השיטה שפותחה של תיוג 13C6-Glucose בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציית מסה ברזולוציה גבוהה היא רב-תכליתית ומניחה את הבסיס למחקרים עתידיים על האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא, כמו גם ניצול מקיף של מטבוליטים שניוניים אלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
13C6-תיוג גלוקוז הקשור LC-MS: זיהוי של איברים ראשוניים צמחיים בסינתזת מטבוליטים משנית
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאמר זה מציג שיטה חדשנית ויעילה לאישור איברים ראשוניים המעורבים בסינתזת מטבוליטים שניונית. כמטבוליט המשני החשוב ביותר בפריזפוליפילה var. yunnanensis (Franch.) יד. -Mzt. (PPY), פריז saponin (PS) יש מגוון רחב של פעילויות פרמקולוגיות PPY הוא ביקוש גובר. מחקר זה ביסס עלים, קני שורש וצרור גזע-כלי דם 13C6-גלוקוז הזנה ולא הזנה ארבעה טיפולים כדי לאשר במדויק את האיברים העיקריים המעורבים בסינתזת פריז ספונינים VII (PS VII). על ידי שילוב ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS), חושבו במהירות ובמדויק היחסים של 13C/12C של עלה, קנה שורש, גזע ושורש בטיפולים שונים, ונמצאו ארבעה סוגים של יחסי שיא יונים איזוטופיים PS (M−): (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− ו-(M+4) −/M−. התוצאות הראו כי היחס של 13C/12C בקני השורש של צרור גזע-כלי דם וקני שורש היה גבוה משמעותית מזה שבטיפול ללא האכלה. בהשוואה לטיפול ללא הזנה, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) −/M− בעלים גדל משמעותית תחת טיפולי הזנה של עלים וגבעול-כלי דם. במקביל, בהשוואה לטיפול ללא הזנה, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) - / M - בעלים תחת טיפול קנה שורש לא הראה הבדל משמעותי. יתר על כן, היחס בין מולקולות PS VII (M+2) - / M - בגזע, בשורש וקנה השורש לא הראה הבדלים בין ארבעת הטיפולים. בהשוואה לטיפול ללא האכלה, היחס בין מולקולת Paris saponin II (PS II) (M+2) −/M− בעלים תחת טיפול הזנת עלים לא הראה הבדל משמעותי, והיחס (M+3) −/M− של מולקולות PS II בעלים תחת טיפול הזנת עלים היה נמוך יותר. הנתונים אישרו כי האיבר העיקרי לסינתזה של PS VII הוא העלים. הוא מניח את הבסיס לזיהוי עתידי של האיברים והמסלולים העיקריים המעורבים בסינתזה של מטבוליטים משניים בצמחי מרפא.
מבוא
המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים בצמחים הם מורכבים ומגוונים, וכוללים איברי צבירה ספציפיים ומגוונים מאוד1. כיום, אתרי הסינתזה הספציפיים והאיברים האחראים למטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא רבים אינם מוגדרים היטב. עמימות זו מציבה מכשול משמעותי לקידום אסטרטגי וליישום של שיטות גידול שנועדו לייעל הן את התשואה והן את האיכות של חומרי מרפא.
ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה וטכניקות תיוג איזוטופים נמצאות בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי הסינתזה והאתרים של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא 2,3,4,5, וכל אחת מהמתודולוגיות הללו מציגה חוזקות ומגבלות ייחודיות, כגון הבדלים ביעילות ובדיוק.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה ניסיונית
- ודא כי במהלך גידול הצמח, הלחות היחסית של החממה היא 75%, טמפרטורות היום / לילה הם 20 °C / 10 °C (75 °F), תקופת הצילום מורכבת מ 12 שעות ביום ו 12 שעות בלילה, ואת עוצמת האור היא 100 μmol·m-2·s-1. מספקים קרינה באמצעות מנורות דיודה פולטות אור (LED), תוך שמירה על מרחק של 30 ס"מ בין מנורת הלד לחופת הצמח.
הערה: תקופת האור ועוצמת האור הם בהתאם למספר שעות השמש במהלך תקופת הגידול ביונאן. קרינה נמדדת באופן שגרתי על ידי חיישן קוונטי (ראו טבלת חומרים). בצע את השינויים הנדרשים בפרמטרים סביבתיים בהתאם למאפייני צמח המרפא. לאחר שתנאים סביבתיים אלה כוילו בקפידה בהתבסס על מאפייני הצמח ופרופיל אור השמש ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לאשר שאספקת 13C6-גלוקוז בקני שורש הייתה מוצלחת, ניתחנו עוד יותר את יחסי האיזוטופים של 13C/12C בקני שורש. יחסי האיזוטופים של 13C /12C בטיפולים 3 ו-4 היו גבוהים בהרבה מאלה של טיפול 2 (איור 1A). התוצאות הצביעו על כך ש-13C,6-גלוקוז מטיפול 3 ו-4 נכנסו לקני השורש באמצעות בליעה.
היחסים של 13פסגות איזוטופ C, כגון (M+1) −/M−, (M+2) −/M
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היישום המוצלח של פרוטוקול זה תלוי במחקר מקיף של תכונות פיזיולוגיות של צמחים, רקמות, איברים ומטבוליטים משניים. גישת התכנון הניסויי המתוארת בפרוטוקול מניחה בסיס איתן לחקר המסלולים הביוסינתטיים של מטבוליטים שניוניים צמחיים. הגורמים הקריטיים בניסוי זה הם: (1) קביעת גיל השתילים הרב-שנתיים ו-(2) בחירת העיתוי הנכון לזיהוי תיוג-תיוג איזוטופים. צמחי המרפא מסווגים לרב-שנתיים וחד-שנתיים, כל אחד עם דפוסים שונים של סינתזת מטבוליטים משנית וצבירה. ניסוי זה נועד להבהיר את האיברים הסינתטיים העיקריים של מטבוליטים שניוניים בצמחי מרפא על יד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של תוכנית הנוער של סין (מס '82304670).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.1% מי חומצה פורמית | מפעל ריאגנטים כימיים צ'נגדו קלונג | 44890 | |
| 13C6-אבקת גלוקוז | MERCK | 110187-42-3 | |
| אצטוניטריל | צ'נגדו קלונג מפעל ריאגנטים כימיים | 44890 | |
| AUTOSAMPLER בקבוקונים Biosharp | Biotechnology Company | 44866 | |
| BEH C18 טור | ווטרס, מילפור, MA | 1.7μ m, 2.1 * 100 מ"מ | |
| CNC אולטרסאונד מנקה | Kunshan אולטרסאונד מכשיר ושות', בע"מ | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM תוכנה | Thermo Scientific, Fremont, CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM תוכנה | תרמו סיינטיפיק, פרמונט, קליפורניה | 3 | |
| תנור ייבוש פיצוץ בטמפרטורה קבועה חשמלית | DHG-9146A | ||
| מפעל ריאגנט כימי צ'נגדו קלונג | 44955 | ||
| מטחנה מהירה מדגם אוטומטי לחלוטין | שנחאי Jingxin טכנולוגיה | Tissuelyser-48 | |
| גז כרומטוגרפיה יציבה יחס איזוטופ ספקטרומטר מסה | תרמו פישר | דלתא V יתרון | |
| פתרון הוגלנד | סיגמא-אולדריץ' | H2295-1L | |
| טנק הידרופוני | JRD | 1020421 | |
| תוכנת Isodat | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה | Agilent Technology | אג'ילנט 1260 -6120 | |
| מכשיר לייצור חנקן | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| מסנן פאזה אורגני | טיאנג'ין Jinteng ציוד ניסיוני ושות', בע"מ | 44890 | |
| משאבת חמצן | Magic Dragon | MFL | |
| חיישן קוונטי | Highpoint | UPRtek | |
| אזמל | יד | 11-23 | |
| התזה יכול | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur תוכנה | תרמו פישר סיינטיפיק | 4.2 |
מקורות
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
