מאמר שיטה

מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66522

⸱

14 ביוני 2024

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים כמה שיטות מבוססות לקביעת מתח רשתית אנדופלסמית (ER) והפעלת תגובת חלבון פרושה (UPR), עם דגש מיוחד על זיהום HIV-1. מאמר זה מתאר גם סדרה של פרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעה של מתח ER / UPR על שכפול HIV-1 והדבקה virion.

תקציר

זיהומים נגיפיים עלולים לגרום ללחץ של רטיקולום אנדופלסמי (ER) עקב הצטברות חלבון חריגה, מה שמוביל לתגובת חלבון מקופלת (UPR). וירוסים פיתחו אסטרטגיות כדי לתפעל את UPR המארח, אבל יש חוסר הבנה מפורטת של אפנון UPR ואת המשמעות התפקודית שלה במהלך זיהום HIV-1 בספרות. בהקשר זה, המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקולים המשמשים במעבדה שלנו למדידת רמות לחץ בחדר מיון ו- UPR במהלך זיהום HIV-1 בתאי T ואת ההשפעה של UPR על שכפול ויראלי והדבקה.

צביעת תיאופלבין T (ThT) היא שיטה חדשה יחסית המשמשת לזיהוי עקה בחדר מיון בתאים על ידי איתור צברי חלבונים. כאן, הדגמנו את הפרוטוקול לצביעת ThT בתאים נגועים ב- HIV-1 כדי לזהות ולכמת לחץ במיון. יתר על כן, מתח ER זוהה גם בעקיפין על ידי מדידת רמות של סמני UPR כגון BiP, IRE1 זרחני, PERK ו- eIF2α, שחבור של XBP1, מחשוף של ATF6, ATF4, CHOP ו- GADD34 בתאים נגועים ב- HIV-1, באמצעות אימונובלוטינג קונבנציונלי ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-PCR). מצאנו כי ThT-fluorescence מתואם עם האינדיקטורים של הפעלת UPR. מאמר זה גם מדגים את הפרוטוקולים לניתוח ההשפעה של לחץ ER ומודולציית UPR על שכפול HIV-1 על ידי ניסויי הפלה, כמו גם שימוש במולקולות פרמקולוגיות. ההשפעה של UPR על ביטוי / שכפול גנים של HIV-1 וייצור וירוסים נותחה על ידי מבחני כתב Luciferase ו- p24 antigen capture ELISA, בהתאמה, ואילו ההשפעה על זיהום ויריונים נותחה על ידי צביעה של תאי דיווח נגועים. באופן קולקטיבי, קבוצה זו של שיטות מספקת הבנה מקיפה של מסלולי תגובת החלבונים שנפרשו במהלך זיהום HIV-1, וחושפת את הדינמיקה המורכבת שלה.

מבוא

תסמונת הכשל החיסוני הנרכש (איידס) מאופיינת בירידה הדרגתית במספר לימפוציטים מסוג CD4+ T, מה שמוביל לכישלון מתקדם של התגובה החיסונית. וירוס הכשל החיסוני האנושי -1 (HIV-1) הוא הגורם הסיבתי לאיידס. זהו וירוס RNA חד-גדילי עטוף וחיובי עם שני עותקים של RNA לכל ויריון, והוא שייך למשפחת הרטרו-ויריים. ייצור ריכוזים גבוהים של חלבונים נגיפיים בתוך התא המארח יוצר לחץ מוגזם על מנגנון קיפול החלבונים של התא1. ER הוא התא הראשון במסלול ההפרשה של תאים אאוקריוטים. הוא אחראי על ייצור, שינוי והעברת חלבונים למסלול ההפרשה ולאתרי המטרה בחלל החוץ-תאי. חלבונים עוברים שינויים רבים לאחר התרגום ומתקפלים לקונפורמציה הטבעית שלהם בחדר המיון, כולל גליקוזילציה הקשורה לאספרגין ויצירת קשרים דיסולפידים תוך-מולקולריים ובין-מולקולריים2. לכן, ריכוזים גבוהים של חלבונים נמצאים בלומן ER ואלה נוטים מאוד לצבירה וקיפול שגוי. מצבים פיזיולוגיים שונים, כגון הלם חום, זיהומים מיקרוביאליים או נגיפיים, הדורשים סינתזת חלבון משופרת או מוטציה חלבונית, מובילים ללחץ בחדר המיון עקב הצטברות חלבון מוגברת בחדר המיון, ובכך מפריעים להומאוסטזיס לומן במיון. הלחץ בחדר המיון מפעיל רשת של מסלולי העברת אותות אדפטיביים שמורים ביותר, תגובת החלבון המקופלת (UPR)3. UPR משמש כדי להחזיר את המצב הפיזיולוגי הרגיל של ER על ידי יישור נטל החלבון הפתוח ויכולת הקיפול שלו. הדבר בא לידי ביטוי בהגדלת גודל חדר המיון והמלווים המולקולריים והקיפולים המתקפלים של חדר המיון, וכתוצאה מכך ניתן להעלות את יכולת הקיפול של חדר המיון. UPR גם מפחית את עומס החלבונים של חדר המיון באמצעות הנחתת סינתזת חלבונים גלובלית ברמת התרגום ומגביר את פינוי החלבונים המקופלים מהמיון על ידי ויסות פירוק הקשור ל- ER (ERAD)4,5.

לחץ ER מורגש על ידי שלושה חלבונים טרנסממברניים תושבי ER: חלבון קינאז R (PKR) דמוי רטיקולום קינאז (PERK), גורם שעתוק מפעיל 6 (ATF6), ואנזים דורש אינוסיטול מסוג 1 (IRE1). כל המשפיעים הללו נשמרים לא פעילים על ידי קשירה למלווה משפחת חלבוני הלם חום A (Hsp70) חבר 5 (HSPA5), הידוע גם בשם חלבון קושר (BiP)/78-kDa חלבון מווסת גלוקוז (GRP78). עם עקה בחדר מיון והצטברות של חלבונים מקופלים / לא מקופלים, HSPA5 מתנתק ומוביל להפעלה של גורמים אלה, אשר לאחר מכן מפעילים סדרה של מטרות במורד הזרם המסייעות בפתרון הלחץ בחדר המיון, ובתנאים קיצוניים, מקדמות מוות תאי6. עם דיסוציאציה מ- HSPA5, PERK autophosphorylates, ופעילות הקינאז שלו מופעלת7. פעילות הקינאז שלו פוספורילטים eIF2α, מה שמוביל להנחתה תרגומית, ומוריד את עומס החלבון של ER8. עם זאת, בנוכחות גורם אתחול פוספו-אאוקריוטי 2α (eIF2α), מסגרות קריאה פתוחות שאינן מתורגמות על mRNA ספציפי הופכות לעדיפות מתורגמות, כגון ATF4, המווסתות גנים הנגרמים על ידי לחץ. ATF4 וחלבון הומולוגי C/EBP (CHOP) הם גורמי שעתוק המווסתים גנים הנגרמים על ידי לחץ ומווסתים אפופטוזיס ומסלולי מוות תאי 9,10. אחת המטרות של ATF4 ו- CHOP היא עצירת גדילה וחלבון המושרה נזק ל- DNA (GADD34), אשר, יחד עם חלבון phosphatase 1 dephosphorylate peIF2α ופועל כמווסת משוב עבור הנחתה תרגומית11. תחת לחץ ER, ATF6 מתנתק מ-HSPA5, ואות הלוקליזציה של גולג'י שלו נחשף, מה שמוביל לטרנסלוקציה שלו למנגנון גולג'י. במנגנון גולג'י, ATF6 נבקע על ידי פרוטאז Site-1 (S1P) ופרוטאז Site-2 (S2P) כדי לשחרר את הצורה החתוכה של ATF6 (ATF6 P50). ATF6 p50 מועבר לאחר מכן לגרעין, שם הוא גורם לביטוי של גנים המעורבים בקיפול, הבשלה והפרשה של חלבונים, כמו גם פירוק חלבונים12,13. במהלך לחץ ER, IRE1 מתנתק מ- HSPA5, מכפיל ופוספורילטים אוטומטיים14. זרחן של IRE1 מפעיל את תחום ה-RNase שלו, ובמיוחד מתווך את השחבור של 26 נוקלאוטידים מהחלק המרכזי של ה-mRNA של חלבון קושר X-box 1 (XBP1)15,16. זה יוצר C-terminus חדשני המעניק פונקציית טרנסאקטיבציה, יצירת חלבון XBP1s פונקציונלי, גורם שעתוק רב עוצמה השולט במספר גנים הנגרמים על ידי לחץ ER17,18. הפעילות המשולבת של גורמי שעתוק אלה מפעילה תוכניות גנטיות שמטרתן לשחזר הומאוסטזיס במיון.

ישנן שיטות שונות לזיהוי מתח ER ו- UPR. אלה כוללים את השיטות המקובלות לניתוח סמני UPR19,20. שיטות לא קונבנציונליות שונות כוללות מדידת מצב חמצון-חיזור של UPR ופיזור סידן בלומן ER, כמו גם הערכת מבנה המיון. ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לראות עד כמה לומן המיון גדל בתגובה ללחץ ER בתאים וברקמות. עם זאת, שיטה זו גוזלת זמן רב ותלויה בזמינותו של מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר עשוי שלא להיות זמין לכל קבוצת מחקר. כמו כן, מדידת שטף הסידן ומצב החיזור של חדר המיון מאתגרת בשל זמינותם של ריאגנטים. יתר על כן, הקריאה מניסויים אלה רגישה מאוד ועשויה להיות מושפעת מגורמים אחרים של חילוף החומרים התאי.

טכניקה רבת עוצמה ופשוטה לניטור יציאות ה- UPR היא למדוד את ההפעלה של מסלולי האיתות השונים של ה- UPR ושימשה במשך עשרות שנים בתרחישי לחץ שונים. שיטות קונבנציונליות אלה למדידת הפעלת UPR הן חסכוניות, ישימות ומספקות את המידע בפחות זמן בהשוואה לשיטות ידועות אחרות. אלה כוללים immunoblotting כדי למדוד את הביטוי של סמני UPR ברמת החלבון, כגון זרחן של IRE1, PERK, ו eIF2α ו מחשוף של ATF6 על ידי מדידת צורת P50 של ATF6 וביטוי חלבון של סמנים אחרים כגון HSPA5, שחבור XBP1, ATF4, CHOP ו GADD34, כמו גם RT-PCR כדי לקבוע את רמות mRNA, כמו גם שחבור של XBP1 mRNA.

מאמר זה מתאר קבוצה מאומתת ואמינה של פרוטוקולים לניטור לחץ בחדר מיון והפעלת UPR בתאים נגועים ב- HIV-1 ולקביעת הרלוונטיות התפקודית של UPR בשכפול HIV-1 והדבקה. הפרוטוקולים משתמשים בריאגנטים זמינים וחסכוניים ומספקים מידע משכנע על תפוקות UPR. לחץ ER הוא תוצאה של הצטברות של חלבונים מקופלים / לא מקופלים, אשר נוטים ליצור צברי חלבונים21. אנו מתארים בזאת שיטה לאיתור צברי חלבונים אלה בתאים נגועים ב- HIV-1. צביעת תיאופלבין T היא שיטה חדשה יחסית המשמשת לזיהוי וכימות צברי חלבונים אלה22. Beriault ו Werstuck תיארו טכניקה זו כדי לזהות ולכמת אגרגטים חלבונים, ומכאן רמות העקה ER בתאים חיים. הוכח כי המולקולה הפלואורסצנטית הקטנה תיופלבין T (ThT) נקשרת באופן סלקטיבי לצברי חלבונים, במיוחד סיבי עמילואיד.

במאמר זה, אנו מתארים את השימוש ב- ThT כדי לזהות ולכמת לחץ ER בתאים נגועים ב- HIV-1 ומתאמים אותו לשיטה הקונבנציונלית של ניטור UPR על ידי מדידת ההפעלה של מסלולי איתות שונים של UPR.

מכיוון שחסר גם מידע מקיף לגבי תפקידו של UPR במהלך הידבקות ב- HIV-1, אנו מספקים סדרה של פרוטוקולים להבנת תפקידו של UPR בשכפול HIV-1 ובהדבקה בנגיף. פרוטוקולים אלה כוללים את ההפלה בתיווך lentivirus של סמני UPR, כמו גם טיפול עם גורמי לחץ פרמקולוגיים במיון. מאמר זה מציג גם את סוגי הקריאה שניתן להשתמש בהם כדי למדוד את ביטוי הגן HIV-1, ייצור ויראלי, כמו גם את ההדבקה של הנגיפים המיוצרים, כגון בדיקת לוציפראז מבוססת לוציפראז מסוף ארוך (LTR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים p24 (ELISA) ובדיקת צביעה של כתב β-גל בהתאמה.

באמצעות רוב הפרוטוקולים הללו, דיווחנו לאחרונה על המשמעות התפקודית של זיהום HIV-1 על UPR בתאי T23, והתוצאות של מאמר זה מצביעות על אמינות השיטות המתוארות כאן. לפיכך, מאמר זה מספק סדרה של שיטות למידע מקיף לגבי יחסי הגומלין של HIV-1 עם מתח ER והפעלת UPR.

פרוטוקול

הערה: קווי התאים המשמשים כאן הם HEK-293T ו- Jurkat J6 (קו תאים CD4+T), שהתקבלו ממאגר התא, NCCS, פונה, הודו; TZM-bl, קו תאים הנגזר מ- HeLa ששילב עותקים של גנים β-גלקטוזידאז ולוציפראז תחת מקדם החזרה הטרמינלית הארוכה של HIV-1 (LTR)24 ו- CEM-GFP (קו תאים נוסף של כתב CD4+ T)25 התקבלו ממאגר האיידס של NIH, ארה"ב.

1. הכנה ואחסון מלאי וירוס HIV-1

  1. הכנת מלאי וירוס HIV-1
    הערה: מומלץ לתרגל הנחיות בינלאומיות הקשורות לבטיחות ביולוגית כפי שהן זמינות במדריך ארגון הבריאות העולמי (WHO) או המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) בכל הניסויים הקשורים ל- HIV-1. הטיפול בנגיף וכל ניסוי עם הנגיף החי צריך להיעשות רק בארון בטיחות ביולוגית מתאים השוכן לפחות במעבדת הכלה ברמת BSL2. ייצור חלקיקי HIV-1 זיהומיים באמצעות ערכת העברת יונקים סידן פוספט מתואר בסעיף זה של הפרוטוקול.
    1. זרעו תאי HEK-293T בצלחות של 90 מ"מ עם 10 מ"ל של שלם (בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין) DMEM (מדיום הנשר המעובד של דולבקו) בארון בטיחות ביולוגית מסוג A2 מסוג II ושמרו כ-12 שעות באינקובטור תרבית רקמות בטמפרטורה של 37°C כך שמפגש התאים הוא בין 50%-60%.
    2. למחרת, הכינו את תערובת הטרנספקציה: הכינו תמיסה A המכילה 25 מיקרוגרם של pNL4.3 (שיבוט מולקולרי של HIV-1) DNA פלסמיד בחיץ סטרילי, 86.8 μL של 2 M CaCl2, ואת המים הסטריליים הנותרים כדי ליצור את הנפח הסופי 700 μL עבור כל צלחת. הכינו תמיסה B המכילה 700 מיקרוליטר של 2x מלח חוצץ HEPES (HBS) עבור צלחת אחת. לאחר מכן, התאם את החישוב עבור המספר הכולל של הלוחות.
    3. כעת הוסף את פתרון ב' לתמיסה א' באופן טיפתי תוך ערבול מתמשך של פתרון א'. הנפח הכולל של תערובת transfection עכשיו הופך 1.4 מ"ל עבור צלחת אחת.
      הערה: הוספה מדויקת של פתרון B לתמיסה A מבחינת טיפה בזמן שמערבולות רציפות מובילות להיווצרות קומפלקסים מושלמים של טרנספקציה.
    4. דוגרים על תערובת זו בטמפרטורת החדר (RT) במשך כ-20 דקות. לאחר מכן, הוסיפו לאט את התערובת טיפה לכל צלחת המכילה 9 מ"ל טריים של DMEM מלא והעבירו את הצלחות לאינקובטור CO2 . לאחר 8-10 שעות, שנה את המדיה הקיימת עם טרי 10 מ"ל של DMEM מלא.
    5. לאחר 24 שעות לאחר שינוי במדיה, אספו את הסופרנאטנט (המכיל את חלקיקי הנגיף) מכל הלוחות בצינורות חרוטיים. צנטריפוגה במהירות של 600 x גרם למשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגה שולחנית במהירות נמוכה (רשימת חומרים) לסילוק פסולת תאים.
    6. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגות פוליאלומרים ומניחים אותם ברוטור המתנדנד של אולטרה-צנטריפוגה (טבלה של חומרים). בדקו את משקל מחזיקי הצינוריות לאיזון והתאימו עם מדיום סטרילי במידת הצורך.
    7. אולטרה-צנטריפוגה ב 1,41,000 x גרם במשך 2.5 שעות ב 4 °C (75 °F). לאחר מכן, בזהירות להוציא את הצינורות ולרוקן את supernatant לאט בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    8. לגלולה (שהיא הנגיף המרוכז כעת) בכל צינור, הוסף 1 מ"ל של RPMI לא שלם (Roswell Park Memorial Institute) 1640 בינוני ובצע פיפטינג נמרץ כדי לעקור את הכדור.
      הערה: הגלולה לאחר אולטרה-צנטריפוגה כמעט בלתי נראית לעין בלתי. לכן, יש להקפיד להוסיף RPMI 1640 באמצע הצינור, כך שהגלולה תסולק כראוי.
    9. לאחר מכן, להוסיף 25 μL של 1 M HEPES pH 7.4 ל 1 מ"ל של השעיית וירוס. Aliquot 50 μL של התרחיף לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל ואחסן אותם במקפיא -80 °C באופן מיידי לאחסון לטווח ארוך.
  2. כימות ריכוז הנגיף והדבקת הנגיפים
    הערה: לצורך חישוב ההדבקה של הנגיף, חיוני תחילה לכמת את ריכוזו, אשר נעשה על ידי p24 Antigen Capture ELISA (על פי הוראות היצרן ולכן אינו מתואר כאן; ראה טבלת חומרים). תהליך זה נותן את ריכוז הנגיף בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL) של המלאי, אשר משמש לאחר מכן לזיהוי מספר הנגיפים הזיהומיים במלאי באמצעות הניסוי הבא בתאי כתב TZM-bl26.
    1. לספור ולזרוע 0.1 x 106 תאי TZM-bl בצלחת 24 באר באמצעות 500 μL של DMEM מלא עבור כל באר ולשמור אותו באינקובטור תרבית תאים במשך 10-12 שעות.
    2. יש לוודא שהתאים נמצאים במפגש של 50%-60% לפני תחילת ההדבקה לצורך כימות הנגיף. שנה את המדיה הקיימת עם 250 μL של DMEM מלא טרי לכל באר.
      הערה: שמור היטב על בקרה חיובית כדי לשלול כל תקלה ניסיונית.
    3. חשב את כמות וירוס המלאי הדרוש לזיהומים של 1 ng, 0.1 ng ו- 0.01 ng בכפילויות. הוסף את כמות הנגיף המתאימה לבארות ושמור את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    4. לשטוף את התאים פעמיים עם 500 μL של DMEM לא שלם ולאחר מכן להוסיף 500 μL של DMEM מלא.
    5. המשך בהליך צביעת β-גל לאחר 36 שעות של החלפת מדיה.
      1. השליכו את המדיה הקיימת ושטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל PBS. תקן את התאים על ידי הוספת 500 μL של תמיסת הקיבוע (0.25% גלוטראלדהיד ב- PBS) לכל באר ודגר ב- RT בתוך ארון הבטיחות הביולוגית למשך 5-7 דקות.
      2. הכינו את תמיסת הצביעה כמפורט בטבלה 1. הרחק אותו מאור מכיוון ש- X-gal רגיש לאור.
      3. לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS. לכסות את התאים עם 500 μL של תמיסת צביעה מוכן טרי לדגור ב 37 ° C בחושך במשך 2-18 שעות.
      4. כדי לעצור את התגובה לאחר מכן, שטפו את התאים עם 500 μL של 3% dimethyl sulfoxide (DMSO) ב-PBS פעמיים ולאחר מכן שמרו את התאים ב-500 μL של PBS טרי.
      5. ספרו את התאים הכחולים הנגועים (כפי שמוצג באיור 1A) מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 עבור 5 שדות אקראיים. קח ספירה ממוצעת של 5 השדות והכפיל אותה עם גורם השדה וגורם הדילול. זה מכמת את חלקיקי הנגיפים המזהמים במלאי הנגיף.
        הערה: עבור צלחת באר 24, מקדם השדה הוא 75.
רכיביםהכנהעוצמת קול נדרשת
PBSהכינו PBS 1x ממלאי של 10x PBS14 מ"ל
אשלגן פרי-פרו ציאנידלהמיס 0.82 גרם של אשלגן Ferricyanide ו 1.06 גרם של אשלגן Ferrocyanide ב 25 מ"ל של 1x PBS0.75 מ"ל
מגנזיום כלורי1 מ"ל ב-1 מ"ל של 1x PBS15 מיקרוליטר
אקס-גללהמיס 30 מ"ג ב 0.6 מ"ל של N,N-dimethyl formamide (בחושך)0.3 מ"ל
סה"כ = 15 מ"ל

טבלה 1: רשימת הרכיבים הדרושים לצביעה β-gal בתאי TZM-bl.

2. זיהום HIV-1 של קווי תאי T

  1. הפשרה ותרבית קו תאי T שהונצח. במחקר זה נעשה שימוש בקו תאי CEM-GFP בתרבית במדיום RPMI 1640 מלא בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-500 מיקרוגרם/מ"ל G418.
  2. לספור ולקחת 2 מיליון תאים עבור כל נקודת זמן (לא נגוע, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות). קצור את התאים הלא נגועים באופן מיידי על ידי צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 5 דקות והוסף חיץ ליזה התא (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP40, 0.5 mM NaF, 1 mM DTT), בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז, 0.5 mM פנילמתיל סולפוניל פלואוריד (PMSF) ומעכב פוספטאז 1x (50 μL עבור 1-3 מיליון תאים) או lyse במגיב Trizol (1 מ"ל עבור 1-3 מיליון תאים) לבידוד RNA (ראה טבלה של חומרים).
  3. שטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום RPMI 1640 מלא המכיל פוליברן (5 מיקרוגרם/מ"ל) ב-100 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מדיום שלם.
    הערה: פוליברן הוא פולימר קטיוני המשמש להגברת זיהום רטרו-ויראלי בתאי יונקים.
  4. להשעות מחדש את 8 מיליון התאים ב 1 מ"ל של פוליברן המכיל מדיום מלא. כעת חשבו את נפח המלאי הנגיפי הדרוש ל-4 מיליון חלקיקי נגיפים, הוסיפו את מלאי הנגיף, והרכיבו את הנפח הכולל ל-2 מ"ל על ידי הוספת מדיה שלמה. זה הופך אותו ל-MOI של 0.5.
  5. שמור את התאים בתוך אינקובטור CO2 ב 37 ° C במשך 4 שעות, עם הקשה לסירוגין כל 30-45 דקות.
  6. לאחר 4 שעות, סובבו את התאים כלפי מטה והשליכו את הסופרנאטנט בזהירות לתוך ארון הבטיחות הביולוגית עם שיטות סילוק מתאימות.
    הערה: משלב זה ואילך, בצע צנטריפוגה של התאים במהירות של 100 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
  7. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של מדיום שלם. להשהות מחדש את התאים ב 8 מ"ל של תווך שלם, מה שהופך אותו 1 מיליון תאים / מ"ל.
  8. בצלחת תרבית רקמה של 6 בארות, זרעו מספר שווה של תאים במספר הבארות הנדרש ושמרו את הצלחת באינקובטור CO2 נשמר ב 37 מעלות צלזיוס.
  9. במשך 4 הימים הבאים, קצרו את התאים כל 24 שעות על ידי הוספת מאגר ליזה של תאים. כמו כן, לאסוף את supernatant ומיד להעביר אותו למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
  10. כדי לבדוק אם התרחשה הדבקה, המשך ללכידת אנטיגן p24 ELISA עבור כל נקודות הזמן. בצע דילול נכון עבור נקודות הזמן, כלומר, דילול נמוך יותר עבור נקודות זמן ראשוניות וגבוה יותר עבור נקודות זמן מאוחרות יותר בטווח של 1:50 עד 1:500. שרטטו את הקריאות בגרף שמתאר את התקדמות הזיהום (איור 1B).

3. צביעת תיאופלבין T לקביעת לחץ בחדר מיון

  1. תקן 1 מיליון תאי CEM-GFP נגועים ו- 0.5 MOI נגועים (נלקחו 72 שעות תאים נגועים) עם 200 μL של 4% paraformaldehyde ב- PBS למשך 20 דקות ב- RT.
  2. גלולה למטה את התאים ב 100 x גרם במשך 5 דקות ולטפל עם 500 μL של 0.1 M גליצין במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם 500 μL של PBS פעמיים. להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של PBS.
  3. הרכיבו את שקופיות הזכוכית, כרטיסי הסינון ותאי הדגימה. הוסף את 100 μL של תאים מרחפים לתאי הדגימה וסובב את התאים ב 1000 x גרם במשך 4 דקות כדי להדביק את התאים לשקופיות בציטוצנטריפוגה (טבלה של חומרים).
    הערה: לא יהיו מספיק תאים משותקים בשקופית בעקבות הצנטריפוגה הציטוצנטריפוגה אם תרחיף התא מדולל מדי. התאים צפויים להתגבש ולהיות מפוזרים בצורה גרועה לאחר הציטוצנטריפוגה, אם תרחיף התא מרוכז מאוד.
  4. חדרו את התאים למשך 10 דקות באמצעות טיפות של 0.1% Triton-X-100 ב-PBS (מספיק כדי לכסות את האזור שבו התאים נצמדו) ושטפו את התאים פעמיים על ידי הנחת PBS עם טיפה וניגוב PBS עם רקמה על ידי הטיית המגלשה.
  5. לדגור על התאים עם 10 μL של 5 מיקרומטר Thioflavin T במשך 30 דקות.
    הערה: אין לשטוף לאחר הדגירה עם ThT.
  6. הרכיבו את המגלשות באמצעות 5 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה (80% גליצרול v/v, 20% PBS v/v ו-8 מ"ג/מ"ל 1,4-diazabicyclo[2.2.2]אוקטן [DABCO]), הניחו את הכיסוי ואטמו את הכיסוי באמצעות לק. השאירו את המגלשות להתייבש.
    הערה: בכל השלבים האלה, ודא שהתאים אינם מתייבשים.
  7. צלם תמונות קונפוקליות של תאים קבועים עם עדשת טבילה גליצרול 63x במיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים). התאם את הגדרות העירור והפליטה הבאות: GFP (לדוגמה 494 ננומטר, Em. 519 ננומטר) ו-ThT (לדוגמה 458 ננומטר, Em. 480-520 ננומטר).
    הערה: יש לצלם כל ערוץ פלואורסצנטי ברצף, ולא בו-זמנית, כדי למנוע חפיפת ערוץ. GFP נלקח כאינדיקציה לזיהום HIV-1 כמו תאי CEM-GFP יש GFP תחת רגולציה של מקדם LTR, אשר יורה על זיהום HIV-125.
  8. המר את התמונות הפלואורסצנטיות ל- 8 סיביות לפני כימות באמצעות ניתוח סף. כמת את העוצמה של כל תא באופן ידני באמצעות תוכנה כמו Image J (~ 50 תאים)27. התווה את הגרף עם העוצמה של כל תא כנקודות על ציר Y כנגד קריטריונים לא נגועים ונגועים.
  9. כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה, קח שליטה חיובית, למשל, טיפול Thapsigargin (ידוע ER מתח inducer) במקרה זה28. טפל במיליון תאי CEM-GFP, כל אחד עם 1 μL של DMSO (בקרת רכב) ו -100 ננומטר של Thapsigargin במשך 12 שעות.
  10. קצרו את התאים ועברו תהליך לצביעת ThT כפי שהוזכר עבור דגימות נגועות (שלבים 3.1-3.8).
    הערה: עבור דגימות אלה, פלואורסצנטיות GFP אינה נדרשת. לפיכך, רק פלואורסצנטיות ThT נלכדת במיקרוסקופ קונפוקלי.

4. קביעת ההפעלה והביטוי של סמני UPR שונים

הערה: כדי לקבוע את הביטוי של סמני UPR נעשה שימוש בשתי שיטות: Immunoblotting ו- RT-PCR. עבור immunoblotting, לקצור את 0.5 MOI HIV-1 נגוע תאים CEM-GFP בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה (24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, ו 96 שעות לאחר ההדבקה) ולהשעות מחדש את גלולת התא בחיץ ליזה (כפי שהוזכר בשלב 2.2). לחלופין, עבור RT-PCR, כדורי התא הם lysed מגיב Trizol (1 מ"ל עבור 1-3 מיליון תאים) (ראה טבלה של חומרים). התאים המרחפים מחדש במאגר ליזיס ובמגיב טריזול יכולים להיות מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

  1. Immunoblotting לניתוח של סמני UPR.
    1. שמור את התאים המרחפים מחדש במאגר הליזיס על קרח למשך 45 דקות עם ערבוב לסירוגין באמצעות מערבולת.
    2. הפילו את התאים במהירות של 18000 x גרם למשך 15 דקות באמצעות צנטריפוגה מהירה (ראו טבלת חומרים). אספו את הסופרנאטנט בצינור טרי.
    3. כמת את ריכוז החלבון בכל דגימה באמצעות ברדפורד או מגיב דומה.
    4. קח ריכוז שווה של חלבון עבור כל דגימה והכן את דגימות החלבון במאגר Laemmli (מאגר 6x: 250 mM Tris-Cl pH 6.8, 10% SDS, 30% גליצרול ו-0.02% ברומופנול כחול; 5% β-מרקפטואתנול).
      הערה: עבור immunoblotting עבור כל סמן UPR, מינימום של 60-80 מיקרוגרם של חלבון שימש.
    5. מרתיחים את דגימות החלבון בטמפרטורה של 96°C למשך 5 דקות ונותנים סיבוב קצר.
    6. יש לפענח את דגימות החלבון בג'ל SDS-PAGE 10%-12% ולהעביר את החלבונים לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (ראו טבלת חומרים).
    7. יש לחסום עם חלב יבש 5% ללא שומן או אלבומין בסרום בקר (BSA) למשך 1-2 שעות, לשטוף פעמיים עם TBST (20 mM Tris pH7.4 ו-0.137 M NaCl; 0.1% Tween 20), ולבדוק עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים לחלבון כנגד סמני UPR (ראו טבלת חומרים) בנדנדה, למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת לאחר שטיפת הכתמים פעמיים עם TBST, יש לבדוק עם נוגדנים משניים מתאימים במשך שעה וחצי.
    8. שטפו שוב את הכתמים עם TBST ודמיינו את רצועות החלבונים באמצעות מצע לזיהוי כימילומינסנציה (ראו טבלת חומרים) במכשיר הדמיה מערבי של כתם.
  2. RT PCR
    1. בודדו את הרנ"א הכולל מהתאים באמצעות מגיב טריזול (ראו טבלת חומרים).
    2. הכן את cDNA מריכוז שווה של RNA באמצעות Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT) (ראה טבלת חומרים).
    3. נתח את האפנון של ביטוי mRNA של HSPA5, שחבור XBP1, ATF4, CHOP ו- GADD34 באמצעות qRT-PCR עם פריימרים ספציפיים לגן (טבלה 2). בקצרה, הכינו תערובות תגובה של 10 μL המכילות תבנית cDNA (100 ng), 5 μL של צבע ירוק SYBR (ראו טבלת חומרים), ו-10 pmol של כל זוג פריימר אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן. כוונן את עוצמת הקול באמצעות H2O סטרילי.
    4. הפעל את התערובות במכשיר PCR בזמן אמת באמצעות התוכנית הבאה: דנטורציה ראשונית ב- 95 ° C למשך 3 דקות ו- 40 מחזורים של 95 ° C עבור 30 שניות, 55 ° C עבור 30 שניות ו- 72 ° C במשך 30 שניות ולאחר מכן ניתוח עקומת ההתכה. חישוב שינוי הקיפול בביטוי גן המטרה ביחס לגן משק הבית (לדוגמה β-Actin) כ:
      שינוי קיפול = 2-Δ(ΔCT)
      כאשר ΔCT = CT (מטרה) − CT (גן לשמירה על הבית)
      ו-Δ(ΔCT) = ΔCT (מטופל) -ΔCT (בקרה)
    5. כדי לאשר עוד יותר את השחבור של XBP1, בצע RT-PCR כמותי למחצה עם דגימות לא נגועות ו 72 שעות נגועות.
      הערה: שחבור של XBP-1 mRNA נחקר באמצעות RT-PCR ברחבי אתר החיבור.
    6. הגבירו את ה-cDNA עם פריימרים XBP1 (טבלה 2) באמצעות תערובת מאסטר PCR באיכות גבוהה (ראו טבלת חומרים) בתנאים הבאים: מחזור אחד של 98°C למשך 30 שניות, ואחריו 5 מחזורים של 98°C למשך 15 שניות, 65*Δ-5°C למשך 30 שניות ו-72°C למשך 30 שניות, ולאחר מכן 30 מחזורים של 98°C למשך 15 שניות, 55 ° C עבור 30 s ו 72 ° C עבור 30 שניות, ואחריו הארכה סופית של 72 ° C למשך 10 דקות להחזיק ב 4 °C (75 °F).
    7. יש להפריד את האמפליקונים על ג'ל אגרוז 2.5% המכיל 50 ננוגרם של אתידיום ברומיד/מ"ל ולדמיין במכשיר ג'ל דוק. רצועת XBP1 קטנה יותר ב-26 נוקלאוטידים.

5. הפלת סמני UPR וניתוח ביטוי גנים מונע HIV-1 LTR וייצור וירוסים

  1. הכנת מבני shRNA להפלה של סמני UPR
    1. צור מבני shRNA באמצעות עמוד השדרה הווקטורי pLKO.1-TRC (וקטור שיבוט לנטיויראלי)29.
    2. בניית שני מבני shRNA לכל גן (IRE1, PERK, ATF6 ו-HSPA5). אוליגונוקלאוטידים של חושים ואנטי-סנסים המכוונים ל-mRNA של הגן בהתאמה מתוכננים על-ידי RNAi Consortium (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (טבלה 3).
      הערה: באופן דומה, ניתן ליצור מבני shRNA עבור סמני UPR אחרים.
    3. אנל את הפריימרים (100 ננומטר כל אחד קדימה ואחורה) ב 95 ° C ולאחר מכן קירור הדרגתי RT.
    4. לאחר מכן, הכניסו אותו לאתרי Age1 ו-EcoRI של וקטור pLKO.1 באמצעות ליגאז דנ"א T4 (ראו טבלת חומרים). אשר את הרצף על ידי ריצוף DNA.
      הערה: מבנה shRNA המכוון לגן LacZ משמש כבקרה שאינה ממוקדת.
  2. הפלת PERK, ATF6, IRE1 ו- HSPA5 בתאי HEK-293T, בדיקת Luciferase ו- p24 ELISA
    1. הכינו תערובת של מבנה shRNA (0.9 מיקרוגרם) ומגיב טרנספקציה כמו פוליאתילנימין (PEI) (3 מיקרוליטר של PEI עבור 1 מיקרוגרם DNA) (ראו טבלת חומרים) ב-50 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום על ידי ערבול ודגירת במשך 20 דקות.
    2. מתאי HEK-293T המכילים צלוחיות, טריפסיניזציה וזרעים ~ 0.25 x 106 תאים יחד עם תערובת הטרנספקציה בצלחת 24 באר, מה שהופך את הנפח הכולל של 125 μL ודגרה במשך 6 שעות ב 37 ° C באינקובטור CO2 . שיטה זו נקראת טרנספקציה הפוכה שבה התאים נזרעים יחד עם תערובת הטרנספקציה.
    3. לאחר 6 שעות, להוסיף 125 μL של מדיה מלאה לבארות ולהשעות מחדש את התאים אפילו זריעה.
      הערה: עבור ניסויי הדחה, טרנספקציה הפוכה (שלבים 5.2.1-5.2.3) מספקת יעילות טובה יותר הן עם shRNA והן עם siRNAs.
    4. לאחר 24 שעות, לבצע transfection השני. הכינו תערובת של pNL4-3 (100 ננוגרם), pLTR-Luc (100 ננוגרם) ו-pEGFP-N1 (50 ננוגרם) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) מבנים עם PEI (3 מיקרוליטר של PEI עבור 1 מיקרוגרם DNA) ב-50 מיקרוליטר של מדיה לא שלמה על ידי מערבולת. דגרו על התערובת במשך 20 דקות ב-RT. החליפו את המדיה הקיימת ב-250 μL של מדיה טרייה לא שלמה והוסיפו את התערובת לתאים.
      הערה: וקטור כתב עבור HIV-1 LTR פותח על ידי תת-שיבוט LTR מ-pU3RIII30,31 ל-pGL3basic במעבדה מוקדם יותר32. ביטוי GFP באמצעות pEGFP-N1 נוצל כדי לנרמל את יעילות הטרנספקציה32.
    5. שנה את המדיה לאחר 6 שעות לאחר הטרנספקציה עם 500 μL של DMEM מלא. לקצור את התאים לאחר 36 שעות עבור immunoblotting ו luciferase assay.
    6. לבדיקת לוציפראז, יש לתלות את התאים ולהשהות מחדש במצע לוציפראז שנרכש מסחרית (50 μL) (ראה טבלת חומרים). מוסיפים את ליזט התא המרחף לצלחת אטומה של 96 בארות ודגרים במשך 10-15 דקות. קבל את קריאת luciferase בלומינומטר. כמו כן, למדוד פלואורסצנטיות GFP באותן דגימות כדי לנרמל את קריאת לוציפראז בקורא לוחות microplate micromode (לדוגמה: 494 ננומטר, Em:519 nm).
    7. התווה את הגרף כיחידת לוציפראז/GFP על ציר Y.
      הערה: יש לבדוק את ההפלה של סמני UPR המתאימים, וניתן לעשות זאת על ידי immunoblotting או qRT-PCR באמצעות נוגדנים או פריימרים ספציפיים לגן, בהתאמה.
    8. אספו את הסופרנאטנטים לעיבוד עבור p24 ELISA כפי שהוזכר לעיל.
  3. יצירת תאים יציבים עם הפלת סמני UPR וזיהום HIV-1.
    1. הכן את חלקיקי Lentivirus על ידי הדבקת תאי HEK-293T שנזרעו בצלחת 6 בארות, עם מבני shRNA (1 מיקרוגרם) המתאימים יחד עם pMD2.G (וקטור מעטפת VSV-G) (0.75 מיקרוגרם), ו- psPAX2 (פלסמיד אריזה לנטיויראלי) (0.25 מיקרוגרם) (ראה טבלת חומרים) באמצעות PEI ביחס של 1 מיקרוגרם DNA: 3 μL של PEI. הכינו את התערובת ב-100 מיקרוליטר של DMEM לא שלם ודגרו במשך 20 דקות ב-RT. הוסיפו את התערובת ל-1.8 מ"ל של מדיה מלאה בתאי HEK-293T שנזרעו.
      הערה: זרעו תאי HEK-293T בצלחת 6 בארות לפחות 12 שעות לפני הטרנספקציה עד שהם מקבלים מורפולוגיה והם בערך 60-70% במפגש.
    2. לאחר 24 שעות של transfection, להוסיף 1 מ"ל של DMEM מלא לכל באר.
    3. יש לאסוף את הסופרנאטנטים לאחר 48 שעות, לאחסן במקפיא בטמפרטורה של -80°C, ולבצע p24 ELISA כדי לאשר את נוכחות הנגיף בסופרנאטנטים אלה. השתמש בסופרנאטנט לנטיויראלי גולמי זה להמרת תאי J6.
    4. לדגור על 2 מיליון תאים בצלחת 6 בארות עם נפח שווה של סופרנאטנט לנטיויראלי (500 μL) עבור כל לנטיוירוס בקרה והגנה ספציפי לגן ולהוסיף תווך RPMI 1640 שלם טרי בנוכחות פוליברן (5 מיקרוגרם / מ"ל) כדי להשלים את הנפח ל -2 מ"ל.
    5. לאחר 24 שעות, הוסף Puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) לכל באר כדי לבחור תאים יציבים. לאחר הוספת Puromycin, גלולה את התאים כל 24 שעות ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה טרייה עם Puromycin.
    6. עשו זאת עד שלא יהיה מוות תאי (~ שבוע). התאים ששרדו הם התאים היציבים עם הפלה גנטית רצויה.
      הערה: ניתן לבדוק את הפלת הגנים בהתאמה במרווחי זמן קבועים, ולבסוף, כאשר רק תאים ששרדו נראים במדיה המכילה פורומיצין באמצעות אימונובלוטינג או qRT-PCR.
    7. להדביק את LacZ ואת תאי knockdown ספציפיים לגן עם 0.5 MOI של HIV-1 כמתואר בסעיף 2 ולקצור את התאים 48 שעות לאחר ההדבקה.
    8. לאסוף את supernatant מכל דגימה ותהליך עבור p24-ELISA כפי שתואר קודם לכן, ולעבד את התאים כדי לבדוק את רמת knockdown על ידי immunoblotting.

6. טיפול בגורם מתח במיון וניתוח השפעתו על שכפול HIV-1

הערה: כדי לקבוע את ההשפעה של גירוי יתר של UPR במהלך שכפול HIV-1, ניתן להשתמש במולקולת השראות הפרמקולוגית, Thapsigargin.

  1. קביעת אחוזי הכדאיות של התא לאחר טיפול ב- Thapsigargin.
    הערה: ציטוטוקסיות של Thapsigargin נקבעת על ידי מגיב MTT (ראה טבלת חומרים).
    1. זרע 25,000-30,000 תאי CEM-GFP לכל באר בצלחת 96 באר המכילה 100 μL של RPMI מלא 1640. הוסף 100 ננומטר Thapsigargin למדיה ודגור ב 37 ° C באינקובטור.
      הערה: תאים שטופלו עם 1 μL של DMSO נלקחו כבקרת רכב.
    2. לאחר 48 שעות, להוסיף 10 μL של MTT (5 מ"ג / מ"ל) בכל באר לדגור בחושך במשך 4 שעות עבור היווצרות גבישי formazan ב 37 ° C עם 5% CO2.
    3. לאחר 4 שעות, ממיסים את הגבישים באמצעות 100 μL של איזופרופנול ליצירת צבע סגול ומודדים את הספיגה ב 570 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
    4. חישוב אחוז הכדאיות של התא בהתבסס על המשוואה המופיעה להלן
      % כדאיות התא = (שליטהOD570 -OD570 טיפול) / שליטהOD570 x 100
  2. טיפול מקדים ב- Thapsigargin וניתוח התקדמות זיהום HIV-1 על ידי p24 ELISA.
    1. זרעו מיליון תאי CEM-GFP בצלחת באר 12 המכילה 1 מ"ל של RPMI מלא 1640 וטפלו בתאים עם 100 ננומטר של Thapsigargin או 1 μL של DMSO (בקרת רכב) במשך 12 שעות באינקובטור CO2 הנשמר ב 37 ° C. לאחר 12 שעות, לשטוף את התאים עם RPMI מלא 1640 ולהדביק עם 0.5 MOI של HIV-1 כפי שתואר קודם לכן.
    2. קצרו את התאים בנקודות זמן שונות, כגון 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה, לצורך אימונובלוטינג.
    3. אספו את הסופרנאטנטים מכל דגימה ובצעו p24 ELISA כפי שתואר קודם לכן.
    4. התווה את הגרף עם ריכוז p24 במדגם כציר Y ונקודות הזמן בהתאמה כציר X.
    5. באמצעות immunoblotting, לנתח את השראת מתח ER עקב טיפול Thapsigargin על ידי מדידת הרמה של כל סמני UPR. מחקר זה השתמש ב- HSPA5 כסמן.

7. בדיקת זיהום TZM-bl β-gal לקביעת ההשפעה של UPR על הידבקות בנגיפים

הערה: כדי להבין את התפקיד של UPR בהדבקה של הנגיף, ניתן להשתמש בסופרנאטנט מהדפיקה כמו גם בטיפול ב- Thapsigargin, לבדיקת זיהום TZM-bl β-gal כמתואר בסעיף 1.2, בהתבסס על ריכוז p24 שנקבע על ידי p24 ELISA.

  1. להדביק תאי TZM-bl בריכוז שווה של p24 מכל דגימה ולבצע צביעה β-gal. ספרו את התאים הכחולים הנגועים תחת המיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 עבור 5 שדות אקראיים.
  2. קח ממוצע של הספירה של 5 השדות עבור כל דגימה מהשלבים לעיל.
  3. חשב את שינוי הקיפול כמפורט להלן:
    שינוי קיפול = מספר ממוצע של תאים כחולים בדגימות הבדיקה/מספר ממוצע של תאים כחולים בדגימת הבקרה.

תוצאות

בעבודה זו תיארנו פרוטוקול מפורט לחקר עקה במיון חוץ גופי והפעלת UPR בעת הידבקות ב-HIV-1 בתאי T (איור 2). מחקר זה מתאר גם שיטות לניתוח הרלוונטיות התפקודית של UPR בשכפול HIV-1 ובהדבקת נגיפים (איור 3).

לשם כך, ניתחנו את הלחץ בחדר המיון שנגרם על ידי זיהום HIV-1 על ידי התבוננות בצברי החלבונים בתוך התא על ידי צביעה עם תיאופלבין T. כפי שניתן לראות באיור 4A, עוצמת ה-ThT מייצגת את צברי החלבונים בתאים הלא נגועים והנגועים. באופן דומה, כבקרה חיובית, איור 4B מייצג את צביעת ה-ThT בתאים שטופלו ב-Thapsigargin. עוצמת ה-ThT המשופרת מצביעה על נוכחות של יותר צברי חלבונים, אשר מתואמים עם סטרס מוגבר בחדר המיון.

יתר על כן, כדי לאמת תצפית זו, נעשה שימוש בשיטה קונבנציונלית יותר, הכוללת ניתוח של סמני UPR. הפעלת UPR נותחה בתחילה על ידי הפעלת המשפיעים העיקריים -IRE1, ATF6 ו- PERK. ההפעלה של IRE1 נמדדה על-ידי ניתוח רמות הפוספו-IRE1 על-ידי אימונובלוטציה של תאים לא נגועים ונגועים שנקצרו בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה, כפי שמיוצג באיור 5A. העלייה ברמות pIRE1/Total IRE1 מצביעה על הפעלת IRE1. באופן דומה, ההפעלה של PERK נמדדה על-ידי רמות ה-phospho-PERK בתאים לא נגועים ונגועים (איור 5B). ההפעלה של ATF6 כומתה על-ידי רמת הביטוי של צורת ATF6 P50 על-ידי אימונובלוטינג (איור 5C). סמן חשוב נוסף של UPR הוא הרגולטור הראשי ומלווה ER, HSPA5. רמת HSPA5 נותחה גם על ידי immunoblotting, כפי שניתן לראות באיור 5D. פרוטוקול דומה בוצע עבור סמני UPR אחרים, כגון sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP ו-GADD34, תוך שימוש בנוגדנים הספציפיים שלהם (איור משלים 1). השחבור של XBP1 mRNA ניתן לניתוח הן על ידי RT-PCR כמותי (איור 5E) והן על ידי RT-PCR כמותי למחצה. מאחר ש-RT-PCR כמותי לא יכול היה לזהות שחבור באופן ספציפי, הוא הוצמד לבדיקת השחבור, שם נעשה שימוש ב-RT-PCR כמותי למחצה (איור 5F). עם הפרוטוקול הנ"ל, ראינו כי נתוני qRT-PCR תואמים את נתוני qRT-PCR למחצה. בדומה ל-qRT-PCR שבוצע עבור sXBP1, הפרוטוקול שימש לניתוח סמנים אחרים של UPR, כגון HSPA5, ATF4, CHOP ו-GADD34 ברמת ה-mRNA (איור משלים 2)

לאחר מכן, כדי לחקור את התפקיד של UPR בשכפול HIV-1 והדבקה של נגיפים, ביצענו הפלה של סמני UPR מסוימים: PERK ו- HSPA5. באמצעות הפרוטוקולים שהוזכרו, השגנו את הפלת הסמנים האלה לרמה משמעותית גם בתאי HEK-293T (איור 6A) וגם בתאי J6 (איור 6B). באמצעות תאי ההפלה האלה, חקרנו את ההשפעה של הפלת פעילות הגן המונעת על ידי HIV-1 LTR (איור 6A), אשר מיוצגת כיחס ביטוי Luc/GFP בדגימות המתאימות. ייצור הנגיף נמדד על-ידי p24 ELISA של הסופר-נטנט, כפי שמיוצג באיור 6B. ניתן לנתח את ההדבקה של הנגיפים המיוצרים גם באמצעות פרוטוקול צביעת β-גל באותו אופן שמוצג באיור 1A.

יתר על כן, באמצעות גורם כימי של מתח ER, Thapsigargin, ההשפעה של גירוי יתר של UPR על שכפול HIV-1, ייצור וירוסים, זיהום virion ניתן ללמוד. ציטוטוקסיות של Thapsigargin בריכוז נתון נותחה באמצעות בדיקת MTT (איור 7A), אשר מראה כי ציטוטוקסיות בריכוז הרצוי אינה מובהקת. החיסון עבור HSPA5 בוצע כדי לנתח את ההשפעה של התרופה על לחץ בחדר מיון (איור 7B). התוצאות מראות כי טיפול מקדים של 12 שעות של 100 ננומטר Thapsigargin גרם לביטוי של HSPA5 בנקודות כל הזמנים. p24 ELISA מראה את ההשפעה על ייצור הנגיף ואת ההדבקה של הנגיפים המיוצרים, אשר ניתן לנתח כפי שתואר קודם לכן.

figure-results-1
איור 1: כימות ההדבקה בנגיפים וניתוח התקדמות ההדבקה . (A) כימות הדבקה בנגיפים על ידי בדיקת β-gal מבוססת TZM-bl. ההדבקה של הנגיף נקבעה על ידי הוספת 1 ng, 0.1 ng ו-0.01 ng של הנגיף לתאי TZM-bl, ולאחר מכן צביעה של β-gal וספירת מספר התאים הכחולים. הגדלה: פי 10. (B) ניתוח התקדמות הזיהום בתאי CEM-GFP נגועים ב- 0.5 MOI HIV-1 בהתבסס על לכידת אנטיגן p24 ELISA של סופרנאטנטים בתרבית. תאי CEM-GFP היו נגועים ב-0.5 MOI של HIV-1, והסופרנאטנטים עובדו עבור p24 ELISA. קווי השגיאה מוצגים כערכי ממוצע ± S.E. כוכביות מציינות את רמת המובהקות, המצוינת באיורים כ- ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ו- ****=p ≤ 0.0001 כפי שנותח על ידי מבחן t של התלמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הצגה סכמטית של צעדים שיש לנקוט כדי לנתח את ההשפעה של זיהום HIV-1 על לחץ בחדר מיון ועל UPR. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תרשים זרימה של צעדים שיש לעקוב אחריהם כדי לנתח את ההשפעה של UPR על שכפול HIV-1, ייצור וירוסים והדבקה בנגיפים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח רמת העקה בחדר מיון בתאי T כתוצאה מזיהום HIV-1 באמצעות צביעת ThT. (A) תאי CEM-GFP היו נגועים ב-0.5 MOI של HIV-1 ונקצרו 72 שעות לאחר ההדבקה. התאים תוקנו ומוכתמים בתיאופלבין T. ביטוי GFP מצביע על תאי CEM-GFP נגועים. הגרף מראה את עוצמת תיאופלבין T במקרה של תאים לא נגועים ונגועים ב- HIV-1. נתונים מ~50 תאים מ-n = 3 שכפולים ביולוגיים מוצגים בגרף. (B) תאי CEM-GFP טופלו ב-DMSO וב-TG במשך 12 שעות. התאים תוקנו והוכתמו בתיאופלבין T. הגרף מראה את העוצמה של תיאופלבין T במקרה של DMSO ותאים שטופלו ב-TG. נתונים מ~50 תאים מ-n = 3 שכפולים ביולוגיים מוצגים בגרף. קווי השגיאה מוצגים כערכי ממוצע ± S.E. כוכביות מציינות את רמת המובהקות, המצוינת באיורים כ- ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ו- **** = p ≤ 0.0001 כפי שנותח על ידי מבחן t של סטודנט. האו"ם: לא נגוע; ב: נגוע; ט"ג: Thapsigargin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ניתוח הביטוי של סמני UPR שונים בתאי T נגועים ב-HIV-1. (A-E) תאי CEM-GFP נגועים ב- HIV-1 (0.5 MOI) נקצרו עד יום 4 כל 24 שעות ועובדו לניתוחים שונים כמתואר להלן. (A) ההפעלה של IRE1 נותחה על ידי immunoblotting של pIRE1. (B) הפעלת PERK נותחה על ידי immunoblotting של pPERK. (C) ההפעלה של ATF6 נותחה על ידי אימונובלוטינג של צורת ATF6 P50. (D) הביטוי של מלווה ER HSPA5 נותח על ידי immunoblotting HSPA5. (E) שחבור של XBP1 נותח על ידי qRT-PCR של sXBP1 באמצעות פריימרים ספציפיים בזמן אמת. (F) כדי לנתח את השחבור של XBP1 על ידי semi-qRT-PCR, XBP-1 mRNA הוגבר באמצעות RT-PCR על פני אתר החיבור, והפסים הודגמו. קווי השגיאה מוצגים כערכי ממוצע ± S.E. האו"ם: לא נגוע. IN: נגוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: ניתוח התפקיד של UPR על שכפול HIV-1 וייצור וירוסים. (A) PERK (פאנל שמאלי) ו-HSPA5 (פאנל ימני) הופלו בתאי HEK-293T, ובדיקת לוציפראז בוצעה כדי לנתח את פעילות הגן מונע ה-HIV-1 LTR. האימונובלוטים מראים את רמות ההפלות של החלבונים המתאימים. (B) PERK (פאנל שמאלי) ו-HSPA5 (פאנל ימני) הופלו בתאי J6, ו-p24 ELISA בוצע עם הסופרנאטנט שנאסף כדי לנתח את ייצור הנגיף. האימונובלוטים מראים את רמות ההפלות של החלבונים המתאימים. קווי השגיאה מוצגים כערכי ממוצע ± S.E. כוכביות מציינות את רמת המובהקות, המצוינת באיורים כ- ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ו- ****=p ≤ 0.0001 כפי שנותח על ידי מבחן t של התלמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: ניתוח ההשפעה של גורם הלחץ הכימי ER, Thapsigargin, על התקדמות זיהום HIV-1. (A) כדאיות התא של תאי CEM-GFP לאחר הטיפול ב- Thapsigargin- 100 ננומטר. כדאיות התא מנותחת על ידי בדיקת MTT. (B) תאי CEM-GFP שטופלו מראש ב-100 ננומטר של TG במשך 12 שעות היו נגועים ב-0.5 MOI של HIV-1 ונקצרו בנקודות זמן של 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה. האימונובלוט מראה את ההשפעה של TG על הביטוי של HSPA5, ואילו הגרף מראה את ייצור הנגיף כפי שנותח על ידי p24 ELISA. קווי השגיאה מוצגים כערכי ממוצע ± S.E. כוכביות מציינות את רמת המובהקות, המצוינת באיורים כ- ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ו- ****= p ≤ 0.0001 כפי שנותח על ידי מבחן t של התלמיד. ט"ג: Thapsigargin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים משלים 1: ניתוח הביטוי של סמנים שונים במורד הזרם של UPR. ביטוי של (A) sXBP1, (B) זרחן של eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP ו-(E) GADD34 כפי שנותח על ידי immunoblotting. (א-ה) תאי CEM-GFP שנדבקו ב-0.5 MOI של HIV-1 נקצרו ב-24 שעות, 48 שעות, 72 שעות ו-96 שעות לאחר ההדבקה ושימשו לאימונובלוטינג. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: ניתוח סמני UPR שונים ברמת mRNA על ידי qRT-PCR. (א-ד) תאי CEM-GFP נגועים ב- 0.5 MOI של HIV-1 נקצרו כל 24 שעות עד יום 4 ושימשו ל- qRT-PCR של (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP ו- (D) GADD34. קווי השגיאה מוצגים כערכי ממוצע ± S.E. כוכביות מציינות את רמת המובהקות, המצוינת באיורים כ- ns = p ≥ 0.05, * = p ≤ 0.05, ** = p ≤ 0.01, *** = p ≤ 0.001 ו- **** = p ≤ 0.0001 כפי שנותח על ידי מבחן t של התלמיד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

מבנהרצף פריימר 5' עד 3'
XBP1 שחבור ASSAY FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
XBP1 שחבור ASSAY RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
XBP1 שחבור FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
XBP1 R שחבורATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 וCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTGTCAGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RGAAGGTCATCTGGCATGGTT
צ'ופ פCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
צ'ופ רCAGAGCTGGAACCTGAGGAGAG
GADD34 FATGGACAGTGACCTTCTCGG
GADD34 RCTGGGCTCCTCCTAGGCT
אקטין פAGAAAATCTGGCACCACACC
אקטין רGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

טבלה 2: רשימת פריימרים המשמשים לניתוח RT-PCR. ו: קדימה; R: הפוך

מבנה shRNAרצף פריימר 5' עד 3'
הטבה SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
הטבה SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTCTCGATAATTACTAATGACCTGCCG
הטבה SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
הטבה SH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGCGAGTTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAGTTCGAGAACTCTTCGCTTTTTGGACTAGG
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGGACATTAAGCAGGTTTTTG
אירלנד1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAGAGAGGTTGGTTGGTTTTTTTTG
IRE1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTTCTCTACTCGAGTACAGAAGAGGTTGGTTGGGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
LacZ FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
LacZ RAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGTCACGACGTTGTAATACGA

טבלה 3: רשימת פריימרים המשמשים ליצירת מבני shRNA. ו: קדימה; R: הפוך

דיון

היקף הפרוטוקול הנוכחי כולל (i) טיפול במלאי נגיף HIV-1 ומדידת ריכוז הנגיף והדבקה בנגיף, (ii) זיהום תאי T ב- HIV-1 והערכת השפעתו על לחץ ER וסמנים שונים של UPR, (iii) השפעת הפלת סמני UPR והשפעתם על פעילות גנים מונעת HIV-1 LTR, ייצור וירוסים והדבקה בנגיפים ו-(iv) גירוי יתר של ה-UPR באמצעות מולקולה פרמקולוגית וניתוח השפעתו על שכפול HIV-1. באמצעות מערכת הפרוטוקולים הנוכחית, ניתן לקבל מידע מקיף על יחסי הגומלין של HIV-1 ו- UPR. הפרוטוקולים המפורטים במחקר זה קלים לביצוע, חסכוניים ואמינים ביותר.

מכיוון ש- UPR הוא מסלול איתות רגיש ללחץ, העבודה על כך כרוכה בצעדים עדינים למדי. בכל הניסויים אנו ממליצים להימנע מתאים בעלי מעברים ארוכים על מנת להשיג עקביות בתוצאות. חשוב גם לשמור על תנאים סטריליים בכל טכניקות תרבית התא כדי למנוע זיהומים חיידקיים ושמרים, כפי שהם יכולים לעכב את הניסויים ואת התוצאות המתאימות. יתר על כן, בעת טיפול בתאים במהלך ניסויים, כולל גידולם לאחר מכן, למנוע שינויי טמפרטורה קשים או ממושכים ולוודא שהתאים בריאים וללא סטרס מלכתחילה. אחרת, השינויים עלולים לגרום ללחץ נוסף על התאים, אשר יכול לשנות את התוצאות. נסו לשמור על נקודות הזמן קבועות ככל האפשר מכיוון ש- UPR הוא מסלול איתות רגיש, ושינוי קל בנקודות הזמן יכול לשנות את התוצאות.

שיטת צביעת ThT המזהה אגרגטים חלבוניים ומשמשת לקביעת לחץ ER22מראה את רמות הלחץ בחדר המיון בתאים הנגועים ב- HIV-1 בצורה ברורה מאוד., צביעת ThT מבוססת על זיהוי של אגרגטים חלבוניים, אשר מתואמים עם מתח ER. עם זאת, יש לציין כי הפעלת UPR לא תמיד יכולה להיות מתואמת עם צברי חלבונים מכיוון שניתן להפעיל את מסלולי האיתות הבודדים של UPR ישירות ללא מעורבות של אגרגטים חלבוניים. לכן, למרות ששיטת צביעת ThT זו נותנת מושג על רמות הלחץ של ER, לניתוח מעמיק של הפעלת UPR, תמיד יש לאמת אותה עם ניתוח נוסף של סמני UPR. כמו כן, כדי להגדיר עוד יותר את הלוקליזציה התת-תאית של צביעת ThT, ניתן להשתמש בסמנים כגון KDEL במקרה של סימון ER. יתר על כן, במקרים רבים, לחץ ER גורם לשינוי בגודל התא ובצורתו, כך שניתן לקחת בחשבון גם את שטח התאים בעת כימות עוצמת ה- ThT. זמינותם של נוגדנים מסחריים רגישים ביותר, אמינים וחסכוניים לגנים ספציפיים חוללה מהפכה בהיבטים רבים של תחום מדעי החיים, ואפשרה ניתוח קל יותר של רמות החלבונים בתאים. כמו כן, כיום, סוגים רגישים מאוד של ציוד זמינים כדי לדמיין את רצועות החלבונים על כתמים ולהפוך את הכימות מהיר וקל יותר. לפיכך, ההפעלה של סמני UPR ניתן לנתח בקלות על ידי immunoblotting. עם זאת, מכיוון שהביטוי של חלבוני סמן UPR נמוך יחסית, כך יש להשתמש בריכוז משמעותי של חלבון כדי לנתח את הביטוי שלהם. יתר על כן, דילול הנוגדנים הראשוניים צריך להיות אופטימלי כראוי על בסיס ביטוי החלבון בתאים המשמשים על מנת למנוע קשירה לא ספציפית ורעשי הרקע בגושים. כמו כן, כפי שמוצג ב איור 4Cנוגדן ATF6 הוא רב-שבטי ונותן מספר פסים לא ספציפיים., יש צורך באופטימיזציה נכונה של שטיפה וריכוז נוגדנים כדי להפחית את הפסים הלא ספציפיים הללו במידה מסוימת. יש לשטוף את הכתמים כראוי לאחר הדגירה בתמיסת חסימה, נוגדן ראשוני ונוגדן משני כדי להפחית את הרקע ואת הפסים הלא ספציפיים. בעת פיתוח הכתמים, יש להימנע מרוויה יתר של הלהקות כדי לקבל הדמיה נכונה של הדפוס בתוצאות המתקבלות. בהסתכלות על המיקוד הרחב של מאמר שיטה זה, לא התמקדנו בשיטות מפורטות ובפתרון בעיות עבור טכניקות אימונובלוטינג כלליות; עם זאת, ניתן להפנות למאמרי השיטה של מחמוד ויאנג33 וכן גוש ואח'.34 לאותו דבר. מכיוון שכיום RT-PCR היא שיטה נפוצה מאוד, הפריימרים הזמינים בקלות ומכונות RT-PCR מספקים נתונים לניתוח סמני UPR מסוימים. עם זאת, יש לנקוט באמצעי זהירות בעת הכנת ה- RNA וה- cDNA עבור RT-PCR מכיוון שמדובר בשיטה רגישה מאוד, ושינויים קלים באיכות הדגימות והפיפטינג יכולים להוביל לשינויים עצומים בקריאה. כל זיהום DNA או חלבון יש להסיר מדגימות RNA. כמו כן, תמיד לקחת את הדגימות triplicates עבור qRT-PCR, כך שגיאת pipetting ניתן להפחית. ריכוז ה- DNA המשמש ל- qRT-PCR צריך להיות אופטימלי כך שערך ה- CT עבור כל דגימה יהיה מתחת ל- 30, מכיוון שכל דבר מעבר ל- 30 נחשב לא אידיאלי. תמיד יש לשמור בקרה שלילית עבור qRT-PCR כדי למנוע קריאה חיובית שגויה. השחבור של XBP1 ניתן לנתח הן על ידי qRT-PCR כמו גם semi-qRT-PCR. מכיוון ש- qRT-PCR לא יציג במדויק את השחבור, יש לבצע תמיד semi-qRT-PCR מלבד qRT-PCR כדי לאמת את הנתונים ולקבוע את יחס XBP1 היחסי שחבור ל- XBP1 לא שחבור. מכיוון שההבדל בין הגודל של XBP1 שחבור ללא שחבור הוא רק 26 nt, יש להשתמש באחוז גבוה יותר של ג'ל אגרוז כדי לפתור את הג'ל. כמו כן, יש לפתור את הפסים במתח נמוך ומשך זמן ארוך יותר להפרדה טובה יותר. שיטה נוספת אשר פופולרית יותר כיום כדי לצפות שחבור של XBP1, היא בדיקת שחבור אשר משתמשת ב Pst1 הגבלת עיכול אנזים של cDNA ומספק הדמיה טובה יותר של שחבור XBP135. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לדמיין את השחבור של XBP1 בדגימות נגועות ב- HIV-1. התוצאות המתקבלות מאימונובלוטינג ו- RT-PCR יכולות לשמש לאימות תוצאות צביעת ThT.

התוצאות המייצגות המוצגות באיור 5 מצביעות על כך שהפעלת UPR בעת הידבקות ב-HIV-1 נמצאת בקורלציה עם צביעת ThT המשופרת שמוצגת באיור 4. עם זאת, מגבלות השימוש באימונובלוטינג וב- RT-PCR לניתוח UPR הן שהן קפדניות, ויש לנטר תוצרי גנים מרובים מכיוון שניתן לשנות את הגנים הבודדים של UPR באופן עצמאי על ידי גורמי לחץ שאינם ER. כמו כן, שיטות אלה מודדות בעקיפין את הלחץ בחדר המיון על ידי התבוננות בסמני UPR השונים. לכן צביעת ThT וניתוח סמני UPR על ידי immunoblotting ו- RT-PCR יכולים לשמש יחד כדי לנתח את ההשפעה של זיהום HIV-1 על מתח ER והפעלת UPR בתאי T.

החלק השני של מאמר זה עוסק בפרוטוקולים המעורבים בהבנת ההשפעה של UPR על שכפול HIV-1. שיטת הטרנספקציה ההפוכה המשמשת להפלה של סמני UPR המתוארת במאמר זה נמצאה כנותנת הפחתה משמעותית בביטוי של סמני UPR. כפי שהוזכר בפרוטוקול, פלואורסצנטיות GFP שימשה לנרמל את קריאת לוציפראז עבור בדיקת לוציפראז. עם זאת, במקרים רבים, קריאת GFP יכולה להיות מושפעת גם בשל טרנספקציה הגן הספציפי36אז במקרה כזה, אפשר להשתמש בסמנים פלואורסצנטיים אחרים כגון RFP, YFP, או ריכוז החלבון הכולל כדי לנרמל את קריאת לוציפראז., כמו כן, במקרים מסוימים שבהם התאים קשים לליז, כגון תאי TZM-bl, ניתן להוסיף מגיב ליזה נוסף לפני הוספת מצע לוציפראז. כפי שמיוצג בתוצאות, תוצאות לוציפראז (איור 6A פאנל שמאלי) תואם לתוצאות p24 ELISA במקרה של PERK (איור 6B פאנל שמאלי), שבו הפלת PERK מפחיתה באופן משמעותי את פעילות הגן HIV-1 ואת ייצור הנגיף. בעוד שבמקרה של HSPA5, הפלת HSPA5 אינה משפיעה על פעילות הגן מונחה LTR (איור 6A פאנל ימני) לפי תוצאות בדיקת לוציפראז, בעוד שהוא משפיע על ייצור הנגיף על פי p24 ELISA (איור 6B פאנל ימני). בדרך זו, תוצאות אלה מצביעות על כך שלסמני UPR שונים יכולות להיות השפעות שונות על פעילות הגן מונע HIV-1 LTR ועל ייצור הנגיף. האנטיגן p24 שנמדד בסופרנאטנט על ידי ELISA מעיד בעיקר על ריכוז חלקיקי הנגיף המשתחררים בתרבית העל. לכן, באופן שגרתי, חוקרים השתמשו בתוצאות לכידת אנטיגן p24 ELISA כאינדיקציה עקיפה לייצור וירוסים בתא supernatant37. לפיכך, בדיקת לוציפראז בתאים ו- p24 ELISA של הסופרנאטנט יכולים לשמש יחד כדי לקבוע את ההשפעה על פעילות הגן מונע HIV-1 LTR ועל ייצור הנגיף. כמו כן, פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח ההשפעה של סמני UPR אחרים על פעילות גנים מונחי HIV-1 LTR וייצור וירוסים באמצעות shRNA ספציפי לגן. עבור כל אותם ניסויים הכוללים קריאות של p24 ELISA ובדיקת לוציפראז, חשוב לוודא כי דילולים נאותים וזמן הדגירה נשמרים ואין להתחשב בערכים הנכנסים תחת הקטגוריה של החריג. לדוגמה, בעת ביצוע p24 ELISA, OD450 ערך בין 0.1-2 נחשב אידיאלי. הגישה השנייה לחקור את התפקיד של UPR בשכפול HIV-1 היא השימוש במולקולות פרמקולוגיות כגון Thapsigargin, גורם מתח ER או TUDCA, מעכב מתח ER. תרופות אלה נפוצות מאוד לחקר UPR בהקשרים שונים38,39,40,41. במאמר זה, הדגמנו את הפרוטוקול לטיפול ב- Thapsigargin וניתחנו את השפעתו על התקדמות זיהום HIV-1 בתאי T. לפני השימוש בתרופה לכל ניסוי, מומלץ מאוד לבדוק את כדאיות התא עבור מגוון מינונים עבור התרופה בקו התא לשימוש. יש להימנע מהריכוז שנותן פחות מ~80% כדאיות התא בקו התא הנתון. יתר על כן, עבור בדיקות כדאיות התא, תאים בריאים תמיד צריך לקחת, כמו תאים שכבר נמצאים בסטרס לא יראו את הקריאה הנכונה, ופסולת התא יכולה ליצור עכירות ולתת קריאות שווא. הפרוטוקול שהוזכר במחקר זה מראה את ההשפעה של Thapsigargin על שכפול נגיפי במשך 72 שעות לאחר ההדבקה, מה שמספק הבנה טובה יותר של השפעת התרופה על שכפול ויראלי לאורך זמן. אפשר גם לקחת מרווחי זמן קצרים יותר כגון 12 שעות, 24 שעות, 36 שעות, 48 שעות, 60 שעות ו -72 שעות לאחר ההדבקה כדי לנתח עוד יותר את נקודת הזמן המוקדמת ביותר שבה התרופה מתחילה להראות את השפעתה על שכפול הנגיפי.

מאחר ש-UPR מעורב גם בפירוק חלבונים ובדינמיקה של ממברנות 42,43, ייתכן של-UPR יכול להיות תפקיד בהדבקה של נגיפים. ניתן לנתח את ההדבקה של הנגיפים המיוצרים על ידי התאים גם באמצעות פרוטוקול נתון. הפרוטוקולים הנ"ל יכולים לשמש גם כדי לקבוע את ההשפעה של זיהום HIV-1 על לחץ ER ו- UPR והרלוונטיות התפקודית שלו ב- PBMCs אנושיים למחקרים רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית. הבנת תפקודו של ER-UPR בזיהום HIV-1 חיונית בשל המודעות הגוברת למעורבותו בהתפתחות מחלות קשות רבות. המידע המתקבל באמצעות קבוצה זו של שיטות יוסיף לשדה זה שלא נחקר על ידי הצעת הבנה חשובה של האינטראקציה בין HIV-1 ו- UPR.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

אנו מודים למרכז הלאומי למדעי התא, המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו, על התמיכה הפנימית. AT ו- AD אסירי תודה על תמיכת המחקר לתואר שלישי שהתקבלה מהמרכז הלאומי למדעי התא, המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו. DM אסירת תודה על המלגה הלאומית של JC Bose מ- SERB, ממשלת הודו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AcrylamamideBiorad, ארה"ב1610107
AgaroseG-Biosciences, ארה"בRC1013
אמוניום פרסולפטסיגמא-אולדריץ', ארה"בA3678
נוגדן נגד ATF4טכנולוגיית איתות תאים, ארה"ב11815זיהוי כתמים מערביים דילול-1:1000
נוגדן נגד ATF6Abcam, בריטניהab122897זיהוי כתמים מערביים דילול-1:1000
נוגדנים נגד CHOPטכנולוגיית איתות תאים, ארה"ב2897זיהוי כתמים מערביים דילול-1:1000
אנטי-eIF2 ואלפא; נוגדןסנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"בsc-11386זיהוי כתמים מערביים דילול-1:2000 
נוגדן נגד GADD34Abcam, בריטניהab236516זיהוי כתמים מערביים דילול-1:1000
נוגדן נגד GAPDHסנטה קרוז ביוטכנולוגיה, ארה"בsc-32233זיהוי כתמים מערביים דילול-1:3000 
נגד HSPA5, ארה"ב3177זיהוי כתמים מערביים דילול-1:1000
נוגדנים נגד IRE1טכנולוגיית איתות תאים, ארה"ב3294זיהוי כתמים מערביים דילול-1:2000
נוגדן מצומד HRP נגד עכבר Biorad, ארה"ב1706516זיהוי כתמים מערביים דילול - 1:4000
anti-peIF2 ו-alpha; נוגדןInvitrogen, ארה"ב44-728Gזיהוי כתמים מערביים דילול-1:1000
anti-PERK anti-PERKטכנולוגיית איתות תאים, ארה"ב5683זיהוי כתמים מערביים דילול-1:2000
נוגדן anti-pIRE1Abcam, בריטניהab243665זיהוי כתמים מערביים דילול-1:1000
נוגדן נגד pPERKInvitrogen, ארה"בPA5-40294זיהוי כתמים מערביים דילול-1:2000
נוגדן מצומד HRP נגד ארנבBiorad, ארה"ב1706515זיהוי כתמים מערביים דילול- 1:4000
נוגדן נגד XBP1Abcam, בריטניהab37152זיהוי כתמים מערביים דילול-1:1000
צנטריפוגה במהירות גבוהה ספסלאפנדורף, ארה"ב5804Rרוטור- F-45-30-11
צנטריפוגה ספסל במהירות נמוכהאפנדורף, ארה"ב5702Rרוטור- A-4-38
ביס-אקרילאמידביורד, ארה"ב1610201
סרום בקר אלבומין (BSA)MP ביומדיקל, ארה"ב160069
מגיב ברדפורדBiorad, ארה"ב5000006
ערכת טרנספקציה של יונקים CalPhosClontech, Takara Bio, ארה"ב631312מלאי וירוסים הכנה
CEM-GFPNIH, AIDS מאגר, ארה"ב3655
Clarity ECL מצעBiorad, ארה"ב1705061מצע זיהוי כימילומינסנציה
בהירות מקסימום מצע ECLBiorad, ארה"ב1705062מצע זיהוי כימילומינסנציה
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליאולימפוס, יפןדגם: FV3000
צנטריפוגה ציטוספיןThermo Fisher Scientific, ארה"בASHA78300003
DMEMInvitrogen, ארה"ב11995073
DMSOSigma-Aldrich, ארה"בD2650
dNTPsPromega, ארה"בU1515
DTTInvitrogen, ארה"בR0861
EDTAInvitrogen, ארה"ב12635
EtBrInvitrogen, ארה"ב 15585011
סרום בקר עובריInvitrogen, ארה"ב16000044
G418Invitrogen, ארה"ב11811023
גלוטראלדהיד 25%סיגמא-אולדריץ', ארה"בG6257בדיקת זיהום
גליציןתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"בQ24755
HEK-293TNCCS, הודו
HIV-1 שיבוט מולקולרי זיהומי pNL4-3NIH, מאגר איידס, ארה"ב114
מיקרוסקופ הפוךניקון, יפןדגם: Eclipse Ti2
iTaq אוניברסלי SYBR Green SupermixBiorad, ארה"ב1715124
Jurkat J6NCCS, הודו
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ', ארה"בM8266זיהום מבחן
MMLV-RT Invitrogen, ארה"ב28025013
מגיב MTTSigma-Aldrich, ארה"בM5655בדיקת כדאיות תאים
N,N-dimethyl formamideFluka Chemika40255בדיקת זיהום
NaClThermo Fisher Scientific, ארה"בQ27605
NaFSigma-Aldrich, ארה"ב201154
NP40Invitrogen, ארה"ב85124
ערכת לכידת אנטיגן P24 ELISAABL, ארה"ב5421
PageRuler סולם חלבון צבוע מראשמדע בדיוני ביולוגי, הודוPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, ארה"בP6148
pEGFP-N1Clontech, ארה"ב632515
פניצילין/סטרפטומיציןInvitrogen, ארה"ב151140122
מעכב פוספטאזסיגמא-אולדריץ', ארה"ב4906837001
Phusion תערובת מאסטר PCR בנאמנות גבוהה עם מאגר GCNEB, ארה"בM05532
pLKO.1-TRCAddgene, ארה"ב10878וקטור שיבוט לנטיוויראלי
pMD2.GAddgene, ארה"ב12259וקטור מעטפת VSV-G
PMSFסיגמא-אולדריץ', ארה"בP7626
פוליאתילנימין (PEI) Polysciences, Inc., ארה"ב23966
אשלגן פריציאנידסיגמא-אולדריץ', ארה"244023בדיקת זיהום
אשלגן פרוציאנידסיגמא-אולדריץ', ארה"בP3289בדיקת
זיהום מעכב פרוטאזסיגמא-אולדריץ', ארה"ב 
psPAX2Addgene, ארה"ב12260אריזת Lentiviral פלסמיד
PuromycinSigma-Aldrich, ארה"בP8833מבחר תאים יציבים
PVDF ממברנהBiorad, ארה"ב1620177
פריימרים אקראייםInvitrogen, ארה"ב48190011
RPMI 1640Invitrogen, ארה"ב22400105
SDSSigma-Aldrich, ארה"בL3771
Steady-Glo substratePromega, ארה"בE2510בדיקת לוציפראז
T4 DNA ligaseInvitrogen, ארה"ב15224017
TEMEDInvitrogen, ארה"ב17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, ארה"בT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich, ארה"ב596200
TrisThermo Fisher Scientific, ארה"בQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, ארה"בT8787
TrizolInvitrogen, ארה"ב15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, ארה"בP1379
TZM-blNIH, מאגר איידס, ארה"ב8129
אולטרה-צנטריפוגהבקמן Optima L90K, ארה"ב330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, ארה"ב15520-018בדיקת זיהום
טכנולוגיית איתות תאים ב 5056489001

מקורות

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TThioflavin TUPRRT PCRP24 ELISA
מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.