הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66566

⸱

19 באפריל 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

תקציר

סיבוכים לאחר השתלת ריאות קשורים במידה רבה למערכת החיסון המארחת המגיבה לשתל. תגובות חיסוניות כאלה מווסתות על ידי הצלבה בין תאי התורם והמקבל. הבנה טובה יותר של תהליכים אלה מסתמכת על שימוש במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ונעזרת ביכולת לחקור סחר בתאי מערכת החיסון בזמן אמת. ניתן להשתמש במיקרוסקופ תוך-ויטלי של שני פוטונים כדי לצלם רקמות ואיברים לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם נזק מינימלי לאור, מה שמקנה יתרון גדול על פני מיקרוסקופ קונפוקלי של פוטון יחיד. שימוש סלקטיבי בעכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ספציפי למקדם ו / או העברה מאמצת של תאים המסומנים בצבע פלואורסצנטי במהלך מיקרוסקופיה תוך חיונית של שני פוטונים מאפשר מחקר דינמי של תאים בודדים בסביבתם הפיזיולוגית. הקבוצה שלנו פיתחה טכניקה לייצוב ריאות עכברים, שאפשרה לנו לדמיין דינמיקה תאית בריאות נאיביות ושתלי ריאות מושתלים אורתוטופית. טכניקה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התנהגות התא בתוך כלי הדם ובאינטרסטיציום, כמו גם לבחינת אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים שונות. הליך זה ניתן ללמוד בקלות ולהתאים לחקר מנגנונים חיסוניים המווסתים תגובות דלקתיות וסובלרוגניות לאחר השתלת ריאות. זה יכול גם להיות מורחב לחקר של תנאים ריאתיים פתוגניים אחרים.

מבוא

השתלת ריאות היא האפשרות האחרונה עבור חולים רבים הסובלים ממחלת ריאות סופנית; עם זאת, הישרדות לטווח ארוך לאחר השתלת ריאות היא גרועה בהשוואה להשתלות איברים מוצקים אחרות. הישרדות בגיל 5 שנים היא רק ~ 60%-70%1, לעומת 80%-90% בלב2 ו 85%-90% בכליות3. סיבוכים רבים לאחר השתלת ריאות, כגון תפקוד לקוי ראשוני של השתל, דחייה בתיווך נוגדנים ותפקוד לקוי כרוני של אלוגרפט ריאה, נובעים מהתגובה החיסונית של המאכסן לאלוגרפט. לדוגמה, הקבוצה שלנו הראתה כי נויטרופילים מגויסים במהירות לתוך אלוגרפט הריאה בעקבות פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כתוצאה מהשתלה ויוצרים אשכולות דינמיים סביב מונוציטיםבדם 4. יחסי גומלין בין תאי התורם והמקבל אחראים לתגובות אלואימוניות מזיקות 5,6,7, והיכולת לחקור אינטראקציות תאים דינמיות אלה במודל של בעלי חיים חיים לא תסולא בפז.

מיקרוסקופ שני פוטונים מאפשר הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם הלבנה מינימלית של רקמות 8,9. הוא משמש במגוון רקמות ואתרים אנטומיים, כולל ניאוקורטקס10,11, עור12,13 וכליה14,15. לאחרונה, הוא הותאם לאיברים לא סטטיים כגון הריאה והלב 4,16,17. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקה לצילום השתלות ריאה מיוצבות, מונשמות ומחוררות לאחר השתלת ריאה אורתוטופית מורין שמאלית. יתרון מרכזי של מודל ההשתלה הוא היכולת לבצע מניפולציה גנטית בין התורם למקבל בנפרד. ניתן לדמיין אוכלוסיות תאים בודדות עם זני עכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי, העברה מאמצת של תאים המסומנים בפלואורסצנטיות5, או הזרקה תוך ורידית של נוגדנים המסומנים בפלואורסצנטיות כדי לקשור סמנים ספציפיים לתא 4,16,17,18.

על מנת לייצב את הריאה במהלך ההדמיה, פרוטוקול זה כולל הדבקת הריאה לזכוכית כיסוי, בעוד שקבוצות אחרות תיארו ייצוב יניקה באמצעות מכשיר ואקום הפיך בהתאמה אישית19. לפרוטוקול שלנו מספר יתרונות, כולל שטח הדמיה גדול יותר וקלות התקנה יחסית באמצעות חומרים זמינים בדרך כלל במעבדת מיקרוסקופיה (כולל זכוכית כיסוי ודבק). מכיוון שטכניקת הדבקה זו מגבילה את הריאה במשטח העליון, היא צפויה להפחית את תנועת האוורור ולאפשר הדמיה עמוקה יותר. טכניקת הדמיה תוך-חיונית זו מאפשרת תצפית מפורטת על התנהגות תאי מערכת החיסון ואינטראקציות בזמן אמת, מה שתורם לחקר מנגנוני החיסון המווסתים תגובות דלקתיות לעומת סובלרוגניות לאחר השתלת ריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.

1. הרדמה ואינטובציה

הערה: מבוצעת השתלת ריאה שמאלית אורתוטופית של עכבר, כפי שתואר קודם לכן20,21. ריאות מעכברי C57BL/6 (B6) במשקל 20-25 גרם מושתלות במקבלי B6 תואמי מין וגיל. ב6. עכברי כתב LysM-GFP משמשים כמושתלים לניסויים נבחרים כדי לדמיין חדירת נויטרופילים לתוך שתלי ריאה. ניתן לצלם עכברים מושתלים מיד לאחר השתלת ריאה.

  1. מרדימים מחדש עכברים עם מתן intraperitoneal של קטמין (80-100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (8-10 מ"ג / ק"ג). מתן בופרנורפין בשחרור מושהה (0.5-1.0 מ"ג/ק"ג) תת עורית לשליטה נוספת בכאב. ודא עומק הרדמה מספיק עם צביטת כפה.
    הערה: אם הזמן בין השתלת ריאות לבין הדמיה תוך חיונית מתוכננת הוא פחות משעתיים, ניתן לקחת מינון חוזר של חומר הרדמה עם 50% מהמינון הראשוני של קטמין.
  2. הסר את השיער מכל החזה השמאלי באמצעות קוצץ חשמלי ונגב את החזה כדי להסיר את השערות הקצוצות העודפות.
  3. החל משחה אופתלמית לא תרופתית על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות הקרנית.
  4. בצע אינטובציה מחדש של העכבר עם אנגיוקטטר 20 גרם, כפי שתואר קודם לכן21.
  5. יש לאוורר עם אוויר בחדר בקצב של 120 נשימות לדקה ונפח גאות ושפל של 0.5 סמ"ק.
  6. לספק 1% isofluorane endotracheally במהלך כל ההליך.
  7. כדי להמחיש כלי דם במהלך ההדמיה, יש להזריק 20 μL של 655 ננומטר נקודות קוונטיות לא ממוקדות (q-dots) ב-50 μL של מלח חוצץ פוספט תוך ורידי לפחות 5 דקות לפני ההדמיה.

2. הכנה כירורגית של ריאה שמאלית להדמיה

  1. הניחו את העכבר בתנוחת דקוביטוס צידית ימנית (ראו איור 1A).
  2. יש לחטא את עור החזה בתערובת של 0.75% יוד ו-70% אתנול, שלוש פעמים.
  3. פתחו מחדש את בית החזה השמאלי (מהשתלת ריאות בעכבר) דרך החלל הבין-קוסטלי השלישי (ראו איור 1A).
  4. הסירו חלק מהעור ומהרקמה הרכה מעל אתר בית החזה השמאלי, בגודל 1.5X1.5 ס"מ (ראו איור 1B).
  5. לפני כריתת הצלעות, תחילה הדקו את הצלעות במשך ~10 שניות כדי לפקפק כל כלי דם כדי להשיג המוסטזיס (ראו איור 1C, D).
  6. חתכו חלקים של הצלעותה-3 עדה-5 כדי ליצור חלון הדמיה גדול מספיק כדי לחלץ את הריאה (~0.8 ס"מ גולגולתית ו~1.0 ס"מ קדמית, איור 1D, E).
  7. עצור כל דימום נוסף משולי הצלעות עם electrocautery.
    הערה: זה קריטי כדי להשיג hemostasis בקצה לחתוך של הצלעות כדי למנוע איבוד דם מוגזם במהלך תקופת ההדמיה.
  8. הניחו בליטה קטנה (גזה בגודל 4X4 ס"מ מקופלת לאורכה 3 פעמים) מתחת לחזה הימני (ראו איור 1E).
  9. בעזרת מקלוני צמר גפן, הרימו את שתל הריאה אל מחוץ לחזה והניחו את החלק התחתון של הריאה על רצועה בגודל 1X3 ס"מ של גזה ספוגה במי מלח (ראו איור 1F).
    הערה: רצועה זו של גזה ספוגה במי מלח מונעת החלקה של הריאה, שומרת על סביבה לחה עבור הריאה, מגנה על הריאה מפני הקצוות החדים של הצלעות המנותחות, ומפרידה את הריאה מתנועת הלב. לאחר יישום תא הדימות ההיקפי על הריאה (איור 1G, H, המתואר בסעיף 3), אמור להיות אובדן מינימלי של חום ונוזלים מחלל בית החזה הפתוח במהלך תקופת ההדמיה.

3. הכנת תא הדמיה

הערה: תא הדמיה בנוי בהתאמה אישית (ראה איור 2A). תא הדמיה זה מורכב מלוח בסיס ולוח עליון שביניהם העכבר ממוקם ומאובטח במקומו באמצעות ברגים טעונים קפיץ משני הצדדים (איור 2B). הלוח העליון מכיל מגרעת עגולה בקוטר ~ 2 ס"מ. טבעת O שחורה בגודל מתאים ממוקמת בפתח הזה בצד הקדמי של הלוח העליון, אשר תגן על עדשת המטרה (איור 2C). זכוכית כיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ מודבקת לחלק האחורי של הצלחת העליונה באמצעות שומן ואקום גבוה, אשר ייצור אטם אטום למים. זכוכית כיסוי זו תשמש כחלון הדמיה על ידי היצמדות לריאה שמתחתיה והחזקת אמצעי ההדמיה (כלומר, מים) מעל. ודא שלא נכנס שומן ואקום לחלון ההדמיה המעגלי. זכוכית הכיסוי תוחלף בכל ניסוי הדמיה חדש. לוח הבסיס מחומם לטמפרטורה של 35-37 מעלות צלזיוס באמצעות בדיקת טמפרטורה תרמית (איור 2A).

  1. הניחו את העכבר עם האינטובציה על לוח הבסיס של תא ההדמיה כשהחזה השמאלי הפתוח פונה כלפי מעלה (ראו איור 1G, H). הדקו את העכבר בעזרת סרט משי על הפנים, הכפות הקדמיות והזנב (ראו איור 1H ואיור 2A).
  2. מרחו דבק על הצד התחתון של זכוכית הכיסוי המחוברת ללוח העליון (עיגול אפור באיור 2C, למטה), והשאירו עיגול ללא דבק של 0.8-1.0 ס"מ במרכז.
    הערה: יש פשרה בין גודל העיגול נטול הדבק לבין כמות חפץ התנועה; לכן, מומלץ כי המעגל לא יעלה על 1.0 ס"מ קוטר.
  3. הנמיכו את הפלטה העליונה עד שזכוכית הכיסוי תיצור מגע עם הריאה, כשהדבק נוגע בפני השטח של הריאה (ראו איור 1G).
    הערה: הריאה השמאלית תודבק לזכוכית הכיסוי עם עיגול נקי ללא דבק באמצע, שהוא האזור שיצולם.
  4. החזיקו את זכוכית הכיסוי כנגד הריאה וניפחו את הריאה למשך 1-2 שניות כך שאזור הדבק יידבק לרקמה שמסביב. השג ניפוח ריאות על ידי חסימת צינורות הזרימה מהצינור האנדוטרכאלי של העכבר למכונת ההנשמה.
    הערה: אין לנפח את הריאה למשך יותר מ-1-2 שניות, מכיוון שהדבר עלול לגרום לברוטראומה מוגזמת.
  5. יש לסגת מעט מהצלחת העליונה כדי להפחית את הלחץ על רקמת הריאה. ודא שאזור הריאה בחלון ההדמיה אינו זז עם אוורור.
  6. אבטחו את שני הקצוות של הלוח העליון על-ידי אבטחת אום האגודל מעל כל בורג (ראו איור 2B).

4. הדמיה של שני פוטונים

הערה: יש להשתמש במיקרוסקופ זקוף בעל שלב קבוע עם יעד טבילה במים של 20x או 25x >1.0 (NA) עבור מיקרוסקופ תוך חיוני. להלן ההגדרה ששימשה במחקר זה עבור B6 עד B6. LysM-GFP השתלת ריאה שמאלית עם תיוג כלי דם q-dot 655-nm. בעת יישום פרוטוקול זה, ניתן להתאים את ההתקנה של המיקרוסקופ, הלייזרים והמסננים הדיכרואיים בהתבסס על הצרכים של הניסוי הספציפי והכתבים הפלואורסצנטיים שבהם נעשה שימוש.

  1. הניחו את כל תא ההדמיה עם העכבר המושתל שעבר אינטובציה (ריאה שמאלית B6 מושתלת ב-B6. LysM-GFP עם נקודות q-dot של 655 ננומטר) על במת המיקרוסקופ (ראו איור 2A).
  2. השתמשו במסננים דיכרואיים באורכי גל של 480 ננומטר, 560 ננומטר ו-635 ננומטר, אשר יפרידו כראוי את האותות ממדווח GFP, נקודות q, ואות הדור ההרמוני השני (SHG) (445 ננומטר) שנוצר על ידי קולגן. ניתן להתאים מסננים אלה בהתאם לניסוי הספציפי.
    הערה: אות SHG שנוצר על-ידי קולגן תוחם מבנים דמויי מכתש כהה, המייצגים מרחבי אוויר בנאדיות (ראו חיצים לבנים באיור 3).
  3. הגדר את הלייזר פמטו-שנייה עם פמפונת טיטניום-ספיר ל-890 ננומטר (בטווח האינפרא-אדום הקרוב) לעירור. השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית כדי להשיג אות מספיק.
    הערה: יש להתאים את הגדרות הלייזר לניסוי הספציפי כדי למקסם את הפרדת האותות.
  4. מרחו ~1 מ"ל מים כדי לכסות לחלוטין את זכוכית הכיסוי בצלחת העליונה, שתישמר במקומה על-ידי טבעת ה-O ואטם השומן בוואקום של זכוכית הכיסוי לצלחת העליונה (ראו איור 1G ואיור 2C).
  5. השתמש במטרה טבילה במים 20x >1.0 NA במיקרוסקופ. ודא שהעדשה האובייקטיבית מותאמת בהתאם לניסוי הספציפי.
    הערה: NA גדול יותר מאפשר איסוף אור רב יותר, ניגודיות גבוהה יותר ותמונות מפורטות יותר. מטרות טבילה במים עדיפות מכיוון שמים או חיץ מתאימים יותר לרקמות ביולוגיות.
  6. הנמיכו את מטרת המיקרוסקופ למים והתמקדו בפני השטח של הריאה.
  7. הפעל את מחמם צלחת הבסיס ולשמור על הטמפרטורה ב 35-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: אם יש חששות לגבי חוסר היכולת לשמור על טמפרטורת הרקמה או זילוח מספיק לריאה, ניתן לחבר שני נגדים נוספים כדי לחמם את הצלחת העליונה בנוסף לצלחת הבסיס (ראה איור משלים 1).
  8. רכוש ערימות תמונות עם תוכנת רכישה לפי בחירה.
    הערה: ודא שהחדר חשוך לחלוטין במהלך הרכישה, דבר שעשוי לכלול שימוש בווילונות האפלה / תריסים וכיסוי אסטרטגי של כל מקורות האור.

5. רכישת וידאו

הערה: ניתן להתאים את הפרמטרים הבאים בהתבסס על הניסוי הספציפי. שלבים 5.1-5.3 מתארים את הפרמטרים הספציפיים המשמשים עבור B6 עד B6. Lysm-GFP murine השתלת ריאה שמאלית, אשר יכול לשמש כמדריך התייחסות.

  1. באמצעות סורק דו-כיווני בקצב וידאו, הגדר את מידות סריקת x-y ל- 512 x 512 פיקסלים.
  2. באמצעות יחידת צעד xyz, השג הקלטות קיטועי זמן של מחסנית z בת 21 שלבים עם ממוצע של 10 פריימים לכל צעד. כל ערימה אורכת כ-20 שניות, הכוללת את הזמן הדרוש לממוצע פריימים, מנוע הצעד לזוז ולבדוק את מיקומו, והשהיה של 100 אלפיות השנייה.
    הערה: הסורק הדו-כיווני במיקרוסקופ ששימש במחקר זה פועל בקצב וידאו של 30 פריימים לשנייה. זה עשוי להשתנות בהתאם להגדרת המיקרוסקופ הספציפי.
  3. רכוש 80 ערימות z רצופות כדי לקבל הדמיה בהילוך מהיר של נדידת לויקוציטים בתוך פרנכימת הרקמה. זה לוקח בערך ~ 27 דקות ב 20 s / stack.
    הערה: יש למזער את גודל הערימה, ממוצע הפריימים, עוצמת הלייזר והאורך הכולל של הקלטת קיטועי הזמן כדי למנוע חשיפה מוגזמת של לייזר לרקמה. אם כתבים פלואורסצנטיים המשמשים הם בהירים (כלומר, GFP) ועוצמת הלייזר נמוכה, אז חזרה על מחסנית z של 21 שלבים עם ממוצע של 10 פריימים, סריקה של 512 x 512 פיקסלים, במרווחים של 20 שניות למשך ~ 27 דקות נסבלת היטב על ידי העכבר. אם יש צורך בפרקי זמן ארוכים יותר של הדמיה, יש להגדיל את זמן הרכישה לכל ערימה כדי לשמור על חשיפת הלייזר הכוללת זהה (כלומר, דקה אחת לכל ערימה מעל ~1.5 שעות). יהיה צורך למטב הגדרות אלה בהתבסס על כתבי הפלואורסצנט שבהם נעשה שימוש.
  4. הרדימו את העכבר בסוף רכישת התמונה. כדי להרדים את העכבר עם קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (8-10 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן נקע צוואר הרחם. תכשירי הדמיה טיפוסיים ישמרו בקלות על יכולת הקיום של העכבר למשך עד שעתיים.
    הערה: כדי להאריך תקופה זו, ייתכן שיהיה צורך בתוספת נוזלים נוספת, הרדמה עם איזופלורן ותשומת לב לוויסות הטמפרטורה.
  5. עיבוד וידאו מלא עם Imaris. ניתן להשתמש גם בתוכנות הדמיה אחרות (כגון ImageJ).
    הערה: ניתן לעבד תמונות לאחר הרכישה באמצעות שיפור ניגודיות, החלקה ואריתמטיקה של ערוצים כדי להסיר crosstalk של ערוצים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר שעה של אחסון איסכמי קר בטמפרטורה של 4°C, השתלנו אורתוטופית את הריאה השמאלית מעכבר B6 לתוך B6. עכבר LysM-GFP4, ולאחר מכן בוצעה הדמיה תוך חיונית של שני פוטונים, כמתואר לעיל. ביצענו הדמיה בשתי נקודות זמן לאחר ההשתלה – שעתיים (איור 3A) ו-24 שעות (איור 3B). כלי הדם מסומנים באדום על ידי נקודות ה-q המוזרקות מיד לפני ההדמיה. בנוסף, אנו יכולים לדמיין מונוציטים שתפסו q-dots ב 24 h4. ניתן לראות נויטרופילים שמקורם במושתל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עירור שני פוטונים תואר לראשונה בעבודת הדוקטורט שלה על ידי מריה גפרט-מאייר בשנת 1931, שזכתה מאוחר יותר בפרס נובל לפיזיקה על תיאור מבנה המעטפת הגרעינית22,23. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי מסתמך על עירור פוטון יחיד, עם אורכי גל עירור קצרים ובעלי אנרגיה גבוהה יותר מאורכי גל פליטה. בניגוד למיקרוסקופ של פוטון יחיד, מיקרוסקופיה של שני פוטונים כוללת עירור סימולטני על ידי שני פוטונים, כל אחד עם אורכי גל ארוכים יותר מזה של האות הפלואורסצנטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על גילויים רלוונטיים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ-NIH 1P01AI11650 ומהקרן לבית החולים היהודי בארנס. אנו מודים ל-In Vivo Imaging Core בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.75% פובידון-יודAplicareNDC 52380-0126-2לחיטוי
1 אינץ' 20G IV קטטרTerumoSROX2025CAלצינור אנדוטרכיאלי (ETT)
סרט משי 1 אינץ'Durapore3M ID 7100057168לאבטחת העכבר במצב
20x טבילה במים עדשת אובייקטיביות ארוכהאולימפוסN20X-PFH
3M דבקVetbondMedi-Vet.com10872להדבקת כיסוי זכוכית לריאה
655 ננומטר נקודות קוונטיות לא ממוקדותThermoFisherQ21021MPלתיוג כלי דם
70% אתנולסיגמא אולדריץ'EX0281לחיטוי
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
טבעת O שחורה (2 ס"מ)חנות לחומרי בנייןN/Aלהדמיה בהתאמה אישית
תא בורג (2)חנות לחומרי בנייןN / Aעבור תא הדמיה בהתאמה אישית
אגוז אגודל פליז (2)חנות לחומרי בנייןN / Aעבור תא הדמיה בהתאמה אישית
בופרנורפין 1.3 מ"ג/מ"לפידליס בריאות בעלי חייםNDC 86084-100-30לשליטה בכאב
זיקית טיטניום-ספיר פמטו-שנייה פועם לייזרקוהרנטיN/A
כיסוי זכוכית (24 מ"מ x 50 מ"מ)Thomas Scientific1202F63לתא הדמיה שנבנה בהתאמה אישית
מהדק יתושים מעוקל (1)Fine ScienceTools 13009-12
בקר חימום דו-ערוציWarner InstrumentsTC-344B
מספריים עדינים (1)Fine Science Tools15040-11
מיקרוסקופ זקוף שלב קבועOlympusBX51WI
גזה (חתוכה ל-1 ס"מ על 3 ס"מ)McKesson476709להניח מתחת לריאה השמאלית
גריז ואקום גבוהDow CorningN/Aכדי להדביק זכוכית כיסוי על הצלחת העליונה
איזופלורן 1%סיגמא אולדריץ'26675-46-7להרדמה
קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"לVedcoNDC 50989-996-06להרדמה
יריעת מתכת (3 ס"מ על 7 ס"מ)חנות לחומרי בנייןN/Aלתא הדמיה שנבנה בהתאמה אישית
אפליקטורים מחודדים עם קצה כותנהSolon56225למניפולציה של ריאות ולדיסקציה קהה
Power Pro Ultra ClipperOster078400-020-001
Puralube Veter משחת עינייםMedi-Vet.com11897למניעת ייבוש עיניים
מאוורר לבעלי חיים קטניםהרווארד מכשיר55-0000
מלקחיים ישרים (1)Fine Science Tools91113-10
דרייבר תריס תלת ערוציUniblitzVMM-D3סורק תהודה
xyz מנוע צעד אופטיPre ScientificOptiScan II
Xylazine 20 מ"ג/מ"לAkornNDC 59399-110-20לשליטה בכאב

מקורות

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282(2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119(2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36(2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636(2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), e718 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120(2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700(2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), e111 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דימות תוך-חי (Intravital Imaging)השתלת ריאההשתלת ריאת עכברתנועה של תאי חיסוןהשתלת ריאה אורתוטופיתחדירת נויטרופיליםתאי T רגולטורייםחלון דימותהשתלת ריאה אלוגנאית
מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.