פרוטוקול זה מתאר את כל ההליכים, החל מגידול תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי (ADSCs) ואיסוף סופרנאטנט ועד לחילוץ בועיות חוץ-תאיות (EVs) באמצעות אולטרה-צנטריפוגה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
טיהור ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי (ADSCs) יכולים לקדם התחדשות ושחזור של רקמות ואיברים שונים. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שניתן לייחס את תפקודם הרגנרטיבי למגע בין תאים ולהשפעות פרקריניות של תאים. האפקט הפרקריני הוא דרך חשובה לתאים לתקשר ולהעביר מידע למרחקים קצרים, שבהם שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ממלאות תפקיד פונקציונלי כנשאיות. קיים פוטנציאל משמעותי ל-ADSC EVs ברפואה רגנרטיבית. מחקרים רבים דיווחו על יעילותן של שיטות אלה. כיום מתוארות שיטות שונות לחילוץ ובידוד כלי רכב חשמליים המבוססות על עקרונות כגון צנטריפוגה, משקעים, גודל מולקולרי, זיקה ומיקרופלואידיקה. אולטרה-צנטריפוגה נחשבת לתקן הזהב לבידוד כלי רכב חשמליים. עם זאת, פרוטוקול קפדני להדגשת אמצעי זהירות במהלך אולטרה-צנטריפוגה עדיין נעדר. מחקר זה מציג את המתודולוגיה והצעדים המכריעים הכרוכים בתרבות ADSC, איסוף סופרנאטנטים ואולטרה-צנטריפוגה של כלי רכב חשמליים. עם זאת, למרות שאולטרה-צנטריפוגה היא חסכונית ואינה דורשת טיפול נוסף, עדיין ישנם כמה חסרונות בלתי נמנעים, כגון שיעור התאוששות נמוך וצבירת רכב חשמלי.
מבוא
רוב ADSCs נגזרים מרקמת השומן והוכחו כמקדמים התחדשות ושחזור של רקמות ואיברים שונים, כולל שריר הלב, העצם והעור1. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתפקוד הרגנרטיבי של ADSCs עשוי לנבוע ממגע בין-תאי ומההשפעות הפרקריניות של התאים2. האפקט הפרקריני הוא אמצעי חשוב עבור תאים לתקשר ולהעביר מידע על פני מרחקים קצרים, ופונקציה זו מושגת באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs).
כלי רכב חשמליים הם מבני קרום דו-שכבתיים המיוצרים על ידי תאים, בקוטר הנע בין 40 ננומטר ל-160 ננומטר (עם ממוצע של כ-100 ננומטר). הם משפיעים על תפקודים תאיים שונים, כגון ייצור ציטוקינים, התפשטות תאים, אפופטוזיס ומטבוליזם 3,4. מחקרים רבים נערכו על תפקודים של ADSC EVs, כולל קידום התחדשות עצם, התחדשות רקמת רירית הפה, הישרדות רקמת שומן לאחר השתלת רקמות, ותיקון פצעים בעור 5,6,7,8. הפוטנציאל העצום של ADSC EVs ברפואה רגנרטיבית ניכר. קיימות שיטות שונות לחילוץ והפרדה של כלי רכב חשמליים מהסופר-נטנט, כגון טכניקות המבוססות על צנטריפוגה, משקעים, גודל מולקולרי, זיקה ומיקרופלואידיקה. שיטת האולטרה-צנטריפוגה נחשבת לתקן הזהב לבידוד כלי רכב חשמליים9. העיקרון הבסיסי של אולטרה-צנטריפוגה להפרדת EV מבוסס על העובדה שלחלקיקים במדגם יש מקדמי שיקוע משתנים, וכתוצאה מכך שיקוע וצבירה שלהם בשכבות הפרדה נפרדות. עם זאת, טרם נקבע פרוטוקול מפורט המדגיש את אמצעי הזהירות במהלך אולטרה-צנטריפוגה.
לכן, מחקר זה מתאר באופן אובייקטיבי את תרבות ADSC, איסוף supernatant ונהלי אולטרה-צנטריפוגה של כלי רכב חשמליים ונקודות מפתח עם זרימה לוגית של מידע ושפה רשמית ברורה. זה מספק התייחסות חשובה לניסויים עתידיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הסקירה הכללית של שלבי הפרוטוקול מוצגת באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת מדיה
- הכינו מדיום תרבית עבור ADSC ללא אקסוזומים באמצעות 450 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית, 50 מ"ל של נסיוב בקר עוברי ללא אקסוזומים, ו-5 מ"ל של אנטיביוטיקה משולשת.
2. החייאה וטיפוח ADSCs
הערה: לבצע החייאה ADSCs.
- הפעילו מראש את קרינת ה-UV של השולחן האולטרה-נקי וחיטאו אותו למשך 30 דקות.
- מחממים מראש את המדיום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- שלפו 2 צינורות של ADSCs קפואים (P3) מחנקן נוזלי ועוררו אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם טמפרטורה קבועה עד להפשרה מלאה.
הערה: פתיחת צינור המקפיא לא צריכה להיות במגע עם מים כדי למנוע זיהום. - יש לחטא את הצינורית בהקפאה באמצעות 75% אלכוהול ולאחר מכן להעביר אותה לשולחן נקי במיוחד. שאפו את מתלה התא באמצעות פיפטה והניחו אותו בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
- הכניסו את צינור הצנטריפוגה למכונת צנטריפוגות במהירות נמוכה ולצנטריפוגה במהירות של 250 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
- מכינים ארבע מנות תרבית בקוטר 10 ס"מ ומכניסים 9 מ"ל בינוני לכל מנה. סמן את השם, סוג התא, הדור ותאריך הניסוי, ולאחר מכן חמם אותם מראש באינקובטור תאים תרמוסטטי של 37 מעלות צלזיוס.
- יש לחטא את צינור הצנטריפוגה ולהעביר אותו לשולחן נקי במיוחד. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.
- מוסיפים 4 מ"ל בינוני ומסעירים בעדינות את התמיסה (1 x 10,5 תאים/מ"ל) עד שהיא מפוזרת באופן שווה.
הערה: יש להיזהר שלא לסלק את כדורית התא בעת חילוץ הסופרנטנט. - הוסף 1 מ"ל של תרחיף תאים לכל מנה. נערו את הכלים בשיטת צלב.
הערה: מקם את הלוח על משטח ישר ועורר אותו בדוגמת צלב (הזז אותו למעלה, למטה, שמאלה וימינה) במשך 5-6 חזרות. הימנע תנועות מעגליות, כפי שהם עלולים לגרום הצטברות תאים במרכז. - התבוננו בתאים בהגדלה של פי 40 עם המיקרוסקופ האופטי, ולאחר מכן הכניסו את הכלים לאינקובטור.
הערה: המטרה העיקרית של התבוננות בתאים היא לקבוע אם הם מפוזרים באופן שווה, מכיוון שפיזור לא אחיד ישפיע על הצמיחה הבאה. - הכינו אמצעי החלפה עבור התאים.
- הפעילו מראש את קרינת ה-UV של השולחן האולטרה-נקי וחיטאו אותו למשך 30 דקות.
- מחממים מראש את המדיום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- התבוננו במצב התא תחת המיקרוסקופ האופטי בהגדלה של פי 40. רמת המפגש היא כ -50%.
הערה: רמת המפגש מחושבת כיחס בין השטח התפוס על ידי התאים לשטח הפנים של צלחת הפטרי לאחר שהתאים נצמדים לקיר ונמתחים במלואם. - מעבירים את צלחת התרבית לשולחן אולטרה נקי (רמת בטיחות ביולוגית 2) לאחר החיטוי ומסירים את המדיום.
- שטפו בעדינות כל צלחת תרבית פעמיים בתמיסת PBS במינון 2 מ"ל.
- מוסיפים 10 מ"ל בינוני לכל מנה. מעבירים את הכלים לאינקובטור.
3. איסוף ה-ADSCs supernatant וחילוץ כלי הרכב החשמליים
- הפעילו מראש את קרינת ה-UV של השולחן האולטרה-נקי וחיטאו אותו למשך 30 דקות.
- התבונן במצב התא תחת מיקרוסקופ. רמת המפגש היא כ-80%.
- מעבירים את התבשיל לשולחן נקי במיוחד לאחר החיטוי. בזהירות לאסוף את supernatant עם פיפטה ומניחים אותו בתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
הערה: ניתן להקפיא או למחוק תאים. אם אין צורך בסטריליות, ניתן לבצע את השלבים הבאים על שולחן הניתוחים. בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי ולאחר מכן להפעיל אותו מחדש מאוחר יותר. אם הניסוי נעצר, אחסנו את הסופרנאטנט במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ מכיוון שהוא עלול להשפיע על פעילות כלי הרכב החשמליים. הגישה האופטימלית היא לחלץ רכבים חשמליים באופן מיידי. - צנטריפוגה (300 x גרם, 10 דקות, בטמפרטורת החדר) להסרת תאים מרחפים. אוספים את הסופרנאטנט עם פיפטה.
הערה: אין לשפוך. השאירו מעט סופרנאטנט כדי למנוע מהגלולה להישאב. - צנטריפוגה כדי להסיר פסולת תאית (2000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C), ולאחר מכן להמשיך לאסוף את supernatant עם פיפטה.
הערה: נקודות המפתח זהות לשלב 3.4. - סנן את supernatant עם קרום 0.22 um כדי להסיר חלקיקים גדולים ופסולת התא.
הערה: סננו את הסופרנאטנט עם 2 מ"ל PBS סטרילי כדי להרטיב את קרום המסנן לפני הסינון. - צנטריפוגה במכונת אולטרה-צנטריפוגות (10,000 x גרם, 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
- לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,00,000 x גרם במשך 70 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את הגלולה ולאסוף את supernatant.
הערה: כלי הרכב החשמליים שהתקבלו טוהרו על ידי צנטריפוגה מספר פעמים כדי להגביר את טוהרם. ייתכן שהגלולה לא תהיה גלויה לעין בלתי. לכן, חשוב להפעיל את פיפטה בעדינות ולהשאיר מעט סופרנאטנט בתחתית כדי למנוע איסוף כדורים. - מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה. השהה מחדש את הגלולה עם PBS וצנטריפוגה (1,00,000 x גרם, 70 דקות, 4 ° C).
הערה: ייתכן שהגלולה לא תהיה גלויה לעין בלתי. לכן, כאשר שואפים את הסופרנאטנט עם פיפטה, קריטי להסיר את הסופרנאטנט בעדינות וביסודיות כדי למקסם את טוהר הרכבים החשמליים. - הסר את supernatant ולקבל את גלולת EVs. להשעות אותו עם 1 מ"ל של PBS, להעביר אותו לתוך צינור צנטריפוגה 1 מ"ל, ולאחסן אותו במקרר 4 ° C לגילוי הבא.
הערה: ייתכן שהגלולה לא תהיה גלויה לעין בלתי. לכן, כאשר שואפים את הסופרנאטנט עם פיפטה, חשוב להסיר את הסופרנאטנט בעדינות וביסודיות כדי למקסם את טוהר הרכב החשמלי. אם הדגימות אינן נחוצות לתקופה ממושכת, אחסנו אותן במקרר של -80 מעלות צלזיוס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ראשית, ADSCs אופיינו וזוהו, כולל המורפולוגיה10 שלהם ונוגדנים פני השטח. בהתבסס על איור 2A, נראה ש-ADSCs מסודרים בצורת ציר ויוצרים מערבולת לאחר צמיחה צפופה. התאים בתרבית התמינו לתאים אדיפוגניים, אוסטאוגניים וכונדרוגניים ונצבעו באדום שמן O, אדום אליזרין וכחול אלקיאן11. ניסוי הדיפרנציאציה המושרה וציטומטריית הזרימה אישרו כי הם אכן ADSCs עם פוטנציאל להתמיינות רב-כיוונית. אולם 22% מהתאים הם חיוביים ל-CD45 בתוצאות, מה שלא ישפיע על המסקנה מאחר שמספיק נו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במהלך תהליך הניסוי הפורמלי, מספר נקודות הן קריטיות להשגת תוצאות הניסוי הטובות ביותר. בהתבסס על ניסיון העבר שלנו, מומלץ לבחור במעבר 3-6 ADSCs, מכיוון שהם מבטיחים את מצב התא הטוב ביותר האפשרי. לפני P3, ייתכן שתאי דם אדומים, תאי אנדותל ותאים שונים אחרים לא נבדקו. לאחר P6, התאים עשויים להזדקן בהדרגה, מה שיכול להשפיע על מצב ה-EV המופרש. שנית, יש לאסוף את הסופרנאטנט כאשר דרגת מפגש התאים היא בין 80% ל-90% כדי להבטיח הפרשה מספקת של כמה שיותר כלי רכב חשמליים. כדי לשמור על הטוהר המרבי של כלי רכב חשמליים, על החוקרים להיות זהירים במ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרס כלכלי להצהיר.
תודות
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82202473).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מסנן מחט Acrodisc של Supor Membrane | Acros Organics | 4652 | 0.22 μ m |
| מדיום בסיסי לתרבית תאים | OriCell | BHDM-03011 | |
| סרום בקר עוברי ללא EXO + תוסף תרבית (לתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי) | OriCell | HUXMD-05002 | |
| מיקרוסקופ הפוך | OLYMPUS | Lx70-S8F2 | |
| צנטריפוגה במהירות נמוכה | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd. | SC-3612 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | |
| Optima Max-XP שולחני אולטרה-צנטריפוגה | בקמן קולטר | 393315 | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין-ג'נטמיצין (100x) | Solarbio | P1410 |
מקורות
- Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward. Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).
- Xin, H., Li, Y., Chopp, M. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke. Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).
- Li, Q., et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).
- Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).
- Zheng, Y., et al. Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing). Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).
- Mou, S., et al. Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application. Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).
- Li, W., et al. Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).
- Han, B., et al. Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis. Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).
- Brezgin, S., et al. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).
- Kim, S. H., et al. Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).
- Gan, L., et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway. Cytokine. 172, 156386(2023).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. J Vis Exp. (131), e56482(2018).
- Han, Y. D., et al. Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).
- Baranyai, T., et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).
- Yuan, X., et al. Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).
- Eguchi, T., et al. Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment. PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
