מאמר שיטה

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66566

⸱

19 באפריל 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

תקציר

סיבוכים לאחר השתלת ריאות קשורים במידה רבה למערכת החיסון המארחת המגיבה לשתל. תגובות חיסוניות כאלה מווסתות על ידי הצלבה בין תאי התורם והמקבל. הבנה טובה יותר של תהליכים אלה מסתמכת על שימוש במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ונעזרת ביכולת לחקור סחר בתאי מערכת החיסון בזמן אמת. ניתן להשתמש במיקרוסקופ תוך-ויטלי של שני פוטונים כדי לצלם רקמות ואיברים לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם נזק מינימלי לאור, מה שמקנה יתרון גדול על פני מיקרוסקופ קונפוקלי של פוטון יחיד. שימוש סלקטיבי בעכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ספציפי למקדם ו / או העברה מאמצת של תאים המסומנים בצבע פלואורסצנטי במהלך מיקרוסקופיה תוך חיונית של שני פוטונים מאפשר מחקר דינמי של תאים בודדים בסביבתם הפיזיולוגית. הקבוצה שלנו פיתחה טכניקה לייצוב ריאות עכברים, שאפשרה לנו לדמיין דינמיקה תאית בריאות נאיביות ושתלי ריאות מושתלים אורתוטופית. טכניקה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התנהגות התא בתוך כלי הדם ובאינטרסטיציום, כמו גם לבחינת אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים שונות. הליך זה ניתן ללמוד בקלות ולהתאים לחקר מנגנונים חיסוניים המווסתים תגובות דלקתיות וסובלרוגניות לאחר השתלת ריאות. זה יכול גם להיות מורחב לחקר של תנאים ריאתיים פתוגניים אחרים.

מבוא

השתלת ריאות היא האפשרות האחרונה עבור חולים רבים הסובלים ממחלת ריאות סופנית; עם זאת, הישרדות לטווח ארוך לאחר השתלת ריאות היא גרועה בהשוואה להשתלות איברים מוצקים אחרות. הישרדות בגיל 5 שנים היא רק ~ 60%-70%1, לעומת 80%-90% בלב2 ו 85%-90% בכליות3. סיבוכים רבים לאחר השתלת ריאות, כגון תפקוד לקוי ראשוני של השתל, דחייה בתיווך נוגדנים ותפקוד לקוי כרוני של אלוגרפט ריאה, נובעים מהתגובה החיסונית של המאכסן לאלוגרפט. לדוגמה, הקבוצה שלנו הראתה כי נויטרופילים מגויסים במהירות לתוך אלוגרפט הריאה בעקבות פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כתוצאה מהשתלה ויוצרים אשכולות דינמיים סביב מונוציטיםבדם 4. יחסי גומלין בין תאי התורם והמקבל אחראים לתגובות אלואימוניות מזיקות 5,6,7, והיכולת לחקור אינטראקציות תאים דינמיות אלה במודל של בעלי חיים חיים לא תסולא בפז.

מיקרוסקופ שני פוטונים מאפשר הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם הלבנה מינימלית של רקמות 8,9. הוא משמש במגוון רקמות ואתרים אנטומיים, כולל ניאוקורטקס10,11, עור12,13 וכליה14,15. לאחרונה, הוא הותאם לאיברים לא סטטיים כגון הריאה והלב 4,16,17. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקה לצילום השתלות ריאה מיוצבות, מונשמות ומחוררות לאחר השתלת ריאה אורתוטופית מורין שמאלית. יתרון מרכזי של מודל ההשתלה הוא היכולת לבצע מניפולציה גנטית בין התורם למקבל בנפרד. ניתן לדמיין אוכלוסיות תאים בודדות עם זני עכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי, העברה מאמצת של תאים המסומנים בפלואורסצנטיות5, או הזרקה תוך ורידית של נוגדנים המסומנים בפלואורסצנטיות כדי לקשור סמנים ספציפיים לתא 4,16,17,18.

על מנת לייצב את הריאה במהלך ההדמיה, פרוטוקול זה כולל הדבקת הריאה לזכוכית כיסוי, בעוד שקבוצות אחרות תיארו ייצוב יניקה באמצעות מכשיר ואקום הפיך בהתאמה אישית19. לפרוטוקול שלנו מספר יתרונות, כולל שטח הדמיה גדול יותר וקלות התקנה יחסית באמצעות חומרים זמינים בדרך כלל במעבדת מיקרוסקופיה (כולל זכוכית כיסוי ודבק). מכיוון שטכניקת הדבקה זו מגבילה את הריאה במשטח העליון, היא צפויה להפחית את תנועת האוורור ולאפשר הדמיה עמוקה יותר. טכניקת הדמיה תוך-חיונית זו מאפשרת תצפית מפורטת על התנהגות תאי מערכת החיסון ואינטראקציות בזמן אמת, מה שתורם לחקר מנגנוני החיסון המווסתים תגובות דלקתיות לעומת סובלרוגניות לאחר השתלת ריאות.

פרוטוקול

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.

1. הרדמה ואינטובציה

הערה: מבוצעת השתלת ריאה שמאלית אורתוטופית של עכבר, כפי שתואר קודם לכן20,21. ריאות מעכברי C57BL/6 (B6) במשקל 20-25 גרם מושתלות במקבלי B6 תואמי מין וגיל. ב6. עכברי כתב LysM-GFP משמשים כמושתלים לניסויים נבחרים כדי לדמיין חדירת נויטרופילים לתוך שתלי ריאה. ניתן לצלם עכברים מושתלים מיד לאחר השתלת ריאה.

  1. מרדימים מחדש עכברים עם מתן intraperitoneal של קטמין (80-100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (8-10 מ"ג / ק"ג). מתן בופרנורפין בשחרור מושהה (0.5-1.0 מ"ג/ק"ג) תת עורית לשליטה נוספת בכאב. ודא עומק הרדמה מספיק עם צביטת כפה.
    הערה: אם הזמן בין השתלת ריאות לבין הדמיה תוך חיונית מתוכננת הוא פחות משעתיים, ניתן לקחת מינון חוזר של חומר הרדמה עם 50% מהמינון הראשוני של קטמין.
  2. הסר את השיער מכל החזה השמאלי באמצעות קוצץ חשמלי ונגב את החזה כדי להסיר את השערות הקצוצות העודפות.
  3. החל משחה אופתלמית לא תרופתית על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות הקרנית.
  4. בצע אינטובציה מחדש של העכבר עם אנגיוקטטר 20 גרם, כפי שתואר קודם לכן21.
  5. יש לאוורר עם אוויר בחדר בקצב של 120 נשימות לדקה ונפח גאות ושפל של 0.5 סמ"ק.
  6. לספק 1% isofluorane endotracheally במהלך כל ההליך.
  7. כדי להמחיש כלי דם במהלך ההדמיה, יש להזריק 20 μL של 655 ננומטר נקודות קוונטיות לא ממוקדות (q-dots) ב-50 μL של מלח חוצץ פוספט תוך ורידי לפחות 5 דקות לפני ההדמיה.

2. הכנה כירורגית של ריאה שמאלית להדמיה

  1. הניחו את העכבר בתנוחת דקוביטוס צידית ימנית (ראו איור 1A).
  2. יש לחטא את עור החזה בתערובת של 0.75% יוד ו-70% אתנול, שלוש פעמים.
  3. פתחו מחדש את בית החזה השמאלי (מהשתלת ריאות בעכבר) דרך החלל הבין-קוסטלי השלישי (ראו איור 1A).
  4. הסירו חלק מהעור ומהרקמה הרכה מעל אתר בית החזה השמאלי, בגודל 1.5X1.5 ס"מ (ראו איור 1B).
  5. לפני כריתת הצלעות, תחילה הדקו את הצלעות במשך ~10 שניות כדי לפקפק כל כלי דם כדי להשיג המוסטזיס (ראו איור 1C, D).
  6. חתכו חלקים של הצלעותה-3 עדה-5 כדי ליצור חלון הדמיה גדול מספיק כדי לחלץ את הריאה (~0.8 ס"מ גולגולתית ו~1.0 ס"מ קדמית, איור 1D, E).
  7. עצור כל דימום נוסף משולי הצלעות עם electrocautery.
    הערה: זה קריטי כדי להשיג hemostasis בקצה לחתוך של הצלעות כדי למנוע איבוד דם מוגזם במהלך תקופת ההדמיה.
  8. הניחו בליטה קטנה (גזה בגודל 4X4 ס"מ מקופלת לאורכה 3 פעמים) מתחת לחזה הימני (ראו איור 1E).
  9. בעזרת מקלוני צמר גפן, הרימו את שתל הריאה אל מחוץ לחזה והניחו את החלק התחתון של הריאה על רצועה בגודל 1X3 ס"מ של גזה ספוגה במי מלח (ראו איור 1F).
    הערה: רצועה זו של גזה ספוגה במי מלח מונעת החלקה של הריאה, שומרת על סביבה לחה עבור הריאה, מגנה על הריאה מפני הקצוות החדים של הצלעות המנותחות, ומפרידה את הריאה מתנועת הלב. לאחר יישום תא הדימות ההיקפי על הריאה (איור 1G, H, המתואר בסעיף 3), אמור להיות אובדן מינימלי של חום ונוזלים מחלל בית החזה הפתוח במהלך תקופת ההדמיה.

3. הכנת תא הדמיה

הערה: תא הדמיה בנוי בהתאמה אישית (ראה איור 2A). תא הדמיה זה מורכב מלוח בסיס ולוח עליון שביניהם העכבר ממוקם ומאובטח במקומו באמצעות ברגים טעונים קפיץ משני הצדדים (איור 2B). הלוח העליון מכיל מגרעת עגולה בקוטר ~ 2 ס"מ. טבעת O שחורה בגודל מתאים ממוקמת בפתח הזה בצד הקדמי של הלוח העליון, אשר תגן על עדשת המטרה (איור 2C). זכוכית כיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ מודבקת לחלק האחורי של הצלחת העליונה באמצעות שומן ואקום גבוה, אשר ייצור אטם אטום למים. זכוכית כיסוי זו תשמש כחלון הדמיה על ידי היצמדות לריאה שמתחתיה והחזקת אמצעי ההדמיה (כלומר, מים) מעל. ודא שלא נכנס שומן ואקום לחלון ההדמיה המעגלי. זכוכית הכיסוי תוחלף בכל ניסוי הדמיה חדש. לוח הבסיס מחומם לטמפרטורה של 35-37 מעלות צלזיוס באמצעות בדיקת טמפרטורה תרמית (איור 2A).

  1. הניחו את העכבר עם האינטובציה על לוח הבסיס של תא ההדמיה כשהחזה השמאלי הפתוח פונה כלפי מעלה (ראו איור 1G, H). הדקו את העכבר בעזרת סרט משי על הפנים, הכפות הקדמיות והזנב (ראו איור 1H ואיור 2A).
  2. מרחו דבק על הצד התחתון של זכוכית הכיסוי המחוברת ללוח העליון (עיגול אפור באיור 2C, למטה), והשאירו עיגול ללא דבק של 0.8-1.0 ס"מ במרכז.
    הערה: יש פשרה בין גודל העיגול נטול הדבק לבין כמות חפץ התנועה; לכן, מומלץ כי המעגל לא יעלה על 1.0 ס"מ קוטר.
  3. הנמיכו את הפלטה העליונה עד שזכוכית הכיסוי תיצור מגע עם הריאה, כשהדבק נוגע בפני השטח של הריאה (ראו איור 1G).
    הערה: הריאה השמאלית תודבק לזכוכית הכיסוי עם עיגול נקי ללא דבק באמצע, שהוא האזור שיצולם.
  4. החזיקו את זכוכית הכיסוי כנגד הריאה וניפחו את הריאה למשך 1-2 שניות כך שאזור הדבק יידבק לרקמה שמסביב. השג ניפוח ריאות על ידי חסימת צינורות הזרימה מהצינור האנדוטרכאלי של העכבר למכונת ההנשמה.
    הערה: אין לנפח את הריאה למשך יותר מ-1-2 שניות, מכיוון שהדבר עלול לגרום לברוטראומה מוגזמת.
  5. יש לסגת מעט מהצלחת העליונה כדי להפחית את הלחץ על רקמת הריאה. ודא שאזור הריאה בחלון ההדמיה אינו זז עם אוורור.
  6. אבטחו את שני הקצוות של הלוח העליון על-ידי אבטחת אום האגודל מעל כל בורג (ראו איור 2B).

4. הדמיה של שני פוטונים

הערה: יש להשתמש במיקרוסקופ זקוף בעל שלב קבוע עם יעד טבילה במים של 20x או 25x >1.0 (NA) עבור מיקרוסקופ תוך חיוני. להלן ההגדרה ששימשה במחקר זה עבור B6 עד B6. LysM-GFP השתלת ריאה שמאלית עם תיוג כלי דם q-dot 655-nm. בעת יישום פרוטוקול זה, ניתן להתאים את ההתקנה של המיקרוסקופ, הלייזרים והמסננים הדיכרואיים בהתבסס על הצרכים של הניסוי הספציפי והכתבים הפלואורסצנטיים שבהם נעשה שימוש.

  1. הניחו את כל תא ההדמיה עם העכבר המושתל שעבר אינטובציה (ריאה שמאלית B6 מושתלת ב-B6. LysM-GFP עם נקודות q-dot של 655 ננומטר) על במת המיקרוסקופ (ראו איור 2A).
  2. השתמשו במסננים דיכרואיים באורכי גל של 480 ננומטר, 560 ננומטר ו-635 ננומטר, אשר יפרידו כראוי את האותות ממדווח GFP, נקודות q, ואות הדור ההרמוני השני (SHG) (445 ננומטר) שנוצר על ידי קולגן. ניתן להתאים מסננים אלה בהתאם לניסוי הספציפי.
    הערה: אות SHG שנוצר על-ידי קולגן תוחם מבנים דמויי מכתש כהה, המייצגים מרחבי אוויר בנאדיות (ראו חיצים לבנים באיור 3).
  3. הגדר את הלייזר פמטו-שנייה עם פמפונת טיטניום-ספיר ל-890 ננומטר (בטווח האינפרא-אדום הקרוב) לעירור. השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית כדי להשיג אות מספיק.
    הערה: יש להתאים את הגדרות הלייזר לניסוי הספציפי כדי למקסם את הפרדת האותות.
  4. מרחו ~1 מ"ל מים כדי לכסות לחלוטין את זכוכית הכיסוי בצלחת העליונה, שתישמר במקומה על-ידי טבעת ה-O ואטם השומן בוואקום של זכוכית הכיסוי לצלחת העליונה (ראו איור 1G ואיור 2C).
  5. השתמש במטרה טבילה במים 20x >1.0 NA במיקרוסקופ. ודא שהעדשה האובייקטיבית מותאמת בהתאם לניסוי הספציפי.
    הערה: NA גדול יותר מאפשר איסוף אור רב יותר, ניגודיות גבוהה יותר ותמונות מפורטות יותר. מטרות טבילה במים עדיפות מכיוון שמים או חיץ מתאימים יותר לרקמות ביולוגיות.
  6. הנמיכו את מטרת המיקרוסקופ למים והתמקדו בפני השטח של הריאה.
  7. הפעל את מחמם צלחת הבסיס ולשמור על הטמפרטורה ב 35-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: אם יש חששות לגבי חוסר היכולת לשמור על טמפרטורת הרקמה או זילוח מספיק לריאה, ניתן לחבר שני נגדים נוספים כדי לחמם את הצלחת העליונה בנוסף לצלחת הבסיס (ראה איור משלים 1).
  8. רכוש ערימות תמונות עם תוכנת רכישה לפי בחירה.
    הערה: ודא שהחדר חשוך לחלוטין במהלך הרכישה, דבר שעשוי לכלול שימוש בווילונות האפלה / תריסים וכיסוי אסטרטגי של כל מקורות האור.

5. רכישת וידאו

הערה: ניתן להתאים את הפרמטרים הבאים בהתבסס על הניסוי הספציפי. שלבים 5.1-5.3 מתארים את הפרמטרים הספציפיים המשמשים עבור B6 עד B6. Lysm-GFP murine השתלת ריאה שמאלית, אשר יכול לשמש כמדריך התייחסות.

  1. באמצעות סורק דו-כיווני בקצב וידאו, הגדר את מידות סריקת x-y ל- 512 x 512 פיקסלים.
  2. באמצעות יחידת צעד xyz, השג הקלטות קיטועי זמן של מחסנית z בת 21 שלבים עם ממוצע של 10 פריימים לכל צעד. כל ערימה אורכת כ-20 שניות, הכוללת את הזמן הדרוש לממוצע פריימים, מנוע הצעד לזוז ולבדוק את מיקומו, והשהיה של 100 אלפיות השנייה.
    הערה: הסורק הדו-כיווני במיקרוסקופ ששימש במחקר זה פועל בקצב וידאו של 30 פריימים לשנייה. זה עשוי להשתנות בהתאם להגדרת המיקרוסקופ הספציפי.
  3. רכוש 80 ערימות z רצופות כדי לקבל הדמיה בהילוך מהיר של נדידת לויקוציטים בתוך פרנכימת הרקמה. זה לוקח בערך ~ 27 דקות ב 20 s / stack.
    הערה: יש למזער את גודל הערימה, ממוצע הפריימים, עוצמת הלייזר והאורך הכולל של הקלטת קיטועי הזמן כדי למנוע חשיפה מוגזמת של לייזר לרקמה. אם כתבים פלואורסצנטיים המשמשים הם בהירים (כלומר, GFP) ועוצמת הלייזר נמוכה, אז חזרה על מחסנית z של 21 שלבים עם ממוצע של 10 פריימים, סריקה של 512 x 512 פיקסלים, במרווחים של 20 שניות למשך ~ 27 דקות נסבלת היטב על ידי העכבר. אם יש צורך בפרקי זמן ארוכים יותר של הדמיה, יש להגדיל את זמן הרכישה לכל ערימה כדי לשמור על חשיפת הלייזר הכוללת זהה (כלומר, דקה אחת לכל ערימה מעל ~1.5 שעות). יהיה צורך למטב הגדרות אלה בהתבסס על כתבי הפלואורסצנט שבהם נעשה שימוש.
  4. הרדימו את העכבר בסוף רכישת התמונה. כדי להרדים את העכבר עם קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (8-10 מ"ג/ק"ג), ולאחר מכן נקע צוואר הרחם. תכשירי הדמיה טיפוסיים ישמרו בקלות על יכולת הקיום של העכבר למשך עד שעתיים.
    הערה: כדי להאריך תקופה זו, ייתכן שיהיה צורך בתוספת נוזלים נוספת, הרדמה עם איזופלורן ותשומת לב לוויסות הטמפרטורה.
  5. עיבוד וידאו מלא עם Imaris. ניתן להשתמש גם בתוכנות הדמיה אחרות (כגון ImageJ).
    הערה: ניתן לעבד תמונות לאחר הרכישה באמצעות שיפור ניגודיות, החלקה ואריתמטיקה של ערוצים כדי להסיר crosstalk של ערוצים.

תוצאות

לאחר שעה של אחסון איסכמי קר בטמפרטורה של 4°C, השתלנו אורתוטופית את הריאה השמאלית מעכבר B6 לתוך B6. עכבר LysM-GFP4, ולאחר מכן בוצעה הדמיה תוך חיונית של שני פוטונים, כמתואר לעיל. ביצענו הדמיה בשתי נקודות זמן לאחר ההשתלה – שעתיים (איור 3A) ו-24 שעות (איור 3B). כלי הדם מסומנים באדום על ידי נקודות ה-q המוזרקות מיד לפני ההדמיה. בנוסף, אנו יכולים לדמיין מונוציטים שתפסו q-dots ב 24 h4. ניתן לראות נויטרופילים שמקורם במושתל המסומן בירוק חודרים לשתל הריאה בסרטון המתאים 24 שעות לאחר ההשתלה (סרטון משלים 1). ניתן לדמיין נאדיות כמכתשים כהים כתוצאה מ-SHG מקולגן (חיצים לבנים באיור 3). אנו רואים ש-24 שעות לאחר ההשתלה יש יותר נויטרופילים בריאה בהשוואה לשעתיים לאחר ההשתלה (איור 3).

figure-results-1
איור 1: הכנת עכבר לדימות של שני פוטונים. (A) העור נפתח מחדש מעל בית החזה השמאלי. (B) עור ורקמות רכות שנכרתו מעל החזה השמאלי. (ג,ד) הצלעות הידקו במשך 10 שניות לפני החלוקה. (E)צלעות שמאליות 3-5 שנכרתו ליצירת חלון בגודל ~0.8 ס"מ גולגולתי x 1.0 ס"מ קדמי. (F) ריאה שמאלית מוגבהת מתוך החזה השמאלי ומונחת על רצועת גזה. (G) תא הדמיה עם חלון הדמיה מכסה את הריאה השמאלית. (ח) תא ההדמיה הונח על במת המיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הגדרת תא ההדמיה. (A) תא הדימות שהונח על במת המיקרוסקופ. (B) תצוגה מוגדלת של מנגנון בורג טעון קפיץ כדי לאבטח את הפלטה העליונה מעל הריאה השמאלית. (C) החלק הקדמי והאחורי של הלוח העליון עם טבעת O וזכוכית כיסוי. קווים לבנים מייצגים את האזור שבו מורחים שומן ואקום כדי להדביק זכוכית כיסוי לצלחת העליונה. העיגול האפור מייצג טבעת דבק שיש למרוח על זכוכית הכיסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים של השתלת ריאה שמאלית של עכבר מ-B6 ל-B6. עכבר LysM-GFP עם אחסון איסכמי קר של שעה אחת. ההדמיה מתבצעת ב-(A) 2 שעות ו-(B) 24 שעות לאחר ההשתלה. אדום מייצג נקודות q. ירוק מייצג נויטרופילים מ-B6. מושתל LysM-GFP. כחול מייצג SHG מנאדיות עשירות בקולגן. חיצים לבנים מראים מרחבי אוויר בנאדיות. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: פלטה עליונה עם שני נגדים מחוברים כדי לספק חימום נוסף. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרטון משלים 1: הדמיית קיטוע זמן של שני פוטונים של ריאה שמאלית של עכבר מושתל מ-B6 ל-B6. עכבר LysM-GFP עם 1 שעות של אחסון איסכמי קר, מבוצע ב 24 שעות לאחר ההשתלה. אדום מייצג נקודות q. ירוק מייצג נויטרופילים ממושתל LysM-GFP. כחול מייצג את הדור ההרמוני השני מנאדיות עשירות בקולגן. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

עירור שני פוטונים תואר לראשונה בעבודת הדוקטורט שלה על ידי מריה גפרט-מאייר בשנת 1931, שזכתה מאוחר יותר בפרס נובל לפיזיקה על תיאור מבנה המעטפת הגרעינית22,23. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי מסתמך על עירור פוטון יחיד, עם אורכי גל עירור קצרים ובעלי אנרגיה גבוהה יותר מאורכי גל פליטה. בניגוד למיקרוסקופ של פוטון יחיד, מיקרוסקופיה של שני פוטונים כוללת עירור סימולטני על ידי שני פוטונים, כל אחד עם אורכי גל ארוכים יותר מזה של האות הפלואורסצנטי הנפלט 24,25,26. מכיוון ששני פוטונים בודדים צריכים לבצע לוקליזציה משותפת כדי לעורר נקודת מוקד אחת ברקמה, עירור של שני פוטונים הוא מרחבית לנפח מדגם קטן, המאפשר חתך אופטי 24,25,26 ויש פחות פוטו-הלבנה מעל ומתחת למישור המכיל את נקודת המוקד27. ההסתברות לעירור סימולטני על ידי שני פוטונים נמוכה מאוד, ולכן יש צורך בלייזר פועם פמטו-שנייה כדי להשיג את עוצמת העירור הנדרשת לאות פליטה פלואורסצנטי 25,26,27. לייזר העירור הוא בתחום האינפרא אדום הקרוב (700-1100 ננומטר), יתרון שלו הוא פחות פיזור, המאפשר לאור לחדור עמוק יותר לתוך הרקמה28. עומק ההדמיה תלוי במהירות התנודה ובעוצמה של לייזר24. בתוך הריאה, ניתן להשיג עומקי הדמיה של ~500-600 מיקרומטר17. לפיכך, השילוב של עומק הדמיה והלבנה נמוכה הופך את המיקרוסקופ הדו-פוטוני למתאים ביותר להדמיה תוך-חיונית של איברים.

במיקרוסקופ שני פוטונים נעשה שימוש במספר רקמות ואתרים אנטומיים שונים, כגון העור 12,13, בלוטות הלימפה29, אנדותל ורידי30, קליפת המוח10,11, כליות14,15 וכבד31,32. לדוגמה, בדרמיס של עכברים, נעשה שימוש בהדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים כדי לתאר נחיל נויטרופילים בעקבות פגיעה פיזית סטרילית12. במודל של פקקת ורידי, מונוציטים בדם ונויטרופילים נראו זוחלים לאורך האנדותל של הווריד הנחות, קאווה30. תאי מיקרוגליה אנושיים צולמו בהצלחה in vivo לאחר שהושתלו במודל אורגנואיד מוח אנושי33. עם התקדמות מתמדת במיקרוסקופ של שני פוטונים, הדמיה תוך-חיונית אפשרית בעומקים גדולים יותר ואפילו באיברים לא סטטיים. לדוגמה, עומקים של עד 1000 מיקרומטר צולמו בניאו-קורטקס בעכברים באמצעות מגבר רגנרטיבי Ti:Al2O3 34.

אחד האתגרים של הדמיה תוך חיונית באיברי החזה הוא ייצוב תמונה. בשל התנועה מהלב הפועם ונשימת הריאות, תוצרי תנועה יכולים להפחית באופן משמעותי את איכות התמונה. פותחו מספר שיטות לייצוב להדמיית לב וריאות, ביניהן הדבקת האיבר 4,7, יניקה-ייצוב 19,35,36,37 ותיקון תנועה אחורי38. טכניקת ההדמיה שלנו של הריאה מסתמכת על הדבקת משטח הריאה לזכוכית כיסוי מיוצבת. אנו שומרים על הריאה מחוררת, מאווררת ונורמותרמית, מה שמדמה את התנאים הנמצאים in vivo. בהשוואה לשיטת היניקה-ייצוב שתוארה על ידי Looney et al.19, לפרוטוקול זה מספר יתרונות. ראשית, איננו דורשים יצירת מכשיר יניקה מיוחד. במקום זאת, ניתן לבנות את תא ההדמיה ואת הפלטה העליונה שלנו עם חומרים הזמינים במעבדת מיקרוסקופיה. בנוסף, בהשוואה למכשיר היניקה (בעל קוטר פנימי של 4 מ"מ), טכניקת ההדבקה בה נעשה שימוש במחקר זה מאפשרת שטח פנים גדול יותר של הדמיה (עד 10 מ"מ). עם הדבקה היקפית, אזור הריאה בתוך מעגל הדבק מוגבל כראוי, ותנועת האוורור ממוזערת. בהשוואה לטכניקת היניקה, גישת זכוכית הכיסוי מונעת עיוות קמור של פני השטח של הריאה, אשר עלול להשפיע על זרימת הדם הנימי subpleural. החסרונות של המערכת שלנו כוללים את חוסר היכולת להסיר את הכיסוי מבלי לפגוע בצומת pleuroparenchymal. כך, לא ניתן לדמיין את הריאה פעם נוספת בטכניקת הדבק הנהוגה כאן, בעוד שטכניקת היניקה מאפשרת הדמיה סדרתית. בנוסף, השימוש בבית החזה מחייב אובדן של לחץ תוך חזי שלילי נורמלי, אשר, בשילוב עם אוורור לחץ חיובי, אינו פיזיולוגי. מגבלות נוספות של דימות שני פוטונים יידונו להלן.

בעוד החזה פתוח במהלך הדמיה תוך חיונית, זה קריטי לשמור קרוב ככל האפשר לסביבה פיזיולוגית. צלחת הבסיס שעליה שוכב העכבר נשמרת בטמפרטורה של 35-37 מעלות צלזיוס. כאשר רק לוח הבסיס מחומם, מצאנו כי טמפרטורת הליבה של העכבר (הנמדדת באמצעות בדיקה רקטלית) מווסתת היטב במשך מספר שעות. מניסיוננו, תנועתיות התאים והתנהגותם מושפעים באופן גלוי רק כאשר הטמפרטורה יורדת מתחת ל-32°C, מה שלא סביר שיתרחש עם הגדרה זו. אם יש קושי בשמירה על נורמותרמיה של רקמות או זילוח ריאות במהלך ההתקנה הראשונית של תא הדמיה זה, ניתן לחבר שני נגדים נוספים כדי לחמם את הצלחת העליונה בנוסף ללוחית הבסיס (איור משלים 1). לאחר אופטימיזציה של תא ההדמיה, אין צורך לפקח באופן שגרתי על הטמפרטורה הפנימית של העכבר במהלך כל ניסוי הדמיה. בנוסף, מצאנו כי השילוב של גזה ספוגה במי מלח המונחת מעל חלל בית החזה הפתוח וטבעת הדבק החוסמת סביב אזור הריאה להדמיה יעילים במזעור אובדן נוזלים במהלך ההדמיה.

שיקול טכני חשוב הוא השגת המוסטזיס טוב במהלך כריתת הצלעות בעת יצירת חלון הדמיה של בית החזה. חלקיםשל הצלעות השמאליות 3עד 5 מנותחות, ודימום מתמשך מצלעות חתוכות אלה יפגע בהישרדות העכבר במהלך ההדמיה. כדי להילחם בכך, אנו ממליצים תחילה להדק את הצלעות בסמיכות למקום שבו הן אמורות לעבור כריתה במשך 10 שניות כדי לפקפק את כלי הדם הזעירים (ראו איור 1C,D). לאחר מכן, לאחר כריתה של הצלעות, את הקצוות לחתוך של הצלעות צריך להיות קריש בנדיבות עם electrocautery. לבסוף, חיוני להניח את הריאה השמאלית על גבי רצועת הגזה ספוגה במי מלח (ראו איור 1F) במהלך ההדמיה כדי למנוע מקצוות הצלעות החדים לנקב את הריאה. בעזרת שילוב זה של שיקולים טכניים, אנו יכולים לצלם סרטונים ברורים של סחר בתאי מערכת החיסון בתוך פרנכימת הריאה עם תנועה מינימלית למשך מספר שעות ללא פגיעה בריאה או אובדן דפוסי זילוח נורמליים.

מיקרוסקופ שני פוטונים שימש בריאות לחקר מודלים של מחלות זיהומיות ודלקת סטרילית. קבוצה אחת השתמשה בדימות של שני פוטונים כדי לחקור תנועתיות ונדידה של תאי זיכרון B בעקבות אתגרים חוזרים ונשנים של ריאות עכברים עם נגיף שפעת39. בנוסף, נעשה שימוש במיקרוסקופ של שני פוטונים בהשתלות עור, כליות ואיוני לבלב 40,41,42,43. באמצעות מודל השתלה, ניתן לשנות גנטית את התורם והמקבל כדי לחקור את אוכלוסיות התאים שלהם. למיטב ידיעתנו, הקבוצה שלנו הייתה הראשונה שביצעה הדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים בהשתלות ריאה מורין4. הבחנו בגיוס וקיבוץ נויטרופילים מהירים בעקבות פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה בתיווך השתלה, אשר הופחתה עם דלדול תרופתי של מונוציטים בדם4. בעבודה מאוחרת יותר, הראינו כי מונוציטים שמקורם בטחול המקבל מאפשרים אקסטרווציה של נויטרופילים באמצעות ייצור IL-1B44. הדמיה תוך-חיונית במחקרים אלה אפשרה לנו לחשוף את הרגולטורים במעלה הזרם של אקסטרווזיה של נויטרופילים כמטרות טיפוליות אפשריות להפחתת התגובה הדלקתית שלאחר ההשתלה45. בנוסף, ביצענו גם הדמיה תוך-חיונית בלבבות עכברים פועמים לאחר השתלה הטרוטופית16. דמיינו גיוס נויטרופילים לשריר הלב ומצאנו כי מוות של תאים פרופטוטיים של תאי שתל לב מעורר דלקת לאחר השתלת לב46. יישמנו טכניקת ייצוב דומה על קשתות אבי העורקים המושתלות כדי להמחיש סחר מונוציטי לתוך רבדים טרשתיים47. מחקרים אלה הדגימו את ההיתכנות והתועלת של הדמיה תוך חיונית של איברי חזה מושתלים לא סטטיים.

לבסוף, כדאי לדון בשיטות לדמיין סוגי תאים שונים ואת parenchyma הריאות. שתי שיטות עיקריות משמשות לסימון תאים - 1) זני עכברים טרנסגניים עם מוטציות נוקבות של חלבונים פלואורסצנטיים ו -2) נוגדנים מסומנים פלואורסצנטיים להכתמת תאים. זני עכברים טרנסגניים נפוצים לזיהוי תאי מערכת החיסון במיקרוסקופ של שני פוטונים כוללים LysM-GFP עבור נויטרופילים48, CX3Cr1-GFP עבור אוכלוסיות מקרופאגים אינטרסטיציאליות שונות49,50, CCR2-GFP עבור מונוציטים קלאסיים51, CD19-tdTomato עבור תאי B52, ו-Foxp3-GFP עבור תאי T רגולטוריים5. יש לציין כי CX3Cr1 לבדו אינו מספיק כדי לזהות תאים באופן חד משמעי, אך ניתן להיעזר במורפולוגיה של התא ובמיקום התואם את זה של מקרופאגים אינטרסטיציאליים. ניתן לצלם מקרופאגים בנאדיות ללא תיוג בשל האוטופלואורסצנטיותשלהם 53,54, מורפולוגיה ייחודית והתנהגות (כלומר, חוסר תנועתיות ברזולוציית הזמן של רישומי קיטועי זמן). בהשוואה לאאוזינופילים, שהם גם אוטופלואורסצנטיים, המקרופאגים בנאדיות גדולים יותר ובהירים הרבה יותר עם עירור של 890 ננומטר54. לחלופין, מקרופאגים בנאדיות יכולים גם להיות מסומנים על סמך תפקודם הפאגוציטי באמצעות מתן תוך-ריאתי של צברי צבע54.

הדמיה של תאים חיסוניים אצל מושתלים יכולה להתבצע גם על ידי אימוץ תוך כלי דם, העברה של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי או על ידי הזרקת נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית כנגד סמני פני שטח ספציפיים לתא18,55. יתרון מובנה נוסף של מיקרוסקופ שני פוטונים הוא SHG על ידי מבנים birefringent מסוימים בתוך הרקמה, כגון קולגן56. תופעה זו שימושית במיוחד להדמיית ריאות בגלל תכולת הקולגן הגבוהה בשקי הנאדיות, הפועלת כאינדיקטור מהותי למבנה הנאדיות ללא צבעים פלואורסצנטיים נוספים. יתר על כן, alveoli הם גם מוקף על ידי נימים alveolar מסומן על ידי 655 ננומטר q-נקודות. לבסוף, כלי הדם יכולים להיות מסומנים עם הזרקה תוך ורידית של q-dots (כמתואר בפרוטוקול זה) או rhodamine B dextran. בעת תכנון ניסוי במיקרוסקופ תוך-ויטלי של שני פוטונים, אנו ממליצים להשתמש בלא יותר מארבעה ערוצי פליטה שונים כדי למזער את הסיכון לדימום ולהבחנה לקויה בין הערוצים.

אחת המגבלות העיקריות של טכניקת ייצוב הדבק שלנו המתוארת היא חוסר היכולת להסיר את זכוכית הכיסוי מהריאה ללא נזק פוטנציאלי לרקמות ושאריות דבק על פני הריאה. לפיכך, ניתן לצלם את הריאה רק פעם אחת ולא במספר נקודות זמן לאורך מספר ימים. כדי להתמודד עם מגבלה זו, קבוצה אחת תיארה חלון הדמיה חצי קבוע של בית החזה, המאפשר הדמיה סדרתית של הריאה57. עם זאת, מניסיוננו, גישה זו אינה מאפשרת ייצוב ריאתי מספק לפרקי זמן ממושכים של הדמיה. טכניקה זו מעניקה את היכולת לדמיין את הריאה במשך שעות רבות, מה שמספק תובנות מפתח לגבי תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות לאחר השתלה.

מגבלות אחרות של דימות שני פוטונים כוללות את עלות ההתקנה היקרה מראש ואת המומחיות הנדרשת לתחזוקת המערכת. שדות הסריקה קטנים יחסית בהשוואה להדמיה אימונופלואורסצנטית. נזק תרמי ונזק לאור יכול להיות משמעותי ללא אופטימיזציה זהירה של פרמטרי רכישה. פונקציית התפשטות נקודת העירור של שני פוטונים היא רחבה, מה שמגביל במידת מה את הרזולוציה, במיוחד בממד z. בנוסף, דימות של שני פוטונים דורש שתאים בעלי עניין יסומנו באופן פלואורסצנטי, ותאים מסוימים אינם יכולים להיות מסומנים באופן חד משמעי עם סמן תא יחיד. מספר האותות שניתן לצלם בו זמנית מוגבל לעתים קרובות לארבעה או פחות. לבסוף, הרדמה, ניתוח והדמיה עשויים לגרום לדלקת נוספת ולשינויים פיזיולוגיים בנוסף להשתלת הריאה שיכולים לבלבל תוצאות ניסוי ופרשנויות למרות מיטב המאמצים לשמור על סביבה פיזיולוגית. כיוונים עתידיים כוללים פיתוח שיטות זעיר פולשניות של הדמיה תוך חיונית (כגון באמצעות בית חזה קטן יותר או גישה ברונכוסקופית).

לסיכום, מיקרוסקופ תוך-חיוני של שני פוטונים הוא כלי רב ערך בחקר תהליכי מחלה מרובים. במאמר זה אנו מתארים טכניקה אמינה של אימוביליזציה של ריאות והדמיה של שני פוטונים, המאפשרת תצפית תוך-חיונית על סחר בתאים ואינטראקציות דינמיות בין אוכלוסיות תאים שונות לאחר השתלת ריאות. טכניקה זו הרחיבה את הבנתנו את הנוף החיסוני שלאחר ההשתלה ותמשיך להיות כלי חיוני בחקר השתלות ריאות ותהליכים אחרים של מחלות ריאה.

גילויים

המחברים אינם מדווחים על גילויים רלוונטיים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ-NIH 1P01AI11650 ומהקרן לבית החולים היהודי בארנס. אנו מודים ל-In Vivo Imaging Core בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.75% פובידון-יודAplicareNDC 52380-0126-2לחיטוי
1 אינץ' 20G IV קטטרTerumoSROX2025CAלצינור אנדוטרכיאלי (ETT)
סרט משי 1 אינץ'Durapore3M ID 7100057168לאבטחת העכבר במצב
20x טבילה במים עדשת אובייקטיביות ארוכהאולימפוסN20X-PFH
3M דבקVetbondMedi-Vet.com10872להדבקת כיסוי זכוכית לריאה
655 ננומטר נקודות קוונטיות לא ממוקדותThermoFisherQ21021MPלתיוג כלי דם
70% אתנולסיגמא אולדריץ'EX0281לחיטוי
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
טבעת O שחורה (2 ס"מ)חנות לחומרי בנייןN/Aלהדמיה בהתאמה אישית
תא בורג (2)חנות לחומרי בנייןN / Aעבור תא הדמיה בהתאמה אישית
אגוז אגודל פליז (2)חנות לחומרי בנייןN / Aעבור תא הדמיה בהתאמה אישית
בופרנורפין 1.3 מ"ג/מ"לפידליס בריאות בעלי חייםNDC 86084-100-30לשליטה בכאב
זיקית טיטניום-ספיר פמטו-שנייה פועם לייזרקוהרנטיN/A
כיסוי זכוכית (24 מ"מ x 50 מ"מ)Thomas Scientific1202F63לתא הדמיה שנבנה בהתאמה אישית
מהדק יתושים מעוקל (1)Fine ScienceTools 13009-12
בקר חימום דו-ערוציWarner InstrumentsTC-344B
מספריים עדינים (1)Fine Science Tools15040-11
מיקרוסקופ זקוף שלב קבועOlympusBX51WI
גזה (חתוכה ל-1 ס"מ על 3 ס"מ)McKesson476709להניח מתחת לריאה השמאלית
גריז ואקום גבוהDow CorningN/Aכדי להדביק זכוכית כיסוי על הצלחת העליונה
איזופלורן 1%סיגמא אולדריץ'26675-46-7להרדמה
קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"לVedcoNDC 50989-996-06להרדמה
יריעת מתכת (3 ס"מ על 7 ס"מ)חנות לחומרי בנייןN/Aלתא הדמיה שנבנה בהתאמה אישית
אפליקטורים מחודדים עם קצה כותנהSolon56225למניפולציה של ריאות ולדיסקציה קהה
Power Pro Ultra ClipperOster078400-020-001
Puralube Veter משחת עינייםMedi-Vet.com11897למניעת ייבוש עיניים
מאוורר לבעלי חיים קטניםהרווארד מכשיר55-0000
מלקחיים ישרים (1)Fine Science Tools91113-10
דרייבר תריס תלת ערוציUniblitzVMM-D3סורק תהודה
xyz מנוע צעד אופטיPre ScientificOptiScan II
Xylazine 20 מ"ג/מ"לAkornNDC 59399-110-20לשליטה בכאב

מקורות

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282(2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119(2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36(2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636(2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), e718 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120(2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700(2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), e111 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות תוך-חי (Intravital Imaging)השתלת ריאההשתלת ריאת עכברתנועה של תאי חיסוןהשתלת ריאה אורתוטופיתחדירת נויטרופיליםתאי T רגולטורייםחלון דימותהשתלת ריאה אלוגנאית
מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.