מאמר שיטה

הרכבה מחדש של תעלת קולטן הגלוטמט החיידקי על ידי אנקפסולציה של מערכת ביטוי ללא תאים

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66595

⸱

8 במרץ 2024

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את שיטת התחליב ההפוך המשמשת לתמצת מערכת ביטוי ללא תאים (CFE) בתוך שלפוחית חד-למלרית ענקית (GUV) לחקר הסינתזה והשילוב של חלבון קרום מודל בדו-שכבתי השומנים.

תקציר

מערכות ביטוי חופשי של תאים (CFE) הן כלים רבי עוצמה בביולוגיה סינתטית המאפשרים ביומימיקריה של תפקודים תאיים כמו חישה ביולוגית והתחדשות אנרגיה בתאים סינתטיים. שחזור של מגוון רחב של תהליכים תאיים, לעומת זאת, דורש בנייה מחדש מוצלחת של חלבוני ממברנה לתוך הממברנה של תאים סינתטיים. בעוד שהביטוי של חלבונים מסיסים הוא בדרך כלל מוצלח במערכות CFE נפוצות, הבנייה מחדש של חלבוני ממברנה בדו-שכבות שומנים של תאים סינתטיים הוכחה כמאתגרת. כאן, מודגמת שיטה לבנייה מחדש של חלבון קרום מודל, קולטן גלוטמט חיידקי (GluR0), בשלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUVs) כמודל תאים סינתטיים המבוסס על אנקפסולציה ודגירה של תגובת CFE בתוך תאים סינתטיים. באמצעות פלטפורמה זו, הודגמה ההשפעה של החלפת פפטיד האות N-terminal של GluR0 בפפטיד אות פרוטאורהודופסין על טרנסלוקציה קו-תרגומית מוצלחת של GluR0 לממברנות של GUV היברידי. שיטה זו מספקת הליך חזק שיאפשר בנייה מחדש ללא תאים של חלבוני ממברנה שונים בתאים סינתטיים.

מבוא

ביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה זכתה להתעניינות גוברת בעשור האחרון כתחום מתפתח עם יישומים פוטנציאליים רבים בביו-הנדסה, אספקת תרופות ורפואה רגנרטיבית 1,2. התפתחותם של תאים סינתטיים כאבן פינה של ביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה, במיוחד, משכה מגוון רחב של קהילות מדעיות בשל היישומים המבטיחים של תאים סינתטיים, כמו גם תכונותיהם הפיסיקליות והביוכימיות דמויות התא המאפשרות מחקרים ביופיזיקליים במבחנה 3,4,5,6 . תאים סינתטיים מהונדסים לעתים קרובות בשלפוחיות חד-למלריות ענקיות בגודל תא (GUVs) שבהן נוצרים מחדש תהליכים ביולוגיים שונים. בנייה מחדש של שלד התא 7,8, התחדשות אנרגיה תלוית אור9, תקשורת תאית10,11 וחישה ביולוגית12 הן דוגמאות למאמצים שנעשו לשחזר התנהגויות דמויות תאים בתאים סינתטיים.

בעוד שתהליכים תאיים מסוימים מסתמכים על חלבונים מסיסים, מאפיינים רבים של תאים טבעיים, כגון חישה ותקשורת, משתמשים לעתים קרובות בחלבוני ממברנה, כולל תעלות יונים, קולטנים ומובילים. אתגר מרכזי בהתפתחות תאים סינתטיים הוא בנייה מחדש של חלבוני ממברנה. למרות ששיטות מסורתיות של בנייה מחדש של חלבון ממברנה בשכבות שומנים מסתמכות על טיהור בתיווך חומרי ניקוי, שיטות כאלה מייגעות, אינן יעילות עבור חלבונים רעילים לביטוי מארח, או לעתים קרובות אינן מתאימות להרכבה מחדש של חלבון הממברנה ב- GUVs13.

שיטה חלופית לביטוי חלבונים היא מערכות ביטוי ללא תאים (CFE). מערכות CFE היו כלי רב עוצמה בביולוגיה סינתטית המאפשר ביטוי חוץ גופי של חלבונים שונים באמצעות ליזט התא או מכונות תרגום שעתוק מטוהרות14. מערכות CFE יכולות להיות עטופות גם ב- GUVs, ובכך לאפשר תגובות סינתזת חלבונים ממודרות שניתן לתכנת ליישומים שונים, כגון יצירת תאים סינתטיים קצירת אור9 או ביוסנסורים רגישים למכנו15,16. בדומה לשיטות ביטוי חלבון רקומביננטי, ביטוי חלבון ממברנה מאתגר במערכות CFE17. צבירה, קיפול שגוי וחוסר שינוי לאחר תרגום במערכות CFE הם צווארי בקבוק עיקריים המעכבים סינתזת חלבון ממברנה מוצלחת באמצעות מערכות CFE. הקושי בבנייה מחדש של חלבוני ממברנה מלמטה למעלה באמצעות מערכות CFE נובע בחלקו מהיעדרו של מסלול ביוגנזה מורכב של חלבון ממברנה המסתמך על פפטידים של אותות, חלקיקי זיהוי אותות, טרנסלוקונים ומולקולות מלוות. עם זאת, לאחרונה, מחקרים רבים הציעו כי נוכחות של מבנים קרומיים כגון מיקרוזומים או ליפוזומים במהלך התרגום מקדמת ביטוי מוצלח של חלבון הממברנה 18,19,20,21. בנוסף, Eaglesfield et al. ו- Steinküher et al. מצאו כי הכללת תחומים הידרופוביים ספציפיים המכונים פפטידים אותות ב- N-terminus של חלבון הממברנה יכולה לשפר באופן משמעותי את ביטויו22,23. בסך הכל, מחקרים אלה מציעים כי ניתן להתגבר על האתגר של בנייה מחדש של חלבון הממברנה בתאים סינתטיים אם תרגום החלבון מתרחש בנוכחות קרום GUV ואם נעשה שימוש בפפטיד אות N-טרמינלי תקין.

כאן, מוצג פרוטוקול לאנקפסולציה של סינתזת חלבונים באמצעות אלמנטים רקומביננטיים (PURE) תגובות CFE לבנייה מחדש של חלבון ממברנה ב- GUVs. קולטן גלוטמט חיידקי24 (GluR0) נבחר כחלבון קרום המודל, ונבדקת ההשפעה של פפטיד האות N-terminal שלו על המבנה מחדש של הממברנה שלו. ההשפעה של פפטיד אות פרוטאורודוסין, שהוכח כמשפר את יעילות הבנייה מחדש של חלבון הממברנה על ידי Eaglesfield et al.22, נחקרת על ידי בניית גרסה מוטנטית של GluR0 המסומנת כ- PRSP-GluR0 וביטויו ולוקליזציה של הממברנה עם GluR0 מסוג פראי (המכונה WT-GluR0 להלן) המכיל את פפטיד האות המקורי שלו. פרוטוקול זה מבוסס על שיטת תחליב הפוך25 עם שינויים שהופכים אותו לחזק עבור אנקפסולציה CFE. בשיטה המוצגת, תגובות CFE מתחלבות תחילה באמצעות תמיסת שומנים בשמן המייצרת טיפות בגודל מיקרון המכילות את מערכת CFE ומיוצבות על ידי חד-שכבה השומנית. לאחר מכן טיפות האמולסיה מונחות בשכבות על גבי ממשק שמן-מים הרווי בחד-שכבה שומנית נוספת. טיפות האמולסיה נאלצות לנוע על פני ממשק שמן-מים באמצעות כוח צנטריפוגלי. בתהליך זה, הטיפות מקבלות חד-שכבתית נוספת, ובכך יוצרות שלפוחית שומנים דו-שכבתית. לאחר מכן מודגרים ה-GUV המכילים את תגובת CFE, שבמהלכה חלבון הממברנה מבוטא ומשולב בקרום ה-GUV. למרות שפרוטוקול זה מוגדר לביטוי ללא תאים של GluR0, ניתן להשתמש בו לסינתזה ללא תאים של חלבוני ממברנה אחרים או יישומים שונים של תאים סינתטיים כגון בנייה מחדש של שלד ציטו-שלד או מחקרי איחוי ממברנות26.

פרוטוקול

הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר זה מוצגים בטבלת החומרים.

1. תגובות CFE בתפזורת בנוכחות שלפוחיות חד-למלריות קטנות (SUV)

  1. הכנת רכב שטח
    הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה אדים בהתאם להוראות הבטיחות לעבודה עם כלורופורם.
    1. הכינו רכבי שטח 5 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) בבקבוקון זכוכית על ידי העברת 76 μL של 25 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי POPC מומסת בכלורופורם.
    2. תוך כדי סיבוב עדין של בקבוקון הזכוכית, נשפו זרם עדין של ארגון לתוך הבקבוקון כדי ליצור סרט של שומנים מיובשים בתחתית. לאחר מכן, העבירו את בקבוקון הזכוכית למייבש כשהפקק מוברג באופן רופף כדי לאדות עודפי כלורופורם.
    3. שמור את בקבוקון הזכוכית במייבש למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסף 0.5 מ"ל מים טהורים במיוחד deionized כדי להמיס את הסרט שומנים מערבולת במשך כ 2 דקות.
    4. הגדירו מנגנון מיני אקסטרוזיה על ידי השריית שני תומכי מסנן במים נטולי יונים, והצבתם על כל אחד מתומכי הממברנה הפנימיים. לאחר מכן, השרו מסנן פוליקרבונט 100 ננומטר והניחו אותו בין שני תומכי הממברנה הפנימיים המוחזקים יחד על ידי המעטפת החיצונית של המכבש ואום התומך. מקם הגדרה זו במעמד המכבש.
    5. יש לשטוף שני מזרקים אטומים לגזים בנפח 1 מ"ל 3 פעמים במים טהורים במיוחד שעברו דה-יוניזציה.
    6. טען את הדגימה של תערובת שומנים-מים לאחד המזרקים האטומים לגז בנפח 1 מ"ל והנח אותה בקצה אחד של מכבש המיני באמצעות תפסי זרוע הנדנדה כדי להחזיק את המזרק במקומו. הכנס את המזרק השני לקצה השני של המיני מכבש וודא שהוא מדוכא לחלוטין.
      הערה: בעת העמסת המזרק בתערובת מי השומנים, ודא שאין אוויר במזרק לפני העברתו דרך המכבש הקטן.
    7. מעבירים בעדינות את תערובת מי השומנים מהמזרק המקורי למזרק הריק דרך מכשיר המיני-אקסטרודר. חזור על שלב זה 11 פעמים כדי ליצור רכבי שטח. מעבירים את רכבי השטח לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
      הערה: ניתן לאחסן את תמיסת SUV בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.
  2. מכלול תגובת CFE
    1. הרכיב את תגובת CFE על-ידי ביצוע פרוטוקול הביטוי ללא תאים שסופק על-ידי היצרן עם שינויים קלים המפורטים להלן.
    2. ערבוב 10 μL של תמיסה 1 (המכילה חומצות אמינו, NTPs, tRNA ומצעים לאנזימים, וחיץ הכרחי), 1 μL של תמיסה 2 (חלבונים ב-20% גליצרול), 2 μL של תמיסה 3 (ריבוזום (20 μM)), כמות מתאימה של קידוד DNA עבור sfGFP-sfCherry מסיס (1-10)27 (להלן sfGFP מסיס), WT-GluR0-sfGFP או PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ננוגרם/1000 זוגות בסיסים), 1 μL מעכב RNAse murine, ו 4 μL של 5 mM תמיסת SUV עבור חלבוני ממברנה או 4 μL מים עבור חלבונים מסיסים.
    3. הביאו את הנפח הסופי של התגובה ל-20 מיקרוליטר על ידי הוספת מים טהורים במיוחד שעברו דה-יוניזציה.
      הערה: בעת הרכבת מערכת CFE, כל הרכיבים חייבים להישמר על קרח. כל החומרים רגישים לטמפרטורה ועלולים להתפרק אם הם מגיעים לטמפרטורת החדר.
  3. דגירה וניטור של תגובת CFE
    1. העבירו את תמיסת CFE ללוח V תחתון חרוטי בעל 96 בארות. כדי למנוע אידוי במהלך התגובה, מכסים את הצלחת באמצעות סרט איטום.
    2. דגור על הצלחת ב-37°C בקורא לוחות למשך 4-5 שעות תוך ניטור תגובת CFE על ידי מדידת אות GFP עם רווח של 100 באורכי גל עירור/פליטה של 488 ננומטר / 528 ננומטר כל 2 דקות.

2. תגובות CFE מקופלות ב- GUV

  1. הכנת תמיסת חיץ חיצוני GUV
    1. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, מערבבים 1.5 μL של 1 M זרע, 37.5 μL של 100 mM ATP, 25 μL של 100 mM GTP, 12.5 μL של 100 mM CTP, 12.5 μL של 100 mM UTP, 25 μL של 1 M קריאטין פוספט, 18 μL של 1 M מגנזיום אצטט, 93.33 μL של 3M אשלגן גלוטמט, 50 μL של 1 M HEPES KOH (pH 7.4), 1.15 μL של 332 mM חומצה פולינית, 100 μL של 2 M גלוקוז, ו 50 μL מתמיסת מלאי של 6 mM תערובת של כל אחת מ -20 חומצות אמינו (הוכן על ידי ביצוע הפרוטוקול המתואר על ידי Sun et al.28).
    2. הביאו את הנפח הסופי של התמיסה ל-1 מ"ל על ידי הוספת מים מטוהרים במיוחד שעברו דה-יוניזציה.
      הערה: כל הרכיבים חייבים להישמר על קרח. מוסיפים את תערובת חומצות האמינו בסוף כדי למנוע דלדול חומצות אמינו28. הפתרון יכול להיות aliquoted ב 330 μL aliquots ומאוחסן ב -20 ° C עד השימוש.
  2. הכנת תערובת שומנים בשמן
    הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה אדים בהתאם להוראות הבטיחות לעבודה עם כלורופורם.
    1. במכסה אדים, ערבבו 17.3 מיקרוליטר של 25 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי POPC ו-1.08 מיקרוליטר של קופולימר פולי(בוטאדיאן)-בי-פולי(אתילן אוקסיד) (PEO-b-PBD) בבקבוקון זכוכית של 15 מ"ל.
      הערה: תמיסת השומנים בשמן הסופית מכילה שומנים של 0.5 מילימטר עם 95% ו-5% POPC ו-PEO-b-PBD, בהתאמה. PEO-b-PBD שימש לשיפור יציבות הממברנה במהלך ביטוי חלבונים, אך נשמר ביחס מולארי נמוך כדי להפחית את נטיית הקופולימר להצטבר למיצלות נפרדות ממולקולות שומנים29,30.
    2. נשפו בזהירות זרם עדין של גז ארגון לתוך בקבוקון הזכוכית תוך כדי סיבוב הבקבוקון כדי לאדות את הכלורופורם.
    3. פיפטה 1.2 מ"ל של שמן מינרלי קל לתוך בקבוקון זכוכית 15 מ"ל המכיל את השומנים המיובשים.
    4. מערבבים את השומנים והשמן על ידי ערבול במהירות מקסימלית במשך 10-20 שניות. תערובת השומנים-קופולימרים המומסים תיראה מעונן.
    5. כדי להבטיח שכל אגרגטי השומנים האפשריים בשמן מומסים במלואם ומפוזרים ברחבי השמן, מכניסים את בקבוקון הזכוכית לתנור בטמפרטורה של כ-50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני מערבלים 10-20 שניות נוספות במהירות מרבית.
  3. הרכבה ואנקפסולציה של תגובת CFE (איור 1 מסכם את השלבים הבאים).
    1. הכן 300 μL של התמיסה החיצונית GUV בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על ידי ערבוב 270 μL של תמיסת חיץ חיצונית CFE שהוכנה בשלב 2.1, 15 μL של 5 M NaCl ו- 15 μL של 4.5 M KCl.
      הערה: בשלב זה, הוסף 0.45 μL של 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) לתמיסת GUV החיצונית. מטרת הוספת NaCl ו-KCl היא להתאים את האוסמוליות של התמיסה החיצונית כך שתתאים אותה לתמיסת CFE הפנימית. הנפח המדויק של NaCl ו- KCl תלוי בהתאמת האוסמוליות הרצויה. אפשר להוסיף NaCl או KCl או שניהם כדי להתאים את האוסמוליות.
    2. יש לערבב בעדינות פיפטה 300 μL של תערובת שומנים בשמן על גבי התמיסה החיצונית של GUV.
      הערה: בעת הוספת תערובת שמן השומנים, חשוב שהשמן לא יתערבב עם התמיסה החיצונית המימית. לאחר התוספת, צריך להיות ממשק גלוי בין תערובת השומנים בשמן לבין התמיסה החיצונית של GUV.
    3. דוגרים על ממשק שמן-מים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר לחד-שכבה השומנית להיווצר ולהתייצב בממשק.
    4. בינתיים, עקוב אחר סעיף 1.2.1 כדי להרכיב תגובת CFE המכילה את הדנ"א הפלסמיד המקודד את גרסאות חלבון הממברנה או GFP מסיס. החלף את 4 μL של תמיסת SUV 5 mM או מים עם 4 μL של 1 M סוכרוז. תגובה זו תהיה הפתרון הפנימי של GUV.
      הערה: אוסמומטר שימש למדידת האוסמוליות של התמיסות הפנימיות והחיצוניות. האוסמוליות של התמיסה החיצונית הותאמה בהתאם על ידי תוספת של NaCl או מים. האוסמוליות של תגובת CFE היא בדרך כלל סביב 1600 mOsm/Kg. הוספת סוכרוז לתגובה מגדילה את צפיפות התמיסה הפנימית, ובכך מאפשרת לשלפוחיות לנוע על פני ממשק שמן-מים במהלך שלב הצנטריפוגה. חלופה לסוכרוז היא פתרון שיפוע צפיפות Opti-Prep.
    5. הוסף 600 μL של תערובת שמן שומנים לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל את תגובת CFE ופיפטה למעלה ולמטה במרץ במשך ~ 1 דקות כדי לתחליב את התגובה בתמיסת שומנים בשמן וליצור את חד-שכבת השומנים סביב תאים סינתטיים.
      הערה: הפתרון הסופי לא צריך להיות בועות צריך להיראות אטום.
    6. מחזירים בעדינות את תחליב התמיסה הפנימי על גבי שכבת השמן בצינור המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל שבו הוקם ממשק שמן-מים.
      הערה: היזהר שלא להפריע או לערער את יציבות הממשק.
    7. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2,000 x גרם ב-4°C.
      הערה: מהירות הצנטריפוגה הותאמה לפרוטוקול זה. Adir et al.31 דיווחו על מהירות צנטריפוגה שונה.
    8. לאחר סיום הצנטריפוגה, הסר בזהירות את עודפי הנפט והתמיסה החיצונית מצינור המיקרוצנטריפוגה באמצעות פיפטטור. הסר את התמיסה החיצונית עד שהנפח הנותר הוא סביב 100 μL.
      הערה: גלולה של GUV נראית בדרך כלל בתחתית צינור המיקרוצנטריפוגה. עם זאת, היעדר גלולה נראית לעין לא בהכרח אומר שאין תשואה של GUV. במקום להשתמש בפיפטטור, ניתן להסיר את עודפי השמן על גבי התמיסה החיצונית על ידי שאיפה. חשוב לוודא שתמיסת השומנים בשמן מוסרת לחלוטין. זיהום שמן בתמיסת GUV עלול לגרום לתמונות באיכות נמוכה.
    9. השהה מחדש את גלולת ה- GUV בתמיסת 100 μL הנותרת על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. לאחר מכן, העבר את פתרון ה- GUV לצלחת תחתונה שטוחה נקייה 96 שקופה היטב כדי לדגור.

3. אינקובציה והדמיה של תגובת CFE בכמוסה

  1. כסו את הצלחת באמצעות סרט איטום למניעת אידוי. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 5-6 שעות. ניתן להשתמש בקורא צלחות ולבצע את שלב 1.3.2 כדי להכין את קורא הצלחות לשלב הדגירה.
  2. לאחר סיום הדגירה, הניחו את לוח הבאר 96 על שלב ההדמיה של מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמת EMCCD (או מצלמת sCMOS), לייזר נשלט DAQ-MX (או מערכת משולבת משולב לייזר), ודיסק מסתובב CSU-X1 קונפוקלי (או קונפוקלי סריקת לייזר). התמקד בכל החזר השקעה המכיל GUV וצלם תמונות באורך גל עירור של 488 ננומטר באמצעות יעד Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.
  3. שמור תמונות של GUV בתבנית .tiff.
  4. פתח את התמונות בתוכנת עיבוד תמונה (לדוגמה, ImageJ או פיג'י). פתחו את חלונית ההגדרות 'בהירות/ניגודיות '. התאם את הבהירות והניגודיות להגדרות מתאימות שהופכות חלבונים פלואורסצנטיים לגלויים.
  5. אם המטרה היא להשוות את עוצמת האות של חלבונים שונים המבוטאים, ערמו תחילה תמונות בודדות של GUV המכילות חלבונים שונים באמצעות החלונית Images to Stack הממוקמת בתפריט המשנה Image > Stacks . לאחר מכן, התאימו את הבהירות והניגודיות של כל התמונות באמצעות החלונית 'בהירות/ניגודיות '.

תוצאות

לפני האנקפסולציה של תגובות CFE, שתי גרסאות של GluR0-sfGFP המכילות פפטידים של אותות מקוריים ופרוטאורהודופסין (רצפי פפטידי אותות מוצגים בטבלה משלימה 1), וה-sfGFP המסיס בוטאו בנפרד בתגובות בתפזורת, והביטוי שלהן נוטר על-ידי זיהוי אות sfGFP באמצעות קורא לוחות (איור 2A). חלבוני הממברנה התבטאו בהיעדר או נוכחות של רכבי שטח 100 ננומטר. בנוסף, באמצעות עקומת כיול שקורלציה בין אות sfGFP לריכוזו (איור משלים 1), הוערכו ריכוזים של חלבונים מסונתזים (טבלה משלימה 2). ברור של-sfGFP המסיס היה הביטוי הגבוה ביותר מבין שלושת החלבונים, מה שמרמז על כך שהביטוי של חלבוני ממברנה מטיל נטל על מערכת CFE, ובכך מאט את התגובה ומוריד את התפוקה שלה. בנוסף, בממוצע, תגובות המבטאות חלבוני ממברנה בנוכחות רכבי שטח הראו אות sfGFP גבוה יותר בהשוואה לתגובות חסרות רכבי שטח. תצפית זו מתיישבת עם ממצאיהם של Steinküher et al., שהראו כי ביטוי חלבוני ממברנה מפחית את יכולתן של מערכות CFE לייצר חלבונים23. עם זאת, בהינתן ההדגמה המוצלחת של ביטוי חלבונים בתגובת CFE בתפזורת, ניתן להסיק כי CFE בכמוסה יסנתז חלבונים גם בתוך GUVs.

לאחר מכן, תגובות CFE בודדות היו מכוסים ב- GUV באמצעות שיטת תחליב הפוך כדי לבטא גרסאות של GluR0, כלומר WT-GluR0, PRSP-GluR0 ו- sfGFP מסיס. בעוד ש-WT-GluR0, המכיל פפטיד אות מקורי של GluR0, הדגים ביטוי מצוין ולוקליזציה של הממברנות (איור 2B, פאנל שמאלי), מקבילו, PRSP-GluR0, בעל פפטיד אות N-טרמינלי פרוטאורודופסין, לא הראה לוקליזציה חזקה דומה של הממברנה. PRSP-GluR0 נמצא נוטה יותר להיווצרות צבירה וניקוב (איור 2B, פאנל אמצעי). כצפוי, sfGFP מסיס בא לידי ביטוי ב-GUV ונשאר בלומן של GUV (איור 2B, פאנל ימני; ראו איור משלים 2 לתמונות של קבוצות של GUVs).

figure-results-1
איור 1: שלבים ניסיוניים של תחליב הפוך. (1) שלב 2.3.1 עד שלב 2.3.3 של הפרוטוקול מוצגים באופן חזותי כדי להדגים את ההרכבה של חד-שכבת השומנים בממשק של תערובת שמן השומנים ותמיסת החיץ החיצונית. (2) הדמיה של שלב 2.3.5 של הפרוטוקול מוצגת כאן כדי לייצג את היווצרות חד-שכבת השומנים סביב טיפות מתחלבות העוטפות את תמיסת CFE הפנימית. (3) שלב 2.3.6 של הפרוטוקול מראה את התוספת של ה- GUV החד-שכבתי לצינור המיקרוצנטריפוגה עם חד-שכבת השומנים בממשק של תערובת שומנים-שמן ותמיסת חיץ חיצונית. (4) שלב 2.3.7 מתואר כאן, שבו צנטריפוגה מובילה להיווצרות גלולת GUV בתמיסה החיצונית. (5) שלב 2.3.8 מוצג כאן, המציין את תהליך הסרת תערובת השומנים העודפת בשמן והתמיסה החיצונית. (6) לבסוף, שלב 2.3.9 מתואר כאן, שבו גלולת ה- GUV תלויה מחדש בתמיסה החיצונית, וה- GUV מוכנים לדגירה, ואחריה הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ביטוי חלבונים בתגובות CFE בתפזורת ובתגובות GUV המקיפות תגובות CFE. (A) קריאות פלואורסצנטיות של תגובות CFE בודדות בתפזורת המבטאות WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP ו-sfGFP מסיס. גרף sfGFP המסיס מייצג את האות מתגובה של 2.5 μL (נפח התגובה הסטנדרטי הוא 20 μL) כדי למנוע רוויית יתר של מדידות קורא הלוחות. הנתונים מוצגים כממוצע ± S.D, n = 3. (B) משמאל: תמונה קונפוקלית מייצגת של GUV המתמצה בתגובת CFE המבטאת WT-GluR0-sfGFP. באמצע: תמונה קונפוקלית מייצגת של GUV המתמצתת תגובת CFE המבטאת PRSP-GluR0-sfGFP. מימין: תמונה קונפוקלית מייצגת של GUV המתמצה בתגובת CFE המבטאת sfGFP מסיס. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: עקומת כיול האותות sfGFP וניתוח הרגרסיה הלינארית המתאים לה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: תמונה קונפוקלית מייצגת של קבוצות של GUV המבטאים (משמאל) WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP (באמצע) ו-sfGFP מסיס (מימין). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

טבלה משלימה 1: רצף חומצות האמינו של פפטידי אותות מסוג בר ופרוטאורהודופסין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: ריכוז החלבונים המסונתזים בתגובות CFE בתפזורת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

כמעט כל תהליך תאי שתלוי בהעברת מולקולות או מידע על פני קרום התא, כמו איתות תאי או עירור תאים, דורש חלבוני ממברנה. לפיכך, ההרכבה מחדש של חלבוני הממברנה הפכה לצוואר הבקבוק העיקרי במימוש עיצובים שונים של תאים סינתטיים עבור יישומים שונים. בנייה מחדש מסורתית בתיווך דטרגנטים של חלבוני ממברנה בקרומים ביולוגיים דורשת שיטות ייצור GUV כגון נפיחות עדינה או אלקטרופורמציה. גישות נפיחות מייצרות בדרך כלל שלפוחיות בגודל קטן, ותשואת האלקטרופורמציה יורדת משמעותית כאשר פתרונות מסובכים, כפי שקורה לעתים קרובות בעת יצירת תאים סינתטיים, עטופים32. בנוסף, דטרגנטים ממיסים את חלבון הממברנה, והסרתם במהלך תהליך ההרכבה מחדש עלולה לגרום לקיפול שגוי של חלבון33,34. מצד שני, הגישה המוצגת כאן מסתמכת על שילוב קו-תרגומי של חלבון הממברנה לתוך דו-שכבתי השומנים, הדומה יותר למסלול הביוגנזה של החלבון הטבעי בתאים22.

מנקודת מבט טכנית, הפרוטוקול המוצג הוא יתרון לשיטות אנקפסולציה נפוצות אחרות, כגון אלקטרופורמציה ואנקפסולציה רציפה של ממשק טיפות 7,8,35,36 (cDICE), ליישום קל יותר מכיוון שציוד המעבדה היחיד הנדרש לייצור GUV הוא צנטריפוגה. בניגוד לאלקטרופורמציה, שיטת התחליב ההפוך מאפשרת אנקפסולציה של שילובים שונים של מולקולות בריכוזים שונים. בנוסף, בהשוואה לטכניקת התחליב ההפוךהמקורית 25, גישה זו מייצרת GUV יציבים יותר המתאימים לאנקפסולציה של מערכות CFE lysates או PURE. יציבות GUV גבוהה יותר נובעת מנוכחות קופולימר דיבלוק בהרכב קרום GUV37 וכן מהדגירה הארוכה של ממשק שמן-מים המאפשרת לממשק להיות רווי במולקולות שומנים. לבסוף, בניגוד לגישות מיקרופלואידיקה, הפרוטוקול המוצג כאן אינו דורש תעלות קטנות וצינורות. לכן, תגובת CFE יכולה להיות עטופה ברגע שהיא מורכבת, והזמן הקצר יותר של הרכבת GUV עקב חוסר זרימה וסתימה אפשרית מונע התחלה מוקדמת מדי של תגובת CFE. בעוד שההדגמה של ביטוי חלבון ממברנה בפרוטוקול זה היא בלעדית לתגובות PUREfrex, ניתן להרחיב שיטה זו לסנתז חלבונים באמצעות מערכות CFE זמינות שונות, כגון מערכות CFE חיידקיות מבוססות ליזט או יונקים.

לגישה המוצגת כאן יש מגבלות הנגרמות על ידי האופי התלוי בשמן של תהליך היווצרות GUV והכוונה שיהיו GUV יציבים. גישה זו היא בדרך כלל ארוכה יותר בהשוואה לשיטות אחרות, כגון cDICE או microfluidics, בשל זמן הדגירה הארוך של ממשק שמן-מים הנדרש לייצוב ממשק ותפוקת GUV גבוהה. בנוסף, הרכב השומנים מוגבל בעיקר ל- POPC עם מינונים קטנים של שומנים אחרים או קופולימרים בלוקים, בעוד ששיטות אחרות, כגון אלקטרופורמציה, מתאימות יותר לשילוב שומנים בעלי תכונות פיזיקליות וכימיות שונות. בעוד הרכב קרום GUV בשיטה זו הוא תערובת של POPC ו- PBD-PEO כדי למקסם את תפוקת CFE, ניתן לבדוק שינויים אפשריים בהרכב קרום GUV. עם זאת, אופטימיזציה נוספת של הפרמטרים עשויה להידרש עבור חלבוני ממברנה אחרים. מכיוון שהתחליב הטיפתי מתרחש באמצעות פיפטינג ידני, ה- GUV הנוצרים בשיטה זו הם polydisperse והטרוגניים למדי בגודלם. יתר על כן, העובדה כי שומנים מומסים בשלב האורגני עלול לגרום מדי פעם שכבת שמן בין שני עלונים של קרום GUV או לזהם את תא הדימות עם שמן שיכול להזיק לאיכות התמונה. פתרון אפשרי לאתגר של שאריות שמן הוא להחליף שמן מינרלי בממס אורגני נדיף, כגון אתר דיאתיל, כפי שמוצג על ידי Tsumoto et al.38, כדי להסתמך על אידוי ממס יחד עם צנטריפוגה במהלך היווצרות GUV.

אמנם אין הדגמה של תפקוד הערוץ בעבודה זו, בהשראת בדיקות קודמות ששימשו לבדיקת פונקציונליות ערוץ מכנו או רגישה לאור, אך מתוארת בדיקה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. דווח כי פתיחת ערוץ GluR0 מגבירה את מוליכות הממברנה עבור יוני K+ 24. מכיוון שתגובות CFE כבר מכילות ריכוז גבוה של K+, מחווני אשלגן טיפוסיים לא יתאימו להערכת פונקציונליות הערוץ. עם זאת, מכיוון שזרם אשלגן משנה את פוטנציאל הממברנה, אינדיקטורים פוטנציאליים רגישים של הממברנה כגון DiBAC4(3)22 או BeRST 139 יכולים לדווח על פעילות GluR0 בנוכחות גלוטמט.

בנייה מחדש מוצלחת של חלבוני ממברנה בתאים סינתטיים פותחת אפשרויות רבות ליצירת תאים סינתטיים בעלי יכולות חסרות תקדים המחקים באופן הדוק יותר תאים טבעיים. החיסרון העיקרי הנוכחי של תאים סינתטיים הוא חוסר היכולת שלהם להתרבות ולמחזר אנרגיה. עם זאת, עם תוכניות התחדשות אנרגיה תלויות אור וכימיקלים המסתמכות במידה רבה על חלבוני ממברנה, ניתן לדמיין תאים סינתטיים עמידים לאורך זמן40. שימוש במערכות CFE מאפשר בנייה מחדש של חלבוני ממברנה מרובים שיכולים לבצע משימות מסוימות באופן קולקטיבי. לדוגמה, בנייה מחדש של תעלת יונים מגודרת ליגנד בדומה ל-GluR0 המתוארת כאן, יחד עם תעלות יונים מגודרות מתח שונות, יכולה להוביל לבניית תא סינתטי דמוי נוירון מעורר.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

APL מודה בתמיכת הקרן הלאומית למדע (EF1935265), המכונים הלאומיים לבריאות (R01-EB030031 ו-R21-AR080363) ומשרד המחקר הצבאי (80523-BB)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסנן פוליקרבונט 100 ננומטרSTERLITECH1270193
96 צלחת תחתונה שקופה היטבThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M קורא רב-מצבי היברידיAgilent11-120-533
קריאטין פוספטMillipore Sigma10621714001
CSU-X1 יחידת סורק קונפוקלי CSU-X1 יחידת סורק קונפוקליCSU-X1 
מדיום שיפוע צפיפות (Optiprep)Millipore SigmaD1556אופציונלי למתג עם סוכרוז בתמיסה פנימית
מסנן תומךAvanti610014
Fisherbrand (1.5 מ"ל)פישר סיינטיפיק05-408-129 
חומצה פולינית מלח סידן הידרטMillipore SigmaF7878
גלוקוזMillipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 מצלמה אנדורDU-897E-CS0 
L-חומצה גלוטמית אשלגן מלח מונוהידרטMillipore SigmaG1501
שמן מינרלי קלMillipore SigmaM5904
מגנזיום אצטט טטרהידרט Millipore SigmaM5661
(כולל מחזיק מזרק ומעמד מכבש)Avanti610020
Olympus IX81 מיקרוסקופ הפוך OlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x מיקרוסקופ שמן אובייקטיבי אולימפוס1-U2B933 
PEO-b-PBDמקור פולימרP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP DNA פלסמידתוצרת ביתN / A
pET28b-sfGFP-sfCherry (1-10) DNA פלסמידתוצרת ביתN / A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP DNA פלסמידתוצרת ביתN / A
POPC ליפיד בכלורופורם Avanti850457C
אשלגן כלוריMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
סט תמיסת ריבונוקלאוטידים ניואינגלנד BioLabsN0450
מעכב RNase, עכבריםניו אינגלנד BioLabsM0314S
RTS דגימת חומצות אמינוBiotechrabbitBR1401801
נתרן כלוריMillipore SigmaS9888
SpermidineMillipore SigmaS2626
סוכרוזMillipore SigmaS0389
VAPRO אוסמומטר לחץ אדים דגם 5600ELITechGroupVAPRO 5600
במיקרו-צינורות ערכת מיני מכבש

מקורות

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685(2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912(2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236(2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325(2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605(2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917(2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025(2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429(2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104(2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416(2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332(2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509(2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הרכבה מחדש של תעלת קולטן הגלוטמט החיידקי על ידי אנקפסולציה של מערכת ביטוי ללא תאים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.