטיים היא אחד הדברים הראשונים שחוקרים צריכים לשקול לפני שהם מתחילים בפרוטוקול זה. בעיות בכימות עמוד השדרה יכולות לנבוע משיטות תיוג לא מספקות. צביעה של חלבונים מסוימים המתבטאים ברמות נמוכות בעמוד השדרה עלולה לגרום לאותות נמוכים מדי עבור התוכנה. כמו כן יש לציין כי ניתן להציג הטיה על ידי מעקב אחר הדנדריטים הפלואורסצנטיים הבהירים ביותר. אמנם לא ברור אם לדנדריטים פלואורסצנטיים שונים יש תכונות פיזיולוגיות שונות, אך זו עדיין מגבלה של הפרוטוקול שיש לקחת בחשבון. בנוסף, בכמה קווים טרנסגניים, כגון קו THY1-YFP-H, פלואורסצנטיות בעמוד השדרה הדנדריטי מופיעה רק בסביבות P21. זה הופך את הקו הזה ללא מתאים לחקירות של נקודות זמן התפתחותיות צעירות יותר. בחינת השיטה המשמשת לסימון קוצים עבור אפיק החקירה אינה היבט טריוויאלי, שכן ללא פלואורסצנטיות מספקת, התוכנה הפחיתה את השימושיות. באופן דומה, חומרת רכישת התמונה דורשת התייחסות. ישנם כמה סוגי קבצים המוכיחים שהם פחות תואמים לתוכנת הניתוח מאחרים. באופן ספציפי, קבצי ND2 זוהו כסוגי קבצים בעייתיים לשימוש יעיל בתוכנה. ספקי התוכנה ממליצים על המרה לסוגי קבצים, כגון JPEG2000 במקרה של בעיות.

הכנת רקמות ורכישת תמונה הם גם צעדים חשובים לכימות עמוד השדרה באיכות גבוהה. קיבוע, חיתוך והרכבה נכונים של רקמות מבטיחים דגימה לאורך זמן עם מינימום ממצאים שיכולים להפריע לניתוח הנתונים. הדמיה של הרקמה היא גם לא רק עניין של צילום תמונות z-stack של פרוסת המוח כולה. במהלך ההדמיה, הכוונה צריכה תמיד להיות לרכוש ערימות המכילות דנדריטים לכימות עמוד השדרה. יש לשים דגש על רכישת ערימות z המשלבות דנדריטים שיהיה קל לעקוב אחריהם. ערימת z עבה יותר יוצרת בדרך כלל יותר דנדריטים ברקע. זה מקשה על מעקב יעיל אחר דנדריטים עם התוכנה. לקיחת זמן נוסף במהלך ההדמיה כדי למצוא מועמדים טובים יותר למעקב תחסוך זמן רב יותר במהלך ניתוח כימות עמוד השדרה. בנוסף, ודא שתמונות z-stack משלבות את כל הדנדריטים שיש לעקוב אחריהם. אם הדנדריטים ניתנים לצפייה חלקית בלבד בערימת z, מעקב הדנדריטים וזיהוי עמוד השדרה יתגלו כקשים ולא מדויקים עקב עיבוד תלת-ממדי לא שלם.

התהליך של מעקב אחר דנדריטים וקבלת פרופיל מדויק של קוצים דנדריטיים מזוהים יכול להיות תהליך מפרך. יש בזה מידה של ניואנסים. במהלך מעקב דנדריטים, הפונקציה מונחית המשתמש יכולה לפעמים לא לתפקד כמתוכנן. לעיתים, גרעיני הכיוון לא יתאכלסו על מקטע מסוים ולא יתחילו להתאכלס על מקטע לא רצוי. אחת הדרכים לעקוף זאת היא להתחיל עם רוחב תהליך טיפוסי קטן יותר. זה הופך את הדנדריט ליותר ניתן לזיהוי בתוכנה, ומאפשר מעקב קל יותר. אם הליבה הכיוונית לא תאכלס לחלוטין, לחיצה שמאלית על הדנדריט תמקם אחד באופן ידני. זה יגיע לנקודה קטנה מאוד ולא ימלא את הדנדריט, אבל זה יכול להיות מתוקן עם התאמת עובי כמתואר בשלב 3.8 של הפרוטוקול. בעוד שניתן לעקוב אחר דנדריטים באופן ידני אם התוכנה אינה מספקת, מעקב ידני אחר קוצים אינו יכולת של התוכנה. יהיו מקרים שבהם עמוד שדרה ברור נראה לעין, אך לא משנה כמה גבוהה רגישות הגלאי תלך, התוכנה לא תצליח לזהות אותו. דבר אחד שיש לבדוק הוא אם עמוד השדרה החשוד נמצא מחוץ לטווח. אם הוא בטווח אך עדיין לא מזוהה על ידי התוכנה, עמוד השדרה הזה לא ייכלל בניתוח. למרות שזה עשוי להתרחש לעתים רחוקות, זוהי מגבלה שיש לקחת בחשבון. כמו בכל ניתוח הדורש סף ורכיב סיווג ידני, קיימת אפשרות להכנסת הטיה. בעיה זו עלולה להחמיר עוד יותר בעת השוואת נתונים שנוצרו על-ידי משתמשים מרובים. האופי החצי-אוטומטי של ניתוח זה מבקש למזער את כניסתה של הטיה זו, אך היא אינה מתבטלת לחלוטין. במעבדה שלנו, שונות של 10% בין חוקרים במערך נתונים סטנדרטי הייתה סבירה עם תרגול והכשרה מספיקים. בעוד שנעשו מאמצים למזער את ההטיה, עדיין חשוב לקחת בחשבון הטיות בין חוקרים בעת הערכת נתונים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה.

אם ניקח בחשבון את החסרונות הקטנים של התוכנה, הפלט של ניתוח עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות טכניקה זו הוא חזק מאוד. כפי שתואר קודם לכן, ישנם מספר עצום של מדדים שניתן להסיק ממעקב מדויק אחר סגמנטים דנדריטיים וזיהוי עמוד השדרה. היכולת לקבל מידע על תת-סוג עמוד השדרה מספקת תובנה חשובה ברמה עמוקה יותר מהמדדים הבסיסיים. נתונים אלה חשובים בשל הקישוריות בין מבנה ותפקוד. כל תת-סוג של עמוד השדרה מרמז על פונקציה. קוצים דקים הם תת-הסוג השולט העובר מחזור שופע21. גם לקוצים דקים יש פוטנציאל להתפתח לקוצים פטרייתיים38. זה עולה בקנה אחד עם קוצים פטריות להיות קשור מאוד עם למידה וזיכרון 38,39. קוצים עקשניים נחשבים גם כמרכיב בלמידה, אולי כשרידים של קוצי פטריות40. פילופודיה, למרות שאינה נפוצה ברקמות בוגרות רבות, הם מבשרי עמוד השדרה שהם בעלי עניין מרכזי בהתפתחות41,42. מיקרוסקופ אלקטרונים תלת-ממדי נותר תקן הזהב לסיווג המדויק ביותר של תת-סוגים בעמוד השדרה. טכניקה זו אמנם בעלת ערך, אך מוגבלת על ידי מיון וסיווג ידניים מפרכים המועדים לטעויות אנוש. העיצוב האוטומטי למחצה של ניתוח זה מפחית את המקרים שבהם ניתן להציג הטיה סובייקטיבית. אמנם ייתכנו חסרונות במונחים של הרזולוציה האבסולוטית ועוצמת הפלואורסצנטיות הנדרשות כדי לבצע סיווגים מושלמים בפרוטוקול זה, אך הוא עדיין מספק חלופה פחות מעיקה מבחינה מתודולוגית למיקרוסקופ אלקטרונים תלת-ממדי ולסיווג ידני. יתר על כן, ניתוח דנדריטים מלא של ענפים דנדריטיים מרובים מדוגמית רחבה יותר של אזורי המוח אפשרי באמצעות הניתוח המתואר בעבודה זו. זה לא המקרה עם מיקרוסקופ אלקטרונים. באמצעות שימוש בפרוטוקול זה, ניתן לענות על שאלות ממוקדות מבנה במספר דיסציפלינות, כולל אך לא מוגבל לפלסטיות סינפטית, התפתחות והפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, באופן אמין וניתן לשחזור.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לקרולין סמית, שרה ויליאמס אברם, טד אוסדין וה-NIMH SNIR על הסיוע הטכני. בנוסף, ברצוננו להכיר בקבוצת המחקר הביו-רפואי של אוניברסיטת קולגייט בת'סדה. עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית NIMH Intramural (1ZIAMH002881 עד Z.L).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
518F שמן טבילהZeiss444960-0000-000
CryostatLeicaCM3050Sלהכנת פרוסות
מלקחיים עדיניםFST11150-10
מלקחיים המוסטטFST13020-12
מספריים כירורגיים גדוליםFST14002-16
LSM 880 מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM 880
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתFisherbrand12-541-035
משאבה מיני-פריסטלטית IIמכשיר הרווארד70-2027לזלוף
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1תוכנת ניתוח עמוד שדרה
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1תוכנת ניתוח עמוד שדרה
OCT CompoundSakura Finetek4583לחיתוך קריוסטט
פרפורמלדהיד (37%)FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DICZeiss440762-9904-000
להב אזמלFST10022-00
מספריים כירורגיות קטנותFST14060-09
מרית FST10091-12
סוכרוזFIsherbrandS5-500
Superfrost Plus MicroslidesDiaggerES4951 +
Vectashield HardSet הרכבה מעבדות וקטור בינוניH-1400-10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).">Gray, E. G. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).
  2. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).">Ramón Y Cajal, S. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).
  3. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).">Desmond, N. L., Levy, W. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).
  4. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).">Engert, F., Bonhoeffer, T. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).
  5. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).">Yang, Y., Wang, X. B., Frerking, M., Zhou, Q. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).
  6. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).">Oh, W. C., Parajuli, L. K., Zito, K. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).
  7. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).">Shinoda, Y., Tanaka, T., Tominaga-Yoshino, K., Ogura, A. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).
  8. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).">Markus, E. J., Petit, T. L. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).
  9. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).">Duan, H., Wearne, S. L., Rocher, A. B., Macedo, A., Morrison, J. H., Hof, P. R. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).
  10. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).">Chen, C. C., Lu, J., Zuo, Y. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).
  11. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).">Dickstein, D. L., Weaver, C. M., Luebke, J. I., Hof, P. R. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).
  12. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).">Glausier, J. R., Lewis, D. A. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).
  13. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).">Phillips, M., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).
  14. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).">Dorostkar, M. M., Zou, C., Blazquez-Llorca, L., Herms, J. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).
  15. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).">Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).
  16. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).">Cheng, C., Trzcinski, O., Doering, L. C. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).
  17. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).">Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).">Baloyannis, S. J. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).
  19. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).">Levet, F., Tonnesen, J., Nagerl, U. V., Sibarita, J. B. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).
  20. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).">Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).
  21. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).">Pfeiffer, T., et al. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).
  22. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).">Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
  23. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).">Hering, H., Sheng, M. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).
  24. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).">Jontes, J. D., Smith, S. J. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).
  25. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).">Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).
  26. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).">Berry, K. P., Nedivi, E. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  27. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).">Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).
  28. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).">Swanger, S. A., Yao, X., Gross, C., Bassell, G. J. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).
  29. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).">Basu, S., et al. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).
  30. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).">Ekaterina, P., Peter, V., Smirnova, D., Vyacheslav, C., Ilya, B. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).
  31. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).">Li, B. Z., Sumera, A., Booker, S. A., Mccullagh, E. A. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).
  32. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).">Dickstein, D. L., et al. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).
  33. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).">Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  34. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).">Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).
  35. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).">Ferreira, J. S., et al. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).
  36. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).">Megias, M., Emri, Z. s, Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).
  37. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).">Katz, Y., et al. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).
  38. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).">Bourne, J., Harris, K. M. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).
  39. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).">Runge, K., Cardoso, C., De Chevigny, A. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).
  40. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).">Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).
  41. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).">Mattila, P. K., Lappalainen, P. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).
  42. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).">Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Spine QuantificationThree Dimensional Neuron ReconstructionDendritic Spine AnalysisSpine DensitySpine Head VolumeSpine Subtype ClassificationSynaptic PlasticityNeurolucida 360Hippocampal DendritesSpine Morphology

Related Articles