מודלים של ריאות על שבב עולים על תרביות דו-ממדיות מסורתיות על ידי חיקוי ממשק אוויר-נוזל וזילוח תאי אנדותל, המדמים זרימת דם וחילופי חומרים מזינים החיוניים למחקרים בפיזיולוגיה של הריאות. זה משפר את הרלוונטיות של מחקר הריאות, ומציע סביבה דינמית ומדויקת פיזיולוגית לקידום ההבנה והטיפול בזיהומים בדרכי הנשימה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל Alveolus-on-Chip חיסוני לחקר תגובות חיסוניות של נאדיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנו מציגים מודל מתקדם של ריאות על שבב שנועד לשכפל את המבנה והתפקוד של הנאדיות האנושיות. מודל חדשני זה משתמש בשבב ביולוגי מחורר מיקרופלואידית התומך בממשק אוויר-נוזל המחקה את הסביבה בנאדיות האדם. הנדסת רקמות משמשת לשילוב רכיבי מפתח תאיים, כולל תאי אנדותל, מקרופאגים ותאי אפיתל, כדי ליצור מודל רקמתי מייצג של הנאדיות. המודל מאפשר בחינה מעמיקה של תגובות החיסון הרירית לפתוגנים שונים, כולל וירוסים, חיידקים ופטריות, ובכך מקדם את הבנתנו את חסינות הריאות. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק פרטים לביסוס מודל alveolus-on-chip זה כפלטפורמה חזקה במבחנה למחקרי זיהום, המאפשרת לחוקרים לעקוב מקרוב ולנתח את האינטראקציות המורכבות בין פתוגנים לבין מערכת החיסון של המארח בסביבת הריאות. זה מושג באמצעות יישום של טכניקות מבוססות מיקרופלואידים כדי לדמות מצבים פיזיולוגיים מרכזיים של נאדיות האדם, כולל זרימת דם וגירוי ביומכני של תאי אנדותל, לצד שמירה על ממשק אוויר-נוזל חיוני לחשיפה מציאותית של תאי אפיתל לאוויר. מערכת המודל תואמת למגוון בדיקות סטנדרטיות, כגון צביעת אימונופלואורסצנטיות, פרופיל ציטוקינים וניתוח יחידות יוצרות מושבה (CFU)/פלאק, ומאפשרת תובנות מקיפות על הדינמיקה החיסונית במהלך זיהום. Alveolus-on-chip מורכב מסוגי תאים חיוניים, כולל תאי אפיתל ריאה דיסטליים אנושיים (H441) ותאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs) המופרדים על ידי קרומי פוליאתילן טרפתאלט נקבוביים (PET), עם מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים הממוקמים אסטרטגית בין שכבת האפיתל לשכבת האנדותל. מודל הרקמה משפר את היכולת לנתח ולנתח את הגורמים הניואנסיים המעורבים בתגובות חיסוניות ריאתיות במבחנה. ככלי רב ערך, הוא אמור לתרום לקידום מחקר הריאות, לספק מודל מבחנה מדויק ודינמי יותר לחקר הפתוגנזה של זיהומים בדרכי הנשימה ולבדיקת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.
מבוא
לריאה האנושית יש תפקיד יוצא דופן בנשימה ובהגנה החיסונית, עם אינטראקציות מורכבות בין התגובות החיסוניות של רירית הנאדית1. היכולת של הנאדיות ליצור תגובה חיסונית יעילה חיונית למניעת דלקות ריאה ולהבטחת בריאות הריאות. מכיוון שהריאות חשופות כל הזמן למגוון רחב של סיכונים פוטנציאליים, כולל חיידקים, וירוסים, פטריות, אלרגיות וחומר חלקיקי, הבנת המורכבות של תגובות החיסון של רירית הנאדיות היא קריטית לגילוי המנגנונים מאחורי זיהומים בדרכי הנשימה, הפרעות דלקתיות וטיפול במחלות ריאה1.
כדי לחקור זיהומים ותהליכים הקשורים לדלקת של דרכי הנשימה במבחנה, נדרשים מודלים שיכולים לחקות נאמנה את הסביבה הנאדית ואת התגובות החיסוניות. תרביות תאים דו-ממדיות ומודולים של בעלי חיים שימשו במשך עשרות שנים ככלים חיוניים למחקר ביו-רפואי על תגובה חיסונית ריאתית. עם זאת, לעתים קרובות יש להם מגבלות בפוטנציאל התרגום שלהם למצבים אנושיים. מודלים של ריאות על שבב יכולים לתרום למילוי הפער בין מודלים מסורתיים במבחנה ו-in vivo ולספק גישה חדשנית לחקר תגובות חיסוניות ספציפיות לבני אדם 2,3. מודלים של ריאות על שבב יכולים לחקות את ממשק האוויר-נוזל, הנדרש לתאי הריאה כדי לשחזר מצבים פיזיולוגיים של דרכי הנשימה ולפתח מודל רקמות מדויק וחזק יותר. טכניקת תרבית זו מאפשרת בחינה מדויקת של התמיינות תאים, תפקודם ותגובות לתרופות או גירויים הקשורים למחלות במבחנה2.
במחקר זה, אנו מציגים מודל מבוסס מיקרופלואידים של הנאדיות האנושיות ככלי יעיל לשחזור הסביבה הנאדית האנושית על ידי הפעלת זילוח כדי לחקות זרימת דם וגירוי ביומכני של תאי אנדותל ושילוב ממשק אוויר-נוזל עם תאי אפיתל שנחשפו לקראת שלבאוויר 4. פיתחנו נאדיות על שבב מיקרופלואידיות המחקות את המבנה הפיזי ואת האינטראקציות הביולוגיות של הנאדיות האנושיות, עם דגש מיוחד על ממשק אוויר-נוזל. ממשק זה ממלא תפקיד מכריע בהתמיינות תאי אפיתל נשימתיים, החיוניים למידול מדויק של הסביבה הריאתית. המודל משתמש בתאי אפיתל ריאה דיסטליים אנושיים (H441) ובתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs), המופרדים על ידי קרומי פוליאתילן טרפתאלט נקבוביים (PET), עם מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים הממוקמים בין שכבות התא. מערך זה משכפל את הסידור התאי המורכב של הנאדיות והוא קריטי להדמיה מדויקת של ממשק אוויר-נוזל, המהווה גורם משמעותי בתפקוד הפיזיולוגי של רקמת הריאה.
הרציונל מאחורי פיתוח המודל משתרע על שילוב הן של תאים חיסוניים במחזור הדם והן של תאי חיסון השוכנים ברקמות. גישה זו נועדה לחקות במדויק את תגובת המאכסן הדלקתי לזיהומים בדרכי הנשימה בבני אדם, ולספק סביבה דינמית לחקר אינטראקציות פתוגן-מארח. נוכחותם של מקרופאגים מאפשרת לבחון תגובות חיסוניות מיידיות ואת האינטראקציה שלהן עם פתוגנים, המשקפת את קו ההגנה הראשון מפני זיהומים בדרכי הנשימה. יתר על כן, העיצוב של פלטפורמת השבב הביולוגי מאפשר מניפולציה נוחה ומדויקת של רמזים ביופיזיים וביוכימיים כאחד, שהיא חיונית לשכפול תפקוד הנאדיות במבחנה. גמישות זו חיונית בניתוח הגורמים התורמים לזיהומים אנושיים, ומאפשרת לחוקרים להתאים את התנאים כך שישקפו מצבי מחלה שונים או לבחון התערבויות טיפוליות פוטנציאליות. התאימות של הפלטפורמה עם טכנולוגיות קריאה מרובות, כולל מיקרוסקופיה מתקדמת, ניתוחים מיקרוביולוגיים וניתוח שפכים ביוכימיים, משפרת את התועלת שלה. יכולות אלה מאפשרות הערכה מקיפה של תגובת הרקמה לזיהומים, כולל הערכת התנהגות תאית, התפשטות פתוגנים ויעילות של תגובות חיסוניות.
אנו מציגים פרוטוקול מפורט וטכניקות ליצירה ושימוש במודל נאדיות על שבב אנושי המתמקד בשכפול ממשק אוויר-נוזל ושילוב תאי חיסון לחקר זיהומים אנושיים במבחנה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
תאי HUVEC מבודדים מחבל הטבור ומשמשים עד מעבר 4. מונוציטים ראשוניים מבודדים מתורמים בריאים מדם שלם. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי יינה, יינה, גרמניה (3939-12/13). על פי הצהרת הלסינקי, כל האנשים שתרמו תאים למחקר נתנו את הסכמתם מדעת.
1. יום 1: הכנת השבב הביולוגי
- השבבים הביולוגיים זמינים בגדלים ובדגמים שונים. לניסויים כאן, השתמש במודל BC002. הניחו את הביו-שבב בצלחת פטרי מזכוכית, מלאו את הצלחת ושטפו את כל החללים באתנול סטרילי 70% (EthOH). יש לדגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לשטוף את החללים 2x עם ddHסטרילי 2O. הסירו את ddH2O.
- צפו את קרום השבב הביולוגי של שני החללים בתמיסת קולגן IV סטרילית (0.5 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית 0.5 מילימול; השתמשו בריכוז של 1:100 במי מלח חוצצים פוספט של דולבקו המכיל מגנזיום וסידן PBS (+/+)) על ידי שטיפה עדינה של תמיסת קולגן IV דרך שני החללים באמצעות פיפט של 1,000 מיקרוליטר עם קצוות כחולים. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
הערה: מומלץ להשתמש בצינור של 1,000 μL עם קצוות מסנן כחול (P1000) לאורך כל הפרוטוקול. קוטר הפתיחה של קצה המסנן מכסה לחלוטין את פתח היציאות המחברות בין הערוצים, מה שמונע הכנסת בועות אוויר לשבב. - לאחר 30 דקות דגירה, יש לשטוף את החדר התחתון והעליון 2x עם PBS סטרילי (+/+) כדי לשטוף החוצה את שאריות הקולגן והחומצה האצטית.
- הכן מדיום EC על ידי הוספת 1:100 (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL). מלא את החדר העליון של כל חלל עם 250 μL של מדיום EC ואת החדר התחתון עם 150 μL של מדיום EC.
- קציר HUVEC מבקבוק T25 משולב: יש לשטוף עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco ללא PBS מגנזיום וסידן (-/-), להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין + 1 mM EDTA ב- PBS (-/-) ולדגור במשך 3 דקות ב 37 ° C. עצור את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל PBS (+/+) + 5% FCS וצנטריפוגה ב 350 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) בצינור חרוטי 50 מ"ל. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של מדיום EC.
- השתמש בדילול טורי ביחס של 1:10 בעת ביצוע ספירת תאים. הוסף 10 μL של גלולת התא המרחף ל 90 μL של תווך התא. שלבו את הדגימות בזהירות. השתמש צינור microcentrifuge עם 10 μL של כתם כחול trypan. דלל את תמיסת התא בכחול טריפאן (1:1) באמצעות שקופיות תא ספירת תאים. ספור את התאים באופן ידני עם תא נויבאואר או עם מונה תאים אוטומטי. קבע את ספירת התאים והתאם את הריכוז ל- 0.4 x 106 תאים לכל 200 μL.
- החלף את תווך תאי האנדותל בחדר העליון של השבב הביולוגי עם 200 μL של תווך EC המכיל HUVECs מרחפים. פיפטה בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בתעלות או תאים. הניחו את צלחת הפטרי מזכוכית עם הביו-צ'יפס בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
2. יום 2: בדיקת שכבת התא
- ביום השני, בדוק חזותית את המפגש של שכבת התא HUVEC בחדר העליון. בצע חילוף בינוני בחדר העליון עם 300 μL של מדיום EC. פיפטה בעדינות כדי למנוע ניתוק של תאים מן הממברנה. בצע חילופי מדיה מדי יום לאחר 24 שעות. הניחו את צלחת הפטרי מזכוכית עם הביו-צ'יפס בחזרה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
3. יום 3: הכנת החדר התחתון
- בדוק חזותית את המפגש של שכבת תאי האנדותל. בנקודה זו, קבעו את נוכחותם של שכבה קונפלואנטית ומורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת (איור 1). בצע חילוף בינוני בחדר העליון עם 300 μL של מדיום EC.
- לאחר מכן, להכין את החדר התחתון עבור זריעת התאים המרכיבים את שכבת אפיתל. יש לשטוף את החדר התחתון בעדינות עם 150 μL של מדיום RPMI (להוסיף 1:100 (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 5% נסיוב פרה עוברית, 1 מיקרומטר dexamethasone).
- עבור החדר התחתון, זרע 0.5 x 106 H441 תאים מרחפים ב 200 μL של RPMI בינוני (RPMI) לכל חלל.
- קצירת תאי H441
- לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS (-/-) פעם אחת. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין + 1 mM EDTA ב- PBS (-/-).
- לדגור על התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2. זמן הדגירה משתנה בהתאם למפגש של השכבה. תוך 5-7 דקות, התאים אמורים להתנתק לחלוטין.
- עצור את פעילות הטריפסין עם 10 מ"ל PBS (+/+) + 5% FBS, אסוף את התאים והצנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 4 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של RPMI, ולספור.
- זרעו 0.5 x 106 תאים לכל תא על ידי פיפטציה עדינה של תמיסת התא לתוך החדר התחתון. סגור את כל היציאות והפוך את השבב הביולוגי כך שהתאים יוכלו להתחבר לקרום ה-PET. שמור את השבב הביולוגי הפוך ודגור למשך הלילה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
4. ימים 4 - יום7: תחזוקת תאים וקצירת מונוציטים
- בצע חילוף בינוני יומי בחדר העליון והתחתון. עבור החדר העליון, לבצע את חילופי בינוני עם 300 μL של מדיום EC.
- יש להשתמש ב-200 μL של RPMI+ (RPMI בינוני בתוספת 1:100 (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% סרום אנושי אוטולוגי, 1 μM dexamethasone) עבור החדר התחתון. ביום 7, שטפו את החדר התחתון עם RPMI+ כדי להכין את החלל לזריעת מונוציטים.
- זרעים 0.1 x 106 מונוציטים מרחפים ב 200 μL RPMI+ בתא התחתון.
- קצירת מונוציטים
- יש לשטוף את התאים עם 1 מ"ל PBS (-/-) ולדגור במשך 7 דקות ב-37°C ב-PBS שחומם מראש (-/-) המכיל 4 מ"ג/מ"ל לידוקאין + 5 mM EDTA ב-37°C ו-5% CO2.
- אסוף את התאים והצנטריפוגה במהירות של 350 x גרם למשך 7 דקות, השעה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של RPMI+ וספור. הניחו את יציאות השבב הפונות כלפי מטה כך שהתאים יתחברו לממברנה.
5. יום 8: זילוח ביו-שבב
- בשלב זה, ודא שהשבבים הביולוגיים מוכנים לחיבור לזרימה ומחוררים. לפני תחילת הזלוף, להכין אינקובטור ריק ומניחים את המשאבה פריסטלטית בפנים.
- זילוח של biochips
- לפני חיבור הצינורית המעוקרת לביו-שבב, שטפו את הצינורית עם 200 μL של PBS (+/+), ואחריו 200 μL של מדיום EC. לצינור קוטר פנימי של 0.5 מ"מ, המורכב מדפנות ארוכות יותר (20 ס"מ) וקצרות יותר (12 ס"מ) המחולקות על ידי שני פקקי משאבה פריסטלטיים. מניחים את הצינור בצד ומכינים את המאגרים למדיום.
- בצע חילוף בינוני בחדרים העליונים והתחתונים על ידי שטיפתם עם מדיום תרבית התאים הטרי שהוכן בהתאמה.
- הכניסו את המאגר בצד היציאה של השבב הביולוגי וחברו את המאגר עם הצינור לכניסת השבב הביולוגי (איור 2). חברו את הצינור למאגר ולביו-שבב כך שיהיה זילוח תווך מעגלי בין המאגר לביו-שבב.
- ברגע שהכל מחובר לנמלים, מלא את המאגר עם 500 μL של מדיום EC. חברו את השבב הביולוגי עם הצינורית על זילוח עם קצב זרימה של 21 מיקרוליטר/דקה (איור 2). התבונן מקרוב במהלך 15 הדקות הראשונות של זילוח להחדרת בועות. יש לבצע החלפה בינונית מדי יום בשני החדרים.
6. יום 9 - יום 11: הקמת ממשק אוויר-נוזל
- עוצרים את הזלוף, מרוקנים את המאגרים וממלאים מחדש במצע טרי שהוכן תחת ארון בטיחות סטרילי. פיפטה 500 μL של EC בינוני לתוך המאגרים ולשטוף בעדינות את התא התחתון עם 200 μL של RPMI+. התחילו שוב את הזילוח עם קצב זילוח של 21 מיקרוליטר/דקה.
- ממשק נוזלי אוויר (ALI)
- להקים ALI מהיום ה-12 ועד סוף הניסוי (יום 14). במהלך תרבית ALI יש לחשוף את תאי האפיתל לאוויר.
- כדי לבסס את תרבית ALI, הכינו EC חדש של מדיום כלי הדם (הוסף 1:100 (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 10 ng/ml GM-CSF, 20% סרום אנושי אוטולוגי, 1μM dexamethasone) כדי לשמור על כל סוגי התאים בשבב. בשלב זה, המדיום מכיל ריכוז גבוה יותר של AS (20%).
- פתחו את התקעים בתא התחתון מתחת לארון בטיחות סטרילי וספגו בזהירות את המדיום עד להופעת בועת אוויר, כפי שמוצג באיור 3. ודא שכל הנוזל מהתעלה ומהחדר הוסר וסגור את היציאות בזהירות.
- מלאו את המאגרים במדיום EC (-/-) והמשיכו בתרבית זילוח בקצב זרימה של 21 מיקרוליטר/דקה. החליפו בינוני רק בחדר העליון עד היום ה-14 ושמרו את תאי האפיתל בחדר התחתון עם אוויר בלבד.
7. יום 14: קצירת רקמות ואנליזתן
- נתק את השבב הביולוגי מהזרימה. חבר את הצינורית ובדוק במיקרוסקופ אם יש מפגש תאים. בשל האוויר בחדר התחתון, שכבות התא עשויות להיראות מטושטשות וקשות לדמיין. בשלב זה, המודל מוכן לניסויים נוספים.
- קיבוע והכתמה של רקמה בביו-שבב
- שטפו את החללים עם PBS (+/+) כדי להסיר את מדיום תרבית התא. פיפטה 300 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) מומסת ב-PBS (-/-) לחדר העליון ו-200 μL בחדר התחתון ודוגרת במשך 10 דקות ב-RT.
הערה: בעת עבודה עם כימיקלים לקיבוע כגון PFA, השתמש במכסה אדים. אספו והשליכו את הפסולת בהתאם. - שטפו את התאים 3x עם PBS (+/+). לאחר הקיבוע, לאחסן את biochips ב 4 °C או להשתמש בהם ישירות עבור צביעת immunofluorescence של תאים.
- עבור חדירה, פיפטה 300 μL של 0.25% Triton X-100 ב PBS (+/+). דגירה במשך 30 דקות ב- RT.
- לאחר הדגירה, יש לשטוף את שני התאים עם PBS (+/+) ופיפטה 300 μL של אלבומין סרום בקר 3% (BSA) ב-PBS (+/+) בשני החדרים. דגירה במשך שעה אחת ב- RT.
- בינתיים, להכין את לוח נוגדנים עבור צביעת immunofluorescence. כדי להכין את פאנל הנוגדנים לצביעת אימונופלואורסנציה, הוקמה צינורית עם כמות מספקת של 3% BSA כדי לדלל את הנוגדנים. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים עבור כל ממברנה. השתמש ביחס דילול של 1:100 עבור לוחות נוגדנים ראשוניים ו- 1:200 עבור לוחות נוגדנים משניים. בנוסף, עבור פאנל הנוגדנים המשני, הכינו DAPI ביחס דילול של 1:2,000. לגבי נוגדנים מתאימים, ראו (טבלה 1).
- כדי לגשת ישירות לתאים בתוך השבב, יש להסיר את רדיד המליטה. כדי לפתוח את התאים microfluidic, לבצע חתך מדויק על פני החלק החיצוני של החלל ולהסיר את נייר המליטה. חותכים את הממברנה החוצה על ידי הסרת הקצוות האטומים לשבב הביולוגי עם האזמל.
הערה: עבוד בצורה מדויקת ומדויקת במהלך שלב זה כדי למנוע נזק לממברנה ופציעות עקב חדות האזמל. - לאחר ניתוק הממברנה מהשבב, מחלקים את הממברנה לשני חלקים. אספו את חתיכות הממברנה בעזרת פינצטה והניחו אותן על שקופית מיקרוסקופית לצביעה.
- פיפטה 50 μL של תמיסת נוגדנים לכל חתיכת ממברנה. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (75 °F), מוגן מפני אור.
- לאחר הדגירה, מניחים את הממברנה ב 500 μL של PBS (-/-) בצלחת 24 באר ולשטוף את הממברנה 3x במשך 5 דקות כל אחד PBS (+/+). לאחר שטיפה, פיפטה 50 μL של תמיסת נוגדנים משנית לדגור במשך 1 שעה ב RT מוגן מפני אור.
- שטפו את הממברנה עם PBS (+/+) 3x למשך 5 דקות כל אחד. בינתיים, הכינו ותייגו את השקופיות המיקרוסקופיות לניסוי. מניחים טיפה של אמצעי הרכבה על השקופית ומניחים את הממברנה המתאימה. חזור על שלב זה עבור כל הממברנות. בסוף, מניחים טיפה אחת נוספת של אמצעי ההרכבה על החלק העליון של הממברנה ומשתמשים בזכוכית כיסוי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- שטפו את החללים עם PBS (+/+) כדי להסיר את מדיום תרבית התא. פיפטה 300 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) מומסת ב-PBS (-/-) לחדר העליון ו-200 μL בחדר התחתון ודוגרת במשך 10 דקות ב-RT.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בדיקה של שינויים מורפולוגיים וביטוי חלבוני סמן יכולה להתבצע באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. לאחר תרבית משותפת במשך 14 יום, צד כלי הדם וצד האפיתל מנותחים לביטוי של סמני תאים בהתאמה. שיטה זו שימושית לחקר האינטראקציות והשלמות של מרכיבי כלי הדם והאפיתל, החיוניים למידול מחלות כקריאה ביולוגית פונקציונלית הקשורה לזיהום. צביעה אימונופלואורסצנטית יכולה להיתמך על ידי ניתוח כימות , הערכה מורפולוגית ובדיקות תפקודיות, כולל שחרור ציטוקינים, ניתוח שפכים של סמני מוות תאי כגון שחרור LDH, ושינוי במורפומטריה של תאים5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודל הנאדיות על השבב מייצג מודל רקמה רב-שכבתי של הנאדיות האנושיות, המשלב סוגי תאים חיוניים של דרכי הנשימה התחתונות, כולל תאי אפיתל ריאה, תאי אנדותל ומקרופאגים, בתרבית בסידור אורגנוטיפי ב-ALI עם זילוח בינוני של רירית האנדותל. תאים משכבות שונות מבטאים חלבוני סמן תאים ספציפיים כגון E-cadherin, מולקולת היצמדות תלוית סידן של תאי אפיתל ריאתיים, שהיא מרכזית ביצירת מחסומי אפיתל בין-תאיים 5,10. E-cadherin מהווה אלמנט מחסום פיזי ושולט בתגובה החיסונית לפתוגנים וחומרים מזיקי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ק.ר. הוא מנכ"ל Dynamic42 GmbH ומחזיק במניות החברה. א.ס.מ היא יועצת מדעית של Dynamic 42 GmbH ומחזיקה במניות בחברה. לכל שאר המחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
H.K. ו- A.S.M. מכירות במימון מ- Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, הממומן על ידי קו המימון Strategic Networking של אגודת לייבניץ. M.A. ו- A.S.M. נתמכו על ידי פרויקט IGF IMPROVE שמומן על ידי המשרד הפדרלי לענייני כלכלה ואנרגיה על בסיס החלטת הבונדסטאג הגרמני. בנוסף, A.S.M מכירה בתמיכה כספית על ידי Cluster of Excellence Balance of the Microverse במסגרת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים מתכלים | |||
| שקופיות תא ספירת תאים (רוזנת) | Invitrogen | C10283 | |
| תרבית תאים צלחות Multiwell, 24 באר, סטריל | גריינר ביו-וואן | 662 160 | |
| צלחות תרבית תאים, 6 באר, סטריל | גריינר ביו-וואן | 657 160 | |
| כיסויים (24x40 מ"מ; #1.5) | מנזל-גל&אומל; סר | 15747592 | |
| מגבונים אקולוגיים | ד"ר שומאכר | 00-915-REW10003-01 | |
| אפיס 2.0 | סרשטדט | 72.691 | |
| אפיס 0.5 | סרסטדט | 72.699 | |
| אפיס 1.5 | סרסטדט | 72.690.001 | |
| פלקונס 15 מ"ל | גריינר ביו-וואן | 188 271-TRI | |
| פלקונס 50 מ"ל | גריינר Bio-One | 227 261-TRI | |
| ספוגית גזה | Noba | PZN 2417767 | |
| כפפות ניטריל 3000 | Meditrade | 1280 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | Menzel-Glä ser | AAAA000001##12E | |
| צלחות Multiwell 24 באר, | סטרילי Greiner Bio-One | 662 160 | |
| פיפטות פסטר (זכוכית) 150 מ"מ | פיפטות פסטר מסייעות | 40567001 | |
| (זכוכית) 230 מ"מ | מסייעים | 40567002 | |
| תחתונים עגולים (PS, 5 מ"ל) | Falcon | ||
| Safety-Multifly-Set, 20 גרם, 200 מ"מ | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| אזמל | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| פיפטות סרולוגיות 10 מ"ל | גריינר ביו-וואן | 607 160-TRI | |
| פיפטות סרולוגיות 25 מ"ל | גריינר ביו-וואן | 760 160-TRI | |
| פיפטות סרולוגיות 2 מ"ל | גריינר ביו-וואן | 710 160-TRI | |
| פיפטות סרולוגיות 50 מ"ל | גריינר Bio-One | 768 160-TRI | |
| פיפטות סרולוגיות 5 מ"ל | גריינר Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5 מ"ל Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0 מ"ל K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 בקבוק | גריינר Bio-One | 690 960 | |
| טיפים סטריליים 10µ L | גריינר ביו-וואן | 771 261 | |
| טיפים סטרילי 1250&מיקרו; L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| טיפים סטרילי 300µ L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| טיפים לא סטריליים 10µ L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| טיפים לא סטריליים 1000µ L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| טיפים לא סטריליים 200µ L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| פינצטה (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 מ"מ) | Roth | K343.1 | |
| <חזק>כימיקלים | |||
| Descosept AF | ד"ר שומאכר | N-20338 | |
| אתנול 96% | נורדברנד-נורדהאוזן | 410 | |
| פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)-דקסטרן (3-5kDa) | סיגמא אולדריץ' | FD4-100MG | |
| הרכבה פלואורסצנטית בינונית | Dako | S3023 | |
| מתנול | VWR | 20847.295 | |
| Saponin | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| <חזק>תרבית תאים | |||
| קולגן IV | סיגמא-אולדריץ' | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| תמיסת EDTA | Sigma-Aldrich | E788S | |
| גידול תאי אנדותל בינוני | Promocell | C-22020 | |
| צמיחת תאי אנדותל תערובת תוספים בינונית | Promocell | C-39225 | |
| סרום בקר עוברי | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| רקומביננטי אנושי GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| לידוקאין | סיגמא-אולדריץ' | L5647-15G | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| כתם כחול טריפן 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| <נוגדנים ראשוניים>חזקים | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (עז) | BD | 610252 | |
| CD68 (ארנב) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (עז) | מו"פ D | AF748 | |
| SP-A (עכבר) | Abcam | ab51891 | |
| <נוגדנים חזקים>משניים | |||
| AF488 (נגד עכבר) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (חמור נגד עכבר) | Invitrogen | A31571 | |
| AF647 (חמור נגד ארנב) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (חמור אנטי עז) | ג'קסון מחקר | 705-165-147 | |
| <חזק>מיקרופלואידי | |||
| שבב | דינמי 42 | BC002 | |
| זכר לואר לוק (קטן) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| זכר מיני לואר תקעים, שורה של ארבעה, PP, ירוק | Microfluidic | chipshop 09-0558-0336-11 | |
| תקעי מיני לואר זכר, שורה של ארבעה, PP, אטום | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | |
| תקעי מיני לואר זכר, שורה של ארבעה, PP, אדום | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 | |
| תקעים | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
| מאגר 4.5 מ"ל | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| צינורות | דינמי 42 | ST001 | |
| <חזק>ציוד | |||
| אוטוקלאב | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| צנטריפוגה | Eppendorf | 5424 | |
| CO2 אינקובטור | Heracell | 150i | |
| רוזנת מונה תאים אוטומטי | Invitrogen | C10227 | |
| Flowcytometer | BD | FACS Canto II | |
| מקפיא (-20 ° ג) | Liebherr | LCexv 4010 | |
| (-80 & deg; C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| מקרר | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| מיקרוסקופ | Leica | DM IL LED | |
| שייקר אורביטלי | Heidolph | Reax2000 | |
| משאבה פריסטלטית | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| פיפטות 10 ומיקרו; L | Eppendorf Research בתוספת | 3123000020 | |
| Pipettes 100µ L | Eppendorf Research פלוס | 3123000047 | |
| Pipettes 1000µ L | Eppendorf Research בתוספת | 3123000063 | |
| פיפטות 2.5 ומיקרו; L | Eppendorf Research בתוספת | 3123000012 | |
| Pipettes 20µ L | Eppendorf Research פלוס | 3123000039 | |
| פיפטות 200µ L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Scale | Sartorius | 6101 | |
| Scale | Sartorius | TE1245 | |
| ספסל סטרילי | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Waterbath | Julabo | SW-20C | |
| הגדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי | |||
| Apotome.2 | Zeiss | ||
| מכשיר תאורה | Zeiss | HXP 120 C | |
| מיקרוסקופ | Zeiss | Axio Observer 5 | |
| חתך אופטי | Zeiss | ApoTome | |
| ספק כוח מיקרוסקופ | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| <חזק>תוכנה | |||
| ZEN מהדורה כחולה | צייס |
מקורות
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
