מאמר שיטה

מודלים של פצעים בעכברים והכנת תרחיפי תאים בודדים

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66499

⸱

27 בספטמבר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese People's Liberation Army, 2Department of Dermatology, Southwest Hospital, Army Medical University, 3Biomedical Treatment Center, the Seventh Medical Center, Chinese PLA General Hospital, 4The 83th Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, 5Department of Dermatology, the Seventh Medical Center, Chinese PLA General Hospital

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג שתי טכניקות ניסיוניות חיוניות: בניית מודל פצע עכברים להערכת סגירת פצע והכנת תרחיפים חד-תאיים מעור העכברים כדי לשמר את כדאיות התאים.

תקציר

הטיפול בפציעות עור חריפות בעובי מלא מהווה אתגר ניכר בפרקטיקה הקלינית. המורכבות של ריפוי פצעים, המערבת אוכלוסיות תאים מגוונות ומיקרו-סביבת הפצע המורכבת, מסבכת את הערכת השפעות הטיפול והאינטראקציות ביניהן באמצעות גישות ניסיוניות מסורתיות. טכנולוגיית ריצוף טרנסקריפטום של תא בודד חוללה מהפכה בהבנת התפקודים והמנגנונים התאיים במהלך ריפוי פצעים. עם זאת, השונות במתודולוגיות ליצירת מודלים של פצעי עכברים מציגה גורמים מבלבלים שיכולים להשפיע על תוצאות הניסוי. יתר על כן, תהליך פירוק רקמות העור של עכברים מציב מכשולים טכניים משמעותיים, המדגיש את הצורך הקריטי בתרחיפים איכותיים של תא בודד לריצוף טרנסקריפטום מדויק. לכן, מחקר זה נועד לייעל את הבנייה של מודלים של פצעי עכברים כדי להעריך במדויק את השינויים בסגירת הפצע תוך ביטול משתנים שיכולים להשפיע על תוצאת הריצוף שלאחר מכן. בנוסף, הכנת תרחיפי תאים בודדים בוצעה הן באמצעות פרוטוקולי הכנת אנזימים והן באמצעות פרוטוקולי ערכת בדיקה כדי לייעל את העלות והיעילות.

מבוא

העכבר הוא מודל בעל חיים מוכר במחקר בשל הרצף הגנטי ההומולוגי שלו לבני אדם, רבייה מהירה, עלות-תועלת וגודל הניתן לניהול1. עם זאת, קיימים הבדלים במבנה העור בין עכברים לבני אדם. לעכברים יש שכבת קרום עורית מובהקת התורמת להתכווצות העור, וממלאת תפקיד מכריע בריפוי פצעים במין זה. לעומת זאת, ריפוי פצעים אנושיים כרוך בעיקר באפיתל מחדש ויצירת רקמת גרנולציה1.

למרות ההבדלים הבין-מינים הללו במבנה העור, מודל העכבר נותר הבחירה המועדפת במחקר תיקון פצעים ושומר על חשיבות משמעותית בהשוואה למודלים אחרים של בעלי חיים2,3. כאשר משתמשים בעור עכבר כדי לחקות תהליכי ריפוי פצעים אנושיים, חיוני לשקול היטב גורמים משפיעים שונים. גורמים אלה כוללים בחירת אתרים מתאימים להליכים כירורגיים, התחשבות במחזור זקיקי שיער העכבר והבנת ההשפעות של התכווצות קרום עורית4,5. יישום אמצעים מתאימים חיוני לאופטימיזציה של תנאי הניסוי ולשיפור הדיוק של תוצאות התצפית.

רצף RNA של תאים בודדים (scRNA-seq) מרצף תאים ברמה הרבה יותר מעודנת מאשר ריצוף RNA קונבנציונאלי ויש לו דרישה גבוהה בהרבה לאיכות הדגימה עם הבדלים תוך-קבוצתיים מינימליים. ניסויים מרובים נערכו כדי לחדד מודל יציב של פגם עור חריף בעובי מלא של עכבר. ניסויים אלה השתמשו בשילוב של שיטות מבוססות מהספרות וגישות חדשניות כדי להעריך ריפוי פצעים באופן מקיף2,5. כדי לפתח את מודל ריפוי הפצעים, נעשה שימוש בכריתת עור בעובי מלא של עכבר כדי לשכפל את התהליך הפיזיולוגי של תיקון והתחדשות פצעים. מטרתו הייתה להעריך את השינויים הפוטנציאליים הנגרמים על ידי טיפולים שונים באמצעות scRNA-seq. דיסוציאציה של רקמת עור מעכברים מציבה אתגרים, כולל כדאיות תאים נמוכה ושיעורי צבירה גבוהים, במהלך הכנת תרחיפי תאים בודדים6. קשיים אלו עלולים לגרום לבעיות כמו סתימת מכשירים ולכידת תאים חריגים, מה שעלול לפגוע באיכות הנתונים. בהתחשב בעלות הניכרת של ריצוף תא בודד, ביצוע ניסויים ראשוניים מרובים הוא חיוני כדי להבטיח את היציבות והאמינות של המתלה החד-תא. מחקר זה העריך את היעילות של דיסוציאציה של אנזים מעורב ושיטת דיסוציאציה של ערכת רקמות לזיהוי הגישה האופטימלית לדיסוציאציה של רקמות6,7. מחקר זה מבסס בסיס איתן למחקרי עומק נוספים.

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי השביעי של בית החולים הכללי PLA בסין. נעשה שימוש בעכברים זכרים C57/BL6 בני 6 שבועות.

1. מודל ריפוי פצעי עכבר

  1. קיבוץ בעלי חיים
    1. הקצה באופן אקראי עכברים לקבוצות ניסוי וביקורת (6 כל אחת). עכברי בית במתקן ספציפי ללא פתוגנים (SPF), עם טמפרטורה שנשמרת על 23-25 מעלות צלזיוס, לחות של 50%-60% ומחזור אור-חושך של 12 שעות.
    2. ספק לעכברים גישה בלתי מוגבלת למזון סטנדרטי ומי ברז שעברו חיטוי.
  2. הכנה לפני הניתוח
    1. רסנו בעדינות את העכבר באמצעות מסננת או על ידי החזקת העכבר היטב במצב שכיבה. טען את המזרק בנתרן פנטוברביטל 1% שהוחזר לטמפרטורת החדר, הניתן במינון של 0.1 מ"ל/20 גרם משקל גוף.
      הערה: יש לאחסן את תמיסת הנתרן פנטוברביטל 1% בסביבה חשוכה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. נקו את בטן העכבר בעזרת צמר גפן אלכוהולי. הכנס את המזרק בזווית קלה לתוך הבטן. יש לשאוב לפני ההזרקה כדי למנוע מתן לא מכוון לשלפוחית השתן או למעיים. המתן 10 דקות.
    3. לאחר שהעכבר מפסיק להתעוות ואינו מגיב עוד לגירויים, מרחו וזלין לבן על שתי העיניים כדי למנוע יובש. השתמש במכונת גילוח כדי לקצץ פרוות גב ארוכה יותר.
    4. מרחו קרם אפילציה על הגב, המתינו 2 דקות ונגבו בעדינות עם גזה לחה כדי למנוע נזק לעור העכבר. ודא שקרם האפילציה לא נשאר לתקופה ממושכת.
    5. יש לחטא בעדינות את העור שמסביב עם שלוש ספוגיות לסירוגין של בטדין ו-70% אלכוהול.
    6. אגרוף ביופסיית עור חיטוי, מספריים, מלקחיים ומכשירים אחרים לעיקור. שמרו על סביבת עבודה סטרילית. בצע ניתוח לאחר מכן על מטלית כירורגית טרייה.
  3. כריתת עור בעובי מלא
    הערה: מודל סד הפצע שימש להערכת יעילות הטיפול לריפוי פצעים.
    1. בעזרת סמן קבוע, סמן את האזור המרכזי העליון של אזור הגב של העכבר בעיגול אחד בקוטר 8 מ"מ.
    2. הרם את עור הגב באמצעות מלקחיים נקיים ובצע את החיתוך הראשון באמצעות מספריים כירורגיות עדינות. לאחר החיתוך הראשון, החזיקו את אזור העור שהוסר חלקית בעזרת מלקחיים וחתכו בזהירות את העיגולים המסומנים.
    3. השתמש בטבעת נירוסטה מעוצבת בהתאמה אישית (קוטר פנימי 15 מ"מ, קוטר חיצוני 18 מ"מ). לתפור את טבעת המתכת לפריפריה של אתר החתך עם 5-0 תפרים שאינם נספגים, ולמנוע התכווצות של עור אתר החתך (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A). השתמש בנירוסטה כחומר הטבעת למניעת חלודה ועיוותים.
    4. יש לתת זריקה תת עורית אחת של 0.1 מ"ל של דילול 10% בופרנורפין הידרוכלוריד ליד הפצע לטיפול בכאבים לאחר הניתוח.
    5. הכניסו מחדש את העכבר לניקוי כלובים בודדים. הנח את העכבר במצב שכיבה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה לפני שהעכבר חוזר להכרה.
    6. התבונן וצלם את פצע העכבר כל יומיים כדי למדוד את גודל הפצע לאחר ההרדמה כמתואר בשלב 1.2.
  4. סימון חותמת פצע לקבלת רקמת ביופסיה
    1. התכוננו לניסוי כמתואר בשלבים 1.1 ו-1.2.
    2. צור חותמות מותאמות אישית לסימון פצעי עכבר בקוטר עיגול של 8 מ"מ ואורך צד מרובע של 10 מ"מ (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1B).
    3. מקם את העכבר בתנוחה נוטה וחטא את עור הגב בעזרת צמר גפן אלכוהולי. טובלים את החותמת בדיו. סמן את החלק האמצעי העליון של גב העכבר עם החותמת.
    4. כרתו בזהירות את כל שכבת העור של הגב לאורך הסימן העגול בעזרת מספריים כירורגיים, וחשפו את שכבת השריר לחלוטין. השאירו את הפצע פתוח ללא חבישה כדי להימנע מהפרעה למצב הפצע. שמור על סטריליות הפצע על ידי הנחת העכבר בסביבה נקייה ומחוטאת ומתן אפשרות לפצע ליצור גלד באופן טבעי.
    5. יש לתת זריקה תת עורית אחת של 0.1 מ"ל של דילול 10% בופרנורפין הידרוכלוריד ליד הפצע לטיפול בכאבים לאחר הניתוח.
    6. הכניסו מחדש את העכבר לניקוי כלובים בודדים. הנח את העכבר במצב שכיבה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה לפני שהעכבר חוזר להכרה.
    7. התבונן וצלם את פצע העכבר כל יומיים כדי למדוד את גודל הפצע לאחר ההרדמה כמתואר בשלב 1.2.
    8. בצע מתן טיפול כמתואר בסעיף 1.4
  5. ניהול הטיפול
    1. לאחר 4 שעות לאחר שהעכבר חוזר להכרה, בצע הרדמה כמתואר בשלבים 1.2.2-1.2.3.
    2. הזרקה תת עורית של הטיפול הרצוי, כאן 100 מיקרוגרם של אקסוזום שמקורו בתאי גזע מזנכימליים של חבל הטבור האנושי (hucMSC-Exo) מומס ב-200 מיקרוליטר של PBS סביב אתר החתך לקבוצת הטיפול.
    3. הזרקה תת עורית של 200 מיקרוליטר PBS סביב אתר החתך עבור קבוצת הביקורת.
    4. חזור על שלבים 1.5.2 ו- 1.5.3 כל יומיים למשך עד 14 יום. בדוק את מקום ההזרקה לאיתור נפיחות, אדמומיות או סימני זיהום.

2. הכנה לריצוף RNA של תא בודד

  1. איסוף והכנת רקמות
    1. בצע הרדמה כמתואר בשלבים 1.2.2-1.2.3.
    2. הרם את עור הגב באמצעות מלקחיים נקיים והסר את הגלדים. חותכים בערך 2 ס"מ מהעור ליד הפצע, חותכים רקמת שומן וכלי דם גדולים.
    3. העבירו ביופסיית עור עם מלקחיים סטריליים לבאר של צלחת בת 6 בארות מלאה ב-4 מ"ל PBS מקוררים מראש.
    4. שטפו עם PBS על ידי העברת הביופסיה ברצף לבארות חדשות (צלחת 6 בארות) מלאות ב-4 מ"ל PBS עד שלא נמצא דם גלוי.
    5. חותכים את העור בעזרת אזמל לחתיכות בגודל של כ-2 מ"מ, שוטפים עוד יותר ב-DPBS המכיל 0.04% BSA ומסירים כל פסולת.
  2. דיסוציאציה אנזימטית (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2)
    1. שלב 1 מ"ל של קולגנאז I (10 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל של קולגנאז IV (5 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל של קולגנאז D + Dispase II (15 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל של DNase I (5 מ"ג/מ"ל) ו-6 מ"ל של DPBS בצינור חרוטי סטרילי להכנת תמיסת העיכול. מערבבים היטב את הרכיבים כדי להבטיח הומוגניות.
    2. הנח את הצינור החרוטי באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לחמם מראש את תמיסת העיכול.
    3. הוסף 2.5 מ"ל של תמיסת עיכול לרקמה ועכל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 70 דקות, והפוך את המבחנה כל 10 דקות לערבוב יסודי.
    4. הרטיבו מראש מסננת של 70 מיקרומטר עם מאגר כביסה (0.2% BSA ב-PBS). העבירו את תערובת התגובה, כולל תאים מנותקים ושברי רקמה שיוריים, באמצעות קצה פיפטה רחב קדח של 1 מ"ל על המסננת.
    5. מסננים את התערובת הזו דרך מסננת התאים הרטובה מראש של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    6. צנטריפוגה את תערובת התגובה עם רקמה מעוכלת ב-300 x גרם, בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושמרו את הגלולה (התאים) לשלב הדיסוציאציה הבא.
  3. ליזה של כדוריות דם אדומות
    1. דילול תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (פי 10) ביחס של 1:10 עם מים מזוקקים כפולים. לדלל את התאים עם תמיסת ליזה של תאי דם אדומים פי 1 ביחס של 1:10 בצינור חרוטי.
    2. מערבל את התערובת למשך 5 שניות, דוגר בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים בנפח שווה DPBS ואחסנו אותם על קרח.
  4. סינון
    1. אחזר את מתלה התא וסנן אותו דרך מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש.
    2. שטפו את הצינור פעמיים עם 4.5 מ"ל RPMI (10% FCS) כדי להבטיח איסוף של כל התאים הנותרים.
    3. המשך לצנטריפוגה של מתלה התא ב -300 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. השליכו את הסופרנטנט, העיפו בעדינות את הגלולה והשעו מחדש את התאים עם קצות רחבים ב-50 מיקרוליטר של 0.04% BSA PBS. שמרו על התאים על הקרח לאורך כל התהליך הזה.
  5. הסרת תאים מתים
    1. מערבבים את ערכת הסרת התאים המתים 20x מאגר מלאי עם מים נטולי נוקלאז ביחס של 1:20 לקבלת מאגר מחייב 1x.
    2. צנטריפוגה של הדגימה ב-300 x גרם, הסר את הסופרנטנט והוסף 10 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים להסרת תאים מתים עבור 60 מ"ג של דגימת עור.
    3. דוגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מאגר מלאי עד שהוא מגיע ל-500 מיקרוליטר. טען את הדגימה לעמודה המוכנה בערכה והצמד אותה למפריד.
    4. הפעל את תוכנית הניתוק כדי להפריד בין תאים חיים. לאחר סיום התוכנית, סנן את המתלה דרך מסנן של 30 מיקרומטר ודלל אותו בנפח שווה D-PBS.
      הערה: אם מהירות הטפטוף מאטה באופן ניכר, החלף מיד את העמודה כדי למנוע זיהומים לחסום את הנקבוביות ולהשפיע על התאוששות התאים.
    5. בצע צביעת Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) וספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. השתמש בקריטריוני הקבלה הבאים: כדאיות התאים ≥ 85%, קצב צבירת תאים < 20%, וללא תאי דם אדומים או שברי תאים גלויים.
  6. הליך דיסוציאציה לערכת דיסוציאציה מרובת רקמות (אלטרנטיבה)
    1. מערבבים 2.5 מ"ל של RPMI 1640, 100 מיקרוליטר של אנזים D, 50 מיקרוליטר של אנזים R ו-12.5 מיקרוליטר של אנזים A1 לתוך צינור MACS C עדין (רכיבים מערכת דיסוציאציה מרובת רקמות).
    2. העבירו את הרקמה לתוך צינור ה-MACS C העדין המכיל את תערובת האנזימים וסגרו אותה היטב.
    3. הנח את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 90 דקות עם היפוך עדין כל 10 דקות כדי להבטיח חשיפה נאותה של רקמות לתמיסת הדיסוציאציה.
    4. השליכו את תמיסת הדיסוציאציה ושטפו את הרקמות עם DPBS.
    5. העבירו מתלים חד-תאיים דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר ברצף וצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב-300 x גרם.
    6. תאי דם אדומים באמצעות מגיב הליזיס של תאי הדם האדומים באותו הליך כמו שלב 2.3.
    7. הסר תאים מתים באמצעות ערכת הסרת התאים המתים לפי אותו הליך כמו בשלב 2.58.
    8. בצע צביעת AO/PI וספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי. השתמש בקריטריוני הקבלה הבאים: כדאיות התאים ≥ 85%, קצב צבירת תאים < 20%, וללא תאי דם אדומים או שברי תאים גלויים.

תוצאות

נבחנו וריאציות מרובות של הפרוצדורה. פרוטוקולי חתימה (Stamp protocols) הועדפו מכיוון שהם גורמים להפרעה מינימלית לתהליך ריפוי הפצע ושומרים על שלמות הפצע מפני השפעות כגון גירוד ותפרים. זאת כדי למנוע הכנסת רעש ברמת התא הבודד עבור הריצוף העוקב. יצירת פצעים בשני צדי העכבר הובילה להבדלים ניכרים בשטח הפצע עקב הגמישות המובנית של עור העכבר (איור 3A,ב׳). דקירות דו-צדדיות מיקמו את הפצעים קרוב יותר לשוליים, אזור הרגיש להתנהגות גירוד עצמית של העכברים. עכברים בני 7 שבועות ומעלה נחשבו לבלתי מתאימים למחקר, שכן תת-קבוצה מהם הראתה התכהה לא סדירה של עור הגב סביב ה-10th יום לאחר הניתוח, המצביע על תחילת צמיחה מחדש של שיער (איור 4A). הדבר הכניס משתנה נוסף שלא היה רצוי.

בעת שימוש בטבעות גומי, ללא קשר לשאלה האם נעשה שימוש בגומי רך או קשיח, טבעות אלו נטו להינתק ולעתים קרובות התנתקו מאתר הפצע תוך כ-12 h בשל תנועותיהן התכופות של העכברים ותכונות ההדבקה המוגבלות של הטבעות. טבעות גומי שקובעו באמצעות תפרים היו נוטות להיקרע, מה שחייב תפירה חוזרת לצורך ייצוב. הליך תפירה חוזר זה, בתורו, גרם לטראומה נוספת לעכברים (איור 4B,C). לעומת זאת, טבעות מתכת הפגינו יציבות עדיפה ותכונות שימור משופרות, מה שאיפשר את הערכת השפעות הרה-אפיתליזציה ללא הפרעה מצמצום הפצע.

בשל הפוטנציאל של הסד עם תפרי ring-sutured מתכת לגרום לנזק עור מיותר מעבר לאזור הפצע ולהפעיל מאמצים מכניים שאינם אחידים לרוחב הפצע, נעשה שימוש בחותמת סטנדרטית בעלת ממדים קבועים כדי להקל על ניתוחים עוקבים.

החקירה גילתה כי קבוצת הטיפול לדוגמה (hucMSC-Exo) הפגינה קצב ריפוי מהיר יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 5A). בעוד שריפוי מלא התרחש במהירות רבה יותר במודל החתימה (stamp model) מאשר בקבוצת טבעת המתכת התפורה, המגבילה את התכווצות הפצע, לא נצפה הבדל מובהק סטטיסטית בשיעורי הריפוי במהלך תקופת 7 הימים הראשונים (איור 5B). ממצאים אלו תואמים למחקר קודם של Lin et al., המרמז כי 10 הימים הראשונים של ריפוי עור בעכברים כוללים בעיקר רה-אפיתליזציה (re-epithelialization) ולא התכווצות9.

השוואת הדיסוציאציה
לאחר אופטימיזציה נרחבת של הרכב האנזימים, השילוב של Dispase II וקולגנאז הראה ביצועים עדיפים בהשוואה לשימוש באנזים בודד (טבלה 1). באופן חשוב, נוכחותם של כדוריות דם אדומות או שיירי תאים הייתה מינימלית, ובכך עמדה בקריטריונים החיוניים לשימוש במכונה, הכוללים חיוניות תאים העולה על 85% ושיעור אגרגציה הנמוך מ-20%.

לעומת זאת, הגישה של ערכת הבדיקה הראתה תוצאות מבטיחות, עם חיוניות תאית גבוהה יחסית ושיעור נמוך יותר של אגרגציה של תאים (טבלה 1). יתרה מכך, לא נצפו כדוריות דם אדומות או שברי תאים, מה שמעיד על איכות תאית עדיפה באופן כללי בהשוואה לשיטות אחרות.

מכשיר כירורגי על עור בעל חיים; תרשים חתך מעגלי; פצע עם מדידה באמצעות סרגל.
איור 1: מודל פצע סופי בעכבר. (A) תמונה מייצגת של טבעת מתכת מותאמת לאחר תפירה. (B>) תמונה מייצגת של חתך העור והפצע שהוצא. קוטר: 8 mm. שוליים: 1 cm. (C>) קצב סגירת הפצע. פס שגיאה: טעות סטנדרטית. מבחן T דו-זנבי (n=6). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תהליך הכנת תאים: הכנת דגימה, דיסוציאציה, ליזיס RBC, הסרת תאים מתים, תרחיפי תאים בודדים.
איור 2: תרשים להכנת תרחיפי תאים בודדים. השלבים כוללים איסוף דגימות, דיסוציאציה, ליזיס של תאי דם אדומים, הסרת תאים מתים והכנת תרחף תאים בודדים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

ניסוי ריפוי פצעים בחולדות; תמונות ציר זמן, יום 1 ו-6 לאחר הניתוח; סרגל מדידה.
איור 3: מודל פצע בעכבר עם פצעים בכל צד. (A) מוצגת תמונה מייצגת של מודל פצע בעכבר עם פצעים בכל צד. קוטר ייחוס עגול לבן: 8 mm. (B) תמונה מייצגת של ריפוי פצעים בנקודות זמן שונות עבור פצעים בכל צד. העור על גב העכבר סמוך לזנב הגִּיאָה מהר יותר מהעור סמוך לצוואר. צלע אובייקט ייחוס ריבוע לבן: 1 cm. קוטר אובייקט ייחוס עגול לבן: 8 mm. קיצורים: POD = ימים לאחר הניתוח. לחצו כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.

תרשים של ניסוי ריפוי פצעים עם מדידה, מ-POD 1 עד POD 10, מחקר חתכי עור של חולדה.
איור 4: מודל פצעים בעכברים עם פצעים בודדים. (A) תמונה מייצגת של ריפוי פצעים בשלבי צמיחת פרווה שונים בעכברים בני 7 שבועות. העכברים נמצאים בשלבי צמיחת פרווה שונים ב-POD 10. עור כהה יותר ריפא מהר יותר. (B) תמונה מייצגת של טבעות דבק גומי. קצה אובייקט ייחוס ריבוע לבן: 1 cm. (C) תמונה מייצגת של קווי תפרים. קוטר אובייקט ייחוס עגול לבן: 8 mm. קיצורים: POD = ימים לאחר ניתוח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קצב סגירת פצע לאורך זמן; גרפים של עמודות ניסיוניות המשווים את יעילות הטיפול; ניתוח סטטיסטי.
איור 5: קצב סגירת פצע. (A) השוואה בין קבוצת הביקורת לקבוצות hucMSC-Exo. פסי השגיאה מייצגים שגיאות סטנדרטיות. T-test דו-זנבי (n=6). (B) השוואה בין קבוצות הstamp והטבעת המתכתית. פסי השגיאה מייצגים שגיאות סטנדרטיות. המובהקות חושבה באמצעות T-test דו-זנבי (n=6). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

שיעור חיוניות תאיםשיעור אגרגציית תאים
גישה פנימית86.90%18.50%
גישת ערכה לבדיקה90.65%13.73%

טבלה 1: חיוניות וקצב אגרגציה של שתי גישות להכנת התאים.

דיון

מספר צעדים מכריעים היו חיוניים להצלחת הפרוטוקול. שלבים אלה כללו הכנה מדויקת של אזור הפצע על ידי גילוח וניקוי יסודיים, יצירת פצעים סטנדרטיים בגודל ועומק ספציפיים, וטיפול קפדני לאחר הפצע לניטור זיהומים ומתן טיפולים מתאימים. סטנדרטיזציה של נהלים אלה הבטיחה עקביות בתנאי הניסוי, ובכך שיפרה את האמינות והשחזור של התוצאות10.

השתמשנו בסימון חותמת פצע לריצוף, מכיוון ששיטות אחרות מציגות משתנים נוספים כגון שריטה בפצע עכבר וקרע תפר 2,5. מודל החותמת משפר את העקביות הראשונית של פצעים בעכברים ומספק אמת מידה סטנדרטית להערכת ריפוי פצעים, ומפחית אי דיוקים פוטנציאליים בהערכת קצב ריפוי הפצעים במודלים של עכברים. בנוסף, סימן החותמת מקל על השימוש בתוכנה כמו ImageJ. עם זאת, מכיוון שלא משתמשים בחבישה לכיסוי הפצע, לשיטת ההטבעה יש דרישות חיטוי גבוהות בהרבה לסביבה. יהיה צורך לחזור על הניסוי אם מתרחש זיהום.

שונות ביולוגית בין עכברים בודדים יכולה להכניס שונות לתוצאות הניסוי, מה שמחייב מדגם גדול יותר לניתוחים סטטיסטיים חזקים. ניתן להרחיב מודל זה לטכניקות ריצוף אחרות, כגון ריצוף מרחבי, כדי לשפר את התועלת שלו עוד יותר.

אופטימיזציה של התנאים לדיסוציאציה של scRNA-Seq ובחירת שיטות דיסוציאציה מתאימות הם שלבים קריטיים בזרימת העבודה הניסיונית. נכון לעכשיו, המתודולוגיות הנפוצות כוללות עיכול אנזימטי בשילוב עם הגישה המומלצת המבוססת על ריאגנטים גנומייםפי 10 11. יש לציין כי עיכול אנזימטי חסכוני משמעותית מהשיטה המבוססת על ריאגנטים; עם זאת, זה דורש מספר איטרציות לפני הניסוי כדי לייעל את בחירת האנזים ומשך העיכול.

במחקר זה נערכו ניסויים ראשוניים באמצעות שילובי אנזימים שונים. השיטה שנבחרה עמדה בדרישות הבסיסיות לבקרת איכות במורד הזרם למרות היעדר ערכת ריאגנטים גנומיים פי 10 שתוכננה במיוחד לדיסוציאציה של עור בעובי מלא של עכבר. במקום זאת, נעשה שימוש בערכת הדיסוציאציה הרב-רקמתית 1 להשגת תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה. עם זאת, חשוב לציין את העלות הגבוהה יחסית הכרוכה בשיטה זו, אם כי היא מציעה יציבות מעולה בהשוואה לטכניקות עיכול אנזימים פנימיות. עבור דגימות יקרות ערך, מומלץ להשתמש בשיטת דיסוציאציה מבוססת ריאגנט גנומי פי 10.

חיוני לשקול את ההשפעה הפוטנציאלית של שונות בין-אישית על כדאיות התא, מכיוון שהדבר עלול לגרום לכך שדגימות מסוימות לא יעמדו בקריטריונים הנדרשים ובכך להשפיע על איכות הנתונים במורד הזרם12.

בצד החיובי, שיטה זו מספקת הזדמנויות לאינטגרציה עם טרנסקריפטומיקה מרחבית או גישות מולטי-אומיקה אחרות, ובכך מציעה מסגרת אנליטית מקיפה יותר13. יתר על כן, היישומים הקליניים הפוטנציאליים שלו מדגישים את הרבגוניות והרלוונטיות שלו מעבר להקשרי מחקר בסיסיים.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (#82373494).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
75% עכברי אלקולכולליוההJIUJING500ML
C57/BL6Jמעבדות
קולגנאז D + Dispase IIרוש11088858001
קולגנאז Iרוש5349907103
קולגנאז IVמקלוני כותנה 5267439001
רוש היישימיאנקיאן
ערכת הסרת תאים מתיםMiltenyi Biotec130-090-10
DNase IRoche10104159001
gentleMAC DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
חוט ניילון רפואיJinlongHM507
ערכת דיסוציאציה מרובת רקמות 1Miltenyi Biotec130-110-201
אגרוף מחט ביופסיהאינטגרה Miltex
תמיסת ליזה של תאי דם אדומיםMiltenyi Biotec130-094-183
מספריים כירורגייםJingluJIANDAO
פטרולאטום לבןShangyuanBAIFANSHILIN
צ'ארלס ריבר

מקורות

  1. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  2. Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
  3. Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
  4. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
  5. Ganguli-Indra, G. Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model. Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  7. Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
  8. Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
  9. Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
  10. Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
  11. Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
  12. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
  13. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודלים של פצעים בעכברים והכנת תרחיפי תאים בודדים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.