Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Summary

פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.

Abstract

חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא חלבון שמור המאפשר קיפול של חלבונים אחרים בתוך התא, מה שהופך אותו למלווה מולקולרי. בעוד Hsp70 אינו חיוני עבור תאי E. coli הגדלים בתנאים רגילים, מלווה זה הופך להיות חיוני לצמיחה בטמפרטורות גבוהות. מאחר ש-Hsp70 שמור מאוד, אחת הדרכים לחקור את תפקוד המלווה של גנים מסוג Hsp70 ממינים שונים היא לבטא אותם באופן הטרולוגי בזני E. coli שחסרים ב-Hsp70 או לבטא Hsp70 מקורי שנפגע מבחינה תפקודית. תאי E. coli dnaK756 אינם מסוגלים לתמוך בדנ"א של λ בקטריופאג'. יתר על כן, Hsp70 (DnaK) המקומי שלהם מציג פעילות ATPase מוגברת תוך הפגנת זיקה מופחתת ל- GrpE (גורם חילופי נוקלאוטידים Hsp70). כתוצאה מכך, תאי E. coli dnaK756 גדלים כראוי בטמפרטורות הנעות בין 30 °C (75 °F) ל 37 °C (75 °F), אך הם מתים בטמפרטורות גבוהות (>40 °C). מסיבה זו, תאים אלה משמשים מודל לחקר פעילות המלווה של Hsp70. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליישום תאים אלה לביצוע בדיקת השלמה, המאפשרת לחקור את פונקציית מלווה הצלולו של Hsp70.

Introduction

חלבוני הלם חום ממלאים תפקיד חשוב כמלווים מולקולריים בכך שהם מסייעים לקיפול חלבונים, מונעים צבירת חלבונים והופכים קיפול שגוי^של חלבונים ^1,2. חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא אחד המלווים המולקולריים הבולטים ביותר, הממלא תפקיד מרכזי בהומאוסטזיס של חלבון ^3,4. DnaK הוא E. coli Hsp70 homologue⁵.

בדיקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבוססות תאים שונות פותחו כדי לחקור את פעילות המלווה של Hsp70 ולסנן מעכבים המכוונים למלווה זה ^6,7,8. Hsp70 הוא חלבון שמור מאוד. מסיבה זו, מספר Hsp70s של אורגניזמים אאוקריוטים, כגון פלסמודיום falciparum (הסוכן העיקרי של מלריה), דווחו כתחליף לתפקוד DnaK ב- E. coli ^6,9. בדרך זו, פותחה בדיקת השלמה מבוססת E. coli הכוללת את הביטוי ההטרולוגי של Hsp70s ב- E. coli כדי לחקור את הפונקציה cytoprotective שלהם. בדרך כלל, בדיקה זו כוללת ניצול של תאי E. coli אשר חסרים עבור DnaK או המבטאים DnaK מקורי כי הוא בסכנה תפקודית. בעוד DnaK אינו חיוני לצמיחת E. coli בתנאים רגילים, הוא הופך להיות חיוני כאשר התאים גדלים בתנאים מלחיצים כגון טמפרטורות גבוהות או צורות אחרות של מתח^10,11.

זני E. coli שפותחו כדי לחקור את תפקוד Hsp70 באמצעות בדיקת השלמה כוללים E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) ו- E. coli dnaK756. תאי E. coli dnaK103 מייצרים DnaK קטוע שאינו מתפקד, וככזה, התאים גדלים כראוי ב 30 ° C, בעוד הזן רגיש לקור ומתח חום^12,13. באופן דומה, זן E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) אינו גדל מעל 40°C^14,15. זן E. coli dnaK756 מבטא DnaK טבעי מוטנטי (DnaK756) המאופיין בשלושה תחליפי גליצין לאספרטט במיקומים 32, 455 ו-468, מה שגורם לתוצאות פרוטאוסטטיות בסיכון. כתוצאה מכך, זן זה עמיד בפני בקטריופאג' λ DNA¹⁴. בנוסף, E. coli dnaK756 מציג פעילות ATPase מוגברת, בעוד זיקתו לגורם חילופי הנוקלאוטידים, GrpE, מופחתת¹⁶. אי קולי זנים מוטנטיים של DnaK משמשים כמודלים אידיאליים לחקר פעילות המלווה של Hsp70 באמצעות גישת השלמה. מאחר ש-DnaK חיוני רק בתנאי לחץ, בדיקת ההשלמה מתבצעת בדרך כלל בטמפרטורות גבוהות (איור 1). כמה יתרונות של שימוש E. coli עבור מחקר זה כוללים גנום מאופיין היטב, צמיחה מהירה, ואת העלות הנמוכה של גידול ותחזוקה¹⁷.

במאמר זה, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול הכולל שימוש בתאי E. coli dnaK756 כדי לחקור את הפונקציה של Hsp70. ה-Hsp70s בהם השתמשנו בבדיקה הם מסוג פרא DnaK והנגזרת הכימרית שלו, KPf (המורכבת מתחום ATPase של DnaK המאוחה לתחום קשירת המצע C-terminal של Plasmodium falciparum Hsp70-1 ^6,18). KPf-V436F התבטא באופן הטרולוגי כבקרה שלילית, שכן המוטציה למעשה חוסמת אותו ממצע קשירה, ובכך מבטלת את פעילות המלווה שלו⁹.

Protocol

1. טרנספורמציה

הערה: השתמש בכלי זכוכית סטריליים לתרבית, קצוות פיפטה ומדיה טרייה ואוטומטית. הכינו תרביות של תאי E. coli ב-2x שמרים טריפטון (YT) [1.6% טריפטון (w/v), 1% תמצית שמרים (w/v), 0.5% NaCl (w/v), 1.5% אגר (w/v)] אגר. ריאגנטים כלליים המשמשים בפרוטוקול ומקורותיהם מובאים בטבלת החומרים.

1. תווית 2.0 מ"ל צינורות microcentrifuge ו aliquot 50 μL של תאי E. coli dnaK756מוכשר, שמירה על התאים על קרח.
2. לצינורות מיקרוצנטריפוגות 2.0 מ"ל עם תאים מתאימים, aliquot 10-50 ng של pQE60/DnaK, pQE60/KPf ו- pQE60/KPf-V436F פלסמיד DNA⁹ לצינורות נפרדים.
3. שמור את צינורות מיקרוצנטריפוגות 2.0 מ"ל המכילים את התאים המוסמכים ואת DNA פלסמיד על קרח במשך 30 דקות.
4. מחממים את תערובת התאים-דנ"א המוסמכת למשך 60 שניות ב-42 מעלות צלזיוס ומחזירים את צינורות המיקרוצנטריפוגות בחזרה על קרח למשך 10 דקות.
5. הוסיפו 950 מיקרוליטר של ציר YT טרי 2x (מודגר מראש ב-37°C) ודגרו ב-37°C תוך כדי ניעור ב-150°/min למשך שעה. השאירו את התאים לגדול במשך זמן רב יותר כדי לעודד את התאוששותם במידת הצורך.
   הערה: הימנע מטלטול נמרץ של התאים.
6. פיפטה 100 μL של התאים ולהפיץ אותם על 2x לוחות אגר YT המכילים 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין עבור הזן המתאים, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין (ראה טבלה של חומרים) עבור בחירת פלסמיד.
7. צנטריפוגה את שאר התאים (שנפחם כיום הוא כ 900 μL) במשך דקה אחת ב 5000 x גרם (ב 4 ° C) באמצעות מיקרוצנטריפוגה benchtop.
8. דקנט על 800 μL של המרק ולהשתמש בתווך הנותר כדי להשעות מחדש את התאים כדוריים.
9. צלחת את התאים התאושש על צלחת אגר YT 2x.
10. לדגור על שתי צלחות אגר לילה (או כ 17 שעות) ב 37 ° C.
    הערה: תאים אלה גדלים לאט מאוד וייתכן שיהיה צורך לדגור עליהם למשך זמן רב יותר. היזהר לזהות את המושבות אשר עשוי להתחיל קטן מאוד. הלוח המכיל תאים התלויים מחדש לאחר צנטריפוגה (שלב 1.7) משמש כגיבוי למקרה שיעילות הטרנספורמציה של התאים ירודה, ובמקרה זה התאים הכדוריים עשויים לשפר את ההתאוששות של תאים מותמרים. עם זאת, אם יעילות הטרנספורמציה מצוינת, לוחית האגר שעליה צופו תאים מרוכזים עשויה להתאפיין בתרבית מגודלת בעת הדגירה, מה שמקשה על זיהוי מושבות בודדות. במקרה כזה, צלחת האגר השנייה עשויה להיות זו שעליה צומחות מושבות מרווחות היטב.

2. ציפוי תאים

1. הרימו מושבה אחת מהטרנספורמנטים וחסנו אותה ל-10 מ"ל של מרק YT 2x בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל טטרציקלין לבחירת תאי E. coli dnaK756, ו-100 מק"ג/מ"ל אמפיצילין לבחירת פלסמיד.
   הערה: השתמש בצלוחיות (≥50 מ"ל) כדי להבטיח אוורור בעת התסיסה של התרבית. יש לדגור על החיסון למשך הלילה (17 שעות) בטמפרטורה של 37°C תוך כדי ניעור ב-150 סיבובים לדקה.
2. קח קריאת ספיגה ב OD₆₀₀ למחרת בבוקר.
3. נקו את משטח שולחן העבודה באמצעות אתנול 75% כדי לספוג את המשטח כהכנה לאיתור תאים.
4. באמצעות צינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, תקנן את התרבית לקריאת OD₆₀₀ של 2.0 באמצעות מרק YT 2x.
   הערה: ודא שקריאות OD נלקחות כראוי מכיוון ששלב זה חשוב לסטנדרטיזציה של צפיפות התאים בין הדגימות השונות.
5. באמצעות 2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, להכין דילולים סדרתיים של התאים מ 10⁰ ל ^10-5.
6. יש לדגור על צלחות האגר שישמשו לאיתור התאים בתנור בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לצלחות להתייבש עם מכסים פתוחים חלקית כדי להבטיח שאדי המים יבריחו.
   הערה: כדי להבטיח שהתאים מזוהים במרחקים מופרדים באופן אחיד, צייר קווים על פיסת נייר שעליה מודפסת תבנית של אתרי תצפית.
7. נקודה 2 μL של התאים המדוללים סדרתית על לוחות אגר בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין, 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין, 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין, ו 0.5 mM IPTG (להשראת ביטוי של חלבונים רקומביננטיים) (ראה טבלת חומרים).
8. אתר כל דגימה על שני לוחות נפרדים (אחד יודגר ב 37 ° C והשני ב 43.5 ° C).
   הערה: הימנעו מפירסינג בצלחת האגר.
9. דגימות בקרה נקודתיות על אותה צלחת כמו דגימות הניסוי כדי למזער את ההשפעות הסביבתיות.
10. בצע את האיתור במהירות כדי להבטיח שהתהליך יושלם לפני שהתאים יתחילו לגדול, מכיוון שהדבר עלול ליצור דפוסי צמיחה מוטים.
    הערה: חשוב להימנע מאירוסולים בעת תצפית, מכיוון שאלה יזהמו את הלוחות. חשוב גם לשמור על הצלחות סגורות בין הכתמים כדי למנוע זיהום.
11. לדגור צלחת אחת ב 37 ° C (טמפרטורת גידול מתירני) ואת השני בטמפרטורת צמיחה מתירנית של 43.5 ° C.
    הערה: יש לדגור על הצלחות הפונות כלפי מטה כדי למנוע הצטברות אדים על המכסה, מכיוון שהמים המרוכזים ישטפו את המושבות המנומרות ממקומן.
12. מניחים את כל הצלחות באינקובטורים בו זמנית ונמנעים מפתיחת האינקובטור עד למחרת בבוקר.
    הערה: פתיחת דלת האינקובטור מספר פעמים במהלך הדגירה של הלוחות אינה מומלצת. הסיבה לכך היא שהגישה של אוויר לתוך האינקובטור עלולה לגרום לתנודות טמפרטורה המשפיעות לרעה על צמיחת התאים.

3. אישור ביטוי של חלבונים רקומביננטיים

1. באמצעות לולאה סטרילית, לאסוף חלק מהתאים הנותרים מאותה מושבה של תאי E. coli dnaK756 מותמרים.
2. יש לחסן את התאים במרק YT של 10 מ"ל בתוספת קנמיצין של 50 מיקרוגרם/מ"ל, טטרציקלין של 10 מיקרוגרם/מ"ל ואמפיצילין של 100 מק"ג/מ"ל. יש לדגור למשך הלילה (17 שעות) ב-37°C צלזיוס תוך כדי טלטול ב-150 סיבובים לדקה.
3. להעביר את התרבית לתוך 90 מ"ל של מרק סטרילי 2x YT המכיל את האנטיביוטיקה הדרושה כאמור בשלב 3.2. תן לתאים לגדול לשלב אמצע יומן (OD₆₀₀ = 0.4-0.6).
4. קח 2 מ"ל של תרבית המדגם לפני האינדוקציה (דגימת אינדוקציה של 0 שעות).
5. הוסף IPTG לריכוז סופי של 1 mM כדי לגרום לייצור חלבונים ולדגור מחדש את התאים ב 37 ° C.
6. קח דגימה שנייה של 2 מ"ל 6 שעות לאחר הזירוז.
7. קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 5000 x גרם במשך 10 דקות. שמור על טמפרטורת הצנטריפוגה על 4 °C (75 °F).
8. השליכו את הסופרנטנט.
9. יש להשהות מחדש את הגלולה במאגר PBS (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1.4 mM KH₂PO₄) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.

4. ניתוחי SDS-PAGE ו-Western Blot

1. הכינו 2x 10% ג'ל SDS כמתואר קודם¹⁹.
2. שמור את אחד מג'לי SDS-PAGE לצביעה עוקבת באמצעות כתם קומאסי כדי להציג את רצועות החלבון. השתמש בג'ל SDS-PAGE השני כדי לבצע ניתוח כתמים מערביים.
3. Aliquot 80 μL של דגימות resuspended ולערבב אותו עם 20 μL של 4x Laemmli SDS טוען חיץ.
4. מרתיחים את המתלה ב-100°C למשך 10 דקות. לאחר מכן טען 10 μL מכל דגימה על ג'ל SDS precast (ראה טבלת חומרים).
5. בצע אלקטרופורזה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת באמצעות מתח של 120 V בתמיסה אחת של מאגר הפעלה SDS (25 מ"מ Tris, 250 mm glycine, 0.1% (w/v) SDS).
6. צבעו את הג'ל בכתם קומאסי (ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת, ולאחר מכן החזיקו באמצעות חיץ מעכב (50% מתנול, 10% (v/v) חומצה אצטית במים מזוקקים) למשך שעתיים.
7. דמיינו את רצועות החלבונים הקיימות בג'ל באמצעות מערכת הדמיה של ג'ל (ראו טבלת חומרים). הפעל מחדש ג'ל SDS-PAGE אחר עם אותן דגימות בהתאם לפרוטוקול הנ"ל.
8. כאשר הריצה האלקטרופורטית מסתיימת, יש ליטול ג'לים מסוג SDS-PAGE כדי לבצע ניתוח כתמים מערביים כפי שתואר קודם לכן¹⁹.
9. שטפו את קרום הניטרוצלולוז שאליו הועברו החלבונים שלוש פעמים בחיץ שטיפה (TBS-Tween, pH 7.4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
10. השתמש ב- α-DnaK (ראה טבלת חומרים) כדי לזהות את DnaK ואת α-PfHsp70-1⁷ כדי לזהות KPf ואת המוטציה שלו, KPf-V436F), בהתאמה.
11. יש להשתמש בנוגדנים בדילול 1:2000 בחלב 5% ללא שומן. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C תוך כדי טלטול ב-60 סיבובים/דקה למשך שעה אחת.
12. יש להסיר נוגדנים שאינם קשורים באופן ספציפי על ידי שטיפת קרום הניטרוצלולוז ב-TBS-Tween 3 פעמים תוך 15 דקות.
13. לדגור על הממברנה בנוגדן המשני (α-ארנב, ראה טבלת חומרים) באותם תנאים כמו השלב הקודם. זה ואחריו כביסה לאחר מכן באותם תנאים כמו הנוגדן העיקרי.
14. פתור את הפסים באמצעות מגיב זיהוי כימילומינסנציה משופרת (ECL).
15. דמיינו את הפסים באמצעות מצלמת ג'ל.

Results

איור 2 מציג תמונה של האגר הסרוק המכיל תאים שנצפו וגודלו בתרבית בטמפרטורת גידול מתירנית של 37°C ו-43.5°C, בהתאמה. בצד ימין של איור 2, רכיבי הכתם המערבי שנכרתו מייצגים את הביטוי של DnaK, KPf ו-KPf-V436F בתאי E. coli dnaK756. כצפוי, כל תאי E. coli dnaK756 בתרבית בטמפרטורת גידול מתירנית של 37 מעלות צלזיוס הצליחו לגדול. אולם בתנאי גידול לא מתירניים של 43.5 מעלות צלזיוס, רק תאים המבטאים באופן הטרולוגי DnaK ו-KPf הצליחו לגדול, כפי שדווח קודם לכן ^6,9,20 (איור 2). מצד שני, תאים המבטאים KPf-V436F גדלו רק ב 37 ° C אבל לא הצליחו לגדול ב 43.5 ° C. זה מדגים כי DnaK ו- KPf הצליחו לשחזר את פגם הגדילה של תאי E. coli dnaK756 בתנאי עקת חום. הכישלון של תאים המבטאים באופן הטרולוגי KPf-V436F לתמוך בצמיחת תאים בטמפרטורה של 43.5 מעלות צלזיוס מדגים את חוסר תפקוד המלווה של חלבון זה. בהקשר זה, KPf-V436F משמש חלבון שליטה שלילי אידיאלי.

איור 1: עקרון בדיקת ההשלמה באמצעות תאי E. coli dnaK756 כדי לחקור את תפקוד המלווה של חלבונים בעלי ביטוי הטרולוגי. E. coli dnaK756 מבטא חלבון DnaK756 מקומי שאינו מסוגל להגן על התאים מפני עקת חום. החדרת Hsp70 הטרולוגי פונקציונלי מציל את התאים ממוות בחשיפה לעקת חום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: בדיקת לוחות השלמה המדגימה את היכולות של DnaK ו-KPf להגן על תאי E. coli dnaK756 מפני עקת חום. התאים שעברו טרנספורמציה גודלו בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (טמפרטורת גידול מתירנית) ו-43.5 מעלות צלזיוס (טמפרטורת גדילה לא מתירנית). התאים עברו סטנדרטיזציה וצופו כדילולים סדרתיים. 'N' מסמל 'מסודר', המייצג את המקום הראשון המורכב מתאים לא מדוללים. בצד ימין קיצוני נמצאות כריתות הכתם המערבי המייצגות ביטוי של שלושת החלבונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הפרוטוקול מדגים את התועלת של תאי E. coli dnaK756בחקר תפקוד המלווה של Hsp70 מבוטא באופן הטרולוגי. בדיקה זו יכולה להיות מאומצת כדי לסנן מעכבים המכוונים לתפקוד Hsp70 בצלולו. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי Hsp70s שאינם מסוגלים להחליף DnaK ב E. coli אינם תואמים לבדיקה זו. חוסר שינוי לאחר תרגום²¹ של כמה Hsp70s שאינם ילידי עשוי להסביר את חוסר התפקוד שלהם בתוך מערכת E. coli . בדיקת השלמה מבוססת שמרים²² עשויה לענות על חלק מהחסרונות של הבדיקה מבוססת E. coli.

מספר שלבים מרכזיים חיוניים להבטחת תוצאות הניתנות לשחזור. אלה כוללים הבטחה כי רק תאים שהשתנו על ידי מבנה פלסמיד בהתאמה משמשים במהלך הציפוי. בנוסף, חשוב למנוע זיהום של התרבות לאורך כל השלבים. יתר על כן, מכיוון שתאי E . coli DnaK לחוצים רגישים לנימה מוגזמת¹⁰, חשוב להימנע מרעד נמרץ במהלך התרבית, שכן זן פיזי זה מקדם נימה נרחבת. תאים מנוממים יתר על המידה נותנים קריאות גדילה כוזבות גבוהות יותר ב- OD₆₀₀, מה שמוביל להערכת יתר של צמיחת התרבית ומשפיע לרעה על סטנדרטיזציה של תאים לפני הציפוי. למרות Hsp70 אינו חיוני לצמיחה E. coli בתנאים רגילים, תאים חסרים חלבון זה רגישים ללחץ¹⁰. מסיבה זו, תאי E. coli dnaK756 גדלים הרבה יותר לאט לאחר טרנספורמציה או במהלך ההתאוששות שלהם ממלאי גליצרול. בנוסף, הם רגישים מאוד לתנודות טמפרטורה. לכן, חשוב להימנע מפתיחת דלת האינקובטור ברגע שמניחים את צלחות האגר המצופות בפנים עד שהגיע הזמן לראות את הצלחות.

נתוני הכתם המערבי חשובים כדי לאשר את הביטוי של חלבוני Hsp70 רקומביננטיים בהתאמה בתאי E. coli dnaK756. כישלון לבטא את החלבון המתאים מוביל לתוצאה שלילית שגויה עבור תאים הגדלים תחת טמפרטורת גידול לא מתירנית.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-&בטא;-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'	8,05,740	מרכיב לטעינת דגימה
צבע חומצה אצטית	Labchem	101005125	מרכיב של מעכב
אקרילאמיד	סיגמא-אולדריץ'	8008300100	רכיב של SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	מרכיב של בדיקת גידול בינונית ונוזלית
אגרוז	ביולוגיה		מולקולרית מוסמכת 14131031 מדעי חכם
אמוניום פרסולפט	סיגמא-אולדריץ'	101875295	רכיב עבור ג'ל SDS-PAGE
Ampicillin	VWR International	0339—EU—	אנטיביוטיקה סלקטיבית
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	רכיב של SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	מרכיב לטעינת דגימה צבע
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	להכנת תאים מוכשרים
Coomassie כחול מבריק	VWR International	443293X	SDS-PAGE צבע
נתרן פוספט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	RB10368	מרכיב של מאגר PBS
ECL	Thermofischer Scientific	32109	מגיב לזיהוי כתמים מערביים
אתידיום ברומיד	Thermofischer Scientific	17898	צבע אינטרקלציה DNA
גליצרול	Merck	SAAR2676520L	מרכיב לטעינת דגימה צבע
גליצין	VWR International	10119CU	רכיב של SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	משרה
Kanamycin	Melford	K0126	אנטיביוטיקה סלקטיבית
מגנזיום כלוריד	Merck	SAAR4123000EM	מרכיב של בדיקת גידול בינונית ונוזלית
מתנול	Labchem	113140129	מרכיב של מעכב
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Merck	1,04,87,30,250	מרכיב מאגר PBS
פפטון	Merck	HG000BX4.250	מרכיב של בדיקת גידול בינונית ונוזלית
אשלגן כלורי	Merck	SAAR5042020EM	מרכיב PBS
buffer ממברנת PVDF	Thermofischer scientific	PB7320	קרום כתם מערבי
נתרן כלורי	Merck	SAAR5822320EM	מרכיב של בדיקת גידול בינונית ונוזלית
נתרן דודציל סולפט	VWR International	108073	לפתרון חלבונים מבוטאים
הפרדות	Spectramax iD3	373705019	קורא צלחות אוטומטי
TEMED	VWR international	ACRO420580500	רכיב של ג'ל SDS
טטרציקלין	Duchefa ביוכימיה	T0150.0025	אנטיביוטיקה סלקטיבית
Tris	VWR International	19A094101	רכיב של ג'ל SDS
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	מרכיב עבור מאגר כביסה מערבי
תא העברה מערבי	Thermofisher Scientific	PB0112	העברת חלבון לקרום ניטרוצלולוז
תמצית שמרים	Merck	HG000BX6.500	מרכיב של בדיקת גידול בינונית ונוזלית
ונוגדני אלפא;-DnaK	Inqaba	BK CAC09317	נוגדן ראשוני
ונוגדני אלפא;-ארנב	Thermofischer scientific	31460	נוגדן משני