הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66503

⸱

10 במאי 2024

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

במאמר זה

סיכום

כאן, פרוטוקול לתרבית אורגנואידים של הוושט האנושי ותרבות ממשק אוויר-נוזל מסופק. ניתן להשתמש בתרבית ממשק אוויר-נוזל של אורגנואידים בוושט כדי לחקור את ההשפעה של ציטוקינים על מחסום אפיתל הוושט.

תקציר

אפיתל הקשקש של הוושט חשוף ישירות לסביבה, מול אנטיגנים זרים ברציפות, כולל אנטיגנים מזון וחיידקים. שמירה על שלמות מחסום האפיתל היא קריטית למניעת זיהומים ולמניעת דלקת הנגרמת על ידי אנטיגנים לא מזיקים שמקורם במזון. מאמר זה מספק פרוטוקולים פשוטים ליצירת אורגנואידים אנושיים בוושט ותרביות ממשק אוויר-נוזל מביופסיות של מטופלים כדי לחקור את תא האפיתל של הוושט בהקשר של הומאוסטזיס רקמות ומחלות. פרוטוקולים אלה היוו אבני דרך מדעיות משמעותיות בעשור האחרון, המתארים מבנים תלת-ממדיים דמויי איברים מתאים ראשוניים שמקורם בחולה, אורגנואידים ותרביות ממשק אוויר-נוזל. הם מציעים את האפשרות לחקור את תפקודם של ציטוקינים ספציפיים, גורמי גדילה ומסלולי איתות באפיתל הוושט במסגרת תלת ממדית תוך שמירה על התכונות הפנוטיפיות והגנטיות של התורם. אורגנואידים מספקים מידע על מיקרו-ארכיטקטורה של רקמות על ידי הערכת התעתיק והפרוטאום לאחר גירוי ציטוקינים. לעומת זאת, תרביות ממשק אוויר-נוזל מאפשרות להעריך את שלמות מחסום האפיתל באמצעות עמידות טרנסאפיתל (TEER) או מדידות שטף מקרומולקולות. שילוב של אורגנואידים אלה ותרביות ממשק אוויר-נוזל הוא כלי רב עוצמה לקידום המחקר במצבי מחסום אפיתל לקוי בוושט.

מבוא

דלקת בוושט פוגעת בשלמות מחסום האפיתל 1,2,3,4,5, כפי שנצפה בדלקת ושט אאוזינופילית (EoE), מחלה דלקתית כרונית הנשלטת על ידי Th2 בוושט6. EoE תואר לראשונה בשנות ה-90של המאה ה-20 7,8 והוא מושרה בעיקר על ידי אנטיגנים של מזון 9,10,11,12,13. הסימפטומים השכיחים ביותר של EoE באוכלוסייה הבוגרת הם דיספגיה ופגיעה במזון14. אצל ילדים, EoE מתבטא בדרך כלל בכישלון לשגשג, סירוב מזון, הקאות וכאבי בטן15. מחקרי אסוציאציה רחבת גנום (GWAS) זיהו גנים בסיכון EoE המעורבים בשלמות מחסום האפיתל, והעבירו את האפיתל למוקד מחקר EoE 16,17,18. תעתיק EoE גילה עוד כי תהליך התמיינות לקוי והיפרפלזיה תגובתית של אזור הבסיס גורמים לתפקוד המחסום הנפגע של אפיתל הוושט 3,5,19,20,21,22. ההבנה המוקדמת של EoE כמחלה בתיווך Th26 הובילה לגילוי IL-13 כמתווך נהיגה על ידי הפרעה לשלמות האפיתל 3,4,21,23. מערכות ניסיוניות המאפשרות דיסקציה של השפעות בתיווך ציטוקינים על שלמות האפיתל מפגיעה במחסום הפנימי באמצעות נטייה גנטית מספקות את האפשרות לחקור את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי מערכת החיסון לבין האפיתל ב-EoE. אורגנואידים של הוושט האנושי ותרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) הוצעו ככלים רבי ערך לניתוח התוצאות של גירוי ציטוקינים על שלמות האפיתל5.

הפרוטוקול הראשון ליצירת אורגנואידים של ושט שמקורם בתאי גזע בוגרים ספציפיים לרקמה (ASC) נקבע חמש שנים לאחר הדוחות הראשונים שפורסמו של אורגנואידי מעיים בשנת 2009 באמצעות LGR5+ ASCs במעי המשחזרים את תא האפיתל של המעי הדק24. DeWard et al. היו חלוצים ביצירת אורגנואידים מתאי אפיתל של הוושט25. בשנת 2018, Kasagi et al. יצרו אורגנואידים אנושיים של הוושט מקו תאי אפיתל קשקשי של הוושט האנושי EPC2-hTERT ותאים ראשוניים שמקורם במטופל26. באותה שנה, Zhang et al. יצרו בהצלחה אורגנואידים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) שמקורם בוושט. הם תיארו את המשמעות של עיכוב TGFβ וחלבון מורפוגנטי עצם (BMP) להתפתחות תאי אב של הוושט (EPC) ואת התפקיד המכריע של איתות Notch בהתמיינות של אפיתל קשקשי מרובד26,27. טריזנו ועמיתיו השלימו ממצאים אלה על ידי זיהוי Sox2 כמעכב Wnt המכוון את הגורל ההתפתחותי לקראת התמיינות הוושט28. השכלולים הבאים של פרוטוקולים, הרכב בינוני ותנאי תרבית הגדילו את קצב היווצרות האורגנואידים והפכו את תת-התרבות והשחזור של אורגנואידים לאחר שימור בהקפאה לאפשריים 26,29,30,31,32. למרות שאורגנואידים אלה הם כלים רבי עוצמה לחקר ארכיטקטורת רקמות וביטוי של גני מטרה פוטנציאליים לאחר גירוי עם ציטוקינים, אורגנואידים של הוושט לא יציעו את האפשרות למדוד עמידות טרנסאפיתל (TEER) או שטף מקרומולקולות כאמצעים ישירים לשלמות המחסום. כפי שתואר קודם לכן על ידי שריל ועמיתיו22, תרביות ALI המדגימות התמיינות אפיתל4 מאפשרות הערכות ישירות של שלמות האפיתל. שילוב אורגנואידים שמקורם במטופל ותרביות ALI הוא כלי רב עוצמה לחקר ארכיטקטורת רקמות ותקינות מחסום אפיתל ב- EoE.

להלן נהלים עם הוראות לבידוד תאים ברי קיימא מביופסיות הוושט והקמת תרביות אורגנואידים ותרביות ALI של הוושט שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעות של ציטוקינים על שלמות המחסום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של צפון מערב ומרכז שווייץ (EKNZ; מזהה פרויקט 2019-00273). כל החולים נתנו הסכמה מדעת בכתב לשימוש ניסיוני בביופסיות לפני הבדיקה האנדוסקופית. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד תאים לאורגנואידים של הוושט שמקורם במטופל

הערה: רשימה של המרכיבים הבינוניים לגידול אורגנואידים של הוושט האנושי מובאת בטבלה 1.

  1. להשיג את הביופסיות.
    הערה: במחקר הנוכחי, שתי ביופסיות ממקטע אחד של הוושט מתקבלות במהלך esophagogastroduodenoscopy עם מלקחיים ביופסיה באמצעות גסטרוסקופ עם ערוץ עבודה 2.8 מ"מ.
  2. להעביר את הביופסיות למדיום ללא סרום קרטינוציטים זמין מסחרית (KSFM; Ca2 + 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 מיקרוגרם/מ"ל BPE).
    הערה: ניתן לאחסן ביופסיות על קרח למשך מספר שעות עד לשימוש.
  3. החלף את מדיום KSFM ב- 1 מ"ל של Dispase I (10 U / mL) ודגור על הביופסיות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה את הביופסיות בטמפרטורת החדר ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
  5. יש לשאוף את הדיספאז באמצעות פיפטה של 1000 μL מבלי לגעת בביופסיות ובגלולת פסולת התא.
  6. שטפו את הביופסיות במי מלח חוצצי פוספט (DPBS) במינון 1 מ"ל של Dulbecco.
  7. צנטריפוגה את הביופסיות בטמפרטורת החדר ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
  8. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
  9. לדגור על הביופסיות עם 500 μL של טריפסין-EDTA (0.05%) ב 37 ° C במשך 10 דקות תוך רעד ב 800 סל"ד.
  10. בצע הפרעה מכנית על ידי צנרת חוזרת ונשנית למעלה ולמטה עד לקבלת מתלה חד-תאי.
  11. סנן את התאים דרך מסננת תאים בגודל 70 מיקרומטר באמצעות ראש בוכנה גומי של מזרק שחפת.
  12. לשטוף את המסננת עם 2-4 מ"ל של מעכב טריפסין סויה (250 מיקרוגרם / מ"ל).
  13. סנן את התאים דרך מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר עם מכסה הצמדה על צינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של 5 מ"ל.
  14. העבר את התמיסה התאית הבודדת לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  15. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  16. שאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
  17. להשעות את התאים ב 100 μL של מדיום KSFM.
  18. מערבבים 10 μL של כחול טריפאן עם 10 μL של השעיית תאים.
  19. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.

2. תרבית אורגנואידים שמקורה במטופל

  1. הוסף 1-2 מ"ל של KSFM לתרחיף התא לאחר הספירה.
  2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  3. שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית התא.
  4. יש להשהות מחדש את גלולת התא במטריצת הידרוג'ל של תמצית קרום מרתף (BME) (40 מיקרוליטר BME לכל 20,000 תאים).
    הערה: לאחר הוספת ה-BME, יש לשמור את התאים על קרח כדי למנוע התמצקות מוקדמת של ה-BME.
  5. חותכים קצה פיפטה של 200 μL כדי לשאוף את תערובת התרחיף הצמיגי של תאי BME.
  6. טופס טיפות 40 μL בלוח תרבית תאי תרחיף שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס).
  7. לדגור על הצלחת ללא מדיום במשך 20-30 דקות ב 37 ° C כדי להבטיח התמצקות של טיפות BME.
  8. הוסיפו מדיום KSFM-C שחומם מראש בתוספת 10 מיקרומטר של Y27632 (מעכב סלעים) ליומיים הראשונים של התרבית.
  9. החלף את המדיום בתווך KSFM-C חדש (ללא Y27632 ו +/- ציטוקין מעניין) כל יומיים.
  10. שאפו את המדיום וגרדו טיפות עם קצה הפיפט תוך הוספה רציפה של 1 מ"ל של דיספז II (1.5 U/mL) לבאר.
  11. מעבירים את תערובת BME-dispase לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ודגרים עליה במשך 20 דקות ב-37°C באמבט מים רועד כדי לעכל את ה-BME.
  12. צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C ולשאוף את Dispase II.
  13. המשך על פי הפרוטוקול של קריאת הריבית (למשל, בידוד RNA, בידוד חלבונים, או קיבוע עם 4% PFA עבור היסטולוגיה).

3. בידוד תאים עבור תרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) שמקורן במטופל

  1. להשיג את הביופסיות. במהלך esophagogastroduodenoscopy באמצעות גסטרוסקופ עם ערוץ עבודה 2.8 מ"מ, שתי ביופסיות נלקחות מקטע אחד הוושט עם מלקחיים ביופסיה.
  2. הניחו את הביופסיות בתווך ללא סרום קרטינוציטים זמין מסחרית (KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) ולאחסן על קרח במשך מספר שעות עד לשימוש.
  3. החלף KSFM עם 1 מ"ל של Dispase (10 U / mL). לאחר מכן, יש לדגור על הביופסיות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה את הביופסיות בטמפרטורת החדר ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
  5. הסר את הדיספאז באמצעות פיפטה של 1000 μL מבלי לגעת בביופסיות ובגלולת פסולת התא.
  6. לשטוף את הביופסיות עם 1 מ"ל של DPBS.
  7. בטמפרטורת החדר, סובבו את הביופסיות ב 300 x גרם במשך 2 דקות.
  8. שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
  9. יש לדגור על הביופסיות ב-500 מיקרוליטר של טריפסין-EDTA (0.05%) ב-37°C למשך 10 דקות ולערבב ברציפות ב-800 סל"ד במהלך הדגירה.
  10. יש לשבש את הביופסיות באופן מכני באמצעות פיפטינג חוזר ונשנה מעלה ומטה עד לקבלת תרחיף חד-תאי.
  11. מעבירים את התאים המנותקים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר עם ראש בוכנה גומי ממזרק שחפת ואוספים את התאים בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  12. שטפו את המסננת עם 2-4 מ"ל של מעכב טריפסין סויה (250 מיקרוגרם / מ"ל) כדי להסיר את התאים הנותרים מהמסננת.
  13. סנן את התאים עם מכסה הצמדה של מסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר לתוך צינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ"ל.
  14. העברת תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  15. צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות.
  16. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
  17. השהה מחדש את גלולת התא ב 4 מ"ל של KSFM בינוני (Ca2 + 0.09 mM), כולל 10 מיקרומטר Y27632.
  18. מעבירים את התאים לצלוחית תרבית תאי T25.
  19. כדי להרחיב את הקרטינוציטים הראשוניים, תרבית את התאים עד 60%-80% מפגש במשך כשבוע אחד.
    הערה: מעבר (P)0 יוצר קונגלומרטים של תאים דמויי איון ואינו חד-שכבתי. קרטינוציטים ראשוניים יוצרים חד-שכבות מ-P1 ואילך.
  20. מעבר במפגש של 60%-80% וזרע מחדש P1 בצלוחיות תרבית תאים 2-3 T25 או 1-2 T75.
  21. מעבר P1 שוב כאשר קרטינוציטים יוצרים שכבה אחת עם מפגש של 60%-80%.

4. תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI) הנגזר מהמטופל

  1. זרעו קרטינוציטים ראשוניים P2 על תוספות טרנסוול לתרבית ALI.
    הערה: זרעו 400,000 תאים ב-12 תוספות באר (200,000 קרטינוציטים ל-0.6 ס"מ2) ב-500 מיקרוליטר של KSFM (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 מיקרוגרם/מ"ל BPE).
    1. זרעו 150,000 תאים ב-24 תוספות באר (155,000 קרטינוציטים ל-0.5 ס"מ2) ב-100 מיקרוליטר של KSFM (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 מיקרוגרם/מ"ל BPE).
    2. לחלופין, יש להקפיא בתווך KSFM (Ca2+ 0.09 mM + 10% DMSO) בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות ולאחר מכן להעביר את התאים הקפואים לחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: בעת שימוש בבקבוקונים קפואים, יש לעבור פעם נוספת לאחר ההפשרה לפני השימוש בתאים לתרבית ALI.
  2. מוסיפים מדיום לבאר התחתונה מתחת לתוספת של צלחת תרבית הטרנסוול.
    הערה: עבור 12 לוחות באר: 1.5 מ"ל של KSFM (Ca2 + 0.09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 מיקרוגרם / מ"ל BPE). עבור 24 צלחות באר: 600 μL של KSFM (Ca2 + 0.09 mM, 1 ng / mL EGF, 50 μg / mL BPE).
  3. החלף את KSFM עם סידן בינוני עד גבוה (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) לאחר יומיים.
  4. החליפו את מדיום KSFM עתיר הסידן כל יומיים עד ליום 7.
  5. בצעו רכבת אווירית ביום השביעי על ידי שאיפת התווך מהחדר העליון והחלפת התווך בתא התחתון בסידן KSFM גבוה (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) המכיל 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית (AA).
    1. אופציונלי: להוסיף ציטוקין מעניין בריכוז הרצוי למדיום.
  6. החליפו את המדיום כל יומיים עד היום ה-14.

5. מדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER)

  1. לעקר את האלקטרודה של מד TEER על ידי טבילתו בבאר של צלחת 24 באר עם 5% hypochlorite נתרן במשך 10-15 דקות.
  2. שטפו את 5% נתרן היפוכלוריט על ידי טבילת האלקטרודה לתוך 4 בארות עוקבות עם ddHסטרילי 2O ולתת לאלקטרודה להתייבש באוויר.
  3. הגדר את החסר על ידי הצבת אלקטרודה אחת בבאר ואת האלקטרודה השנייה לתוך הכנס transwell, למלא אותו עם PBS, ולמדוד את TEER.
    הערה: נפחים מומלצים למדידות TEER: עבור 12 פלטות באר (1900 μL בבאר ו- 900 μL בעלון). עבור 24 צלחת באר (750-1000 μL בבאר ו 250 μL בהכנסה).
  4. החלף את המדיום של תרביות ALI ב- PBS סטרילי בטמפרטורת החדר.
    הערה: הסר את המדיום מהבאר התחתונה, ובשלב שני, מתוספת הטרנסוול. באופן דומה, הוסף PBS תחילה לאינסרט ולאחר מכן לבאר התחתונה כדי למנוע ניתוק של תרבית ALI מקרום הטרנסוול.
  5. מקמו את אלקטרודות מד TEER בבארות הניסוי עם תרביות ALI ובצעו את מדידת TEER1.
    הערה: בצע מדידות TEER כל יומיים לפני שינוי המדיום.

6. שטף מקרומולקולרי

  1. דללו את תמיסת המלאי FITC-Dextran (3-5 kDa) לריכוז תקין של 1 מ"ג/מ"ל.
    הערה: הגן תמיד על FITC-Dextran מפני חשיפה לאור.
  2. הכן שורת דילול עם ריכוז FITC יורד (1000 מיקרוגרם/מ"ל עד 0.25 מיקרוגרם/מ"ל) כתקן לקריאה.
  3. הוסף 500 μL של תמיסת FITC-dextran (1 מ"ג / מ"ל) לתא העליון של transwell ו 1.5 מ"ל בינוני (+/- ציטוקין של עניין) לתוך התא התחתון ומניחים את הצלחת באינקובטור.
  4. אסוף 120 מיקרוליטר של מדיום מהתא התחתון בנקודות הזמן המתאימות (לדוגמה, 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 120 דקות, 150 דקות ו-180 דקות).
  5. פיפטה משכפלת (50 מיקרוליטר/באר) של כל נקודת זמן ללוח תחתון שטוח שחור שקוף בן 96 בארות.
  6. הרגש את FITC-dextran ב- 490 ננומטר וקרא את הפליטה באורך גל של 520 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
  7. חישוב כמות השטף המקרומולקולרי על פי התקן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אורגנואידים של הוושט יגדלו מתאים ראשוניים שחולצו מביופסיות של מטופלים בהתאם להוראות הפרוטוקול שסופק, כפי שתועד במיקרוסקופ שדה בהיר הפוך (איור 1). ASCs אפיתל מתחילים ליצור צבירי תאים באופן התארגנות עצמית ביומיים הראשונים של התרבית לאחר זריעת התאים המבודדים בתמצית קרום המרתף, המשמש פיגום. הגודל והמספר של צבירי תאים, שניתן להבחין בהם במיקרוסקופ שדה בהיר הפוך, גדלים ברציפות בשבוע הראשון (איור 2). עם זאת, בשלב זה, אשכולות התאים חסרים את המבנה דמוי הבצל האופייני לאפית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההליכים הניתנים מאפשרים טיפוח של אורגנואידים שמקורם במטופל ותרביות ALI עם סיכויי הצלחה גבוהים. פרוטוקול האורגנואידים הותאם מהפרוטוקול הראשון שפורסם המדווח על יצירת אורגנואידים של הוושט האנושי26 ומפרוטוקול32 שפורסם לאחרונה. שריל ועמיתיו תיארו את מודלALI 22. אורגנואידים ומודלים של תרבית ALI מסייעים זה לזה בחקר ההשפעה של ציטוקינים ומתווכים אחרים על מחסום האפיתל של הוושט בהקשרים של מחלות ושט, כגון EoE 5,26

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מענק SNSF 310030_219210 ל- J.H.N. תמך בפרסום כתב יד זה ללא הגבלות. איור 1 נוצר בעזרת BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1250 ומיקרו; L Griptip - מסנןIntegra4445
300 ומיקרו; L Griptip - מסנןאינטגרה4435
70 ומיקרו; מסננת תאיםM Sarstedt83.3945.070
חומצה אסקורביתSigma-Aldrich (Merck)A4544
תמצית יותרת המוח בקרGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ' (Merck)21115
תרבית תאים Multiwell Plates CELLSTAR לתרביות תרחיףGreiner Bio-One7.657 185
תמצית קרום הבסיס של Cultrex (BME), סוג 2, PathclearR& D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
דימתיל סולפוקסיד (DMSO), >99,5% בדרגת BioScienceCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos פוספט חוצץ מלח  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE מונה תאים אוטומטיNanoEntekEVE-MC
EVE שקופית ספירת תאיםNanoEntekEVS-050
Falcon 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול, עם מסננת תאים מכסה הצמדפלקון352235
פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרןסיגמא-אולדריץ' (Merck)FD4ממוצע מול wt 3000-5000
הראוס - מגה-פוגה  40R Thermo Fisher Scientific75004518
גורם גדילה אפידרמלי רקומביננטי אנושיGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Keratinocyte-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
פניצילין-סטרפטומיציןGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
חלבון KGF/FGF-7 רקומביננטי אנושיR& D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
צינור מכסה בורג, 15 מ"לSarstedt62.554.502
ערוץ יחיד EVOLVE 100-1000 ומיקרו; L Integra3018
ערוץ יחיד EVOLVE 20-200 ומיקרו; L מזרק Integra3016
1 מ"ל1134950
ThermoMixer Cמעכב Eppendorf5382000015
טריפסין מבית Glycine max (פולי סויה)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 דיהידרוכלורידטוקריס (ביו-טקנה)1254

מקורות

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

אורגנואידים של ושטממשק אוויר-נוזלהתמיינות אפיתליאליתתרבית קרטינוציטיםהתנגדות טרנס-אפיתליאליתגרגרים של ציטוקיניםמסלול MAP Kinase
מודלים תלת מימדיים של תרביות תאים לחקר מחסום האפיתל בדלקת ושט אאוזינופילית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.