מאמר שיטה

ייצור אצוות וקטוריות משויכות אדנו בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תאי תרחיף HEK293

DOI:

10.3791/66532

⸱

26 באפריל 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Regeneration of Sensorimotor Systems, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), 2Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצג פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתלה, וכתוצאה מכך זמן ועבודה מופחתים הדרושים לייצור וקטורי באמצעות רכיבים הזמינים למטרות מחקר מספקים מסחריים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) הם כלי יוצא דופן לחקר מערכת העצבים המרכזית (CNS). קפסידים חדשניים, כגון AAV. PHP.eB, להדגים התמרה נרחבת של CNS על ידי הזרקה תוך ורידי בעכברים. כדי להשיג התמרה דומה, יש צורך בטיטר גבוה פי 100 (מינימום 1 x 1011 עותקי גנום / עכבר) בהשוואה להזרקה ישירה בפרנכימה CNS. בקבוצה שלנו, ייצור AAV, כולל AAV. PHP.eB מסתמך על תאי HEK293T דבקים ועל שיטת הטרנספקציה המשולשת. השגת תפוקות גבוהות של AAV עם תאים דבקים כרוכה בתהליך עתיר עבודה וחומר. אילוץ זה הניע פיתוח פרוטוקול לתרבית תאים מבוססת השעיה בצינורות חרוטיים. AAVs שנוצרו בתאים דבקים הושוו לשיטת ייצור התרחיף. תרבית בהשעיה באמצעות ריאגנטים transfection Polyethylenimine או TransIt הושוו. וקטורי AAV טוהרו על ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול ואחריה חילופי חיץ וריכוז באמצעות מסנן צנטריפוגלי. בשיטה הדבקה השגנו ממוצע של 2.6 x 1012 עותקי גנום (GC), בעוד ששיטת ההשעיה והפוליאתילנימין הניבו 7.7 x 1012 GC בסך הכל, ו- TransIt הניב 2.4 x10 13 GC בסך הכל. אין הבדל ביעילות התמרת vivo בין וקטורים המיוצרים עם דבק בהשוואה למערכת תאי התלייה. לסיכום, פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתרחיף מוצג, וכתוצאה מכך כמות מופחתת של זמן ועבודה הדרושים לייצור וקטורי תוך השגת תפוקות גבוהות פי 3 עד 9 באמצעות רכיבים הזמינים מספקים מסחריים למטרות מחקר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס הקשור לאדנו (AAV) התגלה בשנת 1965 ומאז נעשה בו שימוש במספר עצום של יישומים1. AAVs יושמו במחקר מדעי המוח כדי לחקור גנים ותפקוד עצבי, למפות מעגלים עצביים, או לייצר מודלים של בעלי חיים למחלות2. באופן מסורתי, זה נעשה על ידי הזרקה ישירות באתר של עניין, כמו רוב הסרוטיפים הטבעיים אינם חוצים את מחסום הדם-מוח או צריך מינון גבוה לעשות זאת 1,2,3.

עם גילוי AAV. PHP.B4 וקפסידים מהדור הבא כגון AAV. PHP.eB5 ו- AAV. CAP-B106, ניתן לכוון את מערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות הזרקה מערכתית פשוטה. מיפוי מרחבי חושף את התאים שאליהם מכוון AAV. PHP.eB ברמה סלולרית 6,7. בשילוב עם מקדמים/משפרים ספציפיים, קפסידים אלה מציעים הזדמנויות נרחבות למדעני מוח לחקור גנים ותפקוד המוח על ידי אספקת AAV לא פולשנית 4,8.

בעוד מינון נמוך יותר נדרש עבור AAV. PHP.eB (בדרך כלל 1 עד 5 x 1011 עותקי גנום (GC) / עכבר) בהשוואה ל- AAV9 (4 x10 12 GC / עכבר)7, עדיין יש לייצר יותר וקטור בהשוואה לאסטרטגיות הזרקה ישירה (בדרך כלל 1 x 109 GC / μL הזרקה). ניתן לייצר את רוב הסרוטיפים הטבעיים באמצעות מערכת תרבית התאים הדבקה הקלאסית בשילוב עם טיהור יודיקסנול 9,10,11,12. עבור AAV. PHP.eB זה כרוך בתהליך עתיר עבודה לתרבית ולהעברת תאים כדי להשיג מספיק וקטורים לניסוי אחד8. לכן, פותח ייצור AAV בתרבית תאי השעיה בצינורות חרוטיים. צינורות חרוטיים, עם קיבולת של עד 300 מ"ל, הם קומפקטיים, חוסך הן שטח אינקובטור פלסטיק. תאי תרחיף הרבה יותר קלים לתרבית ולטיפול בכמויות גדולות מאשר תאים דבקים על לוחות 15 ס"מ. רכיבי הטרנספקציה של הפרוטוקול נשארים זהים. לכן, פלסמידים ששימשו בעבר עם מערכת דבק ניתן בקלות להשתמש בפרוטוקול זה מבוסס על ייצור בתאי ההשעיה. הפרוטוקול הועבר בהצלחה לחוקרים אחרים במעבדה ושימש בהצלחה לקפסידים ומבנים שונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה המלכותית ההולנדית למדעים (KNAW) והיו בהתאם לחוק ההולנדי לניסויים בבעלי חיים תחת פרויקט מספר AVD8010020199126. באיור 1 מוצגת סקירה סכמטית של הפרוטוקול המלא. מזריעת תאים ועד לטיהור AAV, הפרוטוקול לוקח 6 ימים להשלים.

1. הכנת מגיב

  1. טיהור פלסמיד
    1. בצע מיצוי פלסמיד כמתואר על ידי היצרן עם כמה התאמות כדי להבטיח סטריליות של פלסמידים.
    2. הכינו אתנול 70% באמצעות מים מזוקקים סטריליים ואתנול מוחלט.
    3. לאחר שלב הצנטריפוגה איזופרופנול, יש לייבש פלסמידים במכסה המנוע של ארון הזרימה ולהוסיף אתנול סטרילי 70% לצינורות. לאחר משקעי אתנול, יבשו את הפלסמידים במכסה המנוע של ארון הזרימה והשעו מחדש את הפלסמיד במים מזוקקים סטריליים. יש להקפיד להשתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגות מעוקרים.
    4. קח aliquot עבור כימות, ניתוח הגבלה, ואם יש צורך, ריצוף. מומלץ לבדוק את תקינות החזרות הטרמינליות ההפוכות (ITR) מכיוון שלמוטציות יכולה להיות השפעה שלילית על התפוקה. התאם את ריכוז הדגימה ל- 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
  2. הכנת חיץ ליזיס 10x Tween
    1. יש להמיס 30.3 גרם מאגר Tris ו-2.033 גרם MgCl 2.6H 2O ב-400 מ"ל מים מזוקקים סטריליים, להגדיר pH ל-8.0 ולהגדיל את הנפח הכולל ל-450 מ"ל.
    2. שמור על Tween 20 סטרילי, הוסף 50 מ"ל של Tween 20 לתמיסת חיץ במכסה המנוע, וסנן סטריליזציה באמצעות מסנן ואקום 0.2 מיקרומטר.
  3. דילול יודיקסנול
    1. תמיסת יודיקסנול מסופקת בריכוז של 60%. השתמש בפתרון ההתחלתי כדי ליצור פתרונות של 15%, 25% ו- 40%.
    2. עבור תמיסה של 15%, יש לדלל 60 מ"ל של תמיסה של 60% עם 48 מ"ל של 5 M NaCl ו-48 מ"ל של PBS-MK (5x PBS עם 5 mM MgCl2 ו-12.5 mM KCl), ולהוסיף מים מזוקקים עד 240 מ"ל.
    3. עבור 25% תמיסה, לדלל 67 מ"ל של 60% תמיסה ו 32 מ"ל של PBS-MK. מוסיפים מים מזוקקים עד 160 מ"ל. מערבבים היטב ומוסיפים 1.6 מ"ל של תמיסה אדומה פנול.
    4. עבור 40% תמיסה, לדלל 160 מ"ל של תמיסה 60% עם 48 מ"ל של PBS-MK ולהוסיף מים מזוקקים עד 240 מ"ל. עבור 60% תמיסה, להוסיף 1 מ"ל של פנול אדום ל 100 מ"ל של 60% תמיסה.
  4. תמיסת PBS 5% סוכרוז
    1. הוסף 25 גרם סוכרוז לבקבוק 500 מ"ל של DPBS ללא סידן או מגנזיום. יש לנער היטב ולסנן באמצעות מסנן ואקום של בקבוק 0.2 מיקרומטר.
  5. תמיסת פוליאתילן גליקול (PEG) 8000
    1. יש להמיס 400 גרם PEG 8000 ו-24 גרם NaCl במים מזוקקים סטריליים ולהתאים לנפח הסופי של 1000 מ"ל. מערבבים עם חימום עד להמסה מלאה. כוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות נייר pH.
    2. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן ואקום של בקבוק 0.2 מיקרומטר לקבלת תמיסת 40% PEG 8000. שים לב כי סינון ייקח זמן מה בשל צמיגות של פתרון לאחסן ב 4 ° C.

2. תרבית תאי השעיה HEK293

  1. השתמשו במגבונים ספוגים באתנול 70% לניקוי. נקו את מכסה המנוע לבטיחות ביולוגית, הכינו ונקו את כל החומרים הדרושים לגידול תאים.
  2. מחממים מראש 30 מ"ל של תא השעיה בינוני עד 37 מעלות צלזיוס בצינור תרבית חרוטי 50 מ"ל. אחזור תאי ייצור נגיפיים מחנקן נוזלי. הפשיר במהירות תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. רגע לפני שהבקבוקון מופשר לחלוטין, נקו אותו עם מגבון ספוג באתנול 70% והעבירו את הבקבוקון למכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית.
    הערה: הפרטים של תאי הייצור הנגיפיים המשמשים כאן מופיעים בטבלת החומרים.
  3. להעביר במהירות תאים לצינור תרבית חרוטי 50 מ"ל שחומם מראש. תאי תרבית באינקובטור רעד בטמפרטורה של 37°C, 80% לחות, 8%CO2, 200 סיבובים לדקה (RPM) וקוטר טלטול של 50 מ"מ. תאי מעבר, פעם אחת הכדאיות היא מעל 90% וצפיפות התאים היא מעל 1-3 x 106 תאים / מ"ל.
    הערה: האינקובטור המשמש הוא בעל קוטר רעד של 50 מ"מ; יש להתאים את תנאי התרבית לקוטר רעד שונה.
  4. תאי מעבר 3-4 ימים לאחר ההפשרה. בדוק צינור(ות) תרבית כדי לוודא שאין סימנים של זיהום; לדוגמה, פטרייה תופיע כטבעת דהויה (שחורה או ירוקה).
  5. הכינו 400 מיקרוליטר של 0.4% תמיסה כחולה טריפאן לכל דגימה באמצעות פס 1 מ"ל.
  6. שלפו במהירות תאי השעיה מהאינקובטור. מיד לחלץ 500 μL מן הצינור באמצעות פס 1 מ"ל. מזלפים בעדינות למעלה ולמטה.
  7. הוסף 100 μL של תרחיף התא לצינור הכחול טריפאן מוכן. הפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב; אין לערבב בצנרת, מכיוון שהדבר יוביל למוות תאי. להחזיר תאים לאינקובטור.
  8. קח 50 μL של תרחיף תאים כחול טריפאן ולהחיל אותו על שקופית hemocytometer. ספור את סך התאים בני קיימא וחשב את כמות תרחיף התאים והמדיום הדרושים למעבר או להעברה למחרת.
  9. חם בינוני באינקובטור במשך 10-15 דקות. מוסיפים את תרחיף התאים למדיום המחומם וחוזרים לאינקובטור. עבור תאים עוברים במשך 3 ימים (כלומר, שני עד חמישי), להגדיר 0.5 x 106 תאים / מ"ל; עבור תאים עוברים במשך 4 ימים (כלומר, חמישי-שני), מוגדר 0.3 x 106 תאים / מ"ל.
    הערה: לדברי היצרן, תאי ייצור נגיפיים מכפילים את עצמם כל 26 שעות וצריכים להיות בין 3.5 x 106 ו 5.5 x 106 לפני המעבר. ניתן לשמור תאים עד מעבר 20.

3. טרנספקציה

  1. יום 1
    1. ב 24 שעות לפני transfection, תרבית 1 x 106 תאים לכל / מ"ל ב 300 מ"ל של מדיה.
  2. יום 2
    1. מדיום חם, פלסמידים, מגיב transfection לטמפרטורת החדר. לסכומים שיש להכין, ראו טבלה 1.
    2. בקצרה פלסמידים מערבולת ריאגנטים. מוסיפים פלסמידים למדיום המוכן, מערבולת. מוסיפים מגיב טרנספקציה ומערבולת בקצרה. אין להתסיס את התערובת לאחר שלב זה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    3. בינתיים, ספרו תאים שהוכנו ביום הראשון. תאים צריכים להיות בין 2 ל 2.5 x 106 תאים לכל מ"ל ו > 95% קיימא.
    4. לאחר הדגירה, טיפתית, להוסיף את תערובת transfection לתאים תוך ערבול עדין של הצינור. דגירה במשך 72-96 שעות.

4. קצירת התאים

  1. יום 5
    1. יש להוסיף 33 מ"ל של חיץ ליזה תאי 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), לערבב על ידי ניעור עדין ולדגור ב-37°C למשך שעה וחצי עם טלטול.
    2. צנטריפוגה ב 3428 x גרם ב 4 ° C למשך 60 דקות. סנן דרך מסנן ואקום PES של 0.45 מיקרומטר כדי להבהיר את הליזט של התא, והשאר את הליזט המובהר במיכל המסנן.
      הערה: אופציונלי לאחר סינון: קח 50 μL של דגימה עבור PCR כמותי (Q-PCR).
    3. הוסף 90 מ"ל של תמיסת 40% PEG 8000 ל- 360 מ"ל של ליזט תאים מסונן.
    4. נקו את הסורג עם 70% אתנול והוסיפו לדגימה. מערבבים על קרח או בחדר הקר במהירות 300 סל"ד למשך שעה. יש לדגור על טמפרטורה של 4°C מבלי לערבב למשך הלילה.
      הערה: נבדקו זמני דגירה של שעה עד 72 שעות. לזמני דגירה ארוכים יותר יש השפעה שלילית על כמות המשקעים הכוללת של החלבון.

5. טיהור יודיקסנול

  1. יום 6
    1. העבירו את כל דגימת נפח התרבית המואצת של PEG לצינור חרוטי גדול ונקי ולצנטריפוגה במהירות של 2,820 x גרם ו-4°C למשך 15 דקות.
    2. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית ה-PEG ב-15 מ"ל של DPBS עם סידן ומגנזיום. קשה לתלות את הגלולה; קח את הזמן לעשות זאת בזהירות.
    3. העבר את החלק המושעה מחדש לצינור נקי של 50 מ"ל. PEG יישאר בצידי צינור הביוריאקטור. מוסיפים עוד 10 מ"ל, דואגים לאסוף את כל משקע ה-PEG. מעבירים הכל למיכל של 50 מ"ל לנפח כולל של 25-30 מ"ל.
    4. הוסף 40 μL של DNaseI (10 U/μL). מניחים באינקובטור למשך שעה אחת ו-37 מעלות צלזיוס.
      הערה: אופציונלי לאחר הדגירה של DNase: לקחת 50 μL של דגימה עבור Q-PCR.
    5. חטיפי ערבוב נקיים ששימשו למשקעים PEG היטב עם תמיסת כלוריד ואחריה 70% אתנול. השאירו את החטיפים באתנול 70% לניסוי הבא.
    6. ממלאים צינור פוליאלומר בגודל 25 מ"מ x 89 מ"מ באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית עם 15.5 מ"ל של ליזט תאי מרוכז בכל צינור. לאחר הוספת ליזט התא, החליפו את פיפטת פסטר הזכוכית בחדשה.
    7. הוסף תמיסות יודיקסנול מ 15%-60%: להחדיר 9 מ"ל של תמיסת 15% יודיקסנול בעדינות מתחת לליזט התא. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של 25% ו 40% יודיקסנול תמיסות, ולבסוף, להוסיף 5 מ"ל של 60% תמיסת יודיקסנול.
    8. מעל הצינור באמצעות מזרק עם DPBS +/+ כדי להסיר את רוב בועות האוויר, תוך הקפדה לא להפריע לשכבות יודיקסנול. אטמו את הצינור באמצעות ציפוי צינור חשמלי.
    9. צנטריפוגה ברוטור ללא נדנדה למשך שעה ו-10 דקות ב-490,000 x גרם ב-16°C באולטרה-צנטריפוגה. מוציאים מאולטרצנטריפוגה, מרכיבים את הצינורות באבזם מתכת ומכינים צינורות איסוף. פתח את הרוטור במכסה המנוע במקרה של שפיכת נוזלים במהלך סיבוב.
    10. הכינו צינור אחד של 50 מ"ל (להשלכת צינור הרוטור), צינור אחד של 15 מ"ל (לאיסוף וירוסים), מזרק של 5 מ"ל ומחט של 30 גרם ו-19 גרם לכל שיפוע.
    11. נקב חור בחלק העליון של הצינור עם מחט 30G. השאירו את המחט במקומה. מניחים מחט 19G על המזרק.
    12. נקב בזהירות את הצינור ממש מתחת לממשק 40% / 60%, אשר ניתן לראות על ידי מחוון פנול אדום. ודא ששיפוע המחט פונה לשכבה של 40%.
    13. הסר את מחט 30G מראש הצינור באמצעות היד הלא דומיננטית. עם המחט משופעת, לחלץ לאט את הנגיף/יודיקסנול. המטרה היא לחלץ בין 3 מ"ל ל 4.5 מ"ל. בערך באמצע הדרך ועמוק לתוך שכבת 40%/שקופה, סובבו את המחט כך שהשיקוע יפנה כלפי מטה והמשיכו לחלץ כדי למנוע איסוף משכבת החלבון.
    14. הכינו את הצינור 50 מ"ל ביד הלא דומיננטית, חלצו בזהירות את המחט תוך הנחת הצינור בצינור 50 מ"ל והשליכו. לדלל את תרחיף AAV/יודיקסנול 5x ב- DPBS על ידי מילוי של עד 15 מ"ל.
    15. מעבירים לצינור מסנן צנטריפוגלי וצנטריפוגה בטמפרטורה של 3428 x גרם, 4°C למשך 10 דקות. השלכת זרימה; הסירו בעדינות את מחזיק המסנן והטו את המיכל התחתון לתוך בקבוק פסולת. הוסף 15 מ"ל של PBS-5% סוכרוז כדי לסנן ולהשהות מחדש.
    16. צנטריפוגה ב 3428 x גרם ב 4 ° C למשך 20 דקות. חזור על חילופי מאגר לפחות 3x. אחסן וירוס (~ 150-250 μL) ב 4 °C (PHP. גרסאות B מקסימום 3 חודשים) או aliquot לתוך 50 μL aliquots ולאחסן ב -80 ° C לטווח ארוך.
      הערה: PHP. גרסאות B capsid רגישות להקפאה/הפשרה, ולכן יש להימנע מכך.
    17. בצע טיטרציה כמתואר בפרוטוקול קודם10.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב המעבדות האקדמיות משתמשות בתאי HEK293T דבקים לייצור AAV 8,9. בעוד שזה עובד טוב יחסית כאשר כמויות קטנות של AAV נדרשות להזרקה ישירה, טיטר גבוה פי 100 (מינימום 1 x 1011 GC / עכבר) נדרש כדי להשיג התמרה דומה עם capsids מערכתיים כגון AAV. PHP.eB.

בפרוטוקול זה נקבע ייצור AAV באמצעות תאי HEK293 תרחיף בתרבית בצינורות חרוטיים. תרביות בקנה מידה קטן ניתן לעשות בצינורות 50 מ"ל בקנה מידה גדול בצינורות 600 מ"ל. עבור שייקרים ספציפיים (ראו טבלת חומרים), ניתן להשתמש בארון תקשורת שבו ניתן לתרבית עד 16 צינורות גדולים בו זמנית. ארון תקשורת זה משמש בשילוב עם תוספות מיוחדות עבור צינורות של 50 מ"ל (איור 2A). מערכת זו מציעה רווח משמעותי בזמן עבור מגזר הטיפוח והטרנספקציה של פרוטוקול זה. ההתקנה הראשונית של הייצור נעשתה עם מבנים כתב עבור לוציפראז וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)10,11. במקביל, מבנה GFP הופק ב 12, 15 ס"מ2 לוחות כמתואר בפרוטוקולשפורסם בעבר 12. בממוצע, תפוקה של 7.7 x 1012 GC בסך הכל הושגה באמצעות פוליאתילנימין (PEI) ו- 2.4 x 1013 GC באמצעות TransIt (איור 2B). עבור PEI, זהו שיפור של כמעט פי 3; עבור TransIt, זהו שיפור של פי 9.2 לעומת טיטרים שהושגו עם תרבות דבק (2.6 x 1012). כאשר משתמשים בו כדי להדביק תאי תרחיף, TransIt נותן שיפור של בערך פי 3 בתפוקה בהשוואה ל-PEI (איור 2B).

לאחר מכן, הביצועים של וקטורי AAV נבדקו in vivo. וקטורי GFP יוצרו עם PEI ו- TransIt והושוו לווקטורי GFP שיוצרו עם מערכת הדבק הקלאסית. לאחר 4 שבועות לאחר ההזרקה, עכברים (6 שבועות C57BL/6 נקבות עכברים במשקל 20-25 גרם) הוקרבו, וביטוי GFP במוחות של עכברים הוערך על-ידי היסטולוגיה (איור 3A). ניתוח השוואתי נעשה על קטעי מוח sagittal. לא נצפה הבדל בדפוס ההעברה של הנגיף שנוצר באמצעות שיטות הייצור האלה (איור 3B). כמו כן הוערכה פעילות הלוציפראז של הווקטורים המיוצרים בשתי השיטות. התמרה נמדדה in vivo במשך 3 שבועות; דפוס הביטוי לאורך זמן דומה, לא משנה באיזה מגיב טרנספקציה משתמשים (איור 4).

לאחר מכן, הפרוטוקול נבדק ויושם על ידי חברים אחרים בצוות (טבלה 2). הייצור של קפסידים אחרים עם PEI היה מוצלח, והניב תשואה ממוצעת של 3.5 x10 12 וקטורים GC. עבור ייצור קפסיד B10, ניתן להשיג שיפור של פי 3 באמצעות TransIt לעומת PEI. עבור פרויקט אחר, כמה מבנים ארוזים AAv.PHP.eB נתן תפוקה ממוצעת של 3.7 x 1012, וזה מספיק כדי להזריק 7 עכברים תוך ורידי במינון של 5 x 1011 GC לכל עכבר. תוצאות אלה ממחישות כי הפרוטוקול יכול לשמש בהצלחה על ידי מספר חוקרים עבור capsids שונים ולבנות שילובים.

figure-results-1
איור 1: סקירה סכמטית של הייצור. ביום 1 (D1), תאים מתורבתים בצינורות של 300 מ"ל. ביום 2 (D2), התאים נגועים בפלסמידים הרלוונטיים. ביום 5 (D5), תאים נקצרים ו lysed באמצעות 10x tween lysis buffer. לאחר ליזיס, פסולת התא מוסרת על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, התא ליזט מסונן כדי להסיר חלבונים גדולים, ואת וירוס AAV הוא זירז באמצעות פוליאתילן גליקול (PEG) 8000. ביום 6 (D6), טיהור יודיקסנול וריכוז מבוצעים. תרכיז ה-PEG מהיום הקודם מטופל ב-DNase ולאחר מכן מונח דרך שיפוע יודיקסנול. הווקטורים המטוהרים עוברים לאחר מכן התפלה ומרוכזים באמצעות מסנן צנטריפוגלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הקמת אינקובטור ותשואות AAV. (A) תאי ייצור נגיפיים מתורבתים באינקובטור מטלטל בקוטר של 50 ס"מ. אינקובטור זה מצויד בצלחת מתאם לצינורות 600 מ"ל ותוספות מיוחדות לצינורות 50 מ"ל המיוצרים על ידי מחלקת מכטרוניקה. (B) לאחר ההגדרה הראשונית, הכתב בונה באמצעות פוליאתילאנאימין (PEI; 7.7 x10 12 GC סה"כ, n=5) או TransIt (2.4 x 1013 GC סה"כ, n=5) כשיטת טרנספקציה ומשווה את התשואות שהושגו בשיטת הדבק הקלאסית (2.6 x10 12 GC סה"כ, n=5) כמתואר ב- Verhaagen et al.12. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תבנית ביטוי GFP לאחר הערכת in vivo . (A) תיאור סכמטי של מבנה וקטורי AAV טיפוסי המכיל את מקדם CMV המצוי בכל מקום, משפר מיידי-מוקדם של CMV, מקדם β-אקטין עוף ואתר קבלת סליס β-גלובין ארנב (CAG) ואחריו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), וירוס הפטיטיס וודצ'וק (WHV), אלמנט רגולטורי לאחר שעתוק (WPRE) וזנב פוליאדנילציה (pA)13. כאן, נקבות עכברים בנות 6 שבועות (n = 3) קיבלו זריקת וריד זנב שהכילה 5 x 1011 עותקים גנומיים סה"כ (gc) / עכבר. לאחר 4 שבועות לאחר ההזרקה, עכברים הוקרבו, ומוחות נותחו על ידי היסטולוגיה. (B) תיאור מייצג של דפוס הטרנסדוקציה בחתכי קשת, תוך שימוש בתאי HEK293T דבקים ותאי השעיה עם פוליאתילניאמין (PEI) או מגיב טרנספקציה טרנזיט, דפוס התמרה דומה נצפה ללא קשר לשיטת הייצור בה נעשה שימוש. סרגל קנה מידה = 1000 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: פעילות דומה של לוציפראז ללא קשר לשיטת הטרנספקציה. (A) תיאור סכמטי של המבנה המשמש המכיל את מקדם CMV הנפוץ בכל מקום, מקדם β-אקטין עוף וארנב β-Globin splice acceptor site (CAG) luciferase (LUC) עם תג V5 וזנב פוליאדנילציה של הורמון גדילה בקר (BGHpA), 5 x 1011 GC סה"כ/עכבר (n = 3) הוזרק דרך וריד הזנב, פעילות לוציפראז באזור הגולגולת (בעיגול אדום, בתמונה לדוגמה) כמו תמונה bioluminescent נמדד מדי שבוע. (B) פעילות ביולומינסנטית נמדדה כיחידות הארה יחסית (RLU) המתוארות כפס כחול לייצור PEI ופס חום עבור TransIt. לא נצפה הבדל משמעותי בפעילות הלוציפראז באזור המוח שנבחר בין הקבוצות. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פרמטרים של טרנספקציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: תשואות הפרוטוקול המיושמע. פרוטוקול השעיה המשמש חוקרים אחרים לייצור AAV. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניהול מערכתי של AAV הוא כלי רב עוצמה להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית; עם זאת, הייצור של AAV הוא תהליך יקר ומייגע. על ידי שימוש בתאי תרחיף, העבודה והפלסטיק מופחתים בהשוואה לתרבית הדבקה של HEK293T על 15 ס"מ2 צלחות. יתר על כן, הצינורות החרוטיים המיושמים כאן קלים לטיפול וממקסמים את השימוש בחלל המעבדה. הפרוטוקול נקבע על ידי שני חוקרים ולאחר מכן יושם על ידי אחרים במעבדה. סדרה של הפקות על ידי שלושה חוקרים עצמאיים הניבה, בממוצע, מספיק וקטורים לכל אצווה כדי להזריק 6-7 עכברים.

השימוש בתאי תרחיף HEK293 תואר קודם לכן13,14. עם זאת, קו תאי ההשעיה המתואר אינו זמין באופן חופשי למטרות מחקר. זהו צוואר בקבוק עבור חוקרים אקדמיים בעת יישום השיטות המתוארות. קו תאי ההשעיה המתואר בפרוטוקול זה זמין באופן חופשי למטרות מחקר. תרבית תאי התרחיף נעשתה בצינורות חרוטיים במקום אלה של ארלנמאייר כדי לחסוך מקום וזמן. אצל ארלנמאייר ניתן לתרבית עד 4 הפקות בו זמנית, לעומת 12 הפקות באמצעות צינורות חרוטיים. צינורות חרוטיים ניתן להעביר ישירות לצנטריפוגה לקציר.

אפשרות חלופית אחת למערכת תרבית תאי השעיה היא המערכת הבקולו-ויראלית. היתרון של מערכת baculo הוא כי תאים אלה ומדיה זמינים לציבור ניתן ליישם בקלות. עבור אקדמאים, מאגרים כגון Addgene זמינים, המכילים ספרייה גדולה של פלסמידים מוכנים לשימוש AAVהעברת 12. בעוד שלאלה יכולות להיות גם אזהרות, כגון ITR פגומים, הם משמשים כמקור טוב לניסויי plug-and-play. הבחירה נעשתה כדי לשמור על מערכת ייצור מבוססת HEK293 כמו פלסמידים זמינים ניתן להשתמש ישירות לייצור ללא העברת המבנה baculovirus.

עבור transfection, polyethyleneimine הוא זול יחסית, ולכן, מגיב transfection של בחירה. כחלופה, שיטת טרנספקציה חדשנית (TransIt) הוערכה כדי להגדיל את התפוקה של וקטורים. שיפור של פי שלושה נצפה באמצעות מחצית מכמות הפלסמידים. זה הופך את TransIt למגיב טרנספקציה חלופי מעניין כאשר יש צורך במלאי גדול יותר. מגבלה של זה היא העלות, מה שהופך אותו פחות מעניין עבור קבוצות קטנות.

לסיכום, כאן מוצג פרוטוקול שניתן להשתמש בו לייצור AAV בעל תפוקה גבוהה בתאי תרחיף בסביבת מעבדה אקדמית. מתוארים כלים שניתן להשתמש בהם במסגרת מעבדה אקדמית כדי לייצר AAV בתפוקה גבוהה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדגם חינם של TransIT סופק על ידי מירוס לבדיקה ראשונית, ולאחר מכן מגיב נרכש לשימוש נוסף. למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים אחרים לדווח עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן המחקר של האקדמיה המלכותית ההולנדית לאמנויות ולמדעים (KNAW) ומענק מ-Start2Cure (0-TI-01). אנו מודים ללישה קופ על תרומתה ועצותיה בהגדרת הפרוטוקול. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
39 מ"ל, צינור פוליפרופילן עגול עם איטום מהיר, 25 x 89 מ"מ - מתאם 342414בקמן קולטר
600 מ"ל צינורות חרוטיים, לרוטור S-4x1000,  5920701002eppendorf
מתאימה ל-16 ביו-ריאקטורים של 600 מ"לInfors HT/TPP587633
מכסים אטומים לאירוסול, לכפות עגולות של 750 מ"לeppendorf5820747005
5920 R G, 230 V, 50-60 הרץ, כולל רוטור S-4x1000, דליים עגולים ומתאם 15 מ"ל/50 מ"ל צינורות חרוטייםeppendorf5948000315
מים מזוקקיםGibco
DNase I רקומביננטי, ללא RNaseRoche4716728001
DNase I רקומביננטי, ללא RNaseRoche4716728001
DPBS, סידן, מגנזיוםGibco14040091
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםGibco14190144
Fisherbrand יחידות מסנן PES חד פעמיות 0,2פישר
Fisherbrand חד פעמי PES סינון יחידות 0,45פישרFB12566505
מחזיק עבור 50 מ"ל צינורות תרבות מתאים גם בז צינורInfors HT / TPP31362
מחזיק עבור 600 מ"ל צינור תרבית תאיםInfors HT / TPP66129
חממה Minitron 50 מ"מInfors HT500043
LV-MAX ייצור בינוניGibco
מגש N מידע אוניברסליHT / TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk ברנבורג1893
PEI MAX - פוליאתילנימין הידרוכלוריד ליניארי בדרגת טרנספקציה (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
תמיסת פנול אדומה סיגמא-אולדריץ'72420100
פולי (אתילן גליקול) 8000סיגמא-אולדריץ'89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreactors-50 מ"לTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600 מ"לTTP87600
תאי ייצור ויראליGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363
50Pkלוחית מתאם צנטריפוגה 15230147FB12566504A3583401

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).
  2. Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).
  3. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  4. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  5. Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
  6. Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
  7. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
  8. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  9. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960(2019).
  10. Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
  11. Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
  12. Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
  13. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  14. Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AAVAAV yieldPolyethylenimine

מאמרים קשורים