הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66589

⸱

24 במאי 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים להכנת דגימות רשתית עבור מיקרוסקופ אלקטרונים נפח, תוך התמקדות בתכונות המבניות של הדקי קולטני אור ברשתית.

תקציר

מיקרוסקופ אלקטרונים נפח (Volume EM) התגלה ככלי רב עוצמה להדמיית המבנה התלת-ממדי של תאים ורקמות בדיוק ברמה ננומטרית. בתוך הרשתית, סוגים שונים של נוירונים יוצרים קשרים סינפטיים בשכבות הפרספקס הפנימיות והחיצוניות. בעוד שטכניקות EM קונבנציונליות הניבו תובנות יקרות ערך לגבי אברונים תת-תאיים ברשתית, המגבלה שלהם טמונה באספקת נתוני תמונה דו-ממדיים, שיכולים לעכב מדידות מדויקות. לדוגמה, כימות גודלן של שלוש בריכות שלפוחית סינפטיות נפרדות, החיוניות להעברה סינפטית, הוא מאתגר בדו-ממד. Volume EM מציעה פתרון על ידי אספקת נתונים תלת-ממדיים בקנה מידה גדול וברזולוציה גבוהה. ראוי לציין כי הכנת הדגימה היא שלב קריטי בנפח EM, המשפיע באופן משמעותי על בהירות התמונה וניגודיות. בהקשר זה, אנו מתווים פרוטוקול הכנת דגימה לשחזור תלת ממדי של מסופי אקסון קולטני אור ברשתית. פרוטוקול זה כולל שלושה שלבים מרכזיים: דיסקציה וקיבוע רשתית, תהליכי הטמעת דגימה ובחירת תחום העניין.

מבוא

הרשתית עמוסה בצפיפות באקסונים עצביים ודנדריטים המשתלבים זה בזה ויוצרים סינפסות ביניהם1. מיקרוסקופיה היא כלי חיוני לחקר אנטומיה של הרשתית מכיוון שיש לה מבנים עדינים, מורכבים וקטנים. למרות שמיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מספק כוח שאין שני לו לחקור את המבנה העל-תאי של אברונים תת-תאיים ואת הלוקליזציה המדויקת של חלבונים ספציפיים ברמה הננומטרית2, הוא מייצר תמונות המוגבלות למישור הדו-ממדי (2D), מה שמוביל לאובדן פוטנציאלי של מידע מפתח.

הפיתוח של טכניקות מתפתחות של מיקרוסקופ אלקטרונים בנפח ברזולוציה גבוהה (Volume EM) תומך במתן מידע מבני תלת מימדי (3D) מקיף יותר בקנה מידה גדול יותר. כמה שיטות EM 3D נבדקו לאחרונה על ידי אחרים 3,4,5. 3D EM מאפשר שחזור של צורה עצבית ופרטי קישוריות, ומאפשר ניתוח כמותי מדויק של מבנים מעניינים. זה מוכיח כי הנתונים המתקבלים על ידי נפח EM הם שיטתיים יותר, שלמים ומדויקים.

קולטני אור ברשתית, המהווים את הנוירונים הראשוניים באיתות חזותי 6,7, מקימים סינפסות עם דנדריטים של תאים דו-קוטביים ואופקיים מסדר שני במסוף הפוטורצפטור כדי להקל על אותות מעוררים 8,9. הדקים אלה, המכונים פדיקור חרוט ושרטוט מוטות, כוללים שלושה מרכיבים חיוניים: מיטוכונדריה, סרטים סינפטיים ובועיות סינפטיות. בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בעיקר במבנה הכללי של סינפסות סרט, היה היעדר בולט של חקירה לגבי המבנה העדין של רכיבים עיקריים, כולל מיטוכונדריה, סרט, בריכות שלפוחית, והארגון המרחבי שלהם בטרמינלים 10,11,12,13. ניתוח מדויק ושיטתי של כל רכיב, יחד עם הבנה של הקשר ההדדי שלהם בתוך הדקי קולטני אור, חיוני לפענוח הארגון המרחבי ולתפיסה מקיפה של פונקציות עיבוד חזותי. בפוטורצפטורים, מיטוכונדריה נמצאים בעיקר במקטע הפנימי, בגוף התא ובטרמינל. התמקדנו כאן במיטוכונדריה בפוטורצפטורים הסופיים. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM), סוג של נפח EM המתגאה ברזולוציה גבוהה (x, y ו- z ברזולוציה < 5 ננומטר) ושטף נפח גדול יחסית 4,14, עומד ככלי רב עוצמה להדמיה מדויקת של המבנה התלת-ממדי של הדקי קולטני אור.

הן FIB-SEM והן Serial Block Face Scanning Electron Microscope (SBF-SEM) הם Volume EM המבוסס על SEM לקבלת תמונה של רקמות על ידי סריקת פני השטח של הדגימה. התכונות האולטרה-סטרוקטורליות של פני השטח של הדגימה מתגלות באמצעות הניגוד שנוצר על ידי עוצמת אלקטרונים משניים או מפוזרים לאחור (BSE) כאשר קרן האלקטרונים סורקת את הדגימה15. בעיקרו של דבר, זיהוי BSE או אלקטרונים משניים משטח החתך של דגימת רקמה משובצת שרף ב- SEM מאפשר קבלת תמונות של הדגימה המשובצת16,17. כאשר BSE או אלקטרונים משניים נוצרים פחות, ניתן לקבל מידע על משטח הדגימה בלבד. השגת ניגודיות עקבית ותמונות טוריות באיכות גבוהה מחייבת שיקוע מספיק של מתכות כבדות בדגימה. לכן, פרוטוקולים ספציפיים להכנת דגימות חיוניים לסגמנטציה עוקבת, שחזור תלת-ממדי וניתוח בעת שימוש ב-SEM להדמיה סדרתית. שיטת osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) היא ערכת הכנת דגימות טיפוסית למיקרוסקופ אלקטרונים תלת-ממדי של דגימות ביולוגיות, תוך שמירה על מבנה הממברנות המכילות שומנים ושמירה על ניגודיות טובה18,19.

כאן, פיתחנו את שיטת OTO להכנת דגימות רשתית לשימוש ב- Volume EM. תהליך זה מתמקד במיוחד בניתוח הרשתית, קביעת זמן הקיבוע האופטימלי לרקמת הרשתית ופירוט ההליכים ואמצעי הזהירות הספציפיים בהכנת דגימה תלת ממדית. בנוסף, סגמנטציה ושחזור תלת ממדי של מבנה היעד הם שלבים אינטגרליים ביישום מורחב זה. הרשתית, בהיותה מבנה קטן ומאתגר להשגת חומרים, דורשת פעולות מהירות ומדויקות עבור EM, עם זמנים קבועים וריאגנטים טריים מוכנים לשימוש מיידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקולים לטיפול ושימוש בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו ועקבו אחר ההנחיות שנקבעו על ידי האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO). כל העכברים נשמרו במחזור אור של 12 שעות וחושך של 12 שעות וסופקו להם דיאטת צ'או סטנדרטית.

1. דיסקציה וקיבוע הרשתית

  1. מרדימים את העכברים (C57BL/6J, זכר, בן 8 שבועות, 20-25 גרם) על ידי הזרקת 2,2,2-טריברומואתנול (0.25 מ"ג/גרם משקל גוף) תוך צפקית. יש לוודא את עומק ההרדמה ללא נסיגה של הכף האחורית לאחר צביטת הבוהן או ללא רפלקס מצמוץ. לאחר מכן, נקע את חוליית הצוואר בעודו תחת הרדמה כדי להרדים את החיה.
    הערה: Tribromoethanol נבחר בשל יעילותו המתועדת היטב בגרימת הרדמה מהירה ואמינה במודלים של בעלי חיים קטנים, במיוחד עבור הליכים קצרי טווח. בעוד הרדמה באיכות תרופתית עדיפה, tribromoethanol מציע יתרונות ספציפיים בפרוטוקולים מסוימים, מה שהופך אותו חלופה מתאימה כאשר מוכן כראוי מנוהל. כל אמצעי הזהירות ננקטו כדי להבטיח שימוש בטוח ויעיל בו. מחקר זה דבק בשיקולים אתיים על ידי הבטחת הכנה, ניהול וניטור נאותים כדי להפחית סיכונים פוטנציאליים הקשורים לשימוש בו.
  2. הסר את העיניים עם מספריים מעוקלים ולטבול את העיניים בתמיסה מעורבת המכילה 2% גלוטראלדהיד ו -2% פרפורמלדהיד בחיץ פוספט (PB, 0.1 M, pH 7.4).
  3. הסר את המקטע הקדמי ואת הזגוגית מהעיניים עם מלקחיים מתחת למיקרוסקופ המנתחת.
  4. מקלפים את לובן העין עם שתי המלקחיים עד שהרשתית מבודדת לחלוטין מהעין.
  5. חותכים את הרשתית במהירות לרצועות בעובי 100 - 200 מיקרומטר עם סכין גילוח ומטפלים ברצועות הרשתית עם פיפטת פסטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש (EP) המכיל 2% גלוטראלדהיד ו-2% פרפורמלדהיד בחיץ פוספט (PB, 0.1 M, pH 7.4) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT) על המסובב. לאחר השלמת, מקם את הצינורות כדי לתקן ב 4 ° C במשך 24 שעות.

2. תהליך הטמעה לדוגמה

  1. לאחר שטיפה במאגר נתרן קודילט 0.1 M (pH 7.4) 5 פעמים במשך 15 דקות כל אחת, לדגור על רצועות הרשתית עם תמיסה המכילה 1.5% אשלגן פרוציאניד ו 1% OsO4 (ב PB, pH7.4) ב 0.1 M נתרן cacodylate עם 4 mM CaCl2 במשך 1.5 שעות בחושך על קרח.
    הערה: דגירה כהה וחוסר פוספט יכולים למנוע משקעים וממצאים בדגימה.
  2. שטפו את רצועות הרשתית 3 פעמים ב-ddH2O במשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן טפלו עם 1% thiocarbohydrazide ב-ddH2O במשך 30 דקות בחושך ב-RT.
  3. לאחר שטיפה ב-ddH2O 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחת, יש לדגור על רצועות הרשתית ב-2% OsO4 (ב-PB, PH 7.4) למשך 45 דקות בחושך ב-RT.
  4. לאחר שטיפה ב ddH2O 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחד, לטבול את רצועות הרשתית ב 1% אורניל אצטט מימי בחושך ב 4 ° C במשך הלילה.
  5. למחרת, לאחר שטיפה ב-ddH2O 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחת, יש לטפל ברצועות הרשתית עם 0.66% עופרת חנקתית בחומצה L-אספרטית (0.03 M, pH 5.5) למשך 40 דקות ב-65°C.
  6. לאחר שטיפה ב-ddH2O 3 פעמים במשך 15 דקות כל אחת, יש לייבש את רצועות הרשתית עם ריכוז אתנול עולה של 30%, 50%, 70%, 90% ו-100% למשך 20 דקות בכל תמיסה.
  7. יש לטפל ברצועות הרשתית בתמיסה מעורבת המכילה אתנול ואצטון שווים למשך 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף אצטון פעמיים למשך 20 דקות כל אחת.
  8. יש לחדור לרצועות הרשתית באצטון/שרף מעורבב ביחס של 7:3 בחושך ב-RT למשך הלילה ולאחר מכן אצטון/שרף ביחס של 3:7 בחושך למשך 24 שעות ב-RT.
    הערה: ההרכב המדויק של השרף הוא כדלקמן: Epon812 10.06 מ"ל, DDSA 4 מ"ל, MNA 5.94 מ"ל ו- DMP-30 0.2 מ"ל.
  9. שנה את הצינורות למחרת ולחדור את רצועות הרשתית עם שרף טהור במשך 24 שעות ב 45 ° C. שנה את השרף שוב למחרת, והטמע את רצועות הרשתית במשך 48 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.
    הערה: מטרת העלאת הטמפרטורה היא לשפר את החדירה.

3. בחירת תחום העניין

  1. חתכו את גושי השרף למקטעים בעובי 1 מיקרומטר, הכתימו חלקים עם 1% טולוידין-כחול, והתבוננו במבנה הכללי של הרשתית תחת מיקרוסקופ אור כדי לבחור את האזורים המחוספסים של העניין.
  2. מצפים את גושי השרף בפלטינה באמצעות קוטר מרזב, ולאחר מכן כרסום בחתך בעובי 70 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יון ממוקדת תחת זרם של 0.23 nA ומתח תאוצה של 30 קילו וולט.
  3. סנן מראש את המקטע באמצעות FIB-SEM עם הגדלה של 2000x כדי לזהות את אזורי העניין המדויקים.
  4. אסוף את הנתונים באמצעות FIB-SEM עם זרם קרן של 0.69 nA ומתח תאוצה של 2 kV. הפרמטרים האחרים הם כדלקמן: זמן שהייה = 2 μs, גודל voxel = 1.8 nm x 1.8 nm x 15 nm.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1A מראה את התמונה של הדקי קולטני אור ברשתית שהוכנו בשיטת הקיבוע הכימי הכפול המסורתית, ואיור 1B מראה את התמונה של הדקי קולטני אור ברשתית שהוכנו בשיטת OTO. שניהם נדגמו על ידי FIB-SEM. ניתן לראות בבירור כי מבנה קרום התא יכול להישמר ככל האפשר באמצעות שיטת OTO, ואפילו את קווי המתאר של שלפוחיות ניתן לראות בבירור. בנוסף, הניגודיות של תמונות המתקבלות באמצעות שיטת OTO הוא גם ברור יותר.

איור 2 מדגים את זרימת ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יישמנו את פרוטוקול הכנת דגימות Volume EM של OTO כדי לנתח את המבנה הסופי של הפוטורצפטורים ברקמת הרשתית. ההתמקדות הייתה בפירוט ההליך כולו, החל מהניתוק והקיבוע של הרשתית ועד להצגת התוצאות של שחזור תלת ממדי של מסופי אקסון קולטני אור.

התכונה הייחודית של רקמת הרשתית, בניגוד לרקמת המוח, טמונה בהיעדר הבדלים אזוריים. הרשתית, המורכבת משלוש שכבות של גופי תאים עצביים ושתי שכבות של קשרים סינפטיים, מציגה מבנה סדיר והיררכי למרות מורכבות מרכיביה העצביים והסינפטיים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילויים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2022YFA1105503), מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח (SKLN-202103), קרן ג'ג'יאנג למדעי הטבע של סין (Y21H120019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
אצטוןאלקטרונים מיקרוסקופיה מדע10000
אמירה 6.8תרמו פישר מדעי
CaCl2SigmaC-2661
עובש הטמעהבייג'ינג Zhongjingkeyi טכנולוגיהGP10590
Epon מדעמיקרוסקופיה אלקטרונית14900
אתנולסיגמא64-17-5
מיקרוסקופיה אלקטרוניתגלוטראלדהיד16020
Helios NanoLab 600i קרן כפולה SEMFEI
חומצה אספרטית L-אספרטיתסיגמא56-84-8
עופרת חנקתיתסיגמא10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650רכיב של מאגר פוספט
NaH2PO4. H2OSigma71507רכיב של מאגר פוספט
OsO4TED PELLA4008-160501
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
אשלגן פרוציאנידSigma14459-95-1
נתרן קקודילאטסיגמא6131-99-3
ציפוי מקרטעLeicaACE200
ThiocarbohydrazideSigma2231-57-4
אורניל אצטטTED PELLACA96049
שרף מדע

מקורות

  1. Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
  2. Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
  3. Varsano, N., Wolf, S. G. Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions. Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).
  4. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Sterling, P., Matthews, G. Structure and function of ribbon synapses. Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).
  7. Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).
  8. Thoreson, W. B. Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina. Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).
  9. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  10. Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).
  11. Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons. J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).
  12. Zampighi, G. A., et al. Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion. PLoS One. 6 (3), e16944(2011).
  13. Barnes, S., et al. Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs. Plos One. 11 (3), e0150024(2016).
  14. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, e25916(2017).
  15. Crewe, A. V., Lin, P. S. The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope. Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).
  16. Richards, R. G., Gwynn, I. A. Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy. J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).
  17. Wergin, W. P., et al. Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope. Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).
  18. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).
  19. Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy. Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).
  20. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  21. Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits. Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Front Neural Circuits. 12, 98(2018).
  23. Guo, J., et al. An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM. J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).
  24. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH). J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הכנת דגימות רשתיתקצוות פוטורצפטוריםשחזור תלת-ממדידיסקציה של הרשתיתהטמעה של דגימותאלומת יונים ממוקדתמיקרוסקופיית אלקטרונים סורקתמאגרי שלפוחיות סינפטיותמבנה ממבנה התא
הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.