ייצור, תחזוקה וזיהוי של מודלים של דגי זברה נטולי חיידקים מזחלים ועד שלבים צעירים

המיקרוביוטה (כלומר, ארכאה, חיידקים, אאוקריה ווירוסים) ממלאת תפקיד מכריע בשמירה על בריאות המאכסן ותורמת להתפתחות מחלות שונות על ידי השפעה על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים באמצעות אינטראקציות סימביוטיות בתוך מחסום המעי, פני השטח של האפיתל ותפקודי מוצין אצל אנשים ^1,2,3. הרכב המיקרוביוטה בשלבי חיים שונים, מינקות ועד יובלה, בגרות והזדקנות, כמו גם נוכחותה במקומות שונים כגון אתרי נארס, פה, עור ומעיים, מעוצבים באופן דינמי על ידי סביבות ובתי גידול מגוונים⁴. מיקרוביוטת המעי באורגניזמים מעורבת בספיגת חומרי מזון, תגובה חיסונית, פלישת פתוגנים, ויסות מטבולי וכו^'5,6. מחקרים על מטופלים הראו כי שיבושים במיקרוביוטה של המעי קשורים להשמנת יתר אנושית, הפרעות שינה, דיכאון, מחלות מעי דלקתיות (IBD), מחלות נוירודגנרטיביות (פרקינסון, אלצהיימר), הזדקנות וסוגי סרטן שונים ^7,8,9. יתר על כן, מסלולים אינטראקטיביים בין מיקרוביוטת המעי לפונדקאים כוללים גורמים דלקתיים, מוליכים עצביים, מטבוליטים, מחסום מעיים ועקה חמצונית, כפי שנצפה במחקרים קודמים באמצעות מודלים של עכברים ודגים ^10,11.

לאחרונה, גישות או טיפולים רבים הקשורים לחיידקים, כולל פרוביוטיקה פוטנציאלית והשתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT), נחקרו עבור הפרעות אלה במודלים קליניים ובבעלי חיים. מחקרים אלה מבוססים על תגליות הקשורות לציר המיקרוביוטה-מעי-מוח/כבד/כליות, תוצרים שמקורם במיקרוביוטה ופעילות קולטנים משתנה^12,13. עם זאת, הפיתוח, התפקודים והמנגנונים השונים של מערכת המיקרוביוטה-פונדקאי עדיין אינם מובנים ומזוהים לחלוטין בשל המורכבות של קהילת החיידקים והאתגר של יצירת מודלים חזקים של מחלות דמויות אדם.

כדי להתמודד עם בעיות אלה, מודלים של בעלי חיים נטולי חיידקים (GF) הוצעו בדחיפות^{באמצע המאה} ה-19 ופותחו בעיקר במהלך המאה^ה-20. שכלולים מאוחרים יותר, כולל מודלים גנוטוביוטיים וטיפולים אנטיביוטיים, יחד עם התקדמות בטכנולוגיות זיהוי ותצפית מיקרוביאליות, שכללו עוד יותר את המודלים האלה 14,15,16. חיות GF, שנוצרו על ידי מחיקת הרקע שלהן והימנעות ממיקרובים סביבתיים, מציעות אסטרטגיה מצוינת לחקר יחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים למארחים שלהם¹⁷. באמצעות יישום מודלים של בעלי חיים ופרוטוקולים מעודנים, חוקרים הצליחו לשחזר הרכבים מיקרוביאליים דומים שנמצאו בחולים בעכברי GF ובדגים. בנוסף, מודלים אחרים של חיות GF, כגון כלבים, תרנגולות וחזירים, מספקים אפשרויות מגוונות כמושאי מחקר 18,19,20,21. גישה זו אפשרה לחקור את ההשפעות הטיפוליות האפשריות של מיקרוביום קומנסלי על מחלות שונות, כולל אימונותרפיה לסרטן בבני אדם ^16,18. מודלים של GF מציעים תובנות מדויקות יותר לגבי המאפיינים והמנגנונים של התיישבות חיידקים ספציפיים, נדידה, כפל ואינטראקציה בתוך פונדקאים. זה מספק תובנות חדשות חיוניות על התרחשות ופיתוח של מחלות הקשורות למיקרוביוטה^22,23. ההיסטוריה של הקמה ויישום של דגי זברה GF במחקר מיקרוביאלי התפתחה מהדוחות של Rawls et al. בשנת 2004 ו- Bates et al. בשנת 2006 לפרוטוקול של Melancon et al. בשנת 2017 16,24,25. עם זאת, ההיתכנות של מודלים GF בוגרים או רבייה היא עדיין תהליך ממושך, מלווה בתוחלת חיים משתנה, שיעורי הצלחה ואתגרים בריאותיים.

בין מודלים שונים של בעלי חיים, דג זברה (Danio rerio) בולט ככלי קריטי למחקר בסיסי וביו-רפואי כאחד בשל הדמיון המועיל שלו לאיברים אנושיים ולגנומיקה, מחזור התפתחות קצר, פריון גבוה ועוברים שקופים^19,26. דגי זברה, המשמשים כמודלים אמינים של מחלות אנושיות, מציעים ייצוג חזותי של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים in vivo, ומספקים תובנות לגבי התכונות האטרקטיביות של אינטראקציות בין מיקרואורגניזמים מארחים. יש לציין כי לדגי זברה יש שושלות תאים נפרדות, המאפשרות הדמיה של פיזיולוגיה של המעי, דינמיקה מיקרוביאלית, גונדות והתפתחות רבייה, הבשלה של מערכת החיסון של המאכסן, התנהגות ומטבוליזם²⁷. עוברי דגי זברה מתפתחים בתוך כוריות הגנה עד הבקיעה, והופכים לזחלים לאחר 3 ימים לאחר ההפריה (dpf). הם צדים באופן פעיל מזון ב 5 dpf ומגיעים לבגרות מינית סביב 3 חודשים לאחר ההפריה (mpf)²⁸. דג הזברה המוצלח הראשון ללא חיידקים (GF), שדווח על ידי Rawls et ^al.24, הראה כי זחלים שניזונו ממזון אוטוקלאבי לאחר ספיגת החלמון הציגו נמק רקמות מ- 8 dpf ומוות כולל ב- 20 dpf. זה הצביע על ההשפעות של דיאטה או על החשיבות של התחשבות באספקת חומרים מזינים אקסוגניים בניסויים הכוללים דגים לטווח ארוך (>7 dpf) GF²⁹. מחקרים מאוחרים יותר שיפרו את פרוטוקול הייצור של דגי GF, תוך שימוש במזון סטרילי ובשיטות ששוכללו במודלים שונים של דגים¹⁶.

עם זאת, רוב המחקר על מודלים של דגי זברה GF התמקד בשלבי חיים מוקדמים, הכוללים זיהום חיידקי ב 5 dpf במשך 24 שעות עד 48 שעות, עם דגימות שנאספו לפני 7 dpf בסיום הניסויים 25,30,31. ידוע כי המיקרוביוטה באורגניזמים, כולל בני אדם ודגי זברה, מאוכלסת בתחילת החיים ומעוצבת במהלך גדילה והתפתחות. ההרכב נשאר יציב בשלבים בוגרים, כאשר תפקידי המיקרוביוטה בפונדקאי הם קריטיים לאורך החיים, במיוחד בהזדקנות, ניוון עצבי, השמנת יתר מטבולית ומחלות מעיים³. לפיכך, פרספקטיבות של חיות GF עם הישרדות ארוכה יותר יכולות לספק תובנות לגבי המנגנונים של תפקידים מיקרוביאליים בהתפתחות איברים מארחים ותפקודם, בהתחשב במערכות החיסון והרבייה הלא בשלות של זחלי דגים בתחילת החיים. בעוד זני חיידקים במעיים של דגי זברה בודדו וזוהו במחקרים קודמים, והציעו את הפוטנציאל להדבקת מודלים של GF בבעלי חיים לבחירת פרוביוטיקה או לחקר תפקודי חיידקים בפונדקאי^19,25, הדור והיישום של מודלים של דגי GF הוגבלו בעיקר לשלבי חיים מוקדמים. מגבלה זו, המיוחסת לתהליך הייצור המורכב, עלויות תחזוקה גבוהות ובעיות הקשורות למזון ולמערכת החיסון, מעכבת את מאמצי המחקר שמטרתם לחקור את ההשפעות ההתפתחותיות והכרוניות של מיקרוביוטה בפונדקאי.

שיעור ההישרדות, ההתנהגות, הגדילה, ההתבגרות והבריאות הכללית של דגים, במיוחד במודלים נטולי חיידקים (GF), מושפעים באופן משמעותי מהרגלי האכלה, הכוללים צריכת תזונה וספיגה במהלך תקופת פתיחת הפה מהזחלים המוקדמים ועד הצעירים^32,33. עם זאת, אחד האתגרים בגידול דגי GF הוא המחסור בתזונה סטרילית מתאימה, המגביל את יעילות התמיכה התזונתית לקיום הצמיחה וההישרדות של הזחלים. פתרון בעיה זו חיוני לשיקום חייהם של דגי GF, בהתחשב במנגנוני ההגנה ההתפתחותיים שלהם וביכולות העיכול החלשות שלהם עקב היעדר מיקרוביום במעי. מבחינת מזון, שרימפס מלח חי (Artemia sp.) מתגלה כתזונה המתאימה ביותר לזחלים פתוחים לפה לדגים צעירים. נצפה כי דגים הניזונים מחסילוני מלח חיים מפגינים שיעורי גדילה והישרדות גבוהים יותר בהשוואה לאלה הניזונים מחלמון ביצה מבושל או פיתיונות טבעיים וסינתטיים אחרים³⁴. בעוד שמודלים מוקדמים של דגי GF יכולים לשרוד עם תמיכה בחלמון ומודלים של זחלי GF יכולים להישמר עם הזנה סטרילית, יצירת מודלים ארוכי טווח מזחלים לצעירים והגעה לבגרות מינית נותרה מאתגרת. בנוסף, מזון פתיתים או אבקה מוגבל על ידי הרכב תזונתי לא שוויוני ויכול להשפיע על איכות המים. לעומת זאת, לארטמיה חיה יתרונות כגון הישרדות הן במלח והן במים מתוקים, גודל קטן המתאים לזחלים לבוגרים, קלות האצווה ואיכות בקיעה גבוהה יותר³⁵. בהתבסס על שיטות קודמות 16,24,30, פישטנו את תהליך הטיפול המורכב והתמודדנו עם אתגר הדיאטה על ידי ביסוס GF לחיות ארטמיה sp. מודגר בקלות כמזון סטרילי לפרקי זמן ארוכים יותר מאשר דגי GF בתחילת החיים.

מחקר זה מציג פרוטוקול אופטימלי המכסה (1) דור, (2) תחזוקה, (3) זיהוי קצב סטרילי, ו-(4) תחזוקה והזנה כדי להבטיח צמיחה של דגי זברה נטולי חיידקים (GF) מעוברים לזחלים ולשלבים צעירים. התוצאות מציעות ראיות ראשוניות על בקיעה, הישרדות, גדילה וסטריליות של דגי זברה GF, יחד עם מדדים חיוניים עבור GF Artemia sp. כמזון סטרילי. השלבים המפורטים ביצירת מודלים והכנה של מזון חי סטרילי מספקים תמיכה טכנית חיונית לבנייה ויישום של מודלים ארוכי טווח של דגי GF, כמו גם GF Artemia sp. במחקר אינטראקציה מיקרוביוטה-מארח. הפרוטוקול מתייחס לבידוד, זיהוי וזיהום חיידקים במודלים של דגי GF, מתווה שיטות לתיוג פלואורסצנטי חיידקי וצפייה בהתיישבות שלהם במעי דגים תחת מיקרוסקופ. דגי GF, דגים גנוטוביוטיים עם זיהום חיידקי, או מודלים של מיקרוביוטה אנושית מועברת יעברו גילויים שונים כדי להבהיר את תפקידיהם והשפעתם על חסינות המאכסן, העיכול, ההתנהגות, ויסות השעתוק וההיבטים המטבוליים. בטווח הארוך, פרוטוקול זה יכול להיות מורחב למיני דגים שונים מסוג בר, כגון מדאקה ימית, ואולי גם לקווי דגי זברה טרנסגניים נבחרים אחרים הקשורים לרקמות או מחלות ספציפיות.

ניסויי הדגים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בצ'ונגצ'ינג והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית צ'ונגצ'ינג, סין, כמו גם התקנים לבעלי חיים ניסיוניים שהונפקו על ידי לשכת המדינה לאיכות ופיקוח טכני (מזהה אישור: GB14922-2001 עד GBT14927-2001). דגי זברה (Danio rerio, סוג בר, זן AB) הופקו מהמכון להידרוביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, ונשמרו במעבדה בעקבות נהלים³⁶ שדווחו בעבר.

1. תחזוקת דגי זברה בוגרים ואיסוף עוברים

הערה: בהסתמך על שינויים ממחקרים קודמים ומדוחות 16,37,38,39, התחזוקה של דגי זברה בוגרים, גידול זחלים ושיטות למודלים נטולי חיידקים (GF) במעבדה שלנו בוצעו בעקבות השלבים המתוארים להלן. מערכת זרימה טהורה במיוחד לגידול דגים הושגה באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). המים, המתוחזקים עם pH מאוזן, מלח ואלקלי, עוברים סינון במהלך הרכיבה כדי להבטיח תנאים נקיים.

1. שמור על דגים בוגרים עם ההליך הסטנדרטי הבא במערכת המחזור האוטומטי (ראה טבלת חומרים) עם פוטו-תקופה של החשיכה: אור = 10 שעות: 14 שעות ב 28 ° C ± 0.5 ° C ומוזן עם ארטמיה דגירה טרייה sp. פעמיים ביום.
2. הכניסו את דג הזברה הבוגר בבגרותו המינית (זכר: נקבה = 2:1) למכלים עם מים מתוקים ונקיים בלילה הקודם.
3. תנו לדגים להשריץ למחרת בבוקר (בסביבות 8:30 בבוקר) תחת גירוי אור קבוע במעבדה. לאחר 1-2 שעות, להעביר את הדג למיכל אחר.
4. אספו את העוברים למים ממערכת המחזור האוטומטי כאמצעי גידול בצלחת תרבית באמצעות פיפטה חד פעמית של פסטר.

2. יצירת דגי זברה GF מעוברים לזחלים

הערה: התהליך ליצירת דגים נטולי חיידקים (GF) מתואר באיור 1, בעוד שהאינדקסים ההתפתחותיים הבסיסיים של מודלים קונבנציונליים (CR) ו-GF מוצגים באיור משלים 1. אנא עקבו אחר השלבים המפורטים להלן בארון בטיחות ביולוגי או מכסה מנוע זרימה למינרית באמצעות טכניקה אספטית סטרילית בחדר נקי.

1. לשטוף את העוברים באמצעות מי תרבית דגים ולהסיר את הצואה, זיהומים וביצים מתות או לא מופרות.
2. העבירו את העוברים בטמפרטורה של 2 HPF לצלחות מעוקרות (עד 480 עוברים לצלחת סטרילית בקוטר 10 ס"מ) מלאות בתמיסה ובתרבית של דגי זברה נטולי חיידקים אנטיביוטיים (AB-GZM, ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 28.5°C למשך 6-8 שעות.
   הערה: AB-GZM משמש לטיפול בעוברים במשך מספר שעות כדי לחסל את מיקרואורגניזמים פני השטח, ו- GZM ללא אנטיביוטיקה משמש לתרבית דגי GF בתת-רצף. בדרך כלל, זמן התרבות המושלמת הוא 6 שעות).
3. לא לכלול ביצים עם כתמים לבנים או מראה לבנבן, ובחר את אלה מפותחים בדרך כלל, הצגת מעטפות שקופות ושלמות לעיבוד נוסף.
4. יש לשטוף את העוברים באמצעות AB-GZM שלוש פעמים בתוך 10 דקות.
5. השרו את העוברים בתמיסת פובידון-יוד (PVP-I) במינון 0.2 גרם/ליטר למשך דקה אחת (ראו טבלת חומרים).
   הערה: ריכוז גבוה יותר ומשך זמן ארוך מ-2 דקות ישפיע על שיעור התמותה והבקיעה של עוברים.
6. שטפו את העוברים באמצעות מדיום דג זברה ללא חיידקים (GZM) שלוש פעמים תוך 10 דקות.
7. הוסף עוברים לתמיסת עבודה של נתרן היפוכלוריט (NaClO), כסה היטב את צינורות המיקרוצנטריפוגות של 50 מ"ל והלבין למשך 15 דקות. במהלך תקופה זו, להשעות את העוברים בתמיסת אקונומיקה על ידי ניעור עדין שלהם.
8. שטפו את העוברים באמצעות GZM שלוש פעמים תוך 10 דקות.
9. מעבירים את העוברים לצלחות סטריליות בנות 6 בארות עם 5 עוברים ו-10 מ"ל GZM לבאר. תרבית אותם בפלטפורמה נקייה במיוחד או אינקובטור עם photoperiod של כהה: אור = 10 שעות: 14 שעות ב 28 ° C ± 0.5 ° C. צפיפות התרבית תשפיע על קצב סטרילי.
10. לחדש את מדיום התרבית מדי יום על ידי הסרת GZM משומש, איסוף אותו כדגימות לזיהוי סטטוס סטרילי, וחידוש כל באר עם אותו נפח של GZM סטרילי.
11. רשום את המדדים ההתפתחותיים הבסיסיים של עוברים/זחלים GF, כולל שיעור הישרדות, קצב בקיעה, פעימות לב, אורך גוף ומשקל וכו '¹⁹.
12. מעבירים את דגי ה-GF למכלים מתאימים (כלים, צלוחיות תרבית תאים, או בקבוקי זכוכית עם כיסויים) עם נפח מורחב, ומספקים מזון סטרילי לאורך כל תהליך הגידול.

3. תחזוקת דגי זברה GF מזחלים ועד צעירים

1. לחדש את GZM ללא הזנה לפני 7 dpf ולזהות מדי יום את המצבים סטריליים (ראה שלב 5).
2. האכילו את זחלי דגי הזברה מ-8 dpf ועד לשלבים צעירים בחלמון ביצה סטרילי (10 μL תמיסת מלאי מוכנה לכל באר) פעם ביום לפני החלפת GZM.
3. להאכיל צעירים GF מ 14 dpf עם חלמון ביצה מעוקר מעורבב עם GF Artemia sp. פעם ביום (1-3 ארטמיה / זחלים, ראה שלב 4), בהדרגה להגדיל את מסת המזון עם הצמיחה וההתפתחות של דגי GF.
4. ספקו חלמון עד שכל הדגים יוכלו לצרוך ארטמיה נאופלי.
   הערה: GF Artemia צריך לעבור בדיקת סטריליות לפני השימוש. העריכו את מספר הארטמיה נאופלי שנותרה, צפו במרדף ובלכידת ההתקדמות, ובחנו את גוף הדג עם המזון הנצרך כדי להצביע על הצלחת ההאכלה.
5. מ 28 dpf עד שלבים בוגרים מוקדמים, להאכיל GF ארטמיה פעם ביום (3-5 ארטמיה / זחלים) ולנקות ארטמיה לא מנוצל או מת, ודגים מתים לתוך GZM פסולת כמו דגימות יומיות.
6. במהלך גדילת דגי GF, שנה את צלחות 6 הבארות לאחר 7 dpf לצלחות סטריליות או צלוחיות תרבית תאים מ 8 ל 21 dpf, ולאחר מכן לבקבוקים סטריליים לאחר 21 dpf. הגדלת מדיום התרבות ומסת המזון בהתאם למספר ומשקל דגי GF בכל מיכל.
7. חדש GZM מדי יום ובדוק דגימות כדי להבטיח את ההצלחה של דגמי GF.
   הערה: שמירה על מודלים של דגים נטולי חיידקים (GF) עד לבגרות מוקדמת ובגרות מינית היא מאתגרת, עם שיעור הישרדות ממוצע נמוך של 30 dpf, בדרך כלל פחות מ -10%. זה מיוחס בעיקר חסינות חלשה, התפתחות מאוחרת, ותפקוד מעיים לקוי.

4. הכנת GF Artemia nauplii כמזון סטרילי לדגי GF כרוניים

הערה: שיטת הגידול וההכנה של ארטמיה נטולת חיידקים (GF) מתוארת באיור 2. שימו לב שכל השלבים הבאים מתבצעים בארון בטיחות ביולוגי, בטכניקה אספטית סטרילית.

1. יש לשטוף 0.25 גרם של ציסטות ארטמיה באמצעות 2.4 גרם / ליטר היפוכלוריט נתרן (NaClO, ראה טבלת חומרים) במשך 5 דקות.
2. מסננים את ציסטות ארטמיה השטופות בפילטר מעוקר וצפוף במיוחד (כ-170 רשתות בצמצם) ושוטפים במים אולטרה-טהורים מעוקרים שלוש פעמים, בכל פעם למשך 1-2 דקות.
3. מעבירים את ציסטות ארטמיה שטופות לתוך 100 מ"ל של 2.5% מים מלוחים מעוקרים, מערבבים וארוזים לבקיעה אספטית בהתאם לשלבים המוזכרים להלן.
4. ארזו את תמיסת תערובת הציסטות ארטמיה שטופלה ב-50 מ"ל לתוך בקבוק סטרילי בנפח של 100 מ"ל, אטמו אותו בסרט ודגרו באינקובטור רועד ב-150 סל"ד, 30 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות עד 24 שעות עם אור.
5. מוציאים כ-30 מ"ל של ארטמיה נאופלי בוקעת מהשכבות האמצעיות והתחתונות באמצעות פיפטה חד פעמית.
   הערה: יש למנוע מביצים צפות ומקליפות ריקות להגיע לשכבה העליונה. האינדקסים של ארטמיה נטולת חיידקים (GF), ציסטות ונאופלי שהודגרו במשך 24 שעות מוצגים באיור 3.
6. סננו את הארטמיה עם פילטר מעקר ושטפו אותם בכוס עיקור עם מים אולטרה-טהורים מעקרים שלוש פעמים, בערך 30 שניות עד דקה לכל פעם. לבסוף, להוסיף 4 מ"ל של מים מעוקרים ultrapure כדי להכין את התמיסה המעורבת ארטמיה .
7. בעזרת פיפטה חד פעמית של פסטר, שולפים ארטמיה שוחה באופן פעיל מהשכבה העליונה, שוטפים ומכינים את תמיסת הנאופלי להאכלה וזיהוי אספטי.

5. זיהוי מודלים של דגי GF בכל שלבי החיים

הערה: לאורך כל שלבי החיים של דגים נטולי חיידקים (GF), אינדקסים מרכזיים וזיהוי דגימות יומי הם חיוניים כדי להבטיח את הצלחת המודלים. שלב זה מסכם את הסיווג הנפוץ של הדגימות ואת שיטות הזיהוי המקובלות (איור 4).

1. שימו לב וספרו את מצב ההישרדות והקצב של זחלי זברי GF מדי יום. בניסויים לחישוב שיעורים קשורים, דגי GF מתורבתים בצלחות של 24 או 48 בארות עם דג אחד בכל באר.
   1. שיעור הישרדות = (מספר דגים חיים בזמן התצפית / מספר כולל של ביצים) × 100%.
   2. שיעור העקרות = (מספר הדגים הסטריליים / מספר הדגים ששרדו) × 100%.
      הערה: פרוטוקול זה מתמקד בקצב הסטרילי של דגים חיים. מספר הדגים הסטריליים נקבע על ידי ספירת דגי GF מוצלחים לאחר בדיקות מרובות בין הדגים החיים. כל דג מת או דגים חיים GF מודלים שנכשלו עקב נוכחות חיידקים מסולקים במהלך הליכי GF הבאים.
2. אסוף את הדגימות הבאות של זחלי זברה GF.
   1. מדיום תרבית של דגי זברה GF מכל באר או מכל בקבוק.
   2. מזון דגים, כגון חלמון ביצה סטרילי וארטמיה GF.
   3. מדיום פסולת, כולל שברי קרום הביצים לאחר הבקיעה ושאריות מזון או צואה בתקופות ההאכלה מזחלים ועד דגים צעירים.
   4. דגימות דגים מתים כדי לזהות נוכחות של חיידקים.
   5. מדיום דגים וחומרים המשמשים לטיפול בעוברים כבקרה סטרילית.
   6. דוגמאות מחומרים, פלטפורמת הפעלה, חממה וכו'.
3. זהה דגימות שנאספו מדי יום במספר שיטות.
   1. ראשית, השתמש בשיטת צלחת התפשטות וצלחות תרבית באינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס.
      1. ציפוי עם 20-50 μL של פסולת מדגם בינוני על צלחת Trypticase סויה אגר (TSA) (ראה טבלה של חומרים) בתנאים אירוביים.
      2. ציפוי עם 20-50 μL של פסולת מדגם בינוני על צלחת TSA בתנאים אנאירוביים.
      3. ציפוי עם 20-50 μL של פסולת מדגם בינוני על לוחות TSA הדם (ראה טבלה של חומרים) בתנאים אירוביים.
      4. מעיל עם 20-50 μL של פסולת מדגם בינוני על צלחות TSA הדם בתנאים אנאירוביים.
   2. שנית, השתמש בשיטת התרבית הנוזלית.
      1. קח 200 μL של דגימה לתוך צינורות אירוביים עם Brain Heart Infusion Broth (BHI) בינוני (ראה טבלה של חומרים) ותרבית באינקובטור רועד ב 30 ° C, 150-180 סל"ד.
      2. הוסף 200 μL של דגימה לתוך צינורות אנאירוביים עם מדיום BHI ותרבית באינקובטור ב 30 ° C.
      3. הוסף 200 μL של דגימה לתוך צינורות אירוביים עם מדיום מרק סויה טריפטיקס (TSB), ולאחר מכן תרבית באינקובטור רועד ב 30 ° C, 150-180 סל"ד.
      4. הוסף 200 μL של דגימה לתוך צינורות אנאירוביים עם מדיום TSB ותרבית באינקובטור ב 30 ° C.
   3. שלישית, השתמש בטכניקות מולקולריות-16s פולימראז תגובת שרשרת (PCR) assay.
      1. נתחו את דגימת השפכים בעזרת שני זוגות פריימרים 27F ו-1492R, וכן 63F ו-1387R (טבלה 1).
         הערה: תערובת האב של ה-PCR הוכנה לפי טבלה 2 באמצעות ערכת DNA פולימראז מסחרית (ראה טבלת חומרים), ומכונת ה-PCR הוגדרה עם התוכנית שצוינה בטבלה 3.
      2. לאחר השלמת תוכנית ה- PCR, בדוק את המוצרים על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז⁴⁰ 1% ברצועות מטרה של 1465 bp (באמצעות פריימרים 27F ו- 1492R) או 1324 bp (באמצעות פריימרים 63F ו- 1387R) כדי להסיק את סטריליות הדגימות.
4. תעד והתבונן בבדיקות סטריליות, כולל צלחת ותרבית בינונית מ 24 שעות עד 3 ימים ו -7 ימים, שבמהלכם אין מושבה על צלחות ואין עכירות בנוזל מעידים על בנייה מוצלחת של דגמי GF. התבונן והקלט את הצלחת ואת המדיום ב 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות, 120 שעות, 144 שעות ו -168 שעות.

6. זיהוי דגימות ארטמיה GF לפני האכלה מדגי GF

הערה: כדי לזהות את דגימות ארטמיה GF, שהן חיוניות כמזון חי לפני שהן ניזונות מדגי GF (איור 4), בצע את השלבים הבאים.

1. איסוף דגימות של דגמי GF Artemia .
   1. ציסטות ארטמיה לא מטופלות.
   2. טופל ציסטות GF ארטמיה .
   3. בקע GF ארטמיה nauplii.
   4. מים אולטרה-טהורים מעוקרים כבקרה.
2. זהה ארטמיה GF בשיטות הבאות.
   1. השתמש בשיטת צלחת התפשטות כדי לזהות את הדגימות על ידי ציפוין על צלחות TSA וצלחות TSA בדם בתנאים אירוביים ואנאירוביים. לדגור אותם ב 30 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש בתווך נוזלי כדי לזהות את הדגימות בצינורות TSB ו- BHI אירוביים ואנאירוביים. תרבית בשייקר ב 150-180 סל"ד, 30 מעלות צלזיוס.
   3. השתמש בבדיקת PCR כדי לזהות נוכחות של חיידקים בדגימות שנאספו באמצעות 16s RNA ריבוזומלי מטרות גנים פריימרים 27F ו 1492R, 63F ו 1387R (טבלה 1). אמצעי האחסון והתוכנית מוצגים בטבלה 2 ובטבלה 3.
3. רשום את התוצאות: זהה את מוצר ה- PCR באלקטרופורזה ג'ל אגרוז⁴⁰ של 1% עבור רצועות מטרה בגודל 1465 bp (באמצעות פריימרים 27F ו- 1492R) או 1324 bp (באמצעות פריימרים 63F ו- 1387R). התוצאות של צלחות ומדיום נוזלי יכולות להבטיח את הסטטוס הסטרילי של ארטמיה GF לפני השימוש בו כמזון דגים GF.

7. בידוד וזיהוי זני חיידקי מעיים מדגי זברה

הערה: כדי לחקור את תפקודי המעי במבחנה וב-in vivo, יש צורך לבודד זני חיידקים מדגי זברה, אשר גם מספקים את מקור הזנים לפרוביוטיקה פוטנציאלית שנסקרת על-ידי זיהום באמצעות חיות GF (איור 5). בפרוטוקול זה, אנו מתארים את שיטת הדיסקציה המסורתית להשגת תכולת מעיים, בעוד שניתן לאסוף את הדגימות ישירות מדגים מורדמים חיים (הנתונים אינם מוצגים).

1. בחרו בדגי זברה בוגרים בריאים ושטפו אותם במים סטריליים. בצע את השלבים הבאים בספסל הנקי.
2. מרדימים את הדג עם 100 מ"ג / ליטר MS-222 למשך 5-10 דקות.
3. השתמשו ב-75% אלכוהול לטיפול בפני השטח של גוף הדג.
4. לנתח את מעיים דגים extrude את תוכן המעי עם TSB או BHI בינוני.
5. לדגור על סופרנאטנט המעי על ידי מריחת TSA, צלחת הדם, TSB ומדיום BHI בתנאים אירוביים ואנאירוביים.
6. תרגם את החיידקים כדי לקבל את זן האות ולהקליט את המאפיינים של מושבות שונות.
7. לאחסן את החיידקים בתוך 30% גליצרול ב -80 ° C.
8. לאחר מכן, זהה את חיידקי המעי על ידי מיצוי DNA גנומי וריצוף PCR.
   הערה: השלבים העיקריים של מיצוי DNA גנומי חיידקי כוללים צנטריפוגה נוזלית, דיסוציאציה של RNase A ופרוטאז K, מיצוי אלכוהול אתילי, שטיפה והמסה באמצעות ערכות זמינות מסחריות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
9. נתח את רצפי 16S באמצעות המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI) וכלי חיפוש יישור מקומי בסיסי (BLAST) עם מסד הנתונים חיידקים וארכאונים^40,41 (ראה טבלת חומרים).
10. בחר את החיידקים והתווים המתאימים ביותר כדי לזהות את זני המעי המבודדים ברמת הסוג.
11. זהה את התפקודים המטבוליים של זני חיידקים באמצעות ערכות זמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים).

8. תווית שפעת, זיהום והתיישבות חיידקים במעיים של דגי זברה GF

הערה: לפני הדבקת דגי זברה GF, החיידקים המבודדים שונו באמצעות צבעים ונספרו, מה שגרם להתיישבות ולנדידת חיידקים להיראות ברציפות ו-in vivo (איור 6).

1. בחר חיידקים מועילים פוטנציאליים או זנים דומיננטיים עם שפע גבוה בפונדקאי כדי להדביק את דגמי דגי GF.
   הערה: החיידקים ששימשו במחקר זה היו Aeromonas sp. ו-Vibrio sp. (ראו טבלת חומרים), שנבחרו מתוך 8 סוגים שבודדו וזוהו מדגי זברה בוגרים מסוג בר במעבדה⁴².
2. תייגו את החיידקים הטריים בצבעי CM-Dil (ראו טבלת חומרים) וחשפו אותם לדגי זברה GF בריכוז של 10 6-10⁸ יחידות יוצרות מושבה (CFUs)/מ"ל.
3. התבונן בפלואורסצנטיות תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי עם הגדלה של 3× כדי להצביע על התיישבות והפצה של חיידקים במעיים של זחלי זברה GF מ 6 dpf ו 14 dpf.
4. ספור ידנית את מספר החיידקים בדגי GF לפי תרבית צלחת בכל נקודת זמן.
5. זהה את המושבות והרצפים כדי לוודא שהזיהום היה מוצלח עם זני חיידקי המטרה.
6. איסוף דגימות של דגי GF עם זיהום חיידקי לבדיקות הבאות, כולל התנהגות עצבית, אינדקסים התפתחותיים, ניתוח היסטופתולוגי ומדידות הורמונים וכו '43,44,45.
   הערה: החיידקים המשמשים בניסוי הזיהום צריכים להיות מוחלמים חדשים ותרבית טרייה על ידי המדיום הנוזלי.

ניתן לייצר ביעילות את דגמי דגי הזברה GF על ידי ניצול שפע הביצים שהושרצו על ידי זוגות דגי זברה, כאשר הפרוטוקול מותאם למודלים קודמים של דגי GF35. צלחת אחת בת 6 בארות יכולה לגדל כ-30-48 עוברים/זחלים, מה שמאפשר איסוף נתונים נרחב וניתוח סטטיסטי. לאחר טיפול סטרילי, עוברי GF מתורבתים באינקובטור נקי עד לבקיעה לזחלים לאחר 48-72 שעות, ומשנים GZM מדי יום עם איתור הדגימות שנאספו, דבר חיוני לשמירה על מצב נקי מחיידקים (איור 1). לאחר 7 dpf, המזון של חלמון ביצה וארטמיה חיה צריך להיות מוכן עבור זחלים לשלבים צעירים. במהלך הצמיחה וההתפתחות של דגים, הנפח, המיכל והצפיפות של GZM צריכים להיות מווסתים או משתנים בזמן כדי למנוע מוות וכישלון של מעמד סטרילי. אם הגילוי אינו מראה זיהום חיידקי, ניתן לשמר את המודלים המוצלחים של GF ככרוניים מגיל צעיר ועד בגרות מוקדמת, אך שיעור ההישרדות נמוך בהרבה בפועל. לבסוף, ניתן למדוד את הקצב הסטרילי, שיעור ההישרדות, מדד ההתפתחות, ההתנהגות, הניתוח ההיסטופתולוגי ופרופיל השעתוק של מודלים של דגי GF ו-CR כדי לחקור את ההשפעה של שדות מיקרוביוטה ומסכי תרופות. במחקר זה הושוו המדדים ההתפתחותיים העיקריים (איור משלים 1), ושיעור הבקיעה של דגי GF היה נמוך ב-45.7% מדגי CR, עם 60% ב-72 כיפות. קצב הלב של זחלי GF ב-7 dpf היה נמוך משמעותית ועמד על 18.2 פעימות ל-10 שניות בהשוואה לדגי CR עם 22.6 פעימות ל-10 שניות, אך לא היה הבדל בין שתי הקבוצות ב-14 dpf עם שיעורים של 23.5-23.8 פעימות ל-10 שניות. שיעור ההישרדות של דגי GF ב-7 dpf היה זהה לזה של דגי CR ב-86.7%, אך ירד ל-60% ב-14 dpf בהשוואה ל-80% בדגי CR. עם זאת, שיעורי ההישרדות של דגי GF ו-CR ירדו ל-25%-10% לאחר תקופת פתיחת הפה, כאשר הם רכשו יכולות או הרגלים של האכלה. הכישלון לשמור על מעמדם הסטרילי של הדגים היה אחת הסיבות לשיעור ההישרדות הנמוך יותר. לכן, האכלה ותחזוקה תזונתית משלבי הנעורים ועד לבגרות המוקדמת הם אתגרים קריטיים בגידול דגים.

גורם מפתח נוסף המשפיע על גדילה והתפתחות של דגים הוא האכלה. במחקר הזה אנו חוקרים שיטות רבות להשגת ארטמיה GF כמזון חי עבור זחלי זברה GF ארוכי טווח לצעירים ובוגרים (תהליך שמוצג באיור 2). בשל השימוש היומיומי במזון לדגי GF, הפרוטוקול הממוטב עבור GF Artemia אמור להיות קל, חוסך זמן וחסכוני בפועל. לאחר השוואת התנועה הפעילה והמוות/חוסר התנועה של nauplii שנצפו במיקרוסקופ, מאפיינים של nauplii, ביצים שלא בקעו וקליפה, השיטה משתכללת. לאחר הדגירה היומית, המדדים של ארטמיה GF טרייה שהתקבלו מבקבוקים, כולל הבקיעה, שיעור ההישרדות והעיוות, והאורך והמשקל של nauplii, נצפו ונמדדו תחת המיקרוסקופ (איור 3). לאחר הטיפול, שיעור הבקיעה של ציסטות ארטמיה היה גבוה, עם ממוצע של 88.15%, הישרדות של nauplii שחייה היה 77.83%, ואת שיעור המום היה 1.87%. אורך הגוף של הנאופלי היה 546.70 מיקרומטר, ומדד משקל הגוף היה 3.80 מ"ג/100, המתאימים לתפיסת דגים והאכלתם מתקופת פתיחת חודש הזחלים ועד לשלב הנעורים והבוגרים.

זיהוי דגי GF וארטמיה GF חשוב גם לתחזוקת המודל. על-פי איסוף דגימות ושיטות בדיקה מרובות, התוצאות יכולות לספק את ההצלחה של עוברי דגי זברה מטופלים וציסטות ארטמיה בצלחת התרבית ובתווך הנוזלי (איור 4). הדגימות השונות הנאספות מדי יום צריכות להיות מזוהות כסטריליות בכל שיטות הבדיקה, אשר לאחר מכן יכולות להצביע על דגמי GF בזמן האיסוף. ארטמיה GF צריך להיות מזוהה לפני האכלה על דגים GF, או צלחת ותוצאות אינקובטור בינוני צריך להתייחס למצב סטרילי של nauplii חי טרי. כלומר, לטפח ארטמיה GF מציסטות על צלחות TSA או זכוכית בינונית נוזלית TSB או BHI בדגירה לנער, אשר יכול לשמש ליצירת ארטמיה GF ואימות סטרילי בו זמנית. פרוטוקול GF Artemia יכול להכיל מספר מוגבל של זחלים להאכלה. במהלך תהליך ההאכלה, היה ברור כי ארטמיה GF שחה בתוך GZM ולאחר מכן נלכד ונאכל על ידי זחלי דגי GF.

היישומים של מודלים של דגי GF כוללים תחומים שונים בביולוגיה וברפואה, ומאפשרים לחקור תפקודים מיקרוביאליים, גדילה והתפתחות, מנגנוני מחלות, וסינון פרוביוטי או תרופתי, בין היתר46. במחקר זה, למשל, שני חיידקי מעיים עיקריים, Aeromonas sp. ו- Vibrio sp., בודדו מדגי זברה. מאפייני המושבה וזיהויה בוצעו, ותפקודים מטבוליים מרובים נמדדו במבחנה באמצעות ערכות זמינות מסחריות (איור 5). חיידקים אלה בודדו וזוהו בריצוף 16S, ותוצאות הפיצוץ הוצגו בדו"ח קודם42. זני החיידקים שזוהו מאפשרים מחקר מדעי על ההשפעה של מיקרוביוטה יחידה או משולבת על בריאות המאכסן על ידי הדבקת מודלים של דגי GF. השקיפות של זחלי דגים מאפשרת תצפית על תאי חיידקים בעלי תווית פלואורסצנטית באמצעות צבעי CM-דיל, מה שחושף התיישבות ותפוצה במעיים של דגי GF (מוצג באיור 6). לאחר זיהום חיידקי ב 5 dpf, זחלי זברה GF ניתן לצלם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצפות ברציפות מ 6 עד 14 dpf, מתן תובנות על תפקודים מיקרוביאליים בשילוב עם אינדקסים התפתחותיים, שינויים היסטופתולוגיים, ושינויים מולקולריים47.

איור 1: פרוטוקול של דגי זברה GF מעוברים לזחלים ולצעירים. השלבים העיקריים ביצירת דגי זברה GF כוללים: (1) איסוף עוברים מדגי זברה מסוג בר ומיקום ב- AB-GZM. (2) יש לשטוף את הטיפול בסוכני PVP-I ו-NaClO כדי להבטיח סטריליות מלאה. (3) תרבית עוברים/זחלים GF בצלחות 6 בארות עם GZM, חידוש המדיום מדי יום. (4) הסדרת תנאי התרבות לצמיחה והתפתחות מיטביים. (5) דיגום בשלבי התפתחות שונים, ולאחר מכן בדיקת סטריליות בשיטות צלחת ומדיום נוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: פרוטוקול הכנת ארטמיה GF כמזון חי לדגי GF. השלבים העיקריים כוללים: (1) לשטוף את הטיפול בציסטות ארטמיה לסטריליות מלאה. (2) הכנת ציסטות GF בתווך. (3) דגירה בתמיסת מלח במשך 24 שעות לקידום הבקיעה. (4) סינון בקיעה כושלת וביצים ריקות לאיסוף נאופלי פעיל. (5) שטיפת נאופלי שנאספה לסילוק פסולת, תוך הבטחת מזון חי איכותי ונקי מזהמים. (6) בדיקת סטריליות של ארטמיה GF לפני האכלה לזחלי דגי GF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אינדקסים של ציסטות ארטמיה GF ונאופלי מודגרות במשך 24 שעות. (A) ציסטות ארטמיה לא מטופלות עם סרט טומאה (סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר). (B) ציסטות ארטמיה מטופלות עם משטח קמור מעט לאחר ספיגת מים ומראה נקי יותר (סרגל אבנית: 500 מיקרומטר). (C) בדיקה מיקרוסקופית של GF Artemia nauplii חי מודגר טרי (סרגל קנה מידה: 2000 מיקרומטר) ו-(D) הגדלה עם סרגל קנה מידה של 1000 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: זיהוי סטרילי של דגי GF בכל שלב בחיים וארטמיה GF. (A) בדיקות סטריליות של דגימות CR ו-GF באמצעות TSB ו-BHI נוזל בינוני, TSA ולוחיות דם בתנאים אירוביים ואנאירוביים. (B) בדיקות סטריליות של ציסטות ארטמיה לא מטופלות, ציסטות ארטמיה GF ונאופלי באמצעות TSB ו- BHI מדיום נוזלי, TSA ולוחיות דם בתנאים אירוביים ואנאירוביים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: בידוד וזיהוי חיידקי מעיים בדגי זברה. (A) זני חיידקים, מאפייני מושבות, מפות ריצוף 16S (דוגמאות: Aeromonas sp. ו-Vibrio sp). (B) הצטרפות לסוג ול-NCBI. (C) תפקודים מטבוליים של חיידקים שבודדו ממעי דגי זברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: זיהום והתיישבות של זני חיידקי מעיים בדגי זברה GF. (A) שחזור זני חיידקים מבודדים ומזוהים לצורך ניסויי זיהום. (B) תיוג חיידקים בצבעים פלואורסצנטיים וזיהום של זחלי זברה GF ב-5 dpf. הגדלה: 1x. (C) תצפית על התפלגות והתיישבות של חיידקים (Vibrio sp.) ברקמות המעי in vivo. הגדלה: 3x. (D) ספירה של CFUs של חיידקים (Aeromonas sp. ו - Vibrio sp.) בכל זחל דגים על ידי דגימה יומית. הנתונים מציגים ממוצע ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פריימרים המשמשים לזיהוי חיידקים.

טבלה 2: ריכוז סופי ונפח של רכיבים לכל תגובה.

טבלה 3: תוכנית PCR להגברה של הגן rRNA 16S.

תרשים משלים 1: המדדים ההתפתחותיים הקריטיים של מודלים של דגי זברה GF ו-CR. (A) קצב הבקיעה של דגי זברה CR ו-GF ב-72 hpf, ו-(B) פעימות לב/10 שניות של דגי CR ו-GF ב-7 dpf ו-14 dpf. שיעורי ההישרדות (%) של דגי CR ו-GF ירדו מ-7 ימים ו-14 ימים עם 86%, 60%-80% ל-10%-25% ב-30 dpf. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

הפרוטוקול של GF Artemia הוענק כפטנט על ידי מנהל הקניין הרוחני הלאומי של סין, אשר יקל על השימוש המוגבל בשיטה לאחר קבלת אישור המחברים. המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים או כלכליים אחרים.