הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור מטריצת טחול דה-צלולרית שמקורה בחולדות

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66520

⸱

9 בפברואר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Local Joint Engineering Research Center for Precision Surgery and Regenerative Medicine, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 2Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 3Center for Regenerative and Reconstructive Medicine, Med-X Institute, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 4Department of Graduate School, Xi'an Medical University

במאמר זה

סיכום

מטריצת הטחול הדה-צלולרית (DSM) טומנת בחובה יישומים מבטיחים בתחום הנדסת רקמת הכבד. פרוטוקול זה מתאר את ההליך להכנת DSM של חולדות, הכולל קצירת טחול של חולדות, דה-צלולריזציה שלהם באמצעות זילוח והערכת ה-DSM המתקבל כדי לאשר את מאפייניו.

תקציר

השתלת כבד היא הטיפול העיקרי במחלת כבד סופנית. עם זאת, המחסור והאיכות הלקויה של איברים מתורמים מחייבים פיתוח טיפולים אלטרנטיביים. כבדים ביו-מלאכותיים (BALs) המשתמשים במטריצת כבד דה-צלולרית (DLM) התגלו כפתרונות מבטיחים. עם זאת, מיקור DLM מתאים נותר מאתגר. השימוש במטריצת טחול דה-צלולרית (DSM) נחקר כבסיס ל-BALs, ומציע חלופה זמינה. במחקר זה, טחול חולדות נקצר ועבר דה-צלולריזציה באמצעות שילוב של מחזורי הקפאה-הפשרה וזילוח עם ריאגנטים של דה-צלולריזציה. הפרוטוקול שימר את המיקרו-מבנים והרכיבים של המטריצה החוץ תאית (ECM) בתוך ה-DSM. תהליך הדה-צלולריזציה המלא ארך כ-11 שעות, והתוצאה הייתה ECM שלם בתוך ה-DSM. ניתוח היסטולוגי אישר את הסרת רכיבי התא תוך שמירה על מבנה ECM והרכבו. הפרוטוקול המוצג מספק שיטה מקיפה להשגת DSM, ומציע יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות כבד ותרפיה תאית. ממצאים אלה תורמים לפיתוח גישות חלופיות לטיפול במחלת כבד סופנית.

מבוא

השתלת כבד נותרה הטיפול הסופי היחיד למחלת כבד סופנית 1,2,3. עם זאת, המחסור הקריטי והאיכות הירודה של תרומת איברים הגבירו את הצורך בטיפולים אלטרנטיביים4. בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כבדים ביו-מלאכותיים (BALs) המשתמשים במטריצת כבד דה-צלולרית (DLM) התגלו כפתרונות מבטיחים 5,6,7. ה- DLM משמר את מבנה הכבד המקורי, כולל הרשת המיקרו-וסקולרית המורכבת שלו ורכיבי ה- ECM, ומציע פיגום ליצירת BAL להשתלה שעשויה להקל על מחלות כבד.

למרות ההבטחה, אימוץ טכנולוגיה זו עומד בפני אתגרים, במיוחד במיקור DLM מתאימים. DLMs שמקורם בבני אדם נמצאים במחסור, בעוד אלה ממקורות מן החי נושאים את הסיכונים של העברת מחלות ודחייה חיסונית. בגישה חדשנית, המחקר שלנו בחן את השימוש במטריצת טחול דה-צלולרית (DSM) כבסיס ל-BALs 8,9,10,11. הטחול זמין יותר במצבים רפואיים שונים, כגון יתר לחץ דם פורטלי, קרע טראומטי, פורפורה טרומבוציטופנית אידיופטית, ותרומה לאחר מוות לבבי. לכן, טחול זמין באופן נרחב יותר מאשר כבד למטרות מחקר. חולים שעברו כריתת טחול אינם סובלים מתנאים חמורים, מה שמאשר עוד יותר את חיוניות הטחול. המיקרו-סביבה של הטחול, במיוחד המטריצה החוץ-תאית והסינוסואידים, דומה לזו של הכבד. זה הופך את הטחול לאיבר מתאים להידבקות תאים והתפשטות במחקר השתלת הפטוציטים. בהתבסס על ממצאים אלה, החקירות הקודמות שלנו הוכיחו כי DSMs חולקים מיקרו-מבנים ורכיבים דומים עם DLMs ויכולים לתמוך בהישרדות ובתפקוד של הפטוציטים, כולל ייצור אלבומין ואוריאה. יתר על כן, DSMs הוכחו כמשפרים את התמיינות הכבד של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם, מה שמוביל לפונקציונליות משופרת ועקבית.

על ידי שימוש ב- DSM המטופלים בהפרין, הנדסנו BALs פונקציונליים המסוגלים להדגים נוגדי קרישה יעילים לטווח קצר ופיצוי חלקי של תפקודי כבד11. כתוצאה מכך, DSM תלת מימדי זה טומן בחובו הבטחה משמעותית לקידום הנדסת רקמות הכבד והטיפול התאי. בעבודה זו אנו מציגים את השיטות המפורטות לקצירת טחול חולדות והכנת DSM המשמרים את המיקרו-מבנים והרכיבים של ה-ECM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג ובוצע בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. קציר טחול

  1. השתמשו בחולדות Sprague Dawley זכרים במשקל 250-280 גרם. שכן את החולדות בחדרים עם טמפרטורה ולחות מבוקרים, וספק להן מזון ומים עד ללידה, למעט צום לפני ניתוח.
  2. תת עורית להזריק buprenorphine (0.05 מ"ל / ק"ג) כמו משכך כאבים 1 שעה לפני הניתוח. מרדימים את החולדה בשאיפת איזופלורן. יש להשתמש בקצב זרימה של 1.5 ליטר/דקה של 5% איזופלורן להרדמה אינדוקציה בקופסת פרספקס ולשמור על הרדמה עם קצב זרימה של 0.6-0.8 ליטר/דקה של 2% איזופלורן דרך מסכה. אשר את עומק ההרדמה על ידי צביטת הבהונות.
  3. השתמשו במכונת גילוח חשמלית כדי לגלח את העור על פני כל הבטן. אבטחו את החולדה במצב שכיבה על שולחן הניתוחים. הזריקו 2 מ"ל של מי מלח הפרינים (1,000 U של הפרין) דרך וריד הפין הגבי כדי להשיג נוגדי קרישה מערכתיים. יש לחטא את העור המגולח בתמיסת פובידון-יוד ולכסות במטלית סטרילית.
  4. לבצע חתך בצורת צלב באמצעות מספריים כירורגיים בבטן, לחשוף את חלל הבטן על ידי מתיחה עם מלקחיים המוסטטיים, ולהפוך את הכבד לכיוון הסרעפת. החלק החיצוני של מערכת העיכול לצד ימין של הבטן וכסה אותו בגזה לחה.
  5. בזהירות להפריד לחתוך את הרצועה splenogastric לחשוף את hilum טחול.
    הערה: הטחול, המופיע כמבנה מוארך אדמדם, בגודל של כ-3.0 ס"מ x 0.6 ס"מ x 0.6 ס"מ, ניתן לזהות בבטן השמאלית.
  6. הפרידו בהדרגה וחשפו את עורק הכבד המשותף, עורק העיכול ועורק הטחול על ידי חיתוך לאורך הילום הטחול. לקשור ולחתוך את עורק העיכול ואת עורק הכבד המשותף תוך ניתוק הדרגתי של הרקמה שמסביב.
  7. הפוך את הטחול לכיוון צד ימין כדי לחשוף את אבי העורקים הבטן. בצעו בעדינות דיסקציה קהה וחשפו את אבי העורקים הבטני ואת גזע הצליאק באמצעות צמר גפן. מניחים תפר משי 3-0, באורך של כ-3 ס"מ, מעל ומתחת לענפי גזע הצליאק, ומניחים תפר משי 6-0, באורך של כ-10 ס"מ, בענף גזע הצליאק.
  8. רצועה את אבי העורקים הבטני מתחת ומעל ענפי גזע הצליאק. בצע חתך קטן בענף העורקי. הרימו בעדינות את תפר המשי 6-0, הכניסו קטטר ורידי 24 G לעורק הטחול לאורך גזע הצליאק, קשרו ואבטחו אותו.
  9. באמצעות משאבת מזרק בקצב של 4 מ"ל/דקה, להחדיר מי מלח רגילים heparinized (25 U / mL) בנפח של 50 מ"ל. במקביל, נתקו את וריד הפורטל כערוץ יציאה כדי לאפשר לנוזל המוחדר לזרום החוצה מהטחול. החיה מורדמת על ידי exsanguination.
  10. בזהירות לנתח את הרקמה שמסביב של הטחול, הימנעות נזק הלבלב, תוך שמירה על כלי העזר העיקריים.
  11. בדוק אם יש דליפה סביב הטחול, ולאחר מכן להסיר את הטחול והלבלב ולשטוף אותם במי מלח רגילים.
    הערה: הטחול והלבלב של חולדות קשורים זה לזה באופן הדוק, כאשר הלבלב עוטף את עורק הטחול. אם הטחול מוסר בנפרד, זה יכול להיות מאתגר לקשור כלי דם קטנים רבים. בהליך זה, הטחול מוסר יחד עם הלבלב. לאחר decellularization, הטחול והלבלב הופכים שקופים ואת microvasculature גלוי, אשר מאפשר את שימור הטחול עם כלי דם שלמים.
  12. מעבירים את הטחול לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל מלא במי מלח רגילים ומאחסנים אותו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: הטחול והצנתר הוורידי המוחדרים לעורק הטחול יישמרו יחד בהקפאה לחיבור נוח במהלך ניסויי הזילוח.

2. דה-צלולריזציה של הטחול

  1. חזור על מחזור ההקפאה-הפשרה 3x במיכל סטרילי כדי ליזה את תאי הטחול.
    הערה: מחזור הקפאה-הפשרה הוא שיטה פיזיקלית המשמשת לפירוק תאים של פיגומים. רקמת הטחול ממוקמת במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה להקפאה, ואז מוסרת מהסביבה בטמפרטורה נמוכה ומונחת בטמפרטורת החדר או באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להפשרה. תהליך הקפאה והפשרה זה חוזר על עצמו 3-6 פעמים, מה שמשבש את קרום התא ומוביל לליזה של תאים.
  2. התקינו מערכת זילוח בתוך ספסל נקי הכולל משאבה פריסטלטית, מאגר 2 ליטר, צינור סיליקון בקוטר פנימי של 2.4 מ"מ ומלכודת בועות (איור 1).
  3. מלאו את מערכת הזילוח במים שעברו דה-יוניזציה (ddH2O) והשאירו אותה פועלת למשך 10 דקות.
  4. העבירו בזהירות את הטחול שנקטף למיכל המלא ddH2O.
  5. חבר את צינור הסיליקון לצנתר ורידי שהוחדר לעורק הטחול.
  6. התחל זילוח עם ddH2O בקצב של 2 מ"ל/דקה למשך 30 דקות.
  7. המשך זילוח עם ddH2O בקצב של 4 מ"ל/דקה למשך 30 דקות.
  8. מחורר עם פתרון SDS של 0.1% (w/v) למשך 4 שעות.
  9. מחורר עם פתרון Triton X-100 של 1% (v/v) למשך שעתיים.
  10. יש לערבב עם PBS בקצב של 4 מ"ל/דקה למשך 4 שעות כדי לשטוף את ה-DSM.
    הערה: שימוש במשאבה פריסטלטית לזילוח חד כיווני של כל הנוזלים.
  11. לאחר השלמת הזילוח, ligate ו transect את ענפי כלי הדם בין הלבלב והטחול, ולאחר מכן להסיר את הלבלב. אחסנו את ה-DSM בצינור צנטריפוגה נקי ואטום בנפח 50 מ"ל ספוג ב-PBS המכיל 10% פניצילין-סטרפטומיצין בטמפרטורה של -20°C עד שיהיה מוכן לשימוש לניסויים עתידיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה השתמש בשילוב של מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים וזילוח עם ריאגנטים של דה-צלולריזציה לדה-צלולריזציה של טחול חולדה. דה-צלולריזציה מלאה של הטחול הושגה תוך כ-11 שעות (איור 2A). במהלך תהליך הדה-צלולריזציה, צבע הטחול השתנה בהדרגה מאדום עמוק לאדום מנומר ובהיר, ובסופו של דבר, מראה לבן שקוף (איור 2B). המורפולוגיה הכללית נותרה יחסית שלמה, עם מבני כלי דם נראים לעין (איור 2B).

צביעת Hematoxylin-eosin איש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ה- BALs מייצגים גישה יעילה לטיפול במחלת כבד סופנית, במיוחד במקרים בהם השתלת כבד מעוכבת על ידי המחסור הנוכחי באיברים תורמים6. אפשרות מבטיחה ליצירת BALs היא שימוש ב- DLM, המשמר את ה- ECM הטבעי של הכבד המקומי ואת מבנה כלי הדם. עם זאת, המחסור ב-DLM אנושי והסיכונים הפוטנציאליים של זיהום ואימונוגניות הקשורים ל-DLM של בעלי חיים מהווים מגבלות משמעותיות. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מציעים אסטרטגיה חדשנית הכוללת שימוש במטריצת טחול דה-צלולרית (DSM) כפיגום חלופי עבור BALs 8,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא הצהירו על ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82000624), תוכנית המחקר הבסיסית במדעי הטבע של שאאנשי (2022JQ-899 &; 2021JM-268), תוכנית התמיכה ביכולת חדשנות במחוז שאאנשי (2023KJXX-030), תוכנית מפתח מו"פ של מחוז שאאנשי פרויקט מפתח משותף של האוניברסיטה (2021GXLH-Z-047), הקרן המוסדית של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג (2021HL-42 ו- 2021HL-21).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכונת הרדמההרווארד מכשירשולחןהרדמה בעלי חיים
מלכודת בועותשאנדונג Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.קוטר נקבוביות: 5 μ mלמנוע בועות אוויר
בופרנורפיןTIPR פרמצבטיקה אחראית ושות', בע"ממשכך כאבים
מלקחיים המוסטטייםשנחאי מכשירים רפואיים ושות', בע"מJ31020כלי כירורגי
Heparinized מלחSPH מס '1 ביוכימי & פרמצבטיקה בע"מ למנוע היווצרות פקקת 
IsofluraneRWD מדעי החיים ושות 'הרדמה: לאינדוקציה ותחזוקה של הרדמה
פניצילין-סטרפטומיצין ביוטיים ביוטכנולוגיה ושות', בע"מC0222אנטיביוטיקה במבחנה למניעת זיהום מיקרוביאלי
משאבה פריסטלטיתBaoding Longer Precision Pump Co., Ltd.BT100-1L
פוספט חוצץ מלחשנחאי טיטאן מדעי ושות', בע"מ4481228 חומצה זרחתית חומצה זרחתית תמיסת מלח
צינור סיליקוןBaoding ארוך יותר דיוק משאבת ושות', בע"מ2.4 ופעמים; 0.8 מ"מ
תפר משיYangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory6-0 ו-3-0כלי דם Ligate
נתרן Dodecyl סולפטשנחאי Titan Scientific Co., Ltd.151-21-3חומר ניקוי יוני, ממיס גם ממברנות תאים וגם ממברנות גרעיניות
משאבת מזרקשנזן Mindray Bio-Medical Electronics Co., LtdBeneFusion SP5עירוי תוך ורידי
Triton X-100Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.9002-93-1חומר ניקוי לא יוני, משבש אינטראקציות שומנים-שומנים, חלבון-שומן וחלבון
DNA צנתר ורידיB. Braun Company24Gמחדיר את עורק הטחול

מקורות

  1. Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
  2. Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285(2023).
  3. Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
  4. Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972(2022).
  5. Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36(2022).
  6. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
  7. Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
  8. Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
  9. Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
  10. Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
  11. Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003(2019).
  12. Somuncu, Ö Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
  13. Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299(2022).
  14. Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786(2022).
  15. Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
  16. Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דה-צלולריזציה של הטחולמטריצה חוץ-תאיתכבד ביו-ארפיפיהנדסת רקמת כבדדה-צלולריזציה באמצעות פרפוזיהמחזורי הקפאה והפשרהפיגום של טחול חולדהשימור רשת כלי דםפיגום להשתתלה תאית
ייצור מטריצת טחול דה-צלולרית שמקורה בחולדות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.