מאמר שיטה

אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות

DOI:

10.3791/66507

⸱

24 במאי 2024

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותח פרוטוקול משופר לבדיקת ניוד סידן עם תאי אנדותל, המשמש לזיהוי ליגנדות של קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs). הפרוטוקול החדש מקצר את זמן הבדיקה הכולל ב-90-120 דקות ומניב עקומות ריכוז-תגובה הניתנות לשחזור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים בריכוז הסידן בתאים מנוטרים במהירות בתפוקה גבוהה באמצעות שימוש בצבעים תוך-תאיים, פלואורסצנטיים, קושרי סידן ומכשירי הדמיה שיכולים למדוד פליטות פלואורסצנטיות מעד 1,536 בארות בו זמנית. עם זאת, מכשירים אלה יקרים בהרבה ויכולים להיות מאתגרים לתחזוקה ביחס לקוראי לוחות זמינים באופן נרחב שסורקים בארות בנפרד. מתואר כאן מבחן קורא לוחות ממוטב לשימוש עם קו תאי אנדותל (EA.hy926) למדידת הפעלה מונעת קולטן המופעל על ידי פרוטאז (PAR) של איתות Gαq וניוד סידן לאחר מכן באמצעות הצבע קושר הסידן Fluo-4. בדיקה זו שימשה לאפיון מגוון ליגנדות PAR, כולל ליגנדות "פרמודולין" אנטי-דלקתיות אלוסטריות המכוונות ל-PAR1 שזוהו במעבדת דוקנדורף. פרוטוקול זה מייתר את הצורך בטיפול אוטומטי בנוזלים ומאפשר סינון בתפוקה בינונית של ליגנדות PAR בלוחות 96 בארות ואמור להיות ישים לחקר קולטנים אחרים היוזמים ניוד סידן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs)1,2,3 הם תת-משפחה של קולטנים מצומדים לחלבון G מסוג A (GPCRs) המתבטאים במגוון סוגי תאים, כולל טסיות דם ותאי אנדותל 4,5,6,7. שלא כמו רוב GPCRs, PARs יש מצב ייחודי intramolecular של הפעלה. רוב GPCRs מופעלים על ידי ליגנדות מסיסות, אינטראקציה עם כיס קישור נפרד, אבל PARs מופעלים על ידי מחשוף פרוטאוליטי של N-terminus, אשר גורם ליגנד קשור חדש שיכול לתקשר עם תחום לולאה חוץ-תאית 2 על פני השטח של תא 6,8,9. אינטראקציה זו מפעילה את הקולטן ויכולה ליזום מספר מסלולי איתות, המקדמים השפעות כגון דלקת והפעלת טסיות 4,10,11,12. פרוטאזות שונות יכולות להפעיל PARs באמצעות מחשוף באתרים ייחודיים על N-terminus, ולחשוף ליגנדות קשורות שונות (TL) המייצבות קונפורמציות קולטן, אשר יוזמות מסלולי איתות שונים 9,13,14,15. לדוגמה, בחבר הנחקר ביותר בתת-המשפחה, PAR1, מחשוף על ידי טרומבין משמש לתמיכה בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל הפעלת טסיות דם וגיוס לויקוציטים לאנדותל, אך יכול להוביל להשפעות מזיקות כאשר הקולטן מתבטא יתר על המידה או מופעל יתר על המידה 4,16,17,18,19,20,21 . לעומת זאת, מחשוף על ידי חלבון פעיל C (aPC) יכול לקדם השפעות אנטי דלקתיות ושמירה על מחסומי אנדותל 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PARs יכולים להיות מופעלים גם על ידי אנלוגים פפטידים של TLs באופן בין-מולקולרי 13,30,31. פפטידים אלה משמשים באופן שגרתי למדידת עיכוב PAR (אפנון) במקום פרוטאזות ממוקדות PAR, והם משמשים בפרוטוקול זה.

הפרעות רבות קשורות לאיתות PAR1 פתולוגי, כולל אלח דם22,32, מחלות לב וכלי דם 33,34,35,36,37,38, מחלת כליות 39,40,41,42, מחלת תאי מגל 43, פיברוזיס44, אוסטאופורוזיס ודלקת מפרקים ניוונית45,46, ניוון עצבי 47,48,49,50,51, וסרטן 52,53,54,55,56,57,58,59 . אנטגוניסטים של PAR1 נחקרו מאז 1990 כחומרים נוגדי טסיות למחלות לב וכלי דם, והרשימה ההולכת וגדלה של מחלות הקשורות לקולטן מחייבת זיהוי של ליגנדות חדשות לשימוש כבדיקות ביולוגיות (תרכובות כלים) או כטיפולים פוטנציאליים. נכון לעכשיו, יש רק אנטגוניסט PAR1 אחד שאושר על ידי ה- FDA, vorapaxar, המשמש לטיפול במחלת עורקים כליליים בחולים בסיכון גבוה 34,36,37,60. אנטגוניסט PAR1 חלופי, הפדוקין PZ-128, השלים מחקר פאזה II מוצלח למניעת פקקת בחולי צנתור לב38. קבוצת דוקנדורף התמקדה בכימיה רפואית ופרמקולוגיה של קבוצה נפרדת של מולקולות קטנות, ליגנדות PAR1 הידועות בשם פרמודולינים61,62. שלא כמו אנטגוניסטים מדווחים של PAR1 כגון vorapaxar, פרמודולינים הם מודולטורים אלוסטריים ומוטים של PAR1 החוסמים באופן סלקטיבי את מסלול Gαq תוך קידום השפעות ציטוטופרוטקטיביות בדומה ל-aPC. שלא כמו אנטגוניסטים אורתוסטריים חזקים PAR1 כגון vorapaxar, parmodulins שפורסמו הם גם הפיכים 63,64,65.

בתחילה, פרמודולינים זוהו על ידי Flaumenhaft ועמיתיו על יכולתם לעכב ביטוי P-selectin או הפרשת גרגירים בטסיות61,66. עם זאת, נדרשה שיטה חלופית כדי לחקור את ההשפעות של פרמודולינים על תאי אנדותל. שיטה נפוצה אחת לניטור איתות הקשור ל-GPCR היא מדידת ניוד Ca2+ תוך-תאי, שליח משני חשוב שניתן למדוד באמצעות צבע קושר סידן תוך-תאימתאים 67,68. ראיות משמעותיות הראו כי גיוס סידן המושרה על ידי PAR1 הוא באמצעות הפעלה של Gαq69,70. לאחר הפעלתו על ידי ליגנד קשור (או ליגנד אקסוגני מתאים), PAR1 עובר שינוי קונפורמטיבי הגורם לדיפוספט גואנוזין (GDP) הקשור לתת-היחידה Gαq להיות מוחלף בגואנוזין טריפוספט (GTP)68. תת-היחידה Gαq מפעילה פוספוליפאז Cβ (PLC-β), אשר מזרז את ההידרוליזה של פוספטידילינוזיטול 4,5 ביספוספט (PIP2), ויוצר טריפוספט 1,4,5-אינוסיטול (IP3) ודיאצילגליצרול (DAG). לבסוף, IP3 נקשר לתעלות Ca2+ רגישות ל-IP3 בממברנה של הרשתית האנדופלסמית, ומאפשר ל-Ca2+ להשתחרר לתוך הציטופלסמה, שם הוא יכול להיקשר לצבעים פלואורסצנטיים תלויי Ca2+, כגון Fluo-4, המתווספים לתאים71. תהליך זה מתרחש תוך שניות ויכול להעלות את הריכוז של Ca2+ פי 100, מה שמוביל לשינוי דרסטי בכמות הצבע הקשור לסידן ולאות פלואורסצנטי חזק.

בשנת 2018, קבוצת דוקנדורף חשפה בדיקת גיוס Ca2+ בתפוקה בינונית שניתן להשתמש בה כדי לזהות אנטגוניסטים של מסלול Gαq של PAR172. הבדיקה השתמשה ב- EA.hy92673, קו תאי אנדותל אנושי היברידי, שניתן להשתמש בו עבור מעברים מרובים ללא שינוי ניכר בביטוי PAR1, והוא נקבע למדידות חוץ גופיות של השפעות ציטוטופרוטקטיביות.

הפרוטוקול המקורי השתמש בתאי EA.hy926 בלוחות של 96 בארות ועמוס בצבע Fluo-4/AM, שנבחר בשל הפלואורסצנטיות האינטנסיבית שלו ב-488 ננומטר וחדירות תאים גבוהה. לאחר שהצבע הועמס לתוך התאים, שלבי שטיפה ארוכים בוצעו עם מטפל אוטומטי בנוזלים בן 8 ערוצים (שיטות מהירות יותר לטיפול בנוזלים, כגון מכונת כביסה בת 96 ערוצים, לא היו נגישות). יכולת השחזור של בדיקה זו הייתה עדיפה על זו ללא שינויי המדיה הרובוטיים האוטומטיים והזהירים. לאחר מכן הודגרו אנטגוניסטים עם התאים, PAR1 הופעל באמצעות הוספה רציפה של אגוניסט סלקטיבי (16 בארות בכל פעם), ונמדדו שינויים בפלואורסצנטיות שנבעו מניוד סידן וקשירת צבע כדי לקבוע פעילות.

בעוד פרוטוקול זה מאפשר מדידה של ניוד סידן בתיווך PAR1, הוא מוגבל על ידי הזמן הדרוש כדי להעריך כל צלחת 96 בארות. זמני ניסוי ארוכים הם בעייתיים לא רק בגלל שמספר התרכובות שניתן לבדוק בכל יום מוגבל, אלא גם בגלל שטף הצבע מתרחש לאורך זמן, מצמצם את חלון הבדיקה על ידי הגדלת הפלואורסצנטיות הבסיסית. אחד התורמים לזמן הניסוי הארוך הוא השימוש במטפל בנוזלים בעל 8 ערוצים לשטיפת צלחות, המוסיף מעל 30 דקות לכל ניסוי. גם הטיפים הנדרשים הפכו קשים להשגה בשל בעיות בשרשרת האספקה. כאן מדווח פרוטוקול מעודכן לבדיקת ניוד סידן בתיווך PAR, שאינו דורש מטפל בנוזלים, ולכן ניתן להריץ אותו בתפוקה גבוהה יותר. פרוטוקול זה צריך להתאים גם למדידת איתות עם GPCRs אחרים המובילים לניוד סידן תוך תאי. פרוטוקול קורא לוחות מעודכן זה אידיאלי עבור מעבדות אקדמיות ותעשייתיות קטנות שאין להן את המשאבים למכשירי דימות תאים יקרים, אך יש להן צורך לסנן במהירות תרכובות רבות. לדוגמה של בדיקת גיוס סידן באמצעות מצלמת צלחת, ראו Caers et al.74.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל חילופי המדיה/התוספות המבוצעים בשלבים 1 ו-2 של הפרוטוקול הבא מבוצעים במכסה מנוע סטרילי. אלא אם כן צוין אחרת, כל כלי הפלסטיק המשמשים במכסה המנוע הסטרילי חייבים להיות נרכשים, מעוקרים ואטומים או מעוקרים כראוי באמצעות autoclave.

1. הפעלת קו תאים EA.hy926

  1. רכוש תאי EA.hy926.
  2. אחסן בקבוקונים של תאים בשלב האדים של מיכל חנקן נוזלי.
  3. הכן DMEM בינוני מלא על ידי חימום ראשון DMEM, FBS, עט / strep (ראה טבלת חומרים לפרטים ספציפיים) באמבט מים 37 ° C במשך 15-30 דקות. הוסף 50 מ"ל של FBS ו- 1 מ"ל של עט/סטרפטוקוקוס ל- 500 מ"ל DMEM. מערבבים בעדינות את התמיסה על ידי היפוך.
    הערה: ערבוב נמרץ מדי גורם לכמויות מוגזמות של בועות.
  4. יש להסיר בקבוקון אחד של תאים מחנקן נוזלי ולחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
  5. לעקר את בקבוקון התאים ואת בקבוק DMEM להשלים בינוני על ידי ריסוס עם אלכוהול, ולאחר מכן לעבור מכסה המנוע סטרילי.
  6. השתמש פיפטה 1,000 μL כדי להעביר בזהירות את התאים לצינור צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל DMEM לבקבוקון לשטיפה והוסף לצינור הצנטריפוגה.
  7. הפוך גלולה של תאים באמצעות צנטריפוגה (150 × גרם, 5 דקות, 22 ° C). הסר את המדיום מצינור הצנטריפוגה על ידי שאיפה; היזהר לא להפריע את כדור התא.
  8. הוסף 3 מ"ל של DMEM מדיום שלם לצינור הצנטריפוגה ופרק בעדינות את הגלולה על ידי ערבוב מתלה התא באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר.
    הערה: יש להימנע מגרימת בועות על-ידי ערבוב נמרץ מדי, שכן הדבר עלול להפעיל את התאים או לגרום להם נזק.
  9. מערבבים 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של כחול טריפאן בצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטה עם 20 μL או 200 μL קצוות. הוסף 10 μL של תערובת התא תרחיף/טריפאן כחול להמוציטומטר וספור את התאים.
    הערה: שימוש בקצוות פיפטה של 0.1-10 μL יכול לגזור את התאים. אין להשתמש בטיפים בגודל זה בעת הטיפול במתלה התא.
  10. הוסף מדיום שלם DMEM לתרחיף התא כדי ליצור צפיפות של 66,000 תאים / מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 או 25 מ"ל. פיפטה 15 מ"ל של תרחיף התא לתוך צלוחיות תרבית T-75. להבטיח פיזור שווה של תרחיף התא על ידי הזזת הבקבוק מצפון לדרום וממזרח למערב.
  11. לדגור על התאים עד שהם מגיעים למפגש (בדרך כלל לאחר 4-6 ימים), כפי שמוערך על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ. בשלב זה, השתמש בתאים בניסוי (החל מסעיף 2) או זרע אותם בצלוחיות חדשות לצורך הרחבה כדי להכין מלאי קפוא (בצפיפות זריעה מומלצת של 1,000,000 תאים ב -15 מ"ל של תווך מלא לכל צלוחיות T-75).
    הערה: ניתן לגדל תאים בצלוחיות התרבית למשך 3 שבועות ללא הבדל ניכר בצורה, בבריאות או בביצועים בבדיקה. מדיום מלא צריך להיות מוחלף כל 3-4 ימים.

2. הוספת תאי EA.hy926 לצלחות 96 בארות

הערה: ניתן להשתמש בתאים מבקבוק תרבית T-75 אחד כדי להכין שתיים או שלוש צלחות בדיקה או להרחיב אותן לעד 15 צלוחיות T-75 טריות. ניתן לסנן לפחות חמש לוחיות בדיקה באמצעות הפרוטוקול בסעיפים 4 ו-5 ביום עבודה רגיל. ההוראות הבאות מתארות הכנה ובדיקה של צלחת בדיקה אחת, אך ניתן להכין לוחות נוספים על ידי חזרה על שלבים 2.2, 2.7, 2.12 ו- 3.2 כדי להכין את המספר הרצוי של לוחות בדיקה. בדרך כלל, ארבעה לוחות בדיקה מוכנים ביום כדי למדוד תגובות ריכוז עם עד 16 תרכובות, אשר דורש שתי צלוחיות T-75 עם תאים מתמזגים.

  1. חם DMEM להשלים בינוני באמבט מים 37 ° C במשך 15-30 דקות. לעקר את בקבוק DMEM מדיום שלם על ידי ריסוס אותו עם אלכוהול, ולאחר מכן להעביר אותו למכסה המנוע סטרילי.
  2. הוסף 100 μL של תמיסת ג'לטין מעוקרת 0.4% לכל הבארות של צלחת שחורת דופן, 96 בארות, תחתית שקופה עם מכסה. דוגרים על הצלחת עם תמיסת הג'לטין באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך 30 דקות.
  3. אשרו כי תאים בבקבוק תרבית T-75 הם 80-100% נפגשים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. הסר DMEM מדיום שלם מן בקבוק T-75 באמצעות שאיפה.
  4. לשטוף את התאים בבקבוק עם PBS 10 מ"ל בעדינות להעביר את הבקבוק מצפון לדרום וממזרח למערב. הסר את PBS מן הבקבוק באמצעות שאיפה.
  5. הוסף 5 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה של תאים לבקבוק ודגר על הבקבוק באינקובטור (37 ° C, 5% CO2) במשך ~ 12 דקות. הקש על הבקבוק לאחר 6 דקות כדי להקל על דיסוציאציה.
    הערה: דגירה של תאים במשך יותר מ-15 דקות עם סוכן הדיסוציאציה של התאים שאליו התייחסה גורמת לתאים להתחיל להתקבץ יחד, מה שמקשה על השגת ספירת תאים מדויקת ועלול להפריע לבדיקה.
  6. הוסף 5 מ"ל של התווך המלא DMEM שחומם מראש לבקבוק וערבב בעדינות עם תמיסת הדיסוציאציה של התא / תרחיף התא. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל. הפוך גלולה של תאים באמצעות צנטריפוגה (150 × גרם, 5 דקות, 22 ° C).
  7. בזמן יצירת הכדורית, מוציאים את תמיסת הג'לטין מהצלחת בעלת 96 הקידוחים באמצעות שאיפה באמצעות פיפטה של פסטר המחוברת לוואקום. הסר את מכסה הצלחת מרגע הסרת הג'לטין עד שהתמיסה מוכנה לצפייה.
    הערה: ניתן להשתמש בפיפטה רב-ערוצית או בסעפת סטרילית המחוברת לוואקום.
  8. הסר את התווך מצינור הצנטריפוגה על ידי שאיפה באמצעות פיפטה פסטר המחוברת לוואקום או פיפטה סרולוגית; היזהר לא להפריע את כדור התא.
  9. הוסף מדיום שלם DMEM טרי לצינור הצנטריפוגה באמצעות פיפטה סרולוגית 5 או 10 מ"ל. שברו בעדינות את גלולת התא על ידי ערבוב המדיום המלא של DMEM עם פיפטה של 1,000 מיקרוליטר או פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
    הערה: בדרך כלל משתמשים בשמונה מיליליטר DMEM, אך ניתן להוסיף נפחים גבוהים יותר כדי להקל על ספירת התאים.
  10. מערבבים 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של כחול טריפאן בצינור מיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטה עם 20 μL או 200 μL קצוות. הוסף 10 μL של תערובת התא תרחיף/טריפאן כחול להמוציטומטר וספור את התאים.
  11. הוסף מדיה מלאה DMEM לתרחיף התא כדי ליצור צפיפות של 600,000 תאים / מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 או 25 מ"ל. זה ייתן צפיפות סופית של 60,000 תאים/באר בצלחת של 96 בארות (שנקבעה כצפיפות האופטימלית על ידי ניסויים).
    הערה: תרבית תאים רגילה ומוצלחת תניב בין 12,000,000 ל-15,000,000 תאים, שיכולים לזרוע שתיים עד שלוש צלחות של 96 בארות.
  12. מערבבים את מתלה התא על ידי היפוך עדין של צינור הצנטריפוגה ומוסיפים אותו למאגר פיפטה רב ערוצי של 50 מ"ל. מערבבים את המתלה במאגר כל 30 שניות על ידי נדנוד עדין של המאגר מצד לצד, מוסיפים 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. החלף את מכסה הצלחת השקוף ונער בעדינות את הצלחת על ידי החלקתה על פני מכסה המנוע הסטרילי מצפון לדרום וממזרח למערב כדי להבטיח פיזור תאים אחיד. לדגור על הצלחת באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 16-24 שעות.
    הערה: ניתן להשתמש בתרחיף תאים נוסף להכנת לוחות נוספים, או לחזור על שלבים 1.10-1.11 כדי להמשיך את קו התא.

3. הכנת בדיקת גיוס סידן

  1. הכינו ריאגנטים לבדיקה.
    1. הכן תמיסה probenecid (250 mM, מימי) על ידי הוספת 36 מ"ג של probenecid לצינור microcentrifuge ו המסתו ב 0.6 M NaOH (500 μL). מערבולת את הפתרון.
      הערה: Probenecid משפר את שימור הצבע בתא על ידי עיכוב מובילי יונים אורגניים 75,76,77.
    2. כדי ליצור חיץ בדיקת HBSS-HEPES, הוסף HEPES (1.19 גרם) לבקבוק 500 מ"ל של HBSS ללא אדום Ca/Mg/phenol (יצירת תמיסה של 10 מילימטר של HEPES). השלימו את החיץ עם MgCl2 (תמיסה מימית של 1 M, 500 μL) ו-CaCl2 (תמיסה מימית של 1 M, 500 μL). יש לערבב את התמיסה ולאחסן במקרר בטמפרטורה של 5°C כאשר אינה בשימוש.
      1. עבור כל צלחת 96 באר, להוסיף 50 מ"ל של חיץ הבדיקה HBSS-HEPES לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל, להשלים עם 500 μL של תמיסה probenecid, ולערבב היטב. יש לחמם את החיץ לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    3. צור תמיסת F-127 פלורונית 10% ב- DMSO על ידי הוספת F-127 פלורוני (20 מ"ג) לצינור מיקרוצנטריפוגה או בקבוקון HPLC והמסתו עם 200 מיקרוליטר DMSO.
      הערה: תמיסה זו ניתנת לאחסון בטמפרטורת החדר והיא מספיקה לכ-30 צלחות. F-127 פלורוני מתמוסס לאט מאוד בטמפרטורת החדר ויש לחמם אותו בעדינות כדי להקל על המסה.
    4. הכינו את מאגר טעינת הצבע על ידי הוספה ראשונית של 24 μL של DMSO לבקבוקון של Fluo-4/AM (50 מיקרוגרם) כדי להמיס את הצבע. בצינור צנטריפוגה עטוף בנייר כסף של 15 מ"ל, יש להוסיף 6 מ"ל של חיץ בדיקת HBSS-HEPES ולהוסיף 6 μL של 10% F-127 פלורוני ו-6 μL של תמיסת Fluo-4/AM. מערבלים בקצרה את התמיסה ומאפשרים לשבת בטמפרטורת החדר, מחוץ לאור, במשך 10 דקות.
      הערה: כדי למנוע הלבנה של Fluo-4, יש להרחיק את הצבע מאור על-ידי כריכת רדיד אלומיניום סביב צינור הצנטריפוגה המכיל את תמיסת הצבע ואת מכסה צלחת הבדיקה.
  2. הכינו צלחות בדיקה.
    1. הסר את צלחת הבדיקה מהאינקובטור ואשר את המפגש באמצעות מיקרוסקופ הפוך. הסר ידנית את המדיה המלאה של DMEM על ידי הכנסתה לכיור וניקוי החלק העליון של הצלחת במגבת נייר.
      הערה: ניתן להסיר את המדיום במידה מספקת על-ידי החזקת הצלחת אופקית והחלקה, ולאחר מכן סיבוב הלוח ב-180° וחוזר חלילה.
    2. הוסף חיץ בדיקת HBSS-HEPES בתוספת פתרון probenecid למאגר ממס פיפטה רב-ערוצי של 50 מ"ל.
      הערה: תמיסה זו תשמש לשלבי כביסה מאוחרים יותר ויש להניח בצד ולכסות אותה ברדיד אלומיניום עד לצורך.
    3. הוסף 100 μL של חיץ הבדיקה HBSS-HEPES בתוספת תמיסה probenecid לכל באר עם פיפטה רב ערוצית ולאפשר לתאים לשבת בנוכחות probenecid במשך 5 דקות. הסר את מאגר בדיקת HBSS-HEPES על-ידי החלקה לתוך הכיור באותו אופן כמו בשלב 3.2.1.
    4. הוסף מאגר העמסת צבע למאגר ממס פיפטה רב-ערוצי נפרד של 50 מ"ל. הוסף 50 μL של חיץ העמסת הצבע לכל באר של צלחת הבדיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית. דוגרים על הצלחת במשך 45 דקות (37°C, 5% CO2).
    5. בזמן שהצלחת נמצאת באינקובטור, הכינו את פתרונות האגוניסט/אנטגוניסט.
      1. פתרונות אנטגוניסטים מאוחסנים כפתרונות 31.6 mM ב- DMSO. בצינור PCR, דלל 2 μL של תמיסת המלאי עם 38 μL של 0.1% BSA/מים כדי לקבל תמיסה של 1.58 mM. 2 μL של פתרון זה ייתן ריכוז סופי של 31.6 מיקרומטר בצלחת המבחן. לדלל 4 μL של תמיסה אנטגוניסטית 1.58 mM עם 36 μL של 5% DMSO/מים (ללא תוספת BSA), ולהכין את הריכוזים הנותרים באמצעות דילולים סדרתיים.
      2. הכן תמיסה של 108.3 מיקרומטר (16.7x) של TFLLRN-NH2 במאגר בדיקת HBSS-HEPES, אשר ייתן ריכוז סופי של 6.5 מיקרומטר כאשר 6 μL מתווסף לכל באר של צלחת הבדיקה. לדוגמה, להמיס aliquot 2 מ"ג של TFLLRN-NH2 עם 5.244 מ"ל של מאגר בדיקת HBSS-HEPES כדי לתת פתרון מלאי 0.5 mM. ערבבו 1.083 מ"ל של תמיסה זו עם 3.917 מ"ל של מאגר בדיקת HBSS-HEPES כדי לתת תמיסה של 108.3 מיקרומטר.
        הערה: יש לאחסן תמיסות TFLLRN-NH2 במקפיא בטמפרטורה של -20°C כאשר אינן בשימוש.
    6. הסר את הצלחת מהאינקובטור וודא ספיגת צבע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בסביבה מתאימה (בדרך כלל עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק, ראה איור 1 לדוגמה של Fluo-4 שהוטען בהצלחה לתוך תאים). הסר את מאגר טעינת הצבע על-ידי הזזת הצלחת באותו אופן כמו שלב 3.2.1.
    7. יש לשטוף את התאים 2x עם 50 μL של חיץ בדיקת HBSS-HEPES בתוספת תמיסה probenecid (משלב 3.2.3) בכל באר (להסיר על ידי החלקה בינונית לתוך הכיור).
    8. הוסף 92 μL של חיץ בדיקת HBSS-HEPES לכל באר ושוב הצג את התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח שעודפי הצבע הוסרו במלואם, ושהתאים יישארו דבוקים.
    9. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 2 μL של פתרונות אנטגוניסט ורכב לבארות מתאימות (ראה טבלה 1 עבור מפת לוחות מייצגת).

4. ביצוע בדיקת גיוס הסידן

  1. הגדר את קורא הלוחות באופן הבא: טמפרטורה: 37 °C; אורך גל עירור: 485 ננומטר; אורך גל פליטה: 525 ננומטר; גובה מדידה: 7.8 מ"מ (ממוטב); מספר הבזקים: 100; מספר חזרות: 20.
  2. דוגרים על הצלחת במשך 15 דקות בקורא הצלחות בטמפרטורה של 37°C. מדוד את פלואורסצנטיות הרקע בעמודות 1 ו-2 (חמש סריקות לכל באר).
  3. הוציאו את הצלחת מקורא הצלחות והוסיפו במהירות 6 מיקרוליטר של תמיסה אגוניסטית לכל באר בעמודות 1 ו-2 מפס PCR בעל 8 צינורות באמצעות פיפטה רב ערוצית.
    הערה: עבור שלב זה, אנו משתמשים פיפטה אלקטרונית 8 ערוצים עם 0.1-10 μL פיפטה קצוות.
  4. מדדו את השינוי בפלואורסצנטיות כאשר מתרחשת ניוד סידן בתאים. בצע 20 סריקות של כל באר בהתאם להגדרות לעיל.
    הערה: סריקת כל באר בשתי עמודות 20x כל אחת אורכת כ-5 דקות (כלומר, ~15 שניות בין סריקות של כל באר).
  5. חזור על שלבים 4.2-4.4 עבור עמודות 3-12 בשתי דרגות עמודה.

5. ניתוח נתונים

  1. יצא נתונים מהבדיקה כגליונות אלקטרוניים נפרדים עבור כל קבוצה בת שתי עמודות.
  2. מצא את הממוצע של קריאות הפלואורסצנטיות הבסיסיות באמצעות הפונקציה AVG (סריקה ראשונה: סריקה אחרונה). עשו זאת עבור כל באר בשתי העמודות.
  3. מצא את הפלואורסצנטיות המקסימלית לאחר הוספת אגוניסט באמצעות הפונקציה MAX (סריקה ראשונה: סריקה אחרונה).
  4. חשב את השינוי בפלואורסצנטיות על ידי הפחתת הפלואורסצנטיות הבסיסית מהפלואורסצנטיות המקסימלית.
  5. הפחת את השינוי בפלואורסצנטיות המחושב עבור הבקרה השלילית (הוספת רכב ללא אגוניסט) מכל באר באותה עמודה.
  6. מצא את השינוי היחסי (המנורמל) בפלואורסצנטיות על ידי חלוקת השינוי בפלואורסצנטיות בכל באר בשינוי הפלואורסצנטיות ברכב (0.1% DMSO / מים) + 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2 היטב.
  7. העתק את הערכים שאינם בקרה, כאחוזים, לתוכנת סטטיסטיקה וגרפים. אם אתה משתמש בתוכנה שבוצעה אליה הפניה, בחר באפשרות טבלת XY, כאשר Numbers נבחר כציר X ושכפל ערכים בעמודות משנה זו לצד זו כציר Y.
  8. השתמש בתוכנית כדי להתוות עקומות ריכוז-תגובה (CRC) מתוך הנתונים. אם אתה משתמש בתוכנה שאליה מתבצעת הפניה, בחר באפשרות log(inhibitor) לעומת response - Variable slope (ארבעה פרמטרים).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת בדיקה זו היא בדרך כלל לייצר עקומות ריכוז-תגובה (CRC) עבור שלושה עד ארבעה פרמודולינים חדשים. על כל צלחת בדיקה, CRC נוסף עבור תרכובת ידועה, כגון NRD-21, נוצר לעתים קרובות המשמש כבדיקת איכות עבור הניסוי בשל IC50 הידוע שלה. כדי ליצור CRCs, יש לתכנן מפת לוחות כמו זו המתוארת בטבלה 1 . אם רוצים במקום זאת תגובות ריכוז חד-נקודתיות, יש להוסיף תרכובות בריכוזים סופיים של 10 מיקרומטר (או ריכוזים מועדפים אחרים) לשלוש בארות לפחות.

בעת ביצוע הבדיקה, אמורה להיות עלייה מהירה בפלואורסצנטיות (העלייה צריכה להתחיל בתוך 3-4 הסריקות הראשונות) המוצגת על-ידי קורא הלוחות (ראו איור 2A לדוגמה פלט בהשוואה לפלט הכושל באיור 2B). חשוב לציין כי יש להוסיף את האגוניסט במהירות (תוך 15 שניות) כדי שקורא הלוחות יוכל ללכוד במדויק את העלייה בפלואורסצנטיות. בניסוי עבודה, אות הפלואורסצנטיות לבאר הרכב צריך להישאר שטוח, בעוד שהאות הפלואורסצנטי בבארות הבקרה החיוביות (רכב + 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2) אמור להתחיל לעלות לאחר שלוש או ארבע סריקות. ברגע שמגיעים לערך המרבי (לאחר ~10 סריקות), האות הפלואורסצנטי אמור להתחיל לרדת לאט. בניסויים עם אנטגוניסטים יעילים מאוד, הבארות עם הריכוזים הגבוהים ביותר של אנטגוניסט צריכות להיות בעלות אות שנשאר שטוח יחסית, בדומה לבקרה השלילית. כמו כן, אמור להיות הבדל קטן בין האות של בארות הבקרה החיוביות לבין אלה עם ריכוזים נמוכים של האנטגוניסט (איור 2C). אם הריכוזים הנמוכים ביותר של אנטגוניסט עדיין מעכבים את ניוד הסידן, יש להתאים את הריכוזים המוקרנים כך שיכללו ריכוזים נמוכים יותר. CRCs שנוצרו צריכים להיות לפחות נקודת נתונים אחת ~ 100% כדי להראות באופן מלא את האופי הסיגמואידלי של העקומה.

הסימן הנפוץ ביותר לכך שניסוי לא עבד הוא אם באר הבקרה החיובית (רכב + 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2) אינה מראה עלייה גדולה בפלואורסצנטיות (איור 2B). זה יכול לקרות ממגוון סיבות: ספירת התאים יכולה להיות נמוכה (אם המפגש לא אושר), הפתרון האגוניסטי עלול להיפגע, או כמויות לא מספיקות של צבע יכול היה להיקלט על ידי התאים. אפשר גם בטעות לא להוסיף אגוניסט לבארות מסוימות.

בשיטה מתוכנתת, הנתונים מופקים כשישה גיליונות אלקטרוניים נפרדים, שכל אחד מהם מכיל נתונים עבור שתי עמודות. חמש הסריקות של הפלואורסצנטיות הבסיסית נמצאות בשורה משלהן, כאשר 20 הסריקות נלקחו לאחר הוספת אגוניסט בשורה שמיד למטה (ראו איור 3 לפלט מייצג). לצורך חישוב לדוגמה, ייעשה שימוש בעמודה מניסוי באמצעות NRD-21. בקובץ המיוצא (איור 3), הפלואורסצנטיות הבסיסית מכל באר מופקת לעמודות C עד G, ונתונים לאחר חיבור האגוניסט (20 הסריקות הבאות) מופקים לעמודות C עד V בשורה הבאה. שורות 14-17 בקובץ מכילות את הבקרה החיובית של שתי עמודות נפרדות. הממוצע של שורת הבסיס עבור אחת מבארות הבקרה החיוביות חושב באמצעות הפקודה "=AVERAGE(C16:G16)", שנתנה ערך של 1,039.8. פקודה זו חזרה על עצמה עבור מדידות הבסיס הנוספות בכל באר. מקסימום סריקות הניסוי חושב באמצעות הפקודה "=MAX(C16:V16)", שנתנה ערך של 2,629. שוב, הפקודה חזרה על עצמה עבור כל הבארות. הפלואורסצנטיות הבסיסית עבור כל באר הופחתה לאחר מכן מהערך המרבי. בניסוי זה, הנתונים נורמלו על ידי הפחתת השינוי בפלואורסצנטיות בבקרה השלילית מכל באר (שהיה 142.6 בטור לדוגמה). ערכים אלה חולקו לאחר מכן בערך המחושב באופן דומה של הבקרה החיובית. בעמודה זו, הערך המרבי היה 2,629, המדידה הבסיסית הממוצעת הייתה 1,039.8, והערך שהופחת עבור החסר היה 142.6. ערך הבקרה החיובית המתואם הוא אפוא 1,446.6 (מחושב מתוך המשוואה). משוואה זו חוזרת על עצמה עבור כל באר בעמודה, והערכים המחושבים מחולקים ב- 1,446.6 כדי לתת את השינוי היחסי שלהם בפלואורסצנטיות. היחסים הומרו לאחוזים והועתקו לתוכנה האנליטית. תהליך זה חזר על עצמו עבור 11 העמודות האחרות.

כדי לעבד את הנתונים באמצעות התוכנה שאליה מתבצעת הפניה, יש לבחור טבלת XY עם אפשרות לבצע שלוש מדידות חוזרות בעמודות זו לצד זו. יש להזין את ערכי -log של כל ריכוז לערכי x, ואת האחוזים המחושבים להוסיף לערכי y. יש לבצע ניתוח רגרסיה לא ליניארית על הנתונים, מה שגורם ליצירת ארבע עקומות ריכוז-תגובה. התוכנית גם מפיקה ערכי IC50 , סטטיסטיקות שגיאות מכומתות וסטטיסטיקות התאמה טובות.

figure-results-1
איור 1: Fluo-4/AM נטען לתוך תאי EA.hy926. Fluo-4 נטען באופן סלקטיבי לתוך תאי EA.hy926, לאחר דגירה של צבע ושלבי שטיפה. כל הפלואורסצנטיות נמצאת בתוך התאים, ללא דליפת צבע. התמונה התקבלה באמצעות הגדרת GTP במצלמת תא EVOS והגדלה של פי 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תפוקה פוטנציאלית של בדיקה. (A) פלט קורא לוחיות מייצג של ניסוי עובד. שורה A היא הבקרה השלילית ואין בה שינוי בפלואורסצנטיות. שורה B היא הבקרה החיובית ומראה עלייה מהירה בפלואורסצנציה. שורות C-H הן בארות הניסוי, כאשר הריכוזים הגבוהים יותר של פרמודולין נמוכים יותר בצלחת. (B) פלט לדוגמה של ניסוי כושל. לא נראית עלייה בפלואורסצנטיות בשורה B, שהיא הבקרה החיובית. (C) שינוי פלואורסצנטי לאורך זמן המושרה על ידי אגוניסט PAR1 TFLLRN-NH2. סריקת שתי עמודות של צלחת 96 בארות באמצעות ההגדרות שסופקו אורכת ~ 5 דקות בקורא לוחות PerkinElmer EnSpire (כלומר, ~ 15 שניות בין סריקות של כל באר). פתרונות NRD-21 שונים הם כפי שצוין, "אגוניסט" הוא 6.5 מיקרומטר tfllrn-nh2, n = 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: פלט Excel לדוגמה עבור בדיקת עבודה. פלואורסצנטיות בסיסית מופקת לשורות זוגיות, החל משורה 10, והתוצאה מ-10 הסריקות הראשונות לאחר חיבור אגוניסט מוצגת בשורות אי-זוגיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: טיפול רובוטי בנוזלים לעומת "הבהוב". ציפוי מקדים של לוחות הבדיקה בג'לטין וביצוע ידני של חילופי מדיה על ידי הזזת הצלחת וייבוש שלה מייצר עקומות ריכוז-תגובה עם שונות נמוכה יותר. (A) עקומות ריכוז-תגובה של פרמודולינים ML161 ו-NRD-21 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (טיפול אוטומטי בנוזלים). (B) עקומות ריכוז-תגובה של פרמודולינים ML161 ו-NRD-21 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (לוחות מצופים ג'לטין, מצופים). הנתונים הם אמצעים ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: מחקרי טמפרטורה. ביצוע הבדיקה ב 37 ° C מייצר נתונים לשחזור יותר מאשר בטמפרטורת החדר. (A) עקומות ריכוז-תגובה של ML161 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (טמפרטורת החדר). (B) עקומות ריכוז-תגובה של ML161 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (37°C). הנתונים הם אמצעים ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: מחקרי צפיפות תאים. צפיפות התאים האופטימלית היא 60,000 תאים לבאר בעת זריעה 16-24 שעות לפני תחילת הבדיקה. (A) עקומות ריכוז-תגובה של TFLLRN-NH2 בצפיפויות תאים שונות, n = 3. (B) עקומת ריכוז-תגובה של TFLLRN-NH2 בצפיפות תאים אופטימלית של 60,000 תאים/באר. הנתונים הם אמצעים ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: נפח המבחן. שימוש בנפח בדיקה של 100 μL יוצר יותר עקומות ריכוז-תגובה הניתנות לשחזור מאשר בדיקות המשתמשות בנפח סופי של 200 μL. (A) עקומות ריכוז-תגובה של ML161 ו- 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (נפח סופי של 200 μL). (B) עקומות ריכוז-תגובה של ML161 ו-5 מיקרומטר TFLLRN-NH2, n = 3 (נפח סופי של 100 מיקרוליטר). הנתונים הם אמצעים ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: יצירת גורמי Z כדי לקבוע את היכולת של הבדיקה לזהות תרכובת פגיעה. תגובות ניוד סידן עם 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2 (עמודה B) בתוספת אנטגוניסטים אופציונליים PAR1 10 מיקרומטר NRD-21 (עמודה C) או 0.316 מיקרומטר vorapaxar (עמודה D). (A) הבדיקה הושלמה 16 שעות לאחר זריעת התא. (B) הבדיקה הושלמה 24 שעות לאחר זריעת התא. (C) טבלת גורמי Z המחושבים באמצעות המשוואה הבאה: figure-results-9, כאשר σp היא סטיית התקן של הבקרה החיובית, σn היא סטיית התקן של הבקרה או המדגם השליליים, μp הוא הממוצע של הבקרה החיובית, ו- μn הוא הממוצע של הבקרה או המדגם השליליים. כל ערך מחושב על ידי ייעוד רכב + 6.5 מיקרומטר TFLLRN-NH2 כבקרה החיובית והשוואה למצב המצוין כבקרה שלילית (רכב) או מדגם (NRD-21 ו- vorapaxar). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 9: ניוד סידן מאגוניסט PAR2. שינוי פלואורסצנטי לאורך זמן המושרה על ידי 10 מיקרומטר SLIGKV-NH2, n = 4. הנתונים הם אמצעים ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מפת לוחות 96 בארות לדוגמה להקרנה מורכבת. כל ריכוז נמדד בשלשה. שורה A מכילה פקדים שליליים (ללא אנטגוניסט; ללא אגוניסט), ושורה B מכילה פקדים חיוביים (ללא אנטגוניסט; אגוניסט). עמודות 1 עד 3 מכילות שישה ריכוזי חצי יומן של הפרמודולין NRD-21 שניתן להשתמש בהם באופן אופציונלי לבקרת איכות. PM-A, PM-B, PM-C הם פרמודולינים ללא שם. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: השוואה בין פרוטוקול שפורסם בעבר לבין פרוטוקול חדש וממוטב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד פרוטוקול72 שדווח בעבר היה אמין בדרך כלל ואפשר לנו לזהות פרמודולין עופרת חדש, NRD-21,62 היה רצוי פרוטוקול יעיל יותר. הבדיקה נפגעה עוד יותר במהלך המחסור באספקה שנגרם על ידי מגפת הקורונה. השגת טיפים עבור המטפל האוטומטי בנוזלים הפכה לקשה, והניסיון לשטוף, לעקר ולעשות שימוש חוזר בטיפים יצר CRC עם שונות משמעותית. זה הקל על סדרה דחופה של ניסויים שנועדו לייעל בדיקת ניוד סידן משופרת מונעת PAR.

זיהוי חלופה תקפה לשימוש במטפל הנוזלים האוטומטי לשלבי שטיפה היה בראש סדר העדיפויות במחקר זה. במהלך פיתוח הבדיקה הקודמת, השימוש במטפל הנוזלי הרובוטי הפחית שגיאות שנגרמו על ידי חילופי מדיה ידניים. עם זאת, זה הוסיף זמן משמעותי לבדיקה, שכן חילופי התקשורת עם מטפל הנוזלים בן 8 הערוצים הגדילו את הזמן הכולל של כל צלחת בדיקה ב 30-45 דקות. למרות ששיטת "פליקינג" של חילופי מדיה נוסתה בעבר, ניסויים אלה נעשו מבלי לצפות את לוחות הבדיקה בג'לטין לפני זריעת תאים. על ידי טיפול בלוחות עם ג'לטין, התאים הובטחו להישאר במקומם ללא קשר לכוח המשמש להסרה ידנית של מדיה. CRCs שנוצרו בבדיקה באמצעות לוחות מצופים ג'לטין היו בעלי ציוני התאמה טובים יותר וקווי שגיאה קטנים יותר בנקודות נתונים מרובות מאשר עקומות שבהן נעשה שימוש במטפל האוטומטי בנוזלים (איור 4). ערכי שגיאת שורש-ממוצע-ריבוע (RMSE) עבור הלוח באמצעות המטפל האוטומטי בנוזלים היו 9.687 עבור עקומת ML161 ו-10.690 עבור עקומת NRD-21, בעוד שערכי RMSE עבור הלוח באמצעות ג'לטין והחלפת מדיה ידנית היו 7.658 עבור עקומת ML161 ו-6.408 עבור עקומת NRD-21. ערכי RMSE נמוכים יותר מציינים עקומה המתאימה יותר לנתונים הנתונים. שינוי זה גם מקטין מאוד את זמן הבדיקה הכולל. לחלופין, ניתן להשתמש במכונת כביסה אוטומטית רב-ערוצית.

שיטת החיבור האגוניסט הייתה גורם נוסף שנחקר. זה נעשה כדי לקבוע אם ניתן להוסיף אגוניסט לכל בארות הצלחת בו זמנית ולאחר מכן סריקה של הצלחת כולה בבת אחת; זה יבטל את הצורך של החוקרים להישאר ליד קורא הלוחות למשך הבדיקה הרגישה לזמן עבור תוספות אגוניסטיות נפרדות רבות, מה שיכול להגדיל את התפוקה באופן משמעותי. למרבה הצער, הוספת אגוניסט לכל הבארות וסריקת הצלחת כולה הייתה בעייתית, מכיוון שהתגובה מהירה מכדי למדוד באופן אמין את ריכוז הסידן המרבי הארעי בכל באר, מה שנותן CRC משתנה מאוד. הפחתת מספר העמודות שנסרקו מ-12 ל-6 שיפרה מעט את התוצאות, אך התוצאות הטובות ביותר נוצרו מסריקת שתי עמודות בלבד (16 בארות) בו זמנית. ניתן לשער כי הפחתת הטמפרטורה של הבדיקה מ 37 ° C לטמפרטורת החדר יכול להאט את השינוי בריכוז הסידן מספיק כדי לאפשר מדידות אמינות. למרות שפרוטוקולי ניוד סידן מרובים עם צבעים או קווי תאים שונים אומתו בטמפרטורת החדר78,79, בבדיקה ספציפית זו, תוצאות משופרות נצפות ב -37 מעלות צלזיוס. עקומות ריכוז-תגובת אנטגוניסט שנמדדו בטמפרטורת החדר (~23°C) לא היו אחידות כמו ב-37°C (איור 5A לעומת איור 5B). בגלל תוצאות אלה, נקבע כי סריקת שתי עמודות בכל פעם ב 37 ° C הוא אופטימלי.

משתנה נוסף שנבחן כדי להפחית את זמן הבדיקה היה זמן הדגירה של האנטגוניסט. בפרוטוקול הקודם, אנטגוניסטים הודגרו במשך 40 דקות לפני הוספת האגוניסט, אך כאן נקבע כי 15 דקות הן זמן מספיק לפרמודולינים כדי לתקשר עם PAR1. זה נבדק על ידי הוספת תמיסות פרמודולין למספר עמודות בו זמנית ואחריו הוספת אגוניסט בנקודות זמן שונות (אגוניסט נוסף ב t = 15 דקות, 30 דקות, ו 45 דקות). פעילות הפרמודולינים נשמרה, אך לא השתפרה, על ידי דגירה ארוכה יותר של האנטגוניסטים. כתוצאה מממצא זה, בפרוטוקול החדש, מתווספים תמיסות אנטגוניסטיות לכל הצלחת בבת אחת, ותמיסות אגוניסטיות מתווספות לעמודות הראשונות לאחר דגירה של 15 דקות. שינוי זה מקצר עוד יותר את זמן הניסוי הכולל ב-30 דקות. יש לציין כי אנטגוניסטים עם קינטיקה קשירה איטית, כגון vorapaxar, עשויים לדרוש זמני דגירה ארוכים יותר80,81.

בעוד שקיצור זמן הבדיקה וביטול ההסתמכות על המטפל בנוזלים היו הגורמים העיקריים שחייבו עדכון פרוטוקול הבדיקה, נבדקה גם שיטת תרבית תאים חלופית. בעבר, צלחות נזרעו עם תאים ישירות ממלאי קפוא והורשו לגדול בצלחות במשך 40-48 שעות לאחר הזריעה. עם זאת, הזמן הממושך בין זריעת לוחות לביצוע בדיקות הגביל את מספר הניסויים שניתן לבצע בכל שבוע. שימוש בתאים שגדלו בצלוחיות תרבית מפחית באופן דרסטי את הזמן הזה. התאים גודלו בצלוחיות T-75 שטופלו בתרבית רקמה והוסרו מפני השטח של הבקבוק באמצעות חומר דיסוציאציה של תאים שאינו אנזימטי. זה עשוי להיות חשוב כדי למנוע נזק לקולטנים מסוימים לפני השטח של התא, בפרט PAR2, עם טריפסין. לאחר הוספתם לצלחת הבדיקה, התאים זקוקים לזמן מספיק כדי להתיישב ולהיצמד לג'לטין. מכיוון ששיטת ההבהוב של הסרת מדיה יכולה גם להזיז תאים, נדרש מספיק זמן כדי לאפשר לתאים להיות מוטמעים בג'לטין. ניסוי שאיפשר לתאים להסתפק בשעתיים גרם לאובדן משמעותי של תאים, וכתוצאה מכך לבדיקה בלתי שמישה (הנתונים לא מוצגים). זמני התגבשות בין שעתיים ל -12 שעות מגבילים את מספר הצלחות שניתן לנתח ביום אחד, ולכן עדיף דגירה ארוכה יותר בלילה. נמצא כי דגירה של התאים החדשים בתרבית בכל מקום בין 16 שעות ל -24 שעות אפשרה לתאים להידבק באופן מלא לג'לטין, וניתן להשיג נתונים הניתנים לשחזור.

המעבר מתאים קפואים לתאים שגודלו בתרבית שינה גם את צפיפות זריעת התאים האופטימלית. כצפוי, זריעת בארות בצפיפות של 25,000 תאים/באר שהייתה סטנדרטית בפרוטוקול הקודם לא אפשרה לתאים להגיע למפגש עם זמן דגירה קצר יותר. CRCs אגוניסטיים נוצרו עם שמונה צפיפויות תאים נפרדות כדי לקבוע תנאים אופטימליים (איור 6). בעבר, TFLLRN-NH2 שימש כאגוניסט PAR1 ב 5 מיקרומטר, שכן זה איפשר אנטגוניזם סביר עם פרמודולינים מסיסות נמוכה יותר. אין הבדל משמעותי ברקע או באות המקסימלי בעת זריעה עם 45,000-65,000 תאים / באר, אך יש ירידה בשונות עם 5 מיקרומטר TFLLRN-NH2 בעת הוספת 60,000 תאים / באר. באופן מעניין, אין עלייה משמעותית בפלואורסצנטיות מקסימלית עם מספר גבוה יותר של תאים, ולכן 60,000 תאים / באר נבחרה כצפיפות האופטימלית בשל השונות המופחתת. אגוניסטים CRCs ייצרו גם EC50 של 6.5 מיקרומטר עבור TFLLRN-NH2, ולכן זה נבחר כריכוז האגוניסט הסטנדרטי החדש.

גורם נוסף שנותח היה הנפחים ששימשו בבדיקה. בפרוטוקול הקודם, 2 μL של אגוניסט נוסף לכל באר כדי לתת נפח בדיקה סופי של 200 μL. ההשערה הייתה שהוספת נפחים גבוהים יותר של תמיסה אגוניסטית – אך שמירה על ריכוז סופי קבוע – יכולה לסייע בערבוב, ולגרום לאות מהיר ואמין יותר. כדי לבחון השערה זו, הושוותה התוספת של 2 μL, 6 μL ו- 10 μL TFLLRN-NH2 לתוך 100 μL או 200 μL של HEPES-HBSS בצלחת בדיקה המכילה ריכוזים שונים של NRD-21. CRCs של NRD-21 מכל מצב נוצרו כדי לקבוע איזה שילוב של נפח אגוניסט ונפח הבדיקה הסופי נתן את הנתונים העקביים ביותר. בעוד שגם תוספות של 2 μL וגם 6 μL הביאו ליצירת CRCs עם שונות מועטה, לא ניתן לומר את אותו הדבר על עקומות שנוצרו מתוספת של 10 μL TFLLRN-NH2 (הנתונים לא מוצגים); העליות בפלואורסצנטיות לא היו עקביות בבארות אלה לא בסדר גודל ולא בתזמון, מה שמייצר CRCs שאמורים להיות זהים אך במקום זאת שונים באופן דרסטי. למרות שתוספות של 2 μL ו-6 μL הניבו תוצאות דומות, השינוי בפלואורסצנטיות התרחש הרבה יותר מהר עם תוספת של 6 μL של TFLLRN-NH2, שאפשרה לחתוך את המספר הכולל של סריקות בכל באר לחצי, מ-40 סריקות ל-20 סריקות. כמו כן נקבע כי שימוש בנפח סופי של 100 μL מייצר CRCs אחידים יותר בהשוואה לאלה שנוצרו עם נפח סופי של 200 μL (איור 7).

כדי לקבוע אם הפרוטוקול החדש מתאים למבחני תפוקה גבוהה יותר, חושבו גורמי Z לבדיקה (איור 8). פקטור Z היא שיטה סטטיסטית המודדת את איכותה של בדיקת סקר וקובעת אם בדיקה תבדיל באופן אמין בין חומרים פעילים ולא פעילים82. גורמי Z חושבו עבור בדיקות שבוצעו בין 16 ל-24 שעות לאחר זריעת לוחות, ובמעברי תאים שונים. בכל המקרים – הן עבור מצבי אגוניסט בלבד והן עבור מצבי אגוניסט פלוס אנטגוניסט – פקטורי Z המחושבים היו גדולים מ-0.5, מה שמעיד על מבחן מצוין82. גם גורמי Z המחושבים היו דומים לאלה שחושבו עבור הבדיקה הקודמת, מה שמצביע על כך שהשינויים שבוצעו בפרוטוקול כדי לייצר בדיקה מהירה יותר לא השפיעו לרעה על האיכות.

הפרוטוקול לניוד סידן מונחה PAR עודכן באמצעות ניסויים שהפיקו ערכי IC50 מ-CRC, אך ניתן להשתמש בבדיקה גם כדי למדוד את היעילות של אנטגוניסטים של PAR1 בריכוזים בודדים. הבדיקה יכולה לשמש גם למדידת הפעילות של ליגנדות PAR2; לדוגמה, האגוניסט PAR2 SLIGKV-NH2 יכול להחליף את TFLLRN-NH2 בפרוטוקול המעודכן (איור 9); הפרוטוקול הקודם שימש גם עם אגוניסטים PAR2 ואנטגוניסטים83. למרות שלא נבדק במפורש כאן, פרוטוקול זה צריך להיות ישים גם לתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC), אשר שימשו עם הפרוטוקול הקודם, ואולי גם קווי תאים דבקים אחרים. מגבלה לשימוש בקורא לוחות סריקה עם פרוטוקולים כמו זה היא שהם אינם מתאימים לחקר תגובות מהירות (תת-שניות), לפחות לא במקביל כפי שניתן עם מצלמת לוחות.

לסיכום, המדווח כאן הוא פרוטוקול מהיר ופשוט יותר עבור בדיקת ניוד סידן מונחה PAR אנדותל באמצעות קורא צלחות. על ידי ביטול הצורך בטיפול אוטומטי בנוזלים, קיצור זמן הדגירה של האנטגוניסט והקטנת מספר הסריקות עבור כל באר, זמן הבדיקה הכולל הופחת בלפחות 90-120 דקות, ועלויות הבדיקה הופחתו (להשוואה בין הפרוטוקולים שדווחו בעבר לבין הפרוטוקולים הנוכחיים, ראה טבלה 2). זה לא רק יאפשר סינון של תרכובות נוספות בכל יום, אלא גם מבטל את הסיכון של חלון בדיקה מופחת משטף צבע, מה שעלול להוביל לתוצאות לא אמינות. הבדיקה הממוטבת החדשה מאפשרת סריקה מהירה יותר בתאי אנדותל של ליגנדות PAR1 או PAR2, או ליגנדות GPCR אחרות המפעילות ניוד סידן תוך-תאי, במעבדות המוגבלות לשימוש בקוראי צלחות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.D. הוא ממציא פטנטים הקשורים לפרמודולינים והוא המייסד ובעל המניות של Function Therapeutics, Inc., המפתחת פרמודולינים לשימוש קליני.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לאיירין הרננדז, טרודי הוליסט, ד"ר הרטמוט ויילר (המכון לחקר הדם ורסיטי), וד"ר לגי ארנולד (אוניברסיטת ויסקונסין-מילווקי) על מתן מקום ותמיכה עקיפה לפרויקט זה, ולד"ר ג'ון מקורבי (המכללה הרפואית של ויסקונסין) על הייעוץ הרלוונטי. אנו מודים למכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R15HL127636), למשרד ההגנה של ארה"ב (W81XWH22101) ולקרן הלאומית למדע (2223225) על התמיכה במענקים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<ריאגנטים חזקים >תרבית תאים
דבקים תאי EA.hy926 ATCCCRL-2922
CellStripper מגיב דיסוציאציה של תאיםCorning25-056-CIניתן להשתמש באופן אופציונלי, אך בהחלט יש להימנע ממנו עם מבחני PAR2.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) עם פנול אדוםCorning10-013-CV
סרום בקר עוברי (FBS)Avantor97068-091
ג'לטין מעור חזירMilliporeSigmaG2500השתמשו להכנת תמיסה מימית של 0.4% (w/v) עם מים נטולי יונים. חיטוי לפני השימוש לעיקור.
עט/סטרפטוקוקוס (100X)קורנינג30-002-CI
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)קורנינג21-040-CV
טריפאן כחול (0.4% משקל/נפח)קורנינג25-900-CI
<ריאגנטים לגיוס סידן>
4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיאנסולפונית חומצה (HEPES)תרמו172571000
אלבומין בסרום בקר (BSA)Avantor97061-420
סידן כלוריד דיהידראטThermo42352-0250
דימתיל סולפוקסידThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (ללא Ca/Mg/פנול-אדום)קורנינג21-022-CV
מגנזיום כלוריד הקסהידראטMilliporeSigmaM2393
פלורוני F-127 (פולוקסמר 407)ספקטרום כימיP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
נתרן הידרוקסידVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (מלח TFA)הוכן על ידי טרודי הוליסט ב-Versiti Blood מכון מחקר
<חזק>חומרים
96-מטופלים היטב בתרבית, קירות שחורים, צלחת בדיקה תחתונה שקופהקורנינג3603עם מכסים שקופים
צינור צנטריפוגה, 15 מ"לAvantor89039-664
צינור צנטריפוגה, 50 מ"לAvantor89039-656
בקבוק תרבות, T-75קורנינג353136שטופל בתרבית רקמות
, 50 מ"לקורנינגRES-V-50-S
קורא צלחות EnspirePerkin Elmer
צינור מיקרוצנטריפוגה שהופסק, 1.5 מ"לAvantor20170-038
פיפטה פסטר, 9 אינץ'פישר13-678-6Bחייב להיות מעוקר
רצועת צינור PCR עם שטוח נפרד רצועות כובעAvantor76318-802
קצות פיפטה, 20 ומיקרו; LBiotix63300042סטרילי, קצוות מסוננים
קצות פיפטה, 200 ומיקרו; LBiotix63300044סטריליים, קצוות מסוננים
קצות פיפטה, 1250 ומיקרו; LBiotix63300047סטריליים ומסוננים טיפים
פריזמהGraphPadכרך 6 משומש
פיפטה סרולוגית, 5 מ"לTradewinds Direct  07-5005
פיפטה סרולוגית, 10 מ"לTradewinds Direct  07-5010
פיפטה סרולוגית, 25 מ"לTradewinds Direct  07-5025
מאגר ריאגנטים חד פעמי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4(2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582(2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, Pt 1 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597(2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062(2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124(2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100(2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23(2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516(2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PAR1Fluo 4Gq96

מאמרים קשורים