הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים

989 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66543

⸱

12 ביולי 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים של הטמעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים, תוך התמקדות בחקר מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים ברשתית.

תקציר

הרשתית מורכבת מתאים רבים היוצרים מעגלים עצביים מגוונים, המהווים את השלב הראשון של מסלול הראייה. כל מעגל מאופיין בתכונות ייחודיות ובמוליכים עצביים מובחנים, הקובעים את תפקידו ואת משמעותו התפקודית. בהתחשב בסוגי התאים המורכבים בתוך המבנה שלה, המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה. כדי לחקור טוב יותר מעגלי רשתית ודיבור צולב, כגון הקשר בין מסלולי חרוט ומוט, ולוקליזציה מולקולרית מדויקת (מוליכים עצביים או נוירופפטידים), כגון נוכחות של חומר דמוי תגובתיות חיסונית דמוית P ברשתית העכבר, השתמשנו בשיטת מיקרוסקופ אימונואלקטרונים (immuno-EM) להטמעה מראש (immuno-EM) כדי לחקור קשרים סינפטיים וארגון. גישה זו מאפשרת לנו לאתר קשרים סינפטיים בין-תאיים ספציפיים ולוקליזציה מולקולרית מדויקת, ויכולה למלא תפקיד מנחה בחקר תפקידה. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל (1) הכנת קיבוע רשתית, (2) הטבעה מראש של אימונוסטיין, ו-(3) לאחר קיבוע והטבעה.

מבוא

המורכבות של מעגלים עצביים ברשתית מציבה אתגרים לחקירה, בהתחשב בסוגי התאים המגוונים בתוך המבנה שלה 1,2. השלב הראשוני כולל זיהוי קשרים סינפטיים בין תאים שונים וקביעת הלוקליזציה התאית של נוירוטרנסמיטורים או נוירופפטידים ספציפיים. ככל שהביולוגיה המולקולרית מתקדמת מציגה חלבונים חדשים, לוקליזציה מדויקת ברשתית הופכת חיונית להבנת תפקודיהם ולניתוח מעגלי הרשתית והקשרים הסינפטיים 3,4,5.

בשל הרזולוציה המוגבלת של מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) משמש בדרך כלל כדי לזהות את המבנים התת-תאיים של תאי עצב. EM יש סיווגים שונים, עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור קונבנציונאלי (TEM) המשמש לצפייה אולטרה מבנים התא 6,7,8,9. מיקרוסקופ אימונואלקטרונים (immuno-EM), המשלב את הרזולוציה המרחבית של EM עם יכולת הזיהוי הכימית של נוגדנים הנקשרים באופן ספציפי לחלבונים10, בולט כשיטה האופטימלית והבלעדית לחקר קשרים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים תת-תאיים ברשתית 11,12.

ניתן לחלק את טכניקות האימונו-EM לשיטות קדם-הטבעה ופוסט-הטבעה המבוססות על סדר ההטבעה והדגירה של נוגדנים. בהשוואה לשיטת ההטבעה שלאחר ההטבעה, גישת קדם-הטבעה מסוגלת לזיהוי בקנה מידה גדול ולמרחקים ארוכים 13,14,15, ומציעה גישה אופטימלית לחקר תהליכים תאיים כמו אקסונים ודנדריטים. בנוסף, טכניקה זו מספקת אות חזק ושדה ראייה רחב, מה שהופך אותה ליתרון לחקירות מקיפות של ביטוי חלבונים ולוקליזציה מולקולרית בציטופלסמה. שיטה זו מוכיחה את עצמה כבעלת ערך רב במיוחד בהבטחת מבנים מזוהים כימית הנראים לאורך כל הציטופלסמה, התאים או הרשתית.

עם זאת, שיטת ההטבעה שלאחר ההטבעה, אף שהיא בעלת חדירה או דיפוזיה נמוכה יותר בהשוואה לשיטת ההטבעה המוקדמת, אינה רגישה כל כך16,17. במילים פשוטות, אם המטרה היא לחקור את הלוקליזציה של נוירוטרנסמיטורים ספציפיים בציטופלסמה או במסופים סינפטיים, ההטבעה מראש של immuno-EM היא השיטה המועדפת. לעומת זאת, לצורך זיהוי לוקליזציה של קולטני ממברנה, מומלץ יותר להשתמש ב- EM אימונוגולד לאחר הטבעה.

בהתחשב בשיקולים אלה, אנו בוחרים בשיטת ההטבעה מראש של immuno-EM כדי להתעמק במעגלי הרשתית, כולל האינטראקציה בין מסלולי חרוט ומוט, ולוקליזציה מולקולרית, כגון התפלגות וארגון סינפטי של תגובתיות חיסונית דמוית P (SP-IR) ברשתית העכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הטיפול והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי תקנה של ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו בהתאם להנחיות ARVO. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים בוגרים (C57BL/6J, זכר ונקבה, בני 8 עד 12 שבועות). הציוד והריאגנטים הדרושים למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנה לקיבוע הרשתית

  1. הרכיבו את החומרים והכלים הבאים: מיקרוסקופ נתיחה, שני מלקחיים עם קצוות עדינים מאוד, מספריים, מחט מזרק 1 מ"ל (גודל מחט: G26) ונייר סינון.
  2. הרדמה עמוקה של עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 2,2,2-tribromoethanol במשקל גוף של 0.25 מ"ג/גרם. לאחר מכן, ערפו את ראשיהם של העכברים וחתכו את ראשיהם16.
  3. חנכו את עיניהם במספריים למרפק והניחו אותן בכלי זכוכית המכיל 4% פרפורמלדהיד-0.2% חומצה פיקרית בחיץ פוספט 0.1M (PB; pH 7.4).
  4. תחת המיקרוסקופ המנתח מנקבים חור בלימבוס הקרנית באמצעות מחט מזרק 1 מ"ל וחותכים את המקטע הקדמי במספריים, בעקבות החור. לאחר מכן, הסר את העדשה משטח הרשתית הפנימית באמצעות מלקחיים.
  5. השתמשו בשתי מלקחיים כדי לקלף בזהירות את לובן העין עד שהרשתית מבודדת לחלוטין מהעין (רקמת הרשתית המופרדת לחלוטין מהכורואידים). לאחר מכן, לחתוך את הרשתית לארבעה חלקים.
  6. תקן חלקים אלה ב-4% paraformaldehyde-0.2% picric acid ב-0.1 M PB (pH 7.4) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן העבר את הרקמה ל-4% paraformaldehyde ב-0.1 M PB (pH 10.4) למשך הלילה ב-4°C.

2. הטמעה מוקדמת של אימונוסטיישן

  1. לאחר שטיפה של 0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, יש לדגור על רקמות הרשתית בנתרן בורוהידריד 1% (NaBH4) ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך 30 דקות.
  2. יש לשטוף את מקטעי הרשתית ב-0.01 M PBS (pH 7.4) לפחות שש פעמים. בינתיים, להסיר את הזגוגית עם נייר סינון ולאחר מכן לחתוך את הרשתית לפרוסות קטנות בין 100-300 מיקרומטר באמצעות סכין גילוח פיפיות.
  3. לאחר חסימה עם 5% סרום עיזים תקין (NGS) ב 0.1 M PB (pH 7.4) במשך 1 שעה ב RT, לדגור את פרוסות הרשתית עם נוגדנים ראשוניים (נגד ארנב PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) יחד עם 2% NGS ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך שעתיים ב-RT על שייקר. לאחר מכן, לדגור במשך 96 שעות (5 ימים) ב 4 °C על שייקר.
  4. לאחר שטיפה שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת ב-0.01 M PBS (pH 7.4), יש לדגור על פרוסות הרשתית עם הנוגדן המשני ב-1:200, כגון IgG נגד ארנב עיזים, יחד עם 2% NGS ב-0.01 M PBS (pH 7.4) למשך שעתיים ב-RT על שייקר. לאחר מכן, לדגור במשך 48 שעות (2 ימים) ב 4 ° C על שייקר.
    הערה: נוגדנים משניים יושמו לבד בניסויי ביקורת.
  5. יש לשטוף את פסי הרשתית ב-0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחד לפני הדגירה עם מגיב A וריאגנט B מערכת ABC ב-1:100 ב-0.01M PBS (pH 7.4) למשך יומיים ב-4°C. (גם מגיב A וגם מגיב B דוללו ב-0.01 M PBS. לדוגמה: פתרון: 6 μl; תמיסת B: 6 מיקרוליטר; 0.01 M PBS: 588 μl, סה"כ 600 μl).
  6. יש לשטוף את פסי הרשתית בחיץ טריס של 0.05 מטר (pH 7.2) שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד. לאחר מכן, יש לדגור מראש על פסי הרשתית עם מגיב 5% 1 ו-5% מגיב 3 מערכת DAB במים מזוקקים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. (היחס לדוגמה: מגיב 1: 50 μl; מגיב 3: 50 μl; מים מזוקקים: 900 μl, סך של 1000 μl).
  7. מכתימים את פסי הרשתית עם DAB. הוסף את אותו נפח תמיסה משלושה צינורות בערכת DAB ברצף (מגיב 1-מגיב 2-מגיב 3). שימו לב למצב הצביעה באמצעות מיקרוסקופ הדיסקציה. עצור את הכתמים כאשר התאים הופכים חומים; תהליך זה אורך 10-20 דקות.
  8. שטפו את פסי הרשתית עם חיץ 0.05 M Tris (pH 7.2) שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד ולאחר מכן שטפו ב-0.01 M PBS שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת.

3. לאחר קיבוע והטבעה

  1. תקן את פסי הרשתית ב-2% גלוטראלדהיד למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן שטוף ב-0.01 M PBS (pH 7.4) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחד.
  2. דגרו על פסי הרשתית עם 1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO4) ב-0.1 M PB למשך שעה אחת ב-RT ושמרו אותם במקום חשוך.
  3. לאחר שטיפה במים מזוקקים (ddH2O) שש פעמים במשך 10 דקות כל אחת, לדגור על רקמות הרשתית עם אורניל אצטט במשך שעה אחת ב- RT ולשמור אותם במקום חשוך כדי להכתים רקמות אלה.
  4. שים את רקמות הרשתית בתמיסות אצטון (50%, 70%, 80% ו- 90%) למשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן ב- 100% פעמיים למשך 10 דקות כל אחת.
  5. טבלו את רקמות הרשתית בתערובת המכילה את אותו נפח של אורניל אצטט ושרף אפוקסי למשך שעה אחת בתנור ייבוש של 37°C, ולאחר מכן תערובת המכילה אורניל אצטט ואת השרף (1:4) למשך הלילה בתנור ייבוש של 37°C.
  6. מעבירים את רקמות הרשתית בעדינות באמצעות קיסם לתוך השרף החדש למשך שעה אחת בטמפרטורה של 45°C בתנור ייבוש, ולאחר מכן פס הרשתית המכוון מוטבע בצלחת ההטבעה עם השרף.
  7. הכניסו את הדגימה לתנור ייבוש בטמפרטורה של 45 מעלות למשך 3 שעות ולתנור ייבוש בטמפרטורה של 65 מעלות למשך 48 שעות.
  8. עצבו את קוביות ההטבעה לטרפזים וחתכו את הבלוק למקטעים בעובי 1 מיקרומטר עם אולטרה-מיקרוטום, צבעו חלקים אלה בכחול טולוידין, והקרינו מראש אזורים מעניינים תחת מיקרוסקופ אור.
  9. אספו מקטעים דקים במיוחד (70-90 ננומטר) על רשתות נחושת וצפו בהם תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מראה דוגמאות לניסויי בקרה ללא דגירה של נוגדנים ראשוניים כנגד חלבון קינאז C אלפא (PKCα) או SP, שבהם לא נמצאה תגובתיות חיסונית (IR).

איור 2 מתאר את PKCα-IR ברשתית העכבר. PKCα משמש כסמן לכל תאי המוט הדו-קוטבי (RBC) ברשתית18. ברמת מיקרוסקופ האלקטרונים (EM), ניתן לזהות RBC באמצעות PKCα-IR, המודגם על ידי תוצר התגובה דיאמינובנזידין (DAB) עם צפיפות אלקטרונים גבוהה. איור 2A מדגים דנד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה תיאר שלושה שלבים קריטיים לתצפית מוצלחת של מעגלים סינפטיים ולוקליזציה של חלבונים: (1) קיבוע מהיר וחלש, (2) הטבעה מוקדמת של אימונוסטיין, ו-(3) קיבוע והטבעה לאחר קיבוע.

אנו מציעים כי קיבוע הוא שלב המפתח לגישה מוצלחת של הטמעה מראש של immuno-EM. לפיכך, מודגשת כאן חשיבותו של קיבוע טרי ומהיר, המכנה עיקרון זה "עקרון 4F", שהוא חיוני להכנת רקמות. עם זאת, השגת חדירת נוגדנים משופרת וקיבוע יעיל מציבה אתגר20. כדי לטפל בכך, גלוטראלדהיד הוחלף ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילויים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2022YFA1105503), מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח (SKLN-202103), קרן ג'ג'יאנג למדעי הטבע של סין (Y21H120019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל מחט מזרקkangdelai
1% OsO4Electron Microscopy Science19100
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
8% GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
8% ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
אצטוןאלקטרונים מיקרוסקופיה מדע10000
אנטי ארנב PKCסיגמא-אולדריץ'P4334
אנטי ארנב SPAbcamab67006
DAB ערכת מצעMXB ביוטכנולוגיותKIT-9701/9702/9703
מספריים מרפקSuzhou66 חברת ראייה54010
מיקרוסקופ אלקטרוניםפיליפסCM120
אפון שרףאלקטרונים מיקרוסקופיה מדע14910
מלקחייםSuzhou66 חזון החברהS101A
Millipore נייר סינוןMerck Millipore 
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A רכיב של מאגר פוספט
NaH2PO4· H2OSigma71507רכיב של חוצץ פוספט
חומצה פיקריתמדע מיקרוסקופיה אלקטרונית19550
נתרן בורוהידריד (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramicrotomeLeica
Uranyl acetateElectron Microscopy Science22400
ערכת VACTASTAIN ABC, Peroxidase (Rabbit IgG)Vector LaboratoriesPK-4001
PR05538

מקורות

  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
  3. Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
  4. Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
  5. Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
  6. Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
  7. Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
  8. Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
  9. Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
  10. Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
  13. Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
  14. Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
  15. Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
  16. Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
  17. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
  18. Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
  19. Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
  20. van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
  21. Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
  22. Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
  23. Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
  24. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  25. Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  26. Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
  27. Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
  28. Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
  29. Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
  30. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
  31. Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
  32. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

קשרי סינפסהצביעה אימונוהיסטוכימית לפני הטמעהמעגלים נוירונליים ברשתיתתגובתיות אימונוכימית לסובסטנץ Pתאי ביפולר של קולטניםהשכבה הפלקסיפורמית החיצוניתצביעת DAB
חקירת מעגלי רשתית ולוקליזציה מולקולרית על ידי הטבעה מראש של מיקרוסקופ אימונואלקטרונים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.