מאמר שיטה

הערכת תוצאות הקישוריות של יחידת הקישוריות המוטורית של דיאפרגמה חולדה מודדת כסמנים ביולוגיים כמותיים של ניוון ופיצוי של נוירונים מוטוריים פרניים

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66568

⸱

19 באפריל 2024

 ,  ,  ,  , 
1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

במחקר זה אנו מציגים שיטת in vivo להערכת מספר היחידה המוטורית וגודלה כדי לכמת את קישוריות היחידה המוטורית של דיאפרגמה חולדה. מתוארת גישה שלב אחר שלב לטכניקות אלה.

תקציר

אובדן תפקוד שרירי ההנשמה הוא תוצאה של פגיעה בנוירונים מוטוריים וניוון עצבי (למשל, פגיעה בעמוד השדרה הצווארי וטרשת אמיוטרופית צידית, בהתאמה). נוירונים מוטוריים פרניים הם החוליה המקשרת הסופית בין מערכת העצבים המרכזית לשריר, והיחידות המוטוריות שלהם בהתאמה (קבוצות של סיבי שריר המעצבבים על ידי נוירון מוטורי יחיד) מייצגות את היחידה התפקודית הקטנה ביותר של מערכת האוורור העצבית-שרירית. פוטנציאל פעולת שרירים מורכבים (CMAP), פוטנציאל יחידה מוטורית יחידה (SMUP) והערכת מספר יחידה מוטורית (MUNE) הן גישות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות המאפשרות הערכה אורכית של שלמות היחידה המוטורית במודלים של בעלי חיים לאורך זמן, אך יושמו בעיקר על שרירי הגפיים. לכן, מטרות מחקר זה הן לתאר גישה במחקרי מכרסמים פרה-קליניים שניתן להשתמש בה לאורך זמן כדי לכמת את MUNE הפרני, גודל היחידה המוטורית (המיוצגת כ-SMUP) ו-CMAP, ולאחר מכן להדגים את התועלת של גישות אלה במודל אובדן נוירונים מוטוריים. סמנים ביולוגיים רגישים, אובייקטיביים ורלוונטיים מבחינה תרגומית לפגיעה עצבית, ניוון והתחדשות בפגיעות ומחלות של נוירונים מוטוריים יכולים לסייע באופן משמעותי ולהאיץ תגליות מחקריות ניסיוניות לבדיקות קליניות.

מבוא

נוירונים מוטוריים פרניים (MNs), המשתרעים מרמות C3 עד C6 מיוטומיים, יוצרים את הקישור הסופי ממערכת העצבים המרכזית (CNS) לשריר הסרעפת1. יחידות מוטוריות פרניות (MUs) מורכבות מ- MN יחיד בעמוד השדרה וסיבי שריר הסרעפת העצביים שלו יוצרים את היחידה התפקודית הקטנה ביותר של המערכת העצבית-שרירית הנשימתית. תפקוד האוורור דורש כיווץ נאות של שריר הסרעפת המושג באמצעות הפעלה מתואמת של בריכת MU פרנית 2,3. מחלות נוירולוגיות רבות, כולל טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), גורמות לפגיעה חמורה בהנשמה, ובסופו של דבר תורמות לסיבת המוות4.

ניתן להשתמש במספר גישות אלקטרופיזיולוגיות כדי להעריך ולנטר את שלמות מאגר היחידה המוטורית (MU) in vivo. פוטנציאל פעולת שריר מורכב (CMAP) משקף את הדפולריזציה המסוכמת של כל סיבי השריר בשריר מסוים או בקבוצת שרירים מסוימת לאחר גירוי עצבי היקפי והוא רגיש למגוון מצבים עצביים-שריריים, כולל ALS 5,6 וניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA)7,8,9. מגבלה של הערכת CMAP היא שהנבטה בטחונית יכולה להוביל לשמירה על משרעת CMAP ושטח גם בנוכחות אובדן MU10. כדי להתגבר על מגבלה זו, נעשו שינויים בטכניקת CMAP כדי להעריך הן את מספר היחידה המוטורית והן את גודל11. בנוסף, מחקר in vivo שחקר את ההערכה התפקודית של CMAP בסרעפת על ידי מערכת אלקטרופיזיולוגית הציע כי ייתכן שיהיה אפשרי גם להשתמש בטכניקת ההקלטה CMAP של הסרעפת המתוארת להערכת מספר יחידה מוטורית12.

טכניקת הערכת מספר היחידה המוטורית המצטברת (MUNE) הוצגה לראשונה בתחילת שנות השבעים על ידי McComas et al. עבור שריר extensor digitorum brevis בבני אדם13. גישת MUNE המצטברת הייתה שינוי של טכניקת ההקלטה המסורתית CMAP, שבמהלכה הועבר גירוי הולך וגובר כדי להקליט הפרשים תת-מקסימליים קוונטיים, הכל או אף אחד כמדדים של תגובות יחידה מוטורית יחידה. ההפרשים המסוכמים והממוצעים שימשו לחישוב אומדן לגודל פוטנציאל יחידת מנוע יחידה (SMUP). גודל מחושב זה חולק לאחר מכן למשרעת CMAP כדי להעריך את מספר MUs המעצבבים את השריר הנבדק11. MUNE מדגים רגישות גבוהה באיתור וניטור אובדן יחידות מוטוריות, ומאפשר זיהוי של תפקוד לקוי של היחידה המוטורית לפני שינויים נצפים במדדים כגון משרעת CMAP או שטח14,15. בחולי ALS, MUNE הוכח כרגיש במיוחד, ומשמש סמן ביולוגי בולט להופעת המחלה, התקדמות ופרוגנוזה16,17.

התאמות רבות של MUNE פותחו ונעשה בהן שימוש נרחב כדי להעריך את תפקוד MU במצבים כגון ניוון עצבי, פגיעה עצבית ותהליך ההזדקנות הטבעי 18,19,20,21. מאז התיאור הראשוני, התאמות שונות המשתמשות הן בתגובות אלקטרופיזיולוגיות והן במדידות כוח מצטבר (מכני) שימשו הן במחקרים בבני אדם והן במודלים של בעלי חיים22. MUNE מספק הערכה תפקודית לא פולשנית של קישוריות נוירון מוטורי עם השריר. יישום אורכי של MUNE מאפשר הבנה של התקדמות המחלה או הפנוטיפ המושרה והערכת ההשפעות המגינות או המתחדשות של התערבויות טיפוליות, הן במסגרות קליניות והן במסגרות פרה-קליניות. ללא קשר ליעילות של MUNE מודד את יכולת השחזור ואת הרלוונטיות הקלינית של הטכניקה עבור בריכות MU בכל הגוף האנושי, המאמצים התמקדו בעיקר בשרירי הגפיים בשרירי מכרסמים 10,23,24,25.

לכן, מטרות מחקר זה היו לתאר גישה להשגת פוטנציאל פעולה מורכב של שרירים (CMAP), SMUP ומספר יחידה מוטורית פרנית (MUNE) כהערכות in vivo שניתן להשתמש בהן לאורך זמן במחקרי מכרסמים פרה-קליניים כדי לכמת את MUNE, גודל היחידה המוטורית (המיוצגת כ-SMUP) ו-CMAP. יתר על כן, אנו מציגים נתונים מייצגים המדגישים את אובדן מספר MU של הסרעפת בעקבות מתן intrapleural של סוכן ניווני MN פרני, רעלן כולרה B מקטע מצומד לספורין (CTB-SAP).

פרוטוקול

כל הנהלים אושרו ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מיזורי. ניסויים בוצעו על חולדות Sprague-Dawley זכרים בוגרים, בגילאי 11 עד 15 שבועות. חולדות אלה שוכנו בזוגות והוחזקו תחת מחזור בהיר-חושך ביחס של 12:12, עם גישה למזון מסחרי סטנדרטי ומים שטופלו ב-HCl זמינים בכל עת.

1. הכנת בעלי חיים והרדמה

  1. יש ללבוש ציוד הגנה אישי מתאים בעת הטיפול בחולדות.
  2. מתן הרדמה אינהלציה עם 3-5% איזופלורן, הבטחת אינדוקציה נכונה. לאחר שהחולדה מורדמת כראוי, הניחו אותה במצב שכיבה ושמרו על ההרדמה עם איזופלורן בשאיפה של 1-3%. בדוק את עומק ההרדמה על ידי הפעלת לחץ עדין על כרית כף הרגל האחורית באמצעות מלקחיים כדי לוודא שאין תגובת נסיגה.
    הערה: בהתבסס על גודלה ומשקלה של החולדה, יש לעקוב אחר עומק ההרדמה ולהתאים את ריכוז האיזופלורן בהתאם.
  3. שמור על טמפרטורה של 37 ° C באמצעות לוח התחממות תרמוסטטי כדי למנוע שינויים בטמפרטורה שיכולים להשפיע על משרעת CMAP והשהיה.
  4. יש למרוח משחה וטרינרית על בסיס נפט על העיניים למניעת יובש. עקוב אחר עומק ההרדמה על ידי התבוננות בקצב הנשימה ובדיקת תגובות נסיגה בעת הפעלת לחץ על כרית כף הרגל עם מלקחיים.
  5. הסר שיער מהשליש התחתון של החזה והצוואר כדי להיחקר באמצעות קוצץ. עקוב אחר נשימת החולדה במהלך כל הניסוי.
    הערה: לאחר רישומי CMAP ו-MUNE והפסקת ההרדמה, אין להשאיר את החולדה ללא השגחה עד שהיא חזרה להכרה מספקת. אין להחזיר את בעל החיים לכלוב הביתי עד להחלמה מלאה.

2. מיקום אלקטרודות והגדרתן

  1. הניחו זוג אלקטרודות מחט מונופולריות של 28 G כדי להקליט את CMAP, SMUP ו-MUNE כפי שמתואר באיור 1.
    1. מניחים את אלקטרודת המחט הפעילה (E1) תת עורית מעל הקו הקלאוויקולרי האמצעי נחות מגבול הצלע האחרון, ואת אלקטרודת מחט הייחוס (E2) תת עורית בזווית שבין תהליך הקסיפואיד לסחוס הסטרנוקוסטלי האחרון.
      הערה: אין להחדיר את אלקטרודות המחט לשריר הסרעפת; במקום זאת, הם צריכים להיות ממוקמים באזור תת עורי.
  2. לגירוי העצב הפרני ביריעת התרדמה, השתמש בזוג אלקטרודות מחט מונופולר 28 G כקתודה ואנודה לגירוי עצבי והניח תת עורית על הצוואר הצידי בין שרירי הקשקשים הקדמיים והאמצעיים, מופרדים בכ -1 ס"מ. ודא שמיקום המחטים המעוררות הוא ברמה מתחת לחוליות הצוואר הרביעית (C4).
    הערה: הימנע מהחדרת האלקטרודות המעוררות עמוק מדי כדי למנוע פגיעה בעצב הפרני או במבנה אחר. איור 1 מדגים את מיקום האלקטרודות.
  3. עבור אלקטרודת הקרקע, הניחו אלקטרודת משטח חד פעמית על הזנב.

3. רכישת נתונים

  1. Phrenic CMAP
    1. הקלט תגובות CMAP פרניות על ידי הפעלת פולסים מונופאזיים של גל מרובע קתודי עם משך של 0.1 אלפיות השנייה ועוצמה הנעה בין 60 ל -100 mA כדי לעורר את העצב הפרני.
    2. קבל תגובות CMAP תוך הגדלה הדרגתית של עוצמת הגירוי עד שהמשרעת של התגובה מפסיקה להראות עלייה נוספת. כדי להבטיח גירוי על-מקסימלי, יש להעלות את עוצמת הגירוי לכ-120% מהרמה המשמשת ליצירת תגובה מרבית, ולתעד תגובה נוספת. אם גודל CMAP אינו גדל עוד, שקול תגובה זו כ- CMAP המרבי.
      הערה: מתן גירוי במהלך נשיפה עדיף כדי למזער רעשי פעילות שרירים בו זמנית במהלך הקלטת CMAP.
    3. מדדו ותעדו את המשרעת משיא לשיא של CMAP במיליוולטים (mV) (איור 2).
      הערה: ניתן להעריך את משרעת CMAP מבסיס לשיא ומשיא לשיא. מערכות אלקטרודיאגנוסטיות קליניות הן לעתים קרובות ברירת מחדל להעריך בסיס לשיא אשר מחושב מקו הבסיס האיזואלקטרי לשיא השלילי הראשוני.
  2. גודל ממוצע של יחידת מנוע בודדת (SMUP) וחישוב MUNE
    1. חשב את גודל SMUP הממוצע באמצעות טכניקת גירוי מצטבר.
      1. כדי לעורר תגובות מצטברות, יש לתת גירוי תת-מקסימלי עם משך זמן של 0.1 מילישניות בתדר 1 הרץ, ולהגדיל בהדרגה את העוצמה במרווחים של 0.03 mA עד להשגת תגובה מינימלית של הכל או אף אחד. לרכוש את התגובה הראשונית עם עוצמת גירוי הנע בין 2 mA ו 10 mA.
      2. אם התגובה הראשונית אינה מתרחשת בעוצמת גירוי בין 2 mA ל -10 mA, שנה את המיקום של הקתודה המעוררת, או לקרב אותה או להרחיק אותה מהעצב הפרני בצוואר, כדי להקטין או להגדיל את עוצמת הגירוי הדרושה, בהתאמה.
      3. אם התגובה המצטברת הראשונה מושגת בעוצמת גירוי הנעה בין 2 mA ל- 10 mA, שמור את התגובה הראשונה ורכוש מרווחים נוספים עם עוצמות גירוי גבוהות יותר ויותר, תוך התאמה במרווחים של 0.03 mA, כדי להשיג סך של 9 תוספות נוספות העונות על הקריטריונים הבאים בשלב 3.2.2.
        הערה: כל SMUP מכומת על-ידי חיסור כל הפרש קבוע מההפרש הקודם.
    2. בעת מדידת התגובות המצטברות, ודא שכל תוספת עומדת בקריטריונים הבאים:
      1. ודא שהשיא השלילי הראשוני של התגובות המצטברות מיושר באופן זמני עם השיא השלילי של תגובת CMAP המקסימלית.
        הערה: התנועות הקלות שנצפו עקב רעשי רקע ממחזורי נשימה טבועות באופי הניסוי. עם זאת, הנוכחות העקבית של SMUPs במהלך תצפית חיה מאשרת את זהותם עבור CMAP ספציפי זה.
      2. מכיוון שהסרעפת היא שריר דינמי המעורב בנשימה, כל מחזור נשימה עשוי לגרום לתנועה בסיסית. לכן, ודא את היציבות והיעדר השבר בכל תגובה מצטברת על ידי אישור עקביות על פני שלוש תגובות כפולות.
        הערה: כדי להבחין בין פוטנציאלים מעוררי אמפליטודה נמוכה, במיוחד SMUP הראשון, לבין רעשי רקע כתוצאה מפעילות נשימתית, חשוב להישאר ערניים ולהתבונן במשך 3-4 מחזורי נשימה. כמו כן, ודא את יישור הפסגות עם אלה של CMAP לדיוק.
      3. ודא שכל הפרש נפרד וגדול יותר מההפרש הקודם. לכן, להבחין חזותית בין תגובות מצטברות בזמן אמת, התבוננות בהם כפי שהם כיסוי על הפרשים שנרשמו בעבר.
        הערה: ניתן לבצע העתקים מרובים של הגירוי בכל משרעת כדי להבטיח עקביות במרווחים ועמידה בקריטריונים שהוגדרו מראש.
      4. לאחר אימות חזותי של כל תוספת עם הקריטריונים הנ"ל, ודא כי משרעת ההפרש היא לפחות 25 μV. אם התוספת נמוכה מ-25 μV, מחק את המדידה והערך מחדש את התגובה.
      5. לאחר רישום של 10 תגובות מצטברות, ודא שהמשרעת של כל תגובת תוספת אינה גדולה משליש מהמשרעת המשולבת של כל 10 ההפרשים, המייצגת את המשרעת הכוללת של התגובה הסופית. אם קריטריון זה אינו מתקיים, חזור על מדידת 10 התגובות המצטברות.
        הערה: הסף של שליש מבוסס על ההנחה שכל תגובה מצטברת מייצגת הפעלה של יחידה מוטורית אחת. אם המשרעת של תגובה מצטברת כלשהי עולה על שליש מהמשרעת המשולבת של כל עשר ההפרשים, הדבר מצביע על כך שלא ניתן לייחס את התגובה אך ורק להפעלה של יחידה מוטורית יחידה. במקום זאת, זה יכול להיות מושפע על ידי גיוס של יחידות מוטוריות נוספות או נוכחות של פעילות לא ספציפית, כגון רעש חשמלי או חפצים22,26.
      6. כדי להעריך את המשרעת הממוצעת של SMUPs, ממוצע את הערכים של 10 הפרשים. שיטה נוספת למדידת משרעת SMUP ממוצעת היא לחלק את כל המשרעת של התגובה המצטברת הסופית במספר הכולל של הפרשים11.
    3. קבע MUNE על ידי חלוקת משרעת CMAP המרבית (שיא לשיא) באמפליטודת SMUP ממוצעת (שיא לשיא). במערכות אלקטרופיזיולוגיות מסוימות, SMUPs נרשמים במיקרו-וולטים (μV), בעוד CMAP מבוטא בדרך כלל במיליוולטים (mV). במידת הצורך, המר מדידות CMAP ו- SMUP לאותן יחידות לפני חישוב MUNE.
      הערה: CMAP משיא לשיא, SMUP ממוצע ו- MUNE מחושבים בדרך כלל באופן אוטומטי על-ידי מערכות אלקטרומיוגרפיה במרפאה):
      figure-protocol-1
      CMAP = פוטנציאל פעולה מורכב של שרירים
      SMUP = פוטנציאל יחידה מוטורית יחידה יחידה
      MUNE = הערכת מספר יחידת מנוע

תוצאות

טכניקות CMAP, SMUP ו-MUNE המתוארות בדו"ח זה מאפשרות רישום של תפקוד עצבי-שרירי בשריר הסרעפת תוך שימוש במיקום אלקטרודות זעיר פולשני (איור 1). ניתן להשתמש בפרמטרים של משרעת ושטח כדי לאפיין את גודל CMAP העל-מקסימלי, ולספק מדד כולל של תפוקת קבוצת השרירים (איור 2). עם זאת, בשיטות הנוכחיות שלנו, אנו מסתמכים על משרעת כדי לכמת הן את גודל CMAP והן את גודל SMUP. ניתן להשתמש ב-CMAP, SMUP ו-MUNE למדידת תפקוד עצבי-שרירי במודלים שונים של חולדות של מחלות עצביות-שריריות. כדי להדגים אובדן MU בהקשר של ניוון MN, חולדות עברו הזרקה תוך-פלאורלית דו-צדדית עם CTB-SAP (25 מיקרוגרם) כדי להתמקד ב-MN פרני ו-CTB נוסף (25 מיקרוגרם), וחולדות ביקורת קיבלו CTB לא מצומד (25 מיקרוגרם) ו-SAP (25 מיקרוגרם)1,27.

באיור 3 משווים ממצאים בחולדת ביקורת בוגרת ובחולדה בוגרת (12 שבועות) שבעה ימים לאחר הזרקת CTB-SAP תוך-פלאורלית. לאחר הזרקה תוך-פלאורלית של CTB-SAP, MUNE מופחת ב-60 יחידות מוטוריות תפקודיות מוערכות בהשוואה לממצאים נורמליים של 74 יחידות מוטוריות תפקודיות בחולדת הביקורת. עם זאת, משרעת CMAP בחולדת CTB-SAP (14.25 mV משיא לשיא) הציגה שינויים מזעריים בהשוואה לביקורת (14. 5 mV משיא לשיא) ככל הנראה עקב הנבטה בטחונות. באיור 4, CMAP של הסרעפת, SMUP ו-MUNE נרכשו באופן דו-צדדי ונמדדו בממוצע בנקודת ההתחלה/טרום הזרקה (n = 14), כמו גם 7 (n = 14), 14 (n = 14), 21 (n = 6) ו-28 (n = 14) ימים לאחר ההזרקה. באיור 4 לא נמצאו הבדלים בסיסיים בין הקבוצות. MUNE הראה שינוי משמעותי בזמן (p < 0.05), CTB-SAP (p < 0.001) וזמן אינטראקציה x CTB-SAP (p < 0.01) עם ~ 40% הפחתה של MUNE בחולדות CTB-SAP. SMUP הממוצע של חולדות CTB-SAP הראה שינוי משמעותי עם הזמן (p < 0.05) ו- CTB-SAP (p < 0.01), אך ללא אינטראקציה משמעותית עם ~ 50-60% עלייה באמפליטודת SMUP. CMAP לא הראה שינוי משמעותי.

figure-results-1
איור 1: מיקום אלקטרודות. הקתודה המגרה (A) והאנודה (B) מוחדרות תת עורית לצוואר הצידי בין שרירי הקשקשים הקדמיים והאמצעיים במרחק של כ-1 ס"מ זה מזה. (C) אלקטרודה "פעילה" (E1) ואלקטרודת רישום "ייחוס" (E2) (D) ממוקמות מעל הקו האמצעי, נחות מגבול הצלע האחרונה, בעקבות הזווית בין תהליך הקסיפואיד לסחוס הקוסטוסטרנלי האחרון. בנוסף, (E) אלקטרודת דיסק חד פעמית ממוקמת על הזנב כקרקע כדי למזער חפצים. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פוטנציאל פעולה מורכב של שרירים . איור של תגובת CMAP מייצגת שנרשמה משריר ההמידיאפרגמה השמאלית. משרעת שיא CMAP לשיא נקבעת ממתח שיא שלילי למתח שיא חיובי. קיצור: CMAP = פוטנציאל פעולה מורכב של שרירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: שתי הקלטות CMAP ו-MUNE מייצגות מחולדת ביקורת, ומחולדה בוגרת שבעה ימים לאחר הזרקת CTB-SAP intrapleural . (A) פוטנציאל פעולת שריר פרני שמאלי (CMAP) בחולדה בוגרת ביקורת (גיל 12 שבועות) עם משרעת שיא עד שיא של 14.5 mV. רגישות מסך = 1 mV/חלוקה ומשך מסך 1 ms/חלוקה. (B) עשר תגובות מצטברות עוקבות עם משרעת כוללת של 1.940 mV מחולקות ב-10 כדי לקבוע את גודל SMUP הממוצע (0.194 mV). רגישות מסך = 0.2 mV/חלוקה ומהירות טאטוא של 1 ms/division. MUNE מחושב = 74 (MUNE=CMAP/SMUP ממוצע (14.5 mV/ 0.194 mV)) (C) Phrenic CMAP שבעה ימים לאחר הזרקת CTB-SAP מראה כמעט ללא שינוי באמפליטודת CMAP משיא לשיא 14.25 mV. רגישות מסך = 1 mV/חלוקה ומהירות טאטוא של 1ms/חלוקה. (D) עשר תגובות מצטברות עוקבות עם משרעת כוללת משיא לשיא של 2.360 mV חלקי 10 כדי לקבל גודל SMUP ממוצע של 0.236 mV. רגישות מסך = 0.2 mV/חלוקה ומהירות טאטוא של 1ms/חלוקה. לפיכך, MUNE המחושב היה 60. קיצורים: CMAP = פוטנציאל פעולה מורכב של שרירים; MUNE = הערכת מספר יחידת מנוע; CTB-SAP = רעלן כולרה B מקטע מצומד לספורין; SMUP = פוטנציאל יחידה מוטורית יחידה. *ממחיש את החפץ שנגרם על ידי גירוי חשמלי; חשוב לציין כי בשל הניגוד בין המשרעת של הגירוי החשמלי לבין CMAP, כמו גם תגובות מצטברות, גרפים רק חלק מהגירוי. נעשה שימוש בצבעים ידידותיים לעיוורון כדי לשפר את ההדמיה של התגובות המצטברות לשיפור הנגישות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הערכה אלקטרופיזיולוגית של CMAP, SMUP ו-MUNE בעקבות CTB-SAP. לא נמצאו הבדלים בסיסיים בין הקבוצות (שבעה חולדות זכרים בני 11 שבועות הן ב-CTB-SAP והן בקבוצת הביקורת). (A) CMAP לא הראה שינוי משמעותי. (B) SMUP הממוצע של חולדות CTB-SAP הראה שינוי משמעותי לאורך זמן (p < 0.05) ועם CTB-SAP (p < 0.01), ללא אינטראקציה משמעותית, מה שמצביע על עלייה של 50-60% באמפליטודת SMUP. (C) שבעה ימים לאחר הזרקת CTB-SAP, ה-MUNE הממוצע ירד משמעותית ב-27.07%, מ-102.58 ±-20.54 ל-72.43 ±-15.59 יחידות מוטוריות פונקציונליות משוערות (ממוצע ± SD). ירידה זו נמשכה, עם ירידה נוספת של 11.75% לאחר 28 ימים (MUNE: 60.64 ± 11.33, p < 0.01). כל המדידות בתחילת המחקר, 7, 14 ו-28 ימים לאחר ההזרקה התקבלו מ-14 חולדות, כאשר n = 7 חולדות קיבלו CTB-SAP מצומד ו-n = 7 חולדות קיבלו CTB לא מצומד ו-SAP כקבוצת הביקורת. ביום ה-21 השתמשו בשש חולדות. נתוני CMAP, SMUP ו- MUNE מוצגים כממוצעים, וההשוואות בוצעו באמצעות ANOVA דו-כיוונית. כוכביות מציינות הבדלים בנקודות זמן שונות: *p < 0.05, ו- **p <- 0.01. קיצורים: CMAP = פוטנציאל פעולה מורכב של שרירים; MUNE = הערכת מספר יחידת מנוע; CTB-SAP = רעלן כולרה B מקטע מצומד לספורין; SMUP = פוטנציאל יחידה מוטורית יחידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

במחלות ניווניות של MN, כגון ALS, חיוני להעריך את MUs המעורבים בהנשמה28. למרות התרחשות של ניוון MN נשימתי בחולי ALS, ההתחלה וההתקדמות הספציפיות של מוות MN עדיין לא מובנות לחלוטין 29,30,31. מתוך הכרה בחשיבותו של היבט זה, מודלים שונים, הן מבוססי גנטיקה (למשל, SOD1 2,32) והן שאינם מבוססים גנטית (למשל, הזרקה תוך-פלאורלית CTB-SAP 3,27,33), שימשו לחיקוי ליקוי נשימתי במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות בבעלי חיים. בהתאם לכך, זיהוי סמן ביולוגי לאבחון, ניטור והערכה של השפעות טיפול פוטנציאליות הוא יתרון עבור מודלים אלה. בנוסף, סמנים ביולוגיים יכולים להקל על תרגום קליני של ממצאי מחקר פרה-קליני.

כדי לכמת את מספר ה-MNs העצבניים במודלים ניווניים של מכרסמים, נעשה שימוש בטכניקות תיוג שונות, כולל עוקבים מדרדרים ואדנו-וירוסים, 25,34,35,36. בעבר, אימונוהיסטוכימיה שימשה לסימון נוירונים מוטוריים פרניים בקרן הקדמית של חוט השדרה הצווארי 2,3,33. טכניקות תיוג, למרות שהן בעלות ערך עבור הערכות MN, יש מגבלות בהערכת הפונקציונליות של MUs ואינן מתאימות להערכות אורך37. הערכות אלקטרופיזיולוגיות אובייקטיביות חיוניות לתרגום מוצלח בין מינים, במיוחד בהתחשב בהבדלים מבניים בולטים בתכונות התפקודיות והאנטומיות של המערכות המוטוריות בין בני אדם למכרסמים38,39. שילוב הבדלים נוירוביולוגיים מהווה אתגר בתרגום ממצאים ממודלים של מכרסמים לחולים. MUNE מתגבר על מכשולים אלה בכך שהוא משמש כמדד אלקטרופיזיולוגי אובייקטיבי של תפקוד MN, ומאפשר הערכה של קישוריות MU פונקציונלית כסמן ביולוגי בניסויי מודל ניוונייםשל MN 3,40.

CMAP, SMUP ו- MUNE משמשים בדרך כלל במחקרים ובהערכת חולים עם הפרעות נוירומוסקולריות 9,10,11. סמנים ביולוגיים פוטנציאליים אלה הם זעיר פולשניים, ומאפשרים הערכה אורכית של תפקוד אצל אותו אדם לאורך זמן. חשוב לציין, בעוד שהם אינם מודדים ישירות את ההפעלה או הגיוס של MU על ידי MN קליפת המוח, הם מספקים הערכה רלוונטית קלינית של שלמות MN ומקבילו התפקודי שלה, MU. מודלים של מכרסמים של מחלות ניווניות MN חיוניים להבנת המנגנונים הפיזיופתולוגיים העומדים בבסיס מחלות אנושיות ולהתקדמות פרה-קלינית של טיפולים יעילים. פיתוח מדדי תוצאה וסמנים ביולוגיים הניתנים לתרגום בין מינים שונים יכול לייעל ולזרז את התרגום של ממצאים פרה-קליניים מבטיחים לניסויים קליניים11. בהתחשב במורכבות היחסית של המדדים, התאמנו ושכללנו את הטכניקות האלה מגפי חולדה לשריר הסרעפת. תרגום זה הוצג בפורמט חזותי כדי לאפשר ניצול ויישום רחבים יותר במחקרי חולדות.

מניסיוננו, המערכות האלקטרודיאגנוסטיות הקליניות מתאימות היטב למחקרים המתוארים בהקשר זה. התאמה זו נובעת מארגונומיה משופרת בממשק שבין הבודק למערכת האלקטרודיאגנוסטית, המאפשרת שליטה נוחה. בקבוצת המעבדה שלנו, אנו משתמשים במערכת דו-ערוצית הכוללת שני ערוצי מגבר ללא מיתוג. ערוצים אלה מצוידים בממיר אנלוגי לדיגיטלי של 24 סיביות ופועלים בקצב דגימה של 48 קילוהרץ לערוץ. רווח החומרה מתכוונן בטווח שבין 10nV ל- 100 mV לחלוקה. השתמשנו במסנן בתדר נמוך בטווח שבין 0.2 הרץ ל-5 קילוהרץ, והגדרות המסנן בתדר גבוה כיסו טווח שבין 30 הרץ ל-10 קילוהרץ. בנוסף, השתמשנו בממריץ זרם קבוע עם עוצמה מתכווננת הנעה בין 0 ל -100 mA ומשך בין 0.02 ל -1 ms. רוב המערכות הקליניות מציעות תכונות דומות המתאימות להקלטת תגובות CMAP, SMUP ו- MUNE . ניתן לכוונן מערכות אלו בהתאם כדי להבטיח רישום מדויק של הנתונים הרצויים. לדוגמה, ניתן להעריך את משרעת CMAP מבסיס לשיא ומשיא לשיא. מערכות אלקטרודיאגנוסטיות קליניות הן לעתים קרובות ברירת מחדל להעריך בסיס לשיא אשר מחושב מקו הבסיס האיזואלקטרי לשיא השלילי הראשוני.

תהליך קבלת תגובות CMAP, SMUP ו- MUNE מהסרעפת כולל מספר שלבים מכריעים. מיקום אלקטרודות עקבי ומדויק, יחד עם עומק אלקטרודה מתאים, חיוניים למדידה אמינה של אמפליטודות ולמזעור רעשי רקע במהלך ההקלטה. מיקום שגוי של אלקטרודות מגרה יכול להוביל לתוצאות לא מכוונות. מיקום אלקטרודות מעוררות מדי מאחור עלול לגרום להתכווצויות מוגזמות של שרירי הגפיים הקדמיות לעירור מקלעת הזרוע, בעוד שמיקום גבוה יותר מרמת C4 יכול להקשות על גירוי העצב הפרני. מיקום עמוק יותר נושא את הסיכון לפגיעה בעורק התרדמה או לעורר את העצב התועה, מה שעלול לגרום לבעיות מוליכות לב. הצבת אלקטרודות הקלטה גבוה או נמוך יותר מאשר הצלע האחרונה, מדידות מגירוי intercostal או rectus abdominis עשוי להתרחש, בהתאמה. כדי להימנע מהקלטה משרירים אחרים, שימו לב שהשיא השלילי של חביון CMAP הוא בדרך כלל 1.5-3.5 מילישניות, והצורה האופיינית שלו מוצגת באיור 2. התצפיות שלנו הצביעו על כך שאלקטרודות מחט מניבות רישומי CMAP, SMUP ו-MUNE עקביים יותר בהשוואה לאלקטרודות בצורת דיסק עבור שרירי הסרעפת. עקביות משופרת זו מיוחסת לצורת הכיפה של שריר הסרעפת ולנוכחותם של שרירים אחרים בקרבת מקום, כגון שרירי הבטן הבין-קוסטליים ושרירי הבטן הרקטוסית. בנוסף, מיקום גמיש של אלקטרודות המחט הוא גורם יתרון נוסף. באשר לעוצמת הגירוי החשמלי, השתמשנו בטווח של 60 עד 100 mA כדי לגרות את העצב הפרני, אשר חורג מהטווחים המדווחים עבור מערכות מוטוריות אחרות. הבדל זה נובע מהמיקום העמוק יותר של העצב הפרני בצוואר בהשוואה למיקומים שטחיים יותר של העצב הסיאטי והמקלעת הברכיאלית בגפה האחורית ובגפה הקדמית, בהתאמה.

השגת SMUP ממוצע מציבה אתגרים טכניים גדולים יותר בהשוואה ל- CMAP. גודל התגובה הקטן יותר, בטווח המיקרו-וולט ולא במיליוולטים, הופך את ההשפעה של רעשי הרקע לבולטת יותר. כדי להפחית רעשי רקע, שקול למטב את מיקום האלקטרודות על-ידי התאמת אלקטרודת הקרקע, הקתודה והאנודה. בנוסף, ודא שיש הפרעה מינימלית ממכשירים חשמליים סמוכים במערך הניסוי. כלוב פאראדיי, המשמש בדרך כלל ביישומי אלקטרופיזיולוגיה תוך-תאיים, אינו הכרחי להתקנה זו. הזיהוי החזותי של תגובות SMUP בודדות הוא מיומנות מאתגרת הדורשת תרגול לקבלת תוצאות עקביות וחוזרות. מכיוון שהסרעפת היא שריר דינמי, קו הבסיס יכול להשתנות עם כל מחזור אוורור. להיות קשוב לתוספות ה-SMUP המבטיחות היערכות עם ה-SMUP הקודם הוא גורם קריטי בהתגברות על אתגר זה. בנוסף, חשוב לוודא שהעסקים הקטנים והבינוניים מופעלים במסגרת זמן ההשהיה של ה-CMAP המרבי להקלטות מדויקות.

אתגר נוסף של רישום הסרעפת הוא אופיו הא-סימטרי של שריר זה, המאופיין בעוביים משתנים משמאל לימין ומושפע מהלחץ שמפעיל הכבד בצד ימין41. כדי לטפל בכך, ערכנו מדידות אלקטרופיזיולוגיות בנפרד על ההמידיאפרגמות השמאלית והימנית. לאחר מכן, חישבנו בנפרד את הממוצעים עבור תגובות CMAP, SMUP ו-MUNE בנפרד.

מכיוון שתגובת CMAP משקפת את הדפולריזציה הקולקטיבית של סיבי שריר בשריר מסוים, כל פתולוגיה המשפיעה על MN הפרני לסיב שריר הסרעפת יכולה לגרום לירידה בגודל CMAP. לפיכך, חישוב CMAP הממוצע מ hemidiaphragms דו צדדי מציע הערכה מצוינת של המצב התפקודי הכולל של מערכת העצבים שריר הנשימה. שינויים מפצים, כגון הנבטה בטחונות, יכולים להוביל לשימור גודל CMAP גם בנוכחות MN או אובדן אקסונלי מוטורי11. רישום הפרשים בודדים מאפשר להעריך את התפוקה הממוצעת של MUs בודדים (גודל SMUP), ומציג תובנות מפורטות יותר לגבי המצב התפקודי של MUs של מערכת הנשימה. לפיכך, טכניקת MUNE הופכת חיונית להערכת קלט MN פרני או אקסונים לסרעפת. יישום סמנים ביולוגיים אלה בניסויים פרה-קליניים של טיפולים לחקר מחלות MN טומן בחובו פוטנציאל לשפר את התרגום לניסויים קליניים.

גילויים

WDA קיבלה מימון מחקר מ-NMD Pharma, Avidity Biosciences ודמי ייעוץ מ-NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals ו-Novartis.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי מענק של תוכנית המחקר לפגיעות בחוט השדרה / מחלות מיזורי (NLN ו- WDA).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרק זכוכית 2 מ"לKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 מ"ל, דגם 705 RN מזרקHamilton Company7637-01משמש לביצוע הזרקה תוך פלאורלית
5008 - Formulab DietLabDiet 0001325
מחטים ניתנות לחיטוי 26 גרם (26S RN 9.52 מ"מ 40°)חברת המילטון7804-04משמשת לביצוע הזרקה תוך-פלאורלית רעלן
כולרה B-subunit (CTB)MilliporeSigmaC9903משמש להזרקה תוך-פלאורלית לסימון נוירונים מוטוריים שורדים
תת-יחידה B של רעלן כולרה מצומד לספורין (CTB-SAP)מערכות מיקוד מתקדמותIT-14משמש להזרקה תוך פלאורלית כדי לגרום למוות של נוירונים מוטוריים
כבל ניתן להסרהTechnomed202845-0000לחיבור אלקטרודת המקליט למכונת האלקטרודיאגנוסטיקה
אלקטרודת דיסק חד פעמית בגודל 2 אינץ' x 2 אינץ' עם מוביליםCadwell302290-000אלקטרודה טחונה
חד פעמית מחטים חד קוטביות 28 GTechnomed202270-000אלקטרודות מגרות קתודה ואנודה - אלקטרודות הקלטה
כבל מחט EMG (תיבת מתג Amp/stim)Cadwell190266-200לחיבור אלקטרודות חד קוטביות לממריץ אלקטרודיאגנוסטי
קליפ תנין עוזר לידיים עם בסיס ברזלרדיושאק 64-079שמירה על מיקום אלקטרודות הקלטה 
איזופלורן (בקבוק 250 מ"ל)Piramal Healthcare
מונוject קצה מעוקל מזרק השקיהCovidien81412012משמש ליישום ג'ל אלקטרודות
מערכת ניטור פיזיולוגית PhysioSuite עם התחממות הומותרמית RightTempKent Scientific CorporationPS-RTכולל כרית חימום אינפרא אדום, בדיקה רקטלית ובדיקת טמפרטורת כרית
Pro Trimmer Pet ערכת טיפוחOster078577-010-003קוצץ להסרת שיער
Saporin (SAP)מערכות מיקוד מתקדמותPR-01משמש להזרקה תוך פלאורלית (חומר בקרה כאשר הוא מוזרק בפני עצמו)
מערכת Sierra Summit EMGCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAמערכת אלקטרודיאגנוסטיקה ניידת
SomnoSuite מערכת הרדמה דיגיטלית בזרימה נמוכהקנט סיינטיפיק תאגידSOMNOכולל מתאם עליון לבקבוק נגד שפיכה, נגד אדים; צינורות מתאם Y; מסנן נבלות פחם
Sprague-Dawley חולדהמושבת Envigo 208a, אינדיאנפוליס, IN
משחת עיניים מבוססת נפט וטרינרית Puralube26870מיושם במהלך ההרדמה כדי למנוע פגיעה בקרנית

מקורות

  1. Mantilla, C. B., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
  2. Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S. Acute intermittent hypoxia induced phrenic long-term facilitation despite increased sod1 expression in a rat model of als. Exp Neurol. 273, 138-150 (2015).
  3. Nichols, N. L., Craig, T. A., Tanner, M. A. Phrenic long-term facilitation following intrapleural ctb-sap-induced respiratory motor neuron death. Respir Physiol Neurobiol. 256, 43-49 (2018).
  4. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  5. Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant sod1g93a model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
  6. Shibuya, K., et al. Motor cortical function determines prognosis in sporadic als. Neurology. 87 (5), 513-520 (2016).
  7. Lewelt, A., et al. Compound muscle action potential and motor function in children with spinal muscular atrophy. Muscle Nerve. 42 (5), 703-708 (2010).
  8. Mcgovern, V. L., et al. Smn expression is required in motor neurons to rescue electrophysiological deficits in the smnδ7 mouse model of sma. Hum Mol Genet. 24 (19), 5524-5541 (2015).
  9. Arnold, W. D., et al. Electrophysiological biomarkers in spinal muscular atrophy: Preclinical proof of concept. Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).
  10. Harrigan, M. E., et al. Assessing rat forelimb and hindlimb motor unit connectivity as objective and robust biomarkers of spinal motor neuron function. Sci Rep. 9 (1), 16699(2019).
  11. Arnold, W. D., et al. Electrophysiological motor unit number estimation (mune) measuring compound muscle action potential (cmap) in mouse hindlimb muscles. J. Vis. Exp: JoVE. (103), e52899(2015).
  12. Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons. J. Vis. Exp: JoVE. (99), e52605(2015).
  13. Mccomas, A., Fawcett, P. R. W., Campbell, M., Sica, R. Electrophysiological estimation of the number of motor units within a human muscle. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 34 (2), 121-131 (1971).
  14. Felice, K. J. A longitudinal study comparing thenar motor unit number estimates to other quantitative tests in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 20 (2), 179-185 (1997).
  15. Vucic, S., Rutkove, S. B. Neurophysiological biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 31 (5), 640-647 (2018).
  16. Carleton, S., Brown, W. Changes in motor unit populations in motor neurone disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 42 (1), 42-51 (1979).
  17. Yuen, E. C., Olney, R. K. Longitudinal study of fiber density and motor unit number estimate in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Neurology. 49 (2), 573-578 (1997).
  18. Gooch, C. L., et al. Motor unit number estimation: A technology and literature review. Muscle Nerve. 50 (6), 884-893 (2014).
  19. Henderson, R. D., Ridall, P. G., Hutchinson, N. M., Pettitt, A. N., Mccombe, P. A. Bayesian statistical mune method. Muscle Nerve. 36 (2), 206-213 (2007).
  20. Shefner, J., et al. Multipoint incremental motor unit number estimation as an outcome measure in als. Neurology. 77 (3), 235-241 (2011).
  21. Stein, R. B., Yang, J. F. Methods for estimating the number of motor units in human muscles. Ann Neurol. 28 (4), 487-495 (1990).
  22. Shefner, J. M. Motor unit number estimation in human neurological diseases and animal models. Clin Neurophysiol. 112 (6), 955-964 (2001).
  23. Ahad, M., Rutkove, S. Correlation between muscle electrical impedance data and standard neurophysiologic parameters after experimental neurogenic injury. Physiol Meas. 31 (11), 1437(2010).
  24. Kasselman, L. J., Shefner, J. M., Rutkove, S. B. Motor unit number estimation in the rat tail using a modified multipoint stimulation technique. Muscle Nerve. 40 (1), 115-121 (2009).
  25. Ngo, S., et al. The relationship between bayesian motor unit number estimation and histological measurements of motor neurons in wild-type and sod1g93a mice. Clin Neurophysiol. 123 (10), 2080-2091 (2012).
  26. Feasby, T., Brown, W. Variation of motor unit size in the human extensor digitorum brevis and thenar muscles. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 37 (8), 916-926 (1974).
  27. Nichols, N. L., Vinit, S., Bauernschmidt, L., Mitchell, G. S. Respiratory function after selective respiratory motor neuron death from intrapleural ctb-saporin injections. Exp Neurol. 267, 18-29 (2015).
  28. Nichols, N. L., et al. Ventilatory control in als. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 429-437 (2013).
  29. Cifra, A., Nani, F., Nistri, A. Respiratory motoneurons and pathological conditions: Lessons from hypoglossal motoneurons challenged by excitotoxic or oxidative stress. Respir Physiol Neurobiol. 179 (1), 89-96 (2011).
  30. Kobayashi, Z., et al. Fals with gly72ser mutation in sod1 gene: Report of a family including the first autopsy case. J Neurol Sci. 300 (1), 9-13 (2011).
  31. Su, M., Wakabayashi, K., Tanno, Y., Inuzuka, T., Takahashi, H. An autopsy case of amyotrophic lateral sclerosis with concomitant alzheimer's and incidental lewy body diseases. No to shinkei= Brain and nerve. 48 (10), 931-936 (1996).
  32. Lladó, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the sod1 g93a transgenic rat model of als. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
  33. Borkowski, L. F., Smith, C. L., Keilholz, A. N., Nichols, N. L. Divergent receptor utilization is necessary for phrenic long-term facilitation over the course of motor neuron loss following ctb-sap intrapleural injections. J Neurophysiol. 126 (3), 709-722 (2021).
  34. Nicolopoulos-Stournaras, S., Iles, J. F. Motor neuron columns in the lumbar spinal cord of the rat. J Comp Neurol. 217 (1), 75-85 (1983).
  35. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: An approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Sci Rep. 6 (1), 33058(2016).
  36. Mchanwell, S., Biscoe, T. The localization of motoneurons supplying the hindlimb muscles of the mouse. Phil. Trans. R. , 477-508 (1981).
  37. Nair, J., et al. Histological identification of phrenic afferent projections to the spinal cord. Respir Physiol Neurobiol. 236, 57-68 (2017).
  38. Courtine, G., et al. Can experiments in nonhuman primates expedite the translation of treatments for spinal cord injury in humans. Nat Med. 13 (5), 561-566 (2007).
  39. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Sci Transl Med. 7 (302), 134(2015).
  40. Arnold, R., et al. Nerve excitability in the rat forelimb: A technique to improve translational utility. J Neurosci Methods. 275, 19-24 (2017).
  41. Boriek, A., Rodarte, J., Reid, M. Shape and tension distribution of the passive rat diaphragm. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 280, R33-R41 (2001).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הערכת תוצאות הקישוריות של יחידת הקישוריות המוטורית של דיאפרגמה חולדה מודדת כסמנים ביולוגיים כמותיים של ניוון ופיצוי של נוירונים מוטוריים פרניים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.