מאמר שיטה

תבניות דינמיות של חלבונים המושרים על ידי אור בממברנות המודל

DOI:

10.3791/66531

⸱

23 בפברואר 2024

 , 
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, מתואר פרוטוקול ליצירת תבניות חלבון מווסתות אור והפיכות עם דיוק מרחבי-זמני גבוה בקרומי שומנים מלאכותיים. השיטה מורכבת מפוטואקטיבציה מקומית של החלבון iLID (דימר משופר המושרה באור) המשותק על קרומי המודל אשר, תחת אור כחול, נקשר לחלבון השותף שלו ננו (SspB מסוג פראי).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הלוקליזציה והשפעול המדויקים של חלבונים בקרום התא בזמן מסוים מעוררים תהליכים תאיים רבים, כולל קיטוב התא, נדידה וחלוקה. לפיכך, שיטות לגייס חלבונים למדל ממברנות עם רזולוציה תת-תאית ובקרת זמן גבוהה חיוניות בעת שכפול ובקרה של תהליכים כאלה בתאים סינתטיים. כאן מתוארת שיטה לייצור תבניות חלבון הפיכות מווסתות אור בקרומי שומנים בדיוק מרחבי-זמני גבוה. למטרה זו, אנו משתקים את החלבון iLID (דימר משופר המושרה באור) על דו-שכבות שומנים נתמכות (SLBs) ועל הממברנה החיצונית של שלפוחיות חד-לאומיות ענקיות (GUV). עם הדלקת אור כחול מקומית, iLID נקשר לשותפו ננו (SspB מסוג פרא) ומאפשר גיוס של כל חלבון מעניין (POI) המאוחה לננו מהתמיסה לאזור המואר על הממברנה. כריכה זו הפיכה בחושך, המספקת קשירה ושחרור דינמיים של נקודת העניין. בסך הכל, זוהי שיטה גמישה ורב-תכליתית לוויסות לוקליזציה של חלבונים בדיוק גבוה במרחב ובזמן באמצעות אור כחול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היווצרות תבניות חלבונים על קרום התא באזורים תת-תאיים מולידה תהליכים ביולוגיים רבים, כולל נדידה, חלוקה ותקשורת מקומית בין תאים 1,2. תבניות חלבונים אלה מווסתות במרחב ובזמן, והן דינמיות מאוד. שכפול תבניות חלבונים כאלה בתאים סינתטיים חיוני לחיקוי תהליכים תאיים הנובעים מהם ולהבנה טובה יותר של האופן שבו ויסות כזה פועל ברמה המולקולרית. בדומה למה שנצפה עבור ממברנות בתאים חיים, שיטות ליצירת תבניות חלבונים על ממברנות מלאכותיות חייבות ללכוד את הדינמיקה שלהם ולספק שליטה מרחבית-זמנית מדויקת.

בין הגירויים השונים, האור בולט במתן השליטה המרחבית-זמנית הגבוהה ביותר ומספר יתרונות נוספים3. באמצעות ויסות עם אור, קל להאיר אזור רצוי בכל זמן רצוי בדיוק שאין שני לו. בנוסף, האור מספק יכולת כוונון גבוהה מכיוון שניתן לכוונן הן את עוצמת האור והן את משך הדופק. יתר על כן, האור הנראה אינו מזיק לביומולקולות, כולל חלבונים, וניתן אפילו לטפל בפונקציות מרובות באורכי גל שונים. לפיכך, גישות תגובתיות לאור המבוססות על האור הנראה מתגלות כדרכים מבטיחות לוויסות מבוקר ודו-אורתוגונלי של תבניות חלבונים במרחב ובזמן 4,5,6. שימוש בזוגות חלבונים פוטו-סוויג'יים מאופטוגנטיקה, הפועלים כדימריזרים מעוררי אור, מספק שיטה פשוטה לגיוס חלבונים ספציפיים לממברנות. בפרט, תבניות חלבונים נוצרו בהצלחה על ממברנות מלאכותיות באמצעות אינטראקציה המופעלת על ידי אור כחול בין iLID (דימר משופר המושרה לאור, המבוסס על תחום LOV2 הניתן למיתוג מ- Avena sativa) ו- Nano (SspB מסוג פראי) 7,8, מערכת SpyTag המושרה לאור כחול (BLISS)9, טטרמר החלבון המגיב לאור ירוק CarH10 והאינטראקציה המושרה לאור אדום בין PhyB ו- PIF611.

הוכח כי ניתן להשתמש באינטראקציה הניתנת להחלפה בין iLID ו- Nano5 להחלפת חלבונים בתבנית צילום על קרומי מודל באמצעות אור כחול7. האינטראקציה iLID/Nano הפיכה בחושך, ספציפית מאוד, ופועלת בתנאים פיזיולוגיים. עיגון iLID למודלים של ממברנות ליפידים, כגון שלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUVs) או דו-שכבות ליפידים נתמכות (SLBs), מאפשר גיוס מווסת אור של ננו לממברנות אלה, דבר הפיך בחושך. יש לציין כי ראינו כי החדרת תחום לא מסודר ל-N-terminus של iLID (וכתוצאה מכך חלבון בשם disiLID) כקשירה לממברנת שומנים מודל משפרת את יעילות הגיוס של Nano ואת דינמיקת ההמרה8.

על ידי שימוש באינטראקציית disiLID/Nano, פיתחנו שיטה ליצירת תבניות ניגודיות גבוהה של חלבוני עניין (POI) המותחים ננו על SLB ועל הממברנות החיצוניות של GUVs. שיטה זו מאפשרת יצירת תבניות חלבון ברזולוציה מרחבית וזמנית יוצאת דופן והפיכות גבוהה תוך דקות. הפרוטוקול המפורט מתאר את תהליך הגיוס המקומי של חלבונים על גבי ממברנות מלאכותיות. באופן ספציפי, זה מושג על ידי השתקת גרסה biotinylated של disiLID על SLBs ו- GUV באמצעות אינטראקציה ביוטין-סטרפטאבידין (SAv). לאחר מכן, ננו (mOrange-Nano) המסומן באופן פלואורסצנטי מגויס לממברנות מתפקדות אלה תחת תאורת אור כחול. פרוטוקול הניסוי שלנו מציע גישה פשוטה וניתנת להתאמה להשגת גיוס חלבון מקומי לממברנות. חשוב לציין, מתודולוגיה זו אינה מוגבלת לממשקי SLB ו- GUV המדווחים או mOrange-Nano; ניתן להרחיב אותו לחומרים אחרים הפונקציונליים של disiLID ולחלבונים המאוחים לנאנו.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה ניסיונית

  1. בטא וטיהר biotinylated-disiLID (b-disiLID) ו- mOrange-Nano (ראה טבלת חומרים) על ידי ביצוע נהליםשדווחו בעבר 7,8.
  2. מכינים תערובות שומנים בבקבוקוני זכוכית עם הרכב השומנים שנבחר וריכוזים. ראשית, יש להמיס שומנים בכלורופורם כדי לקבל תמיסת שומנים סופית בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
    1. יש לערבב שומנים על מנת לקבל הרכב של 94.9 mol% 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 5 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineN-(cap biotinyl) נתרן מלח (DOPE-biotin) ו-0.1 mol% 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine (DiD) (ראה טבלת חומרים).
      הערה: ניתן לכוונן את תערובת השומנים ביחסים משתנים ובריכוז DOPE-ביוטין ו/או צבעי ממברנה שונים. ריכוז DOPE-biotin המומלץ (5 mol%) מאפשר היווצרות שכבת סטרפטווידין בצפיפות גבוהה (SAv) בשלבים הבאים.
  3. הכינו שלפוחיות חד-למלריות קטנות (SUV) בהתאם לשיטות 7,8,12 שדווחו בעבר. לשלב זה מומלץ להכין רכבי שטח בקוטר ≤100 ננומטר.
  4. במחקר זה נעשה שימוש בשיטת סוניקציה. ראשית, אידוי תמיסת הכלורופורם בבקבוקון הזכוכית עם זרם חנקן תוך כדי סיבוב הבקבוקונים על מנת ליצור סרט שומנים דק. לאחר מכן, להסיר את שאריות כלורופורם לפחות 1 שעה תחת ואקום.
    1. יש לייבש מחדש את הסרט המיובש במים טהורים במיוחד עם ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל שומנים על ידי ערבול. לבסוף, סוניק את התמיסה המתקבלת במשך 10 דקות עד התמיסה האטומה הופך ברור.
      הערה: יש לאחסן את תערובת השומנים בצינור מיקרוצנטריפוגה במקרר למשך שבועיים לכל היותר. ניתן להשתמש גם בשיטות הכנה שונות לרכבי שטח (למשל, שיטת אקסטרוזיה) כל עוד גודל רכבי השטח הסופיים הוא ≤ 100 ננומטר.

2. גיוס mOrange-Nano ל-SLBs פונקציונליים של disiLID

  1. הוסף 150 μL של 2 M NaOH בכל באר של תא μ שקופיות 18 באר תחתית זכוכית (ראה טבלה של חומרים) ודגר במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר את NaOH ולשטוף את הבארות 3-5 פעמים תחילה עם 150 μL מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן 3 פעמים עם 150 μL חיץ (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) המכיל 10 mM CaCl2.
  2. הוסף 15 μL של רכבי שטח טריים מוכנים (ריכוז מלאי 1 מ"ג / מ"ל במים) לתוך הבארות המכילות חיץ 150 μL עם 10 mM CaCl2 על מנת לקבל בערך גורם 10 דילול של SUV בחיץ. תנו לרכבי השטח לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר זמן הדגירה, ייווצרו SLBs ביוטינילטים.
  3. שטפו את ה-SLB לפחות 7 פעמים עם חיץ (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) ללא CaCl2 על ידי הסרת התמיסה ולאחר מכן הוספת חיץ טרי בכל שלב. מומלץ להשתמש 80 μL של חיץ עבור כל שלב כביסה.
    הערה: שטיפה אופטימלית של SLBs מתקבלת על ידי צנרת תמיסה טרייה למעלה ולמטה מספר פעמים מבלי לגעת במשטח. פיפטציה של התמיסה בבארות המכילות את SLBs שזה עתה נוצרו צריכה להיות עדינה על מנת להפחית את היווצרותן של בועות אוויר קטנות שיפגעו ב- SLB שנוצרו. מרגע זה ואילך, בארות צריכות להכיל נפח מספיק של חיץ על מנת למנוע את התייבשות SLBs.
  4. לפונקציונליות נוספת של SLBs ביוטינילטים עם SAv, הוסף תמיסה של SAv לריכוז סופי של 250 ננומטר ודגר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להסיר את עודף SAv על ידי שטיפתו עם חיץ (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) לפחות 5 פעמים.
  5. מרגע זה ואילך, שמרו את הדגימות תחת אור אדום מגן על מנת למנוע פוטואקטיבציה לא רצויה של חלבונים הניתנים להחלפה. הוסף b-disiILD (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 1 מיקרומטר בבאר. לאחר דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, יש להסיר את עודפי החלבון על ידי שטיפה עם חיץ לפחות 5 פעמים.
  6. הוסף mOrange-Nano (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 200 ננומטר ושמור את הדגימה בחושך על ידי כיסויה ברדיד אלומיניום.
  7. מקם את μ השקופיות מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי וכוונן את הגדרות ההדמיה. הגדר את הלייזר 552 ננומטר לעירור של mOrange-Nano. התאם את טווח הפליטה כדי למטב את אות mOrange. פוטואקטיבציה של disiLID מושגת באמצעות לייזר 488 ננומטר, באמצעות פולסי אור עם מרווחים של 2.58 שניות.

3. הכנת GUVs

  1. הכינו תמיסה של 5% (w/v) של אלכוהול פוליוויניל (PVA, ראו טבלת חומרים) (MW: 145,000 גרם/מול) עם סוכרוז בנפח 100 מ"מ במים טהורים במיוחד, וערבבו למשך הלילה ב-80°C ב-400 סל"ד.
  2. הכינו תמיסת שומנים בכלורופורם עם הרכב רצוי (ריכוז סופי 10 מ"ג / מ"ל). עבור שיטה זו, מומלץ הרכב המורכב של 10 מ"ג / מ"ל POPC, 10 mol% 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG), 2 mol% DOPE-biotin ו 1 mol% DiD (ראה טבלה של חומרים).
  3. הכינו GUVs עם טכניקת הידרציה 7,8. ראשית, יש למרוח 40 μL של תמיסת PVA מוכנה כשכבה דקה הומוגנית על גבי מגלשת זכוכית בגודל 60 מ"מ x 24 מ"מ, רצוי עם קצה פיפטה. לאחר מכן, יבש את השכבה הדקה ב 50 ° C במשך 30 דקות.
  4. מורחים 5 μL של תמיסת השומנים עם מחט על שכבת PVA ולתת להתייבש ב 30 ° C במשך 1 שעה.
  5. הרכיבו תא על מגלשת הזכוכית הפונקציונלית באמצעות ספייסר (~40 מ"מ × 24 מ"מ × 2 מ"מ, ראו טבלת חומרים) ושקופית זכוכית שנייה.
  6. הוסף 1 מ"ל של חיץ התייבשות (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) לתוך התא למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי ליצור GUVs. לאחר שעה, הפוך את החדר והקש בעדינות על משטחי הזכוכית עם קצה פיפטה.
  7. בזהירות להסיר את מגלשת זכוכית בצד אחד כדי לפתוח את התא הבנוי ולקצור את GUV עם פיפטה.
  8. מניחים את התמיסה בצינור פלסטיק ומניחים ל- GUV להסתפק בשעתיים.

4. mOrange-Nano גיוס ל-GOV מתפקדים של disiLID

  1. הוסיפו תמיסה של SAv ל-GUV שזה עתה נקטפו והשאירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: יש לבצע את השלבים הבאים באור אדום מגן על מנת למנוע פוטואקטיבציה של disiLID.
  2. הוסף 1 מיקרומטר של b-disiLID לתמיסת ה- GUV והנח את הדגימה למשך 30 דקות בחושך, תוך כיסוי ברדיד אלומיניום.
  3. יש לטפל בתא תחתון מזכוכית עם 18 בארות μ החלקה עם תמיסת BSA של 150 מיקרוליטר (3% w/v במים) למשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר את הפתרון BSA ולשטוף את הבארות עם 150 μL מים ultrapure 3 פעמים.
  4. הוסף 145 μL של 200 nM mOrange-Nano בחיץ (10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl) לבאר.
  5. לאחר מכן, הוסף 5 μL של GUV מעוטר b-disiLID לתמיסה והמתן ~ 15 דקות עבור GUV להתיישב.
  6. הניחו את המגלשה μ מתחת למיקרוסקופ הקונפוקלי. עורר את הדגימה ב- 552 ננומטר כדי לדמיין mOrange (λex = 557 ננומטר; λem = 576 ננומטר) פלואורסצנטיות וב- 638 ננומטר כדי לדמיין DiD (λex = 644 ננומטר; λem = 665 ננומטר) בקרומי GUV. גיוס mOrange-Nano מופעל באמצעות פולסי אור כחול (488 ננומטר, עוצמה של 1%) כל 5.3 שניות על מנת למזער השפעות הלבנה בלתי רצויות.
    הערה: ניתן להתאים את אורכי גל העירור בהתאם לסוג המיקרוסקופ שבשימוש. אורכי גל עירור נפוצים אחרים הזמינים עבור מיקרוסקופים הם גם 532 ננומטר או 561 ננומטר ולייזרים 633 ננומטר, 647 ננומטר, 639 ננומטר או 640 ננומטר.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנהלים המתוארים מאפשרים היווצרות SLBs כדי לגייס mOrange-Nano על הממברנות הסינתטיות. ההיווצרות של mOrange-Nano מוגדר בתבנית SLBs המתפקדים עם b-disiLID מוצגת באיור 1A. כאשר אזור עניין בריבוע (24 מיקרומטר × 24 מיקרומטר) על ה-SLB מואר באור כחול של 488 ננומטר, נצפתה עלייה מהירה של אות פלואורסצנטי בערוץ mOrange (מוצג באדום) בהחזר ההשקעה תוך 200 שניות. התבנית מראה קצוות מוגדרים וחדים מאוד (איור 1B), מה שמצביע על שליטה מרחבית גבוהה באזור הפוטואקטיבי. האינטראקציה מהירה והפיכה לחלוטין כאשר ההארה באור כחול נקטעת. השיטה הזו גם מאפשרת יצירת תבניות על פני כמה מחזורי הארה (איור 2). מחזורים מתחלפים של ~200 שניות של אור כחול ו-200 שניות של חושך מובילים לגיוס הפיך של mOrange-Nano באזור שנבחר מספר פעמים עם ערכים דומים של עוצמת Δ של פלואורסצנטיות בתבניות.

איור 3 מראה את הייצוג הסכמטי של הכנת ה-GUV. הגיוס של mOrange-Nano נצפה גם על GUVs. זה מראה ש-GUV שממוקמים בחושך לא מפגינים פלואורסצנטיות mOrange (איור 4A). כאשר ה- GUV מוארים באופן גלובלי באור כחול, נצפית פלואורסצנטיות mOrange עם צבע קרום ה- GUV (DiD). האינטראקציה הפיכה מאוד עם סיום ההארה. הכימות של עוצמת mOrange בקרום ה-GUV לאורך זמן מראה את הגיוס המהיר והיעיל של חלבונים, כמו גם את ההפיכות המלאה (איור 4B).

figure-results-1
איור 1: תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של SLB המתפקדות עם b-disiLID. התמונות הפלואורסצנטיות בנוכחות mOrange-Nano לפני (A) ובמהלך (B) תאורת אור כחול מקומי (488 ננומטר) בהחזר ההשקעה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (C) עוצמת פלואורסצנטיות של mOrange נמדדה בהחזר ההשקעה עבור SLBs המתפקדים עם b-disiLID (ב= 200 שניות). האיור נלקח מ Di Iorio et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: עוצמת פלואורסצנטיות של mOrange שגויסו בהחזר ההשקעה על SLBs המעוטרים ב-b-disiLID במהלך שלושה מחזורי גיוס. לאחר כל שלב פוטואקטיבציה, הפלואורסצנטיות mOrange-Nano גדלה בתוך החזר ההשקעה. התבנית מגיעה לרוויה תוך 120 שניות, והפלואורסצנטיות יורדת תוך 120 שניות, כמעט לרמות רקע. לא נצפה אובדן של איכות הדפוסים במהלך מחזורי אור כחול / חושך שונים. האיור נלקח מ Di Iorio et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ייצוג סכמטי של הכנת GUV בשיטת הידרציה עדינה. התוכנית מציעה ייצוג חזותי של מספר מדרגות ושל החדר שנבנה באמצעות שתי שקופיות זכוכית וספייסר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מדידות במיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיוס תלוי אור של mOrange-Nano על קרומי GUV. (A) תמונות פלואורסצנטיות של GUV מתפקד disiLID בנוכחות mOrange-Nano. בירוק הוא צבע הממברנה של ה- GUVs, ובאדום הוא הפלואורסצנטיות הכתומה לפני, במהלך ואחרי תאורת האור הכחול. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) עוצמת פלואורסצנטיות של mOrange הממוקמת על גבי GUV לאורך זמן. עם ההארה, הפלואורסצנטיות הכתומה (מוצגת באדום) על קרום השומנים מגיעה לעוצמה מקסימלית תוך 60 שניות, עם עלייה של פי 5.9 בעוצמת הפלואורסצנציה. עם עצירת התאורה, הפלואורסצנטיות של mOrange יורדת לערכים כמעט טרום הארה תוך 60 שניות (עם התאוששות של 90%). האיור נלקח מ Di Iorio et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיארנו שיטה לגיוס מקומי של חלבוני mOrange-Nano על ממברנות מודל, כגון דו-שכבתית ליפידית נתמכת ובועיות חד-למלריות ענקיות באמצעות החלבון disiLID8 הניתן לפוטו-החלפה. היבטים התורמים לאיכות התבנית כוללים את איכות החלבונים, כמו גם את האיכות הטובה של SLBs ו- GUVs.

כדי להבטיח איכות חלבון טובה לאחר ביטוי וטיהור, חשוב להעריך תחילה את התכונות הניתנות למיתוג של disiLID. לשם כך, יש למדוד את ספיגת הקו-פקטור FMN בחושך ולאחר הדלקת אור כחול. ספקטרום UV-Vis של disiLID צפוי להראות את השיא המשולש האופייני של הקו-פקטור FMN בחושך, אשר יורד משמעותית עם תאורת האור הכחול ומתאושש בחושך13. התנהגות פוטו-סוויץ' זו חיונית להשגת גיוס ניתן לשחזור והפיך בשלבים הבאים. עבודה עם אור אדום מגן וחשיפת disiLID לתאורה חיצונית מינימלית במהלך הכנת הדגימות מגדילה את ביצועי הניסויים.

צעד קריטי נוסף, ואולי החשוב ביותר, הוא היווצרות SLBs תקינים. פגמים בקרומים ו/או היווצרות SLBs לא הומוגניים (כלומר, נוכחות של SLB רב-שכבתי או טלאי) ישפיעו על איכות תבנית החלבון. לכן, למשתמשים חסרי ניסיון, מומלץ לשחזר את הפרוטוקול על ידי תיוג רכבי השטח עם כמה צבעי ממברנה, כגון DiD ו- DiO, על מנת ליצור SLB מסומן פלואורסצנטית. בדרך זו, המאפיינים והאיכות של SLBs יכול להיות מאופיין היטב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מדידות FRAP מייצגות גישה טיפוסית להערכת האיכות של SLB על ידי הערכת נזילות הממברנות. לחלופין, במקרה של SLB ביוטינילציה כמו אלה המתוארים בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש ב- SAv המסומן באופן פלואורסצנטי (למשל, Atto 488-SAv) כדי להמחיש ולהעריך את האיכות של SLBs.

החלק הראשון של הפרוטוקול מתאר את היווצרות הדפוסים על SLBs. כדי להבטיח תוצאה אופטימלית, חשוב להוסיף mOrange-Nano על SLBs ולתת לדגימה לדגור בחושך במשך 15 דקות. במהלך הפוטואקטיבציה, בחירת החזר ההשקעה אינה מוגבלת לגודל מסוים. עם זאת, יש לווסת את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה על מנת להפחית הלבנה לא רצויה של החלבונים הפלואורסצנטיים.

שיטה זו אינה מוגבלת לחלבונים ביוטינילטים, וניתן להשתמש בגישות אחרות כדי לעגן disiLID ל-SLBs. לדוגמה, ניתן לבטא את disiLID המתויג שלו ולעגן אותו על SLB המכיל Ni- NTA. עם זאת, חשוב לבטא Nano ו- disiLID עם תגים שונים על מנת למנוע החלפה של החלבונים על SLBs. שיטה זו מאפשרת גם את האפשרות להפוך את סדר החלבונים, ובכך לתפקד SLBs עם ננו ולגייס disiLID (או חלבונים המותכים disiLID) על הארת אור כחול.

לבקרה דינמית של לוקליזציה של חלבונים, לוקליזציה הפיכה של החלבון לאזור שנבחר צריכה להיות אפשרית שוב ושוב. כדי להשיג זאת, ריכוז ננו (200 ננומטר) בתמיסה הוא פרמטר קריטי להשגת הפיכות גבוהה.

חשש נוסף הוא הגיוס של ננו למשטח ה-GUV המתפקד ב-disiLID. כמו במקרה של דפוס חלבונים על SLBs, שיטה זו יכולה להיות מורחבת לאסטרטגיות פונקציונליות ממברנה שונות. בפרוטוקול זה, ה-GUV כולו הואר באור כחול כדי לגייס mOrange-Nano על כל משטח ה-GUV. עם זאת, הבחירה של ROI קטן הממוקם על קרום GUV צריך להוביל לוקליזציה מדויקת של חלבונים באזור מוגבל יותר.

שיטה זו מציגה רק מגבלה הקשורה לבחירת הפלואורופור המשמש להדמיית גיוס הנאנו בקרום רכבי השטח או ה-GUV. בפרט, יש להימנע מפלואורופורים עם ספקטרום עירור בטווח האור הכחול, מכיוון שהשימוש בהם יפריע לפוטואקטיבציה של (dis)iLID. לכן, הבחירה של פלואורופורים בתחום האור הירוק או האדום (למשל, mOrange או Cy5) מומלצת עבור סוג זה של ניסוי.

עיצוב disiLID מציע דרך פשוטה וניתנת להתאמה לשיפור גיוס החלבונים המקומי לממברנות ומרחיב את הטווח הדינמי של iLID ו- Nano מאופטוגנטיקה4. שיטות אלה מתמקדות בגיוס ננו לחקות ממברנות כגון דו-שכבות שומנים ו-GUV. עם זאת, גישה זו ניתנת להרחבה לכלים אופטוגנטיים רבים בתאים שבהם (dis)iLID או Nano קשורים לממברנה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר האירופית ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W). DDI מודה לקרן אלכסנדר פון הומבולדט על מלגת פוסט-דוקטורט.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
µ-Slide 18 WellIbidi81817להכנת SLB
25 µ מזרק מיקרוליטר L המילטוןדגם 702 Nלהכנת תערובת שומנים ופיזור תמיסת השומנים על שכבת ה-PVA
כובע ביוטיניל PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (מלח נתרן)Avanti Polar Lipids870273Cלהכנת רכבי שטח
CaCl2 (סידן כלורי)Sigma-AldrichC5670להיווצרות SLB
החלקות כיסוי 24 מ"מ x 60 מ"מEngelbrechtK12460להיווצרות GUVs
DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-
Tetramethylindodicarbocyanine)		Thermo Fisher Scientific D7757צבע ממברנה
disiLID: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH
HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA
IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA
GPGSGAASGTVVAAAAGPGPG
AGGVAAAGPPTPTGGSGGSG GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT
DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR
EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK
IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK
FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG
VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK
TAFQIAEAANDENYF
DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850375Pלרכבי שטח הרכב ליפידים
חלבון Eppendorf LoBind
צינורות מיקרוצנטריפוגה		MerkEP0030108116-100EAלאיסוף GUVs טריים
mOrange-Nanoרצף: MRGSHHHHHGSKIEEGKLVI
WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT
GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG
DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA
EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN
GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP
PKTWEEIPALDKELKAKGKKSALM
FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY
ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF
LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN
KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN
YGVTVLPTFKGQPSKPVGVLSA
GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE
GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA
KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM
SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA
LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI
EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI
IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE
GEGEGRPYEGFQTAKLKLKVTKGG
PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH
PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN
FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK
VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG
WEASSERMYPEDGALKGEIKMR
LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV
QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE
QYERAEGRHSTGGMDELYKGG
SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN
SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK
DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ
FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA
RENGDGVMFEPEEIYDELNIG
NaCl (נתרן כלורי)סיגמא-אולדריץ' S9888עבור חוצץ
NaOH (נתרן הידרוקסיד)סיגמא-אולדריץ' 1064980500להפעלת פני השטח בהיווצרות SLB
POPC (1-Palmitoyl-2-
oleoylphosphatidylcholine)		שומנים קוטביים אוונטי850457Cלהרכב שומנים
PVA (אלכוהול פוליוויניל) הידרוליזה מלאה8148940101 סיגמא-אולדריץ'להידרוליזה מלאה להיווצרות GUVs
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי SP8Leica
StreptavidinTermoFisher434301
סוכרוז סיגמא-אולדריץ' 84097עבור GUVs היווצרות
Tris hydrochlorideSigma-Aldrich10812846001עבור מאגר
רצף

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kretschmer, S., Schwille, P. Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division. Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).
  2. Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis. Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).
  3. Caldwell, R. M., et al. Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments. Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).
  4. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  5. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).
  6. Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
  7. Bartelt, S. M., et al. Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles. Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).
  8. Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes. Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).
  9. Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS). J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).
  10. Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns. Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).
  11. Jia, H., et al. Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro. Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).
  12. Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer. ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).
  13. Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins. J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Photoswitchable ProteinsSupported Lipid BilayersGiant Unilamellar VesiclesProtein RecruitmentFluorescence MicroscopySpatiotemporal ControlProtein LocalizationReversible Protein Binding

מאמרים קשורים