מאמר שיטה

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר

4.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66529

⸱

26 באפריל 2024

 ,  , 
1Department of Biology, Indiana University Indianapolis

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק הליך לטיהור זיקה של חלבון רקומביננטי אנושי, דש אנדונוקלאז 1 (FEN1), אשר תויג בתג 6X-היסטידין. הפרוטוקול כולל שימוש בשני עמודי יונים מתכתיים משותקים נפרדים לטיהור החלבון המתויג.

תקציר

אפיון פונקציונלי של חלבונים מחייב ביטוי וטיהור שלהם בכמויות משמעותיות עם טוהר גבוה לביצוע בדיקות ביוכימיות. מערכת Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) מאפשרת הפרדה ברזולוציה גבוהה של תערובות חלבונים מורכבות. על ידי התאמת פרמטרים שונים ב-FPLC, כגון בחירת מטריצת הטיהור המתאימה, ויסות טמפרטורת דגימת החלבון, וניהול קצב זרימת הדגימה על גבי המטריצה וקצב האלוטיון, ניתן להבטיח את יציבות החלבון ותפקודו. בפרוטוקול זה, נדגים את הרבגוניות של מערכת FPLC לטיהור חלבון 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1), המיוצר בתרביות חיידקים. כדי לשפר את יעילות טיהור החלבון, נתמקד במספר שיקולים, כולל אריזה והכנה נכונה של הטורים, הזרקת דגימה באמצעות לולאת דגימה, קצב זרימת יישום הדגימה לעמודה ופרמטרים של אלוציית דגימה. לבסוף, הכרומטוגרמה תנותח כדי לזהות שברים המכילים תפוקות גבוהות של חלבון ושיקולים לאחסון תקין של חלבון רקומביננטי לטווח ארוך. אופטימיזציה של שיטות טיהור חלבונים חיונית לשיפור הדיוק והאמינות של ניתוח חלבונים.

מבוא

קיימות אסטרטגיות רבות להבנת הביולוגיה התאית. גישה אחת כוללת אסטרטגיה מלמעלה למטה, שבה מוטציות גנטיות מוכנסות לתוך גן, ואחריו הערכה של שינויים פנוטיפיים כתוצאה מכך אורגניזם מודל. לעומת זאת, גישה רדוקציוניסטית כרוכה בהבהרה ראשונית של מנגנונים מולקולריים ופונקציות אנזימטיות של חלבון מסוים, המלווה באפיון יחסי הגומלין שלו עם רכיבים תאיים אחרים. לאחר מכן, ההשפעה של חלבון זה על מסלול ביולוגי מוערך. למרות שלכל גישה מחקרית יתרונות ומגבלות מובנים, השגת הבנה מקיפה של מסלול ביולוגי מחייבת חקירות בין-תחומיות.

מכיוון שהדנ"א הוא התוכנית הגנטית של החיים, הבנת מנגנוני שכפול הדנ"א ותחזוקת הגנום היא תחום עניין פעיל כבר למעלה משבעה עשורים. מחקרים בתחום שכפול הדנ"א הניבו נתונים רבים לגבי המבנים והתפקודים הבודדים של חלבוני שכפול רבים. בירורים אלה, הכוללים היבטים מכניסטיים ומבחני פעילות ביוכימית, נעשו אפשריים באמצעות טיהור חלבונים אלה, המאפשרים את בחינתם המדוקדקת בסביבה חוץ-גופית . כתוצאה מכך, טיהור חלבונים מתגלה כטכניקה הכרחית ונפוצה ברוב מאמצי המחקר המיועדים לפענוח תובנות מכניסטיות לגבי שכפול DNA.

מאמר זה מציג מתודולוגיה לבידוד חלבון שכפול DNA המתויג עם 6X-היסטידין, אשר בא לידי ביטוי יתר בתאי חיידקים. החלבון המעניין הוא אנדונוקלאז דש אנושי 1 (FEN1), נוקלאז ספציפי למבנה הממלא תפקיד מרכזי בשכפול גדילים מפגרים והוא גם משתתף קריטי במסלולי תיקון DNA כמו תיקון כריתת בסיס (BER)1,2,3. תפקידו העיקרי של FEN1 הוא להיבקע בבסיס מבנה דש שנעקר מ-5 אינץ', חומר ביניים שנוצר במהלך שכפול DNA או BER. בתחילה, מחקרים ביוכימיים שהעריכו את הפעילות האנזימטית של FEN1 הציעו מנגנון "מעקב", שבו הנוקלאז יזהה את הקצה החופשי של 5'-פוספט של מבנה הדש ולאחר מכן יעקוב לאורך הדש לבסיסו לפני שיבקע אותו4. מחקר מאוחר יותר גילה כי FEN1 פועל באמצעות מנגנון "השחלה", שבו הוא נקשר תחילה לבסיס הדש ולאחר מכן משחיל את קצה 5' החופשי דרך האתר הפעיל שלו לפני המחשוף (איור 1)5. היכולת לבטא יתר על המידה ולבודד FEN1 רקומביננטי אפשרה פריצות דרך אלה, ואפשרה לחוקרים להשתמש בו בחקירות ביוכימיות ומבניות.

כרומטוגרפיית זיקה היא שיטת הפרדה נפוצה לטיהור DNA. טכניקה זו משתמשת בזיקה ההפיכה של חלבוני מטרה כלפי ליגנדות המשותקות על שרף כדי ללכוד באופן ספציפי את החלבון המעניין. אחת הזיקות הביולוגיות הנפוצות ביותר היא האינטראקציה החזקה בין חומצת האמינו, היסטידין ויוני מתכת כגון ניקל וקובלט ולכן ניתן ללכוד אותם על גבי שרף הטעון ב- Ni2+ או Co2+.

רצף הדנ"א המקודד מחרוזת של 6-9 שאריות היסטידין (His) משולב לעתים קרובות במבנה הפלסמיד המקודד את החלבון המעניין (ב-N-terminus או ב-C-terminus), ומתייג את החלבון בתג 6X-His-tag או בתג poly-His. לאחר מכן ניתן לטהר בקלות את החלבון המתויג שלו על ידי כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת (IMAC), תת-סוג של כרומטוגרפיית זיקה שבה יוני מתכת על השרף לוכדים חלבונים עם תג זיקה, אשר מאוחר יותר ניתן לדלל באמצעות סוכני אלוציה מתאימים. יוני מתכת מעבר כגון Ni2+ ו- Co2+ יכולים להיות משותקים על מטריצות אגרוז או סיליקה ג'ל שמקורן בקבוצות N,N,N'-tris-(carboxymethyl)-ethylenediamine או nitrilotriacetic acid (NTA)6.

ליגנדות מתכת ידועות כעמידות בפני התפרקות על ידי גורמים פיזיקליים, כימיים וביולוגיים ומחזיקות ביתרון זה על פני סוגים אחרים של ליגנדות 6,7. בנוסף, התג His-tag הוא תג קטן יחסית ואינו משפיע באופן משמעותי על מבנה החלבון או תפקוד7. עם זאת, במערכת ביטוי חיידקית, חלבונים רבים המבוטאים כרומוזומלית הם בעלי זיקה כלפי יוני מתכת ועשויים לטהר יחד עם חלבון המטרה. ניקל וקובלט הם יוני המתכת האופייניים המשמשים במטריצות IMAC. שרף Ni-NTA ושרף קובלט TALON משמשים בדרך כלל לטיהור חלבונים המסומנים על ידי His.

ני-נת"ע מול טאלון
יוני המתכת בהתאמה של Ni-NTA ו- TALON משותקים על השרף באמצעות ליגנדות NTA. Ni-NTA נחשב כבעל יכולת קשירה גבוהה יותר, הקושרת עד 100 מ"ג/מ"ל חלבון. זה יכול לגרום לתפוקת חלבון גבוהה יותר, עם אזהרה כי חלבונים מזהמים עשויים להיות מטוהרים במשותף. לעומת זאת, לשרף יש סגוליות קשירה גבוהה יותר כלפי חלבונים מתויגים וייתכן שהוא מסוגל לייצר שברים של טוהר גבוה יותר. במחקר זה, אנו שואפים להשוות את יעילות הטיהור של שני השרפים באמצעות מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית האוטומטית של חלבון מהיר, מערכת NGC (ראה טבלת חומרים).

מאגרים ותאימות
חוצצים נדרשים במהלך טיהור חלבון עבור ליזה של תאים, הכנת דגימה, שיווי משקל שרף, ו eluti של החלבון שנלכד מן השרף. מאגרי Tris, MOPS ו-HEPES עד לריכוז של 100 מילימטר הם המאגרים התואמים הידועים לשרף Ni-NTA. מאגרים כוללים לעתים קרובות חומרים מחזרים כדי למנוע חמצון של חלבון וצבירת חלבונים. עם זאת, מעל גבול הסף, חומרים מחזרים יכולים להפשיט את השרף של יוני מתכת. הריכוז המומלץ של חומרים מחזרים כגון בטא-מרקפטואתנול (BME) או דיתיותרייטול (DTT) הוא מתחת ל-1 מילימול עבור השרפים מבוססי הניקל והקובלט שהוזכרו לעיל.

המאגרים לטיהור hFEN1 הם מאגרי Tris המכילים NaCl, BME, פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF), EDTA וגליצרול. NaCl שומר על החלבון בצורה מסיסה ומשבש אינטראקציות מולקולריות כגון קשירת DNA. BME מפחית חלבונים מחומצנים ובכך מונע צבירת חלבונים. PMSF) הוא מעכב פרוטאז המונע פירוק בתיווך פרוטאז של חלבון המטרה. EDTA מבטל קטיונים דו-ערכיים מהדגימה, ומונע את גישתם לנוקלאזות ולפרוטאזות. גליצרול משפר את יציבות החלבון בצורה מימית. בנוסף, מאגר הליזה מכיל טבליות מעכבות פרוטאז מלאות כדי להבטיח הגנה מרבית של חלבון המטרה מפני פירוק פרוטאזות במהלך ליזה של התא. מאגרי שיווי המשקל והאלוציה מכילים אימידזול, כאשר מאגר האלוטיון מכיל כמויות גבוהות יותר עבור האימידזול כדי להזיז את החלבון הקשור מהשרף במהלך ההדבקה.

מערכת כרומטוגרפיה מהדור הבא (NGC)
מערכת כרומטוגרפיה אוטומטית זו בלחץ בינוני המיועדת לכרומטוגרפיה נוזלית של חלבונים בזרימה מהירה (FPLC) משתמשת בשתי משאבות כדי לשאוב בו זמנית שני מאגרים שונים ומסוגלת להזריק מגוון רחב של נפחי דגימה מ-250 מיקרוליטר עד 100 מ"ל. לולאת הדגימה (המכונה Dynaloop במערכת זו), מאפשרת להזריק נפחי דגימה גדולים יותר. ניתן להפעיל את המערכת באמצעות תוכנת Chromlab, המאפשרת יצירת שיטות מותאמות אישית, מניפולציה של ריצות טיהור וניתוח פסגות UV ושברים חלבוניים.

פרוטוקול

1. הכנת מדגם

  1. כדי לטהר FEN1 רקומביננטי, בטא את המבנה (pET-FCH-FEN1) בתאי BL21(DE3) כפי שתואר קודם לכן על ידי Ononye et al.8.
    1. חסן את מדיית LB (טבלה 1) בתרבית לילה של 1% והגדל את התאים בטמפרטורה של 37°C עד שה-OD יגיע ל-0.6.
    2. יש להשרות עם איזופרופיל-בטא-D-תיוגלאקטוזיד (IPTG) במינון 0.4M ולגדל את התרבית למשך 3 שעות נוספות.
    3. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה של התרבית ב 5,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (75 °F). אחסנו את הגלולה במקפיא בטמפרטורה של -80°C.
    4. ביום הטיהור, הסר את גלולת התא מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס, אפשר לה להפשיר על קרח, והשהה מחדש את הגלולה ב -100 מ"ל של חיץ ליזיס (טבלה 1).
      הערה: התא ליזט תמיד צריך להיות ממוקם על קרח במהלך הטיפול כדי למנוע proteolysis. לאחר ההפשרה, יש להשלים את כל תהליך הטיהור באותו היום. אין לאחסן את התא ליזט במקרר למשך הלילה.
  2. העבירו את המתלים לכוס של 250 מ"ל וסוניקו על קרח עם 30 שניות ON ו-30 שניות כיבוי באמפליטודה של 35% למשך 15 דקות.
    הערה: עיין בהגדרות היצרן כדי לזהות את המשרעת.
  3. מעבירים את הדגימה הסוניק לצינור צנטריפוגה ומסתובבים ב-27,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C כדי לקבל ליזט שקוף. מניחים את התא ליזט על קרח במקרר 4°C עד הזרקת דגימה.

2. הכנת עמודות זיקה

  1. התאימו את העמודים (אחד לשרף Ni-NTA ואחד לשרף מבוסס קובלט) למעמד מהדק כך שהעמודים מוחזקים ישרים ככל האפשר, תוך הימנעות מהטיית העמודים. ודא שתחתית העמודות מחוברת לפקק והוסף 1-2 מ"ל של מאגר התחלה לתחתית כל עמודה כדי למנוע בועות אוויר במהלך אריזת העמודות.
  2. נערו את בקבוקי השרף בעדינות עד להשעיה מלאה של השרף. פתח את החלק העליון של העמודים ושפך פנימה 10 מ"ל של כל slurry באופן רציף כדי למנוע הכללת בועות אוויר. שפכו את השרף על מרית מתכת או מוט זכוכית המוחזקים בשולי העמוד כדי למנוע בועות אוויר בעמוד.

3. אריזת עמודות באמצעות מתאם זרימה

  1. נתק את הפקק מהעמוד וחבר את החלק התחתון לקצה אחד של הצינור. חבר את הקצה השני של הצינור ליציאת UV של מערכת FPLC.
  2. ודאו שבית תומך המיטה נמשך לתוך גוף מתאם הזרימה והחליקו את גוף מתאם הזרימה אל החלק העליון של העמוד (איור 2A). כאשר תפס המצלמה נמצא במצב 1, הנמיכו את מתאם הזרימה והקפידו לא להכניס אותו למאגר (איור 2B). החליפו את תפס המצלמה למצב 2 (איור 2B). חבר את הצינור למערכת והתחל את זרימת חיץ ההתנעה למשך 1-2 דקות כדי להיפטר מהצינור ולמנוע בועות אוויר במהלך האריזה.
  3. החזירו את התפס למצב 1 והורידו את מתאם הזרימה למאגר בתנועה חלקה אחת, תוך הימנעות מהכללת בועות אוויר, והחזירו את התפס למצב 2. הדבר מאפשר למאגר מסוים להיכנס למתאם הזרימה ומסיר את כל הבועות שנותרו.
  4. העבירו את התפס למצב 3 והדקו את בסיס המצלמה ואת טבעת הנעילה (איור 2B).
  5. התחל את זרימת המאגר במהירות של 10 מ"ל/דקה כדי לארוז את העמודה. המשיכו בשלב זה במשך 3 דקות או עד שהשרף ארוז היטב.

4. הכנת לולאת הדגימה של מערכת FPLC

  1. חברו את הצינורית מראש לולאת הדגימה ללולאה E במערכת FPLC (איור 3).
  2. חבר את הצינור מתחתית לולאת הדגימה לפסולת 2 במערכת FPLC.
  3. הכנס קצה אחד של הצינור ליציאת העמודים של מערכת FPLC והנח את הקצה השני בבקבוק הפסולת.
  4. הכנס את הצינור ממשאבה A במים מזוקקים כפולים מסוננים (ddH2O).
  5. לחץ פעמיים על הגדרות המשאבה באמצעות התוכנה (איור 4A, מסומן 2) ובחר לולאת הזרקת משאבת מערכת (איור 4C).
  6. לחץ על הגדרות קצב הזרימה (איור 4A, מסומן 1) ושנה את קצב הזרימה ל- 10 מ"ל/דקה. הזן 0% בתיבה %B (איור 4B).
  7. התחל את הזרימה כדי לשטוף את לולאת הדגימה במים, אשר ידחפו את אטם ההזזה כלפי מטה.
  8. ברגע שחותם ההזזה מגיע לתחתית לולאת הדגימה, עצרו את הזרימה. החלף משאבה A מ- ddH2O למאגר ההתנעה. חברו את הצינור מהחלק העליון של לולאת הדגימה לפסולת 2 וזה מלמטה ללולאה E. השאירו את הצינור מפתח העמוד בפסולת.
  9. התחל את הזרימה במהירות של 10 מ"ל/דקה. ברגע שחותם ההזזה שנדחף כלפי מעלה על ידי מאגר ההתנעה הנכנס מגיע לחלק העליון של לולאת הדגימה, עצור את הזרימה. לולאת הדגימה מוכנה כעת להזרקת דגימה.

5. הזרקת דגימה

  1. לחץ פעמיים על הגדרות המשאבה ובחר לולאת עומס ידנית (איור 4C).
  2. שחררו את הברגת הצינור מלולאה E והניחו אותו במיכל הפסולת.
  3. חבר את הצינור מפתח העמוד לצינורות שעל גבי מתאם הזרימה.
  4. צייר את המדגם באמצעות מזרק 30 מ"ל; לאחר מכן, חבר את המזרק למתאם יציאת ההזרקה.
  5. הבריגו את המזרק לתוך פתח ההזרקה והזריקו את הדגימה, כדי לוודא שהיא מוזרקת באופן גלוי לתוך לולאת הדגימה. אחסן 100 μL של הדגימה (תווית קלט ליזט) בצינור מיקרוצנטריפוגה ב -20 °C לניתוח SDS-PAGE
    הערה: בהתאם לנפח הדגימה הכולל, ייתכן שיידרשו 2-3 זריקות.
  6. חבר את יציאת ההזרקה עם מכסה העמודות.
  7. חבר את הצינור מתחתית לולאת הדגימה בחזרה ליציאת Loop E.
  8. הניחו את הצינור ממשאבה B במאגר האלוטיון.

6. יצירת שיטות וניתוח באמצעות תוכנת FPLC המקושרת למערכת FPLC

  1. נווט אל הכרטיסיה בית ובחר שיטה חדשה.
  2. בחר בכרטיסיה הגדרות שיטה בעמודה הימנית, נווט לתפריט הנפתח סוג עמודה ובחר מותאם אישית (איור 5).
  3. הזן את נפח העמודה (5 מ"ל).
  4. הזן את קצב הזרימה הנדרש לריצה (1 מ"ל/דקה).
  5. נווט אל בחירת יחידה ובחר CV (אמצעי אחסון של עמודות) כיחידת הבסיס של השיטה.
  6. ודא שכניסה A מוגדרת למאגר A וכניסה B מוגדרת למאגר B (הגדרת ברירת המחדל).
  7. בחר בכרטיסייה Method Outline בתפריט בצד שמאל. הוסף את שלבי הטיהור בסדר הבא: שיווי משקל, יישום לדוגמה, שטיפת עמודות והדבקה.
    1. תחת שיווי משקל, הגדר את נפח שיווי המשקל ל- 10 CV. ודא שהגדרת המאגר נשמרת על 0% B.
    2. תחת כרטיסיית היישום לדוגמה , הגדר את אמצעי האחסון לדוגמה על-ידי צפייה בלולאה לדוגמה. מיקום חותם ההזזה מציין את נפח הדגימה.
    3. תחת שטיפת עמודות, הגדר את נפח הכביסה ל- 5 CV. השבת את אוסף השברים עבור שלב זה; אספו את הכביסה כולה בכוס במהלך הריצה, במקום לאסוף כשברים.
    4. לצורך הדבקה, הגדר את עוצמת הקול של מעבר הצבע ל- 14 CV החל מ - 0% Buffer B ל- 100% Buffer B.
  8. שמור את השיטה והתחל את הריצה.
  9. ודא שאספן השברים מתחיל במיקום של השבר הראשון.
  10. הזן את שם ההפעלה ולחץ על התחל.
  11. במהלך שלב שיווי המשקל, עקוב אחר עקומת UV בזמן אמת. ודא שכל החיבורים מאובטחים ללא דליפה; אשר מעגל שלם על ידי חיפוש החיץ הזורם לתוך מיכל הפסולת. אם עקומת ה-UV לא התייצבה בדקות האחרונות של שיווי המשקל, האריכו את שלב שיווי המשקל עד להשגת ייצוב (איור 6).
  12. בזמן יישום הדגימה, החלף את הצינורות הנכנסים למיכל הפסולת לכד נקי. במהלך שלב זה, אספו את החלבונים הלא קשורים הזורמים החוצה מצינורות הפסולת כזרימה (תווית כ-FT).
  13. חפשו עלייה חדה בעקומת ה-UV שככל הנראה מגיעה לקריאה המקסימלית האפשרית של 3,000 maU (איור 6).
    הערה: עקומה טיפוסית מגיעה לרמות של 3,000 maU לאורך רוב שלב היישום לדוגמה.
  14. במהלך שטיפת עמודות, כאשר שאריות חלבונים לא קשורים נשטפים ורק חלבונים קשורים נשארים על השרף, חפשו ירידה חדה בעקומת העל-סגול (איור 6). אם עקומת ה- UV לא ירדה בסוף שלב השטיפה, האריכו את השלב על ידי לחיצה על החזק את השלב עד שה- UV ירד מספיק. בתחילת שלב זה, העבר את צינורות הפסולת מכוס FT לכוס נקייה אחרת שכותרתה Wash.
  15. כאשר שלב האלוציה מתחיל, ודא שאוסף השברים נע למקומו והתחל לאסוף שברים. דמיינו את אלוציית החלבון על-ידי חיפוש פסגות בעקומת העל-סגול (איור 6).
  16. לאחר השלמת ההפעלה, נווט אל הכרטיסיה בית ובחר פתח הפעלה. פתח את הריצה כדי להציג את הכרומטוגרמה ובחר שילוב שיא בתפריט העליון כדי לסמן את הפסגות שהתקבלו במהלך הריצה.
  17. בחר בכרטיסיה שברים כדי להציג באופן חזותי את השברים המכילים חלבון מלוטש.

7. ניתוח דפי SDS

  1. יש לערבב 15 μL מכל חלק המכיל חלבון עם 5 μL של מאגר העמסת דגימות SDS (טבלה 1). חממו את הדגימות בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות.
  2. טען דגימות לתוך ג'ל precast ולרוץ על 160 V במשך 45 דקות יחד עם סמן חלבון prestained.
  3. הכתימו את הג'לים בתמיסת צביעה כחולה מבריקה של קומאסי למשך 30 דקות (טבלה 1).
  4. לשטוף את הג'ל ב ddH2O (לחזור על 3x).
  5. יש להכתים את הג'ל בתמיסת עיכוב למשך שעה אחת (טבלה 1).
  6. שימו לב להקות חלבון; לזהות FEN1 בסימן 42 kDa .
  7. שברי בריכה המכילים FEN1 ומרכזים את הבריכה באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 10 kDa . Aliquot ולאחסן במקפיא -80 ° C.

תוצאות

BL21 (DE3) תאי ליזטים המבטאים hFEN1 הועברו דרך שרפים שווי משקל של Ni-NTA ו-TALON. שרף Ni-NTA טעון ביוני Ni2+ ובעל יכולת קשירה גבוהה. התוצאות מראות כי שרף Ni-NTA מניב כמות גבוהה יותר של FEN1 בהשוואה לשרף TALON (איור 7). שרף Ni-NTA ידוע גם כלא נקשר באופן ספציפי לחלבונים אחרים המבוטאים כרומוזומלית. ליזט תאי עבר דרך שרף מבוסס קובלט, טוהר בטוהר גבוה אך יבול נמוך יותר, בהשוואה ל- Ni-NTA. כמו חלבונים קושרי דנ"א רבים אחרים, FEN1 הועבר דרך שרף הרחקת גודל כדי להסיר את הזיהומים. hFEN1 ניתן לזהות בסימן 43 kDa .

figure-results-1
איור 1: מנגנון מחשוף דש לפי hFEN1: מעקב לעומת השחלה. FEN1 (מתואר בצהוב) נחשב בתחילה כקשור לקצה 5' של מבנה הדש ועוקב דרכו לבסיס הדש (משמאל). מחקרים מאוחרים יותר גילו כי FEN1 נקשר תחילה לבסיס הדש ומשחיל את דש ה-5' דרך האתר הפעיל שלו (מימין). קיצור: hFEN1 = אנדונוקלאז דש אנושי 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מתאם זרימה. (A) רכיבים של מתאם הזרימה המשמשים לתהליך אריזת עמודות וטיהור; (B) שלושת המיקומים של תפס המצלמה המשמשים להידוק/שחרור טבעת ה-O ולקיבוע המתאם במקומו. התמונה המוגדלת מציגה את מצב טבעת ה-O (רופפת/הדוקה) במיקומים 1,2 ו-3 מלמעלה למטה. התמונות צולמו באישור 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מודול הזרקה של מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית של חלבון מהיר. היציאות השונות של מודול ההזרקה מחברות את מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית החלבונית המהירה לעמודה, לולאת הדגימה והפסולת. התמונה צולמה באישור 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: בקרת מערכת. (A) כרטיסיית בקרת מערכת שבה ניתן לשנות את הגדרות הזרימה ולראות נתיב זרימה; (ב) חלון הגדרות קצב זרימה; (C) חלון הגדרות המשאבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: חלון הגדרות שיטה. חלון להזנת פרטי טיהור כגון סוג עמודה, אמצעי אחסון של עמודה, יחידת בסיס של שיטה וקצב זרימה עבור ההפעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: סכמטיות של עקומת UV במהלך FPLC: עקומת UV עולה ויורדת בהתאם לשלב הטיהור. בתחילת שיווי המשקל, עקומת UV יכולה להתעוות עקב נוכחות של בועות אוויר או מזהמים בצינורות. ככל ששיווי המשקל נמשך, העקומה אמורה להתייצב כקו שטוח; במהלך הזרקת הדגימה, כאשר חלבונים שאינם קשורים לשרף זורמים החוצה, עקומת UV עולה עד שמגיעים לסף מקסימלי. שלב השטיפה, אשר שוטף החוצה שאריות חלבונים לא קשורים, מראה ירידה הדרגתית במדידות UV. לבסוף, במהלך שלב האלוציה, כאשר חלבון המטרה נפלט, נראה שיא בעקומת UV. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: תמונת ג'ל SDS PAGE. נתיב 1-סמן משקל מולקולרי; נתיב 2-1% כניסת Ni-NTA (ליזט סלולרי); נתיב 3-1% זורם משרף ני-נת"ע; נתיב 4-hFEN1 מטוהר משרף Ni-NATA; נתיב 5-1% קלט (תא lysate); נתיב 6-1% זורם מהשרף מבוסס קובלט; נתיב 7-hFEN1 מטוהר משרף על בסיס קובלט; חץ שחור מייצג את FEN1 ב- 42.5 kDa. קיצורים: SDS-PAGE = נתרן דודציל סולפט; MW = משקל מולקולרי; hFEN1 = אנדונוקלאז דש אנושי 1; NTA = חומצה ניטרילוטריאצטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מאגרים ופתרונותרכיבים
חיץ ליזיס50 mM Tris–HCl [pH 8.0]
500 מ"מ NaCl
1 מ"מ בטא מרקפטואתנול (BME)
1 מ"מ פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)
1 מ"מ EDTA
1 טבליה מעכב פרוטאז מלא
10 מ"מ אימידזול
10% גליצרול
חיץ שיווי משקל/שטיפה50 mM Tris–HCl [pH 8.0]
500 מ"מ NaCl
1 מ"מ BME
1 mM PMSF
10 מ"מ אימידזול
10% גליצרול
חיץ אלוציה50 mM Tris–HCl [pH 8.0]
500 מ"מ NaCl
1 מ"מ BME
1 mM PMSF
1 מטר אימידזול
10% גליצרול
מאגר טעינה לדוגמה של SDSמאגר דגימה 900 μL 4x Laemmli
100 מיקרוליטר BME
פתרון צביעה כחול מבריק של Coomassie50% ddH2O
40% מתנול
10% חומצה אצטית
0.1% קומאסי כחול מבריק R-250
פתרון השבחה50% ddH2O
40% מתנול
10% חומצה אצטית

טבלה 1: הרכב חיץ.

דיון

כרומטוגרפיית זיקה היא טכניקה נפוצה לטיהור חלבונים קושרי DNA. IMAC (ראשי תיבות של Immobilized Metal Affinity Chromatography) היא סוג מסוים של כרומטוגרפיית זיקה המשתמשת ביוני מתכת כדי ללכוד את שאריות ההיסטידין של רצף פפטידי. זו הסיבה שהתג "6X-His tag" או "poly-His tag" מוצמד ל-N-terminus או ל-C-terminus של חלבונים שיש לטהר. ניקל וקובלט הם יוני המתכת הנפוצים ביותר ונבדלים זה מזה בתאימותם לריאגנטים כגון BME ו-DTT המשמשים בדרך כלל לטיהור. למרות טיהורים בוצעו בריכוזים של 1 mM BME או DTT, השימוש בריאגנטים אלה עדיין יכול להיות אמין. חוסר תאימות ניתן לראות במהלך שיווי משקל. אם החיץ הזורם דרך השרף נראה בצבע חום, הדבר מעיד על חמצון יוני המתכת ועלול להסיר את יוני המתכת מהשרף. זה יכול להפחית באופן דרסטי את יכולת הקשירה של השרף.

כדי להבטיח טוהר גבוה ותשואה גבוהה של חלבון, יש להעדיף אינטראקציות זיקה בין יוני מתכת לבין תג His-tag על פני אינטראקציות אפשריות אחרות מבוססות מטען. זה יבטיח שכל החלבון מדולל בבת אחת במקום להיפלט על פני שלבים שונים של ההדבקה. כדי להשיג זאת, החלבון צריך לשאת מטען נמוך מאוד במהלך הטיהור. אם ערכי ה- pH של המאגרים קרובים יותר לנקודה האיזואלקטרית של חלבון המטרה, המטען של החלבון יכול להישמר נמוך. מכיוון שהנקודה האיזואלקטרית של FEN1 היא בערך 8.8, המאגרים שלנו נשמרים ב- pH 8.

שרף Ni-NATA, הטעון ביוני Ni, נחשב לבעל יכולת קשירת חלבון גדולה יותר וצפוי להניב כמות חלבון גבוהה יותר בהשוואה לשרף TALON מבוסס קובלט. משמעות הדבר היא גם כי קיים פוטנציאל גדול יותר עבור קשירה של חלבונים לא ספציפיים ולכן, טוהר נמוך יותר. יכולת הקשירה הנמוכה יותר של TALON משלימה קשירה ספציפית גבוהה יותר ותשואה של חלבון בעל טוהר גבוה. זה עולה בקנה אחד עם התוצאות שלנו המראות תפוקה גבוהה יותר של חלבון מטוהר מני-נת"ע בהשוואה ל-TALON.

ללא קשר לשרף, טוהר ותנובה מושפעים באופן משמעותי מאריזת העמודות. אריזה יעילה יכולה להתבצע באמצעות מתאם זרימה המחובר למערכת הכרומטוגרפיה האוטומטית של החברה9. בקצב זרימה גבוה מספיק, מתאם הזרימה יכול לארוז ביעילות את השרף ולמנוע הצטברות של חיץ בעמודה. מתאם הזרימה יחד עם NGC מאפשר השוואה מדויקת של שני השרפים בשל ויסות קצב הזרימה, הלחץ ושיפוע האלוטיון, כמו גם איסוף יעיל של שברים חלבוניים.

באמצעות תוכנת Chromlab ניתן לנטר את תנאי הריצה בזמן אמת10. ניתן לשנות את קצב הזרימה בכל עת במהלך הריצה. במהלך יישום הדגימה, לחץ המערכת עשוי לחרוג מהסף (600 psi). במקרה זה, הורדת קצב הזרימה במהלך שלב יישום הדגימה יכולה להפחית את הלחץ. התוכנה כוללת גם פונקציית צעד המתנה שבאמצעותה ניתן להרחיב כל צעד לפי הצורך. פונקציה זו שימושית במיוחד במהלך שלבי שטיפת טורים ו- elution. במהלך שטיפת העמודות, גרף ה-UV צפוי לרדת ולהגיע כמעט ל-0 - משמעות הדבר היא שרוב החלבונים הלא קשורים נשטפו החוצה מהשרף. במקרה שקו ה- UV ממשיך לעלות או לא מצליח לרדת, ניתן להאריך את שלב השטיפה עד להצגת הגרף הצפוי. באופן דומה, במהלך ההדבקה, ניתן להמחיש את האלוציה של חלבון המטרה באמצעות שיאים בגרף UV. אם באופן בלתי צפוי, לא נראים פסגות, ניתן להאריך את שלב האלוציה עד לצפייה בפסגות הצפויות.

טיפים וטריקים
במהלך שלב שיווי המשקל, יש להזריק את החיץ לעמוד ולשחרר את מאגר הפסולת ברציפות לבקבוק הפסולת; זה מבטיח שכל החיבורים הדוקים ועמידים בפני דליפות. במקרה של דליפה מכל אתר של החברה, יש לבדוק את כל הנמלים הסובבים את האזור, שכן מקור הדליפה עשוי להיות שונה מהמקום שבו מבחינים בדליפה. אם הזרימה החלה אך לא נכנס חיץ לעמודה, סביר להניח שהאוויר נלכד בתוך הצינור. לטהר את המערכת לפני שתמשיך הלאה.

במהלך הזרקת הדגימה, אם לחץ הגב מהמערכת מתנגד להזרקה, יש לשחרר את הצינורית מלולאה E ולהכניס אותה לבקבוק הפסולת למשך כל ההזרקה. חשוב להבריג אותו בחזרה לתוך Loop E לפני תחילת התוכנית. במקרה שמאגר שיווי המשקל או הדגימה מצטברים בעמודה במהלך הריצה, יש להשהות את הריצה ולהסיר את מתאם הזרימה. יש לפתוח את הצינור מתחתית העמוד ולאפשר לחיץ או לדגימה לזרום דרכו. אם הדגימה זורמת, הקפד לאסוף אותה כזרימה.

אם שברים המופעלים על ג'ל SDS PAGE מראים רמות גבוהות של חלבונים מזהמים, ניתן להריץ שברים משני צדי הפסגות הנראות בכרומטוגרמה. לעתים קרובות, עבור חלבונים בעלי ביטוי נמוך, שברים טהורים אינם מראים פסגות משמעותיות ב- UV.

הבנת ההבדלים בין תכונות השרף מבוסס הניקל לבין השרף מבוסס הקובלט מאפשרת לבחור את השרף המתאים ביותר ליישומים עתידיים של החלבון המטוהר. לדוגמה, חלבונים המשמשים בבדיקות ביוכימיות במבחנה צפויים להיות בעלי הטוהר הגבוה ביותר האפשרי, מצב שבו השרף מבוסס הקובלט מתאים. עם זאת, אם החלבון משמש לייצור נוגדנים, נדרשת תשואה משמעותית של חלבון מטוהר לתהליך. שרף Ni-NTA יכול לשמש אופציה טובה יותר במקרה זה. מאמר זה נועד להביא את ההבדלים בשרפים אלה באמצעות טיהור FEN1.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (1929346) והאגודה האמריקאית לסרטן (RSG-21-028-01). ברצוננו גם להודות לחברי מעבדת Balakrishnan על דיונים מועילים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4x מאגר דגימת LaemmliBioRad1610747
חומצה אצטיתMerckUN2789
בטא-מרקפטואתנול (BME)תוכנת SigmaM-6250
Chromlab גרסה 6.1.27.0BioRadמפעילה את מערכת NGC
טבלית מעכב פרוטאז MINI מלאהRoche11836153001
Coomassie Brilliant Blue RSigmaB0149
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000
Econo-Column זכוכיתBioRad7371512
אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA)Dot ScientificDSE57020
מתאם זרימהBioRad7380014
GlycerolDot Scientific
ImidazoleDot ScientificDSI52000
מתנולפישר סיינטיפיקA412
מיני PROTEAN TGX ג'לBioRad4561084
NGC מערכת כרומטוגרפיהאוטומטית BioRad 
Ni-NTA AgaroseQiagen1018244
פניל-מתיל-סולפוניל פלואורידנקודה מדעיתDSP20270
PreScission Plus חלבון תקני צבע כפול BioRad1610374
נתרן כלורינקודה מדעיתDSS23020
TALON שרף זיקה מתכתיתTakara635502
Tris BaseDST60040
DSG22020 נוזלית

מקורות

  1. Balakrishnan, L., Bambara, R. A. Flap endonuclease 1. Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).
  2. Asagoshi, K. FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells. Mol Cancer Res. 8 (2), 204-215 (2010).
  3. Lyamichev, V., Brow, M. A., Dahlberg, J. E. Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Science. 260 (5109), 778-783 (1993).
  4. Bornarth, C. J., Ranalli, T. A., Henricksen, L. A., Wahl, A. F., Bambara, R. A. Effect of flap modifications on human FEN1 cleavage. Biochemistry. 38 (40), 13347-13354 (1999).
  5. Xu, Y., Potapova, O., Leschziner, A. E., Grindley, N. D., Joyce, C. M. Contacts between the 5' nuclease of DNA polymerase I and its DNA substrate. J Biol Chem. 276 (32), 30167-30177 (2001).
  6. Wen-Hui, K., Kuo, K., Chase, H. A. Exploiting the interactions between poly-histidine fusion tagsand immobilized metal ions. Biotechnol Lett. 33 (6), 1075-1084 (2011).
  7. Charlton, A., Zachariou, M. Immobilized metal ion affinity chromatography of native proteins. Methods Mol Biol. 421, 25-35 (2008).
  8. Ononye, O. E., Njeri, C. W., Balakrishnan, L. Analysis of DNA processing enzyme FEN1 and its regulation by protein lysine acetylation. Methods Mol Biol. 1983, 207-224 (2019).
  9. Econo-column flow adaptor instruction manual. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf (2015).
  10. NGC Chromatography systems and ChromLab software instrument guide version 3.3. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HisFEN1

מאמרים קשורים